As infecções humanas com Leishmania spp dão origem a um amplo espectro de manifestações clínicas que vão desde lesões tegumentares até compromisso visceral. O fenótipo da doença está intimamente relacionado com o tipo de resposta do hospedeiro mamífero à infecção do parasito e à variabilidade genética entre as espécies. Neste contexto, a identificação e caracterização de genes que regulam a virulência no fenótipo de Leishmania são essenciais para a compreensão dos mecanismos patogênicos do hospedeiro-parasita. Estudos anteriores realizados no laboratório mostraram a atenuação da virulência através da superexpressão do SL RNA em transfectantes de Leishmania (L.) major e Leishmania (V.) braziliensis em modelo murino. Para entender as mudanças fenotípicas encontradas em Leishmania (L.) major, a análise do perfil de expressão de genes permitiu identificar seis genes down-regulados e up-regulados, que poderiam contribuir individualmente com um padrão de virulência. Seis genes foram selecionados, os quais estão diferencialmente expressos entre as linhagens controle e transfectante. Para identificar genes específicos que poderiam compensar parcialmente a perda de virulência, foram analisados o fenótipo da infecção in vivo em camundongos suscetíveis. O conjunto de nossos dados sugerem que os genes estudados (LmjF 12.066 proteína fosfatase serina/treonina (PP2A); LmjF 36,5640 semelhante a ciclina; LmjF 36,4740 PIG-P (fosfatidilinositol N-acetilglucosaminil transferase - subunidade P) podem afetar negativamente a virulência de Leishmania (L.) major in vivo. Foram observadas diferenças significativas (p<0,005) entre os transfectantes contendo o vetor vazio e os transfectantes superexpressores, embora a caracterização do crescimento em condições axênicas não mostrou alterações. A localização destas proteínas superexpressas sugerem uma localização citoplasmática. Os resultados apresentados indicam que os altos níveis de expressão destes genes comparado com as linhagens controle afetam negativamente a capacidade de linhagens virulentas, induzam lesões quando são injetadas em camundongos susceptíveis. / Human infections with Leishmania spp give rise to a spectrum of clinical manifestations ranging from tegumentary lesions to a visceral disease. The phenotype of the disease isclosely related to the type of parasite mammalian host response to infection and genetic variability among species. In this context, the identification and characterization of genes that regulate virulence in Leishmania phenotype is essential to the understanding of the pathogenic mechanisms of host-parasite. Previous studies conducted in the laboratory showed attenuation the virulence due to overexpression of the SL RNA in transfectants of Leishmania (L.) major and Leishmania (V.) braziliensis in a murine model. To understand the phenotypic changes found in Leishmania (L.) major, analyzes gene expression profile allowed to identify genes over- or under-expressed that may individually contribute to the virulence pattern. Six genes were selected which are differentially expressed between the control lines and transfectant. To identify specific genes can partly compensate for the loss of virulence, were analyze the phenotype of infection in vivo susceptible mice. Our results suggest that the studied genes (LmjF. 12.0660- Serine/threonine protein phosphatase (PP2A); LmjF. 36.5640 cycline-like; LmjF. 36.4740 PIG-P (phosphatidyl inositol N-acetylglucosaminyl transferase subuni P) had a negative effect over virulence of Leishmania (L.) major in vivo. Significant differences were observed p=<0.005 between parental; transfectants with vector alone and overexpressor, although growth profile in axenic conditions has not shown any change. All the proteins were detected in the cytoplasm. The results presented here indicate that high levels of these proteins affect negatively the ability of a virulent line to induce lesions when injected in susceptible mice.

Este trabalho investigou a ocorrência de infecções causadas por Plasmodium spp. e Leishmania spp. em primatas neotropicais mantidos em cativeiro e de vida livre, oriundos de regiões impactadas pelo homem nos biomas Mata Atlântica e Amazônia. Os agentes parasitários investigados são responsáveis por processos zoonóticos que acometem humanos, animais domésticos e selvagens, com significativas perdas ambientais e econômicas. Amostras biológicas foram colhidas e submetidas para análise parasitária por testes sorológicos e moleculares. Com relação aos plasmódios, os resultados alcançados sugerem a transmissão de Plasmodium spp. entre os primatas de cativeiro e de vida livre. No estado de São Paulo, nossos dados apontam para a circulação de P. malariae e P. simium, sendo este último encontrado em Callicebus nigrifrons. Na Amazônia, nossos dados indicam a circulação de P. brasilianum. Com relação às leishmanias, demonstramos que circula entre os primatas de cativeiro do estado de São Paulo a L. (L.) chagasi, as L. (L.) amazonenses e as leishmanias do complexo Viannia. Na região amazônica, 5,2% (1/19) foram positivos no PCR de sangue para L. (L.) chagasi. Os resultados deste trabalho podem subsidiar abordagens sanitárias públicas e veterinárias com relação aos primatas neotropicais existentes no estado de São Paulo e nas regiões Amazônicas. / This study investigated the occurrence of infections caused by Plasmodium spp. and Leishmania spp. in neotropical primates. Specimens were obtained both in captivity and in the wild in regions impacted by human activities in the Atlantic Forest and Amazon, Brazil. The pathogens investigated are responsible for significant zoonotic processes that affect humans, domestic and wild animals, with significant economic and environmental losses. The samples were collected and submitted for analysis by serological and molecular tests. The results suggest the transmission of Plasmodium spp. in primates from captive to those in the wild. In São Paulo state our data point for the presence of P. malariae and P. simium, this latter being found in Callicebus nigrifrons. In the Amazon, our data indicate the presence of P. brasilianum. Leishmania (L.) chagasi, L. (L.) amazonensis and the Leishmania Viannia complex circulates among the captive primates in São Paulo state. In the Amazon, 5.2% (1/19) of the primates sampled were detected by PCR as positive for L. (L.) chagasi. The results of this work may improve animal and public health approaches in relation to the neotropical primates in the regions studied.

Leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica e potencialmente fatal causada pelas espécies Leishmania infantum/chagasi e Leishmania donovani. O desenvolvimento da resposta Th1 é classicamente associado à proteção contra esses parasitos, mas também há uma correlação positiva entre a produção de citocinas relacionadas com o padrão Th17 e a proteção contra LV por L. donovani em seres humanos. No entanto, a participação de Th17 durante a infecção por L. infantum/chagasi permanece desconhecida. O objetivo desse estudo foi avaliar a participação de Th17 e citocinas relacionadas, além do mecanismo pelo qual tais células operam durante a resposta imune do hospedeiro contra L. infantum/chagasi. Os resultados mostraram que o parasito é capaz de induzir grandes quantidades de TGF-, IL-1, IL-6 e IL-23 por células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC), citocinas envolvidas na indução e/ou manutenção do perfil Th17. Assim, co-cultivando células do baço de camundongos C57BL/6 naves com BMDCs infectadas com L. infantum/chagasi observou-se uma significativa produção de IL-17 por células T. Esses achados foram confirmados por experimentos in vivo onde se constatou a produção de IL-17 no fígado e no baço de camundongos WT infectados, sendo o pico de produção dessa citocina observado na 4ª e 6ª semanas após a infecção. O padrão de resposta do tipo Th17 é crítica para a imunidade protetora contra L. infantum/chagasi, uma vez que camudongos IL-17R-/-, IL-23p19-/- e IL-6-/- mostraram aumento da carga parasitária nos órgãos alvo da infecção, sendo que a susceptibilidade observada em camundongos IL-17R-/- foi associada com o aumento da produção de IL-10 por linfócitos, sugerindo que a IL-17 regula negativamente a produção de IL-10 levando ao controle da infecção causada pelo parasito. Ainda, a ausência da sinalização via IL-17R gerou uma diminuição da inflamação hepática, decorrente de uma menor capacidade proliferativa de linfócitos frente ao estímulo com conA. De maneira interessante, na ausência de IL-10 houve potencialização na produção de IL-17 por camundongos infectados, e esses foram mais resistentes à infecção, apresentando números reduzidos parasitos no baço e no fígado. Além de promover proteção através da modulação de IL-10, a IL-17 foi capaz de potencializar a produção de NO in vitro e in vivo. Juntos, nossos resultados demonstram que a L. infantum/chagasi é capaz de desencadear o padrão Th17 de resposta imune, o qual promove proteção do hospedeiro durante a infecção. / Visceral leishmaniasis (LV) is a chronic and potentially fatal disease caused by Leishmania donovani and Leishmania infantum/chagasi. The development of Th1 response is classically associated with protection against these parasites, but recent data also show that there is a positive correlation between the Th17-related cytokines production and the protection against LV by L. donovani in humans. However, the role of this CD4+ T cells subset during L. infantum/chagasi infection remains unknown. In this study, our aim was to evaluate the Th17 and related cytokines participation, besides the mechanism by which these cells playing during the L. infantum/chagasi infection.The results showed that the parasite induces high amounts of TGF-, IL-1, IL-6, and IL-23 by bone marrow-derived dendritic cells (BMDC), cytokines involved with Th17 induction and/or maintenance. Accordingly, naïve-C57BL/6 spleenocytes co-cultured with L. infantum/chagasi-infected BMDC produced significant amounts of IL-17 by TCD4+. Interestingly, IL-17 was produced in high amounts in the liver and spleen of WT infected-mice, being peaked at 4th and 6th weeks after infection. The Th17 is critical for protective immunity against L. infantum/chagasi, since that IL-17R-/-, IL-23p19-/- and IL-6-/- infected-mice showed increasing of parasite load associated with enhancement of IL-10 production in IL-17R-/- compared to WT infected-mice. Strictly, in the absence of IL-17 signaling, a smaller inflammatory infiltrate was observed in the liver. Interestingly, IL-17 production was potentiated in IL-10-/- infected-mice, and they were more resistant to infection, showing reduced parasites numbers in the spleen and liver. In addition to promoting protection through the downmodulation of IL-10, IL-17 enhanced the NO production. Together, our results demonstrate that L. infantum/chagasi trigger Th17 response that promotes the host protection during infection.

O presente trabalho visa, através de métodos genético-epidemiológicos, identificarem genes associados à resposta ao antígeno da Leishmania. Utilizando amostras através do teste de Montenegro dos municípios de Monte Negro (RO) e Assis Brasil (AC). Na primeira abordagem foram feitos testes com TaqMan&#210 e a segunda com GWAS, e análises de associação foram feitas utilizando-se o pacote SPSS e o Plink. Não foram encontradas associações com cinco SNPs (MYD88, IL12, IL10, IFNGR1 e NRAMP1). A análise de dados de varredura genômica com filtros, indicou uma região no cromossomo 10 com 3 SNPs próximos que fazem parte de uma região regulatória que com o posterior auxilio do real time não se confirmaram, apesar do ensaio RS11251056 apresentar valores limítrofes, se tornando uma possível indicação para trabalhos futuros e por fim a último teste foi a meta-análise, através do método de Woolf, apresentou resultados indicativos de associação para ensaios encontrados no cromossomo 2 com ZNF638 relacionados a diferenciação celular e também no cromossomo 10 que contem lincRNAs e o gene NGR3, com dois ensaios apresentando valores significativos de p, onde podemos inferir que estas duas regiões podem participar ativamente na diferenciação da resposta ao antígeno da Leishmania. / The present study aims, through genetic-epidemiological methods, to identify genes associated with response to Leishmania antigen. Using samples Montenegro skin test through the municipalities of Monte Negro (RO) and Assis Brazil (AC). In the first approach were tested with TaqMan&#210 and the second GWAS, and association analyzes were performed using SPSS and Plink. No associations were found with five SNPs (MyD88, IL12, IL10, IFNGR1, and NRAMP1). The analysis of genome scan data with filters, indicated a region on chromosome 10 with three nearby SNPs that are part of a regulatory region that later with the help of real time is not confirmed, although the test rs11251056 have borderline values, becoming an possible direction for future work and finally the last test was the meta-analysis by the method of Woolf, presented results indicating the association found in tests for chromosome 2 with ZNF638 related to cell differentiation and also on chromosome 10 that contains lincRNAs and gene NGR3, two runs with a significant p value, where we can infer that these two regions can actively participate in the differentiation of the response to Leishmania antigen.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 5 uppsatser.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Institute of parasitology. Title from title page of PDF (viewed 2009/06/10). Includes bibliographical references.

A leishmaniose é uma infecção causada pelo protozoário do gênero Leishmania, que causa um impacto social e econômico elevado, sendo a segunda maior incidência mundial de doença parasitária. Com o intuito de encontrar novas substâncias ou medicamentos de menor toxicidade e de custos inferiores que poderiam ser utilizados nos tratamentos de casos de infecção e, principalmente em situações de resistência parasitária, tem sido averiguada a possibilidade de utilização de substâncias de origem natural, tanto animal como vegetal, e substâncias sintéticas. Entre as que recentemente apresentaram propriedades biológicas úteis, estão alguns derivados de lignanas dibenzilbutirolactônicas que apresentam significativa ação tripanocida. Desse modo, propusemos avaliar a atividade biológica dessas lignanas em sistema in vitro, sobre formas promastigotas e amastigotas de Leishmania amazonensis. Os compostos utilizados foram (1) 7-O-N,N-dimetiletilamino cubebina, (3) cubebina, (D) 6-6´dinitroinoquinina e (H) hinoquinina. Para avaliação da atividade das substâncias foram utilizadas duas metodologias colorimétricas, MTT e Alamar Blue® e a contagem microscópica em hemocitômetro. Pelos resultados obtidos verificamos que pela contagem microscópica das formas promastigotas, as substâncias (1) 7-O-N,N-dimetiletilamino cubebina, (3) cubebina e (D) 6-6´dinitroinoquinina apresentaram potencial leishmanicida, sendo encontrados os seguintes valores de IC50: (1) = 19,4M; (3) 3,6M; (D) = 15,5M. Entretanto, os resultados obtidos com as mesmas substâncias em formas amastigotas do parasita não demonstraram atividade leishmanicida. Os métodos colorimétricos não apresentaram correspondência com a contagem microscópica, mostrando-se ineficazes para essa classe de substância. / Leishmaniasis is an infection caused by a protozoan parasite of the genus Leishmania, being the second great incidence of parasitic diseases in the world. In the search for new drugs or substances with low costs and low toxicity wich could be used in case of infection and situations of parasite resistance, being evaluated the possibility to use natural or synthetic substances. Dibenzylbutirolactonic lignans are substances with useful biological properties presenting significant trypanocidal effect. In this way we proposed to evaluate the in vitro biological activity of the lignans in of Leishmania amazonensis promastigote and amastigote forms . The compounds used were: (1) 7-O-N,N-dimethylamine cubebine, (3) cubebine, (D) 6-6´dinitroinokinine e (H) hinokinin. For the evaluation of these substances, two colorimetric methods were empoyed: MTT and Alamar Blue® , followed by microscopic counting in haemocytometer. After the results obtained after the couting of promastigote forms, we could verify that the substances (1) 7-O-N,N-dimethylamine cubebine, (3) cubebine, (D) 6-6´dinitroinokinine, and (H) hinokinin showed leishmanicidal potential, being fouded the followed values of IC50: (1) = 19.4M; (3) 3.6M; (D) = 15.5M. On the other hand the results obtained of the same substances in the parasite amastigote forms showed no leishmanicidal effect. The colorimetric methods showed no correspondence with microscopic couting demonstrating inefficacy of this substance class.

Orientadora: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Antonio Carlos Alessi / Resumo: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose de interesse em saúde pública e o cão é o principal reservatório doméstico de Leishmania chagasi. Este protozoário modula a resposta imune do hospedeiro. A citocina MIF favorece a permanência do macrófago no sítio da injúria e protege-o da apoptose. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de MIF nos linfonodos de cães com LV, comparando estes achados com a densidade de macrófagos parasitados nos linfonodos e com o estadiamento clínico dos cães. Neste estudo utilizou-se 33 cães oriundos de Araçatuba, município endêmico para a LV. Os cães foram distribuídos nos grupos assintomático (A), oligossintomático (O) e sintomático (S). As alterações morfológicas dos linfonodos poplíteo, subescapular, ilíaco e mesentérico foram avaliadas quanto ao perfil celular, determinado por escores. A carga parasitária e a imunodetecção de MIF foi feita pela técnica de imuno-histoquímica. Nos cães dos grupos com sinais clínicos (O e S), as reações inflamatória granulomatosa e plasmocitária foram predominantes. No grupo S, a atrofia linfóide predominou e associou-se ao maior número de granulomas e a maior carga parasitária. A densidade de parasitos nos linfonodos periféricos diferiu significativamente do grupo S para os demais grupos (P<0,05). A densidade de macrófagos imunomarcados com MIF foi maior no grupo S e apresentou uma correlação significativa com a carga parasitária no linfonodo poplíteo (P<0,05). Conclui-se que macrófagos são uma das células mais envolvidas na resposta ao parasito. O protozoário utiliza MIF para manter o macrófago no sítio de infecção, favorecendo a sua sobrevivência no hospedeiro / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a zoonotic disease critical for the public health and the dog is the main Leishmania chagasi„s domestic reservoir. This protozoan modulates the immune response of the host. The MIF cytokine facilitates the permanence of the macrophage in the site of injury and protects it from apoptosis. The aim of this study was to evaluate the MIF presence in the lymph nodes of dogs with VL, comparing these findings with the parasite density in the lymph nodes and with the clinical outcome of the dogs. Third three dogs from Araçatuba, an endemic city for VL, were used in this study. Dogs were distributed in the asymptomatic (A), oligosymptomatic (O) and symptomatic (S) groups. The cellular profile of the morphologic changes of the popliteal, subscapular, iliac and mesenteric lymph nodes were evaluated and scored. Immunohistochemistry did the parasite load and the MIF immunodetection technique. Granulomatous and plasmocitary inflammatory reaction predominated in the groups with clinical signs (O and S). In the S group, lymphoid atrophy predominated and was associated with high number of granulomas and high parasite load. Comparing the groups, the density of the parasites in the peripheral lymph nodes was significantly different for the S group (P<0.05). The density of the immunolabeling MIF macrophages was higher in the S group and had a significant positive correlation with the parasite load in the popliteal lymph node (P<0.05). In conclusion, the macrophages are the most involved cells, and the protozoan uses the MIF to keep the macrophage in the infection site, helping its survival in the host / Mestre

Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma doença sistêmica e imunomediada. É provocada pelo protozoário da espécie Leishmania (L.) chagasi, que é transmitido ao homem e aos animais através da picada do vetor infectado, o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. Até o momento não há tratamento que leve a cura parasitológica dos cães e o arsenal de fármacos leishmanicidas é limitado. A resistência aos medicamentos constitui um impedimento importante para o controle de enfermidades e a manifestação de resistência a vários medicamentos é conhecida como MDR ("multidrug resistance"). Um desses mecanismos de resistência a múltiplas drogas é o aumento da expressão da glicoproteína-P (gp-P), um sistema de efluxo de xenobióticos codificadas pelo gene MDR1. Na presente pesquisa, buscou-se avaliar a possibilidade do fenômeno de resistência a múltiplas drogas em cães naturalmente parasitados por Leishmania (L.) chagasi . Foram objetivos do estudo avaliar a expressão da glicoproteína-P (gp-P) e da proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP) por meio da imuno-histoquímica, em amostras fígado, adrenais, rins, baço e pele de cães portadores da LV. Os resultados mostraram que o fígado, rins e adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais gp-P do que a pele e o baço; também que as adrenais expressam significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele e o baço e que este ultimo expressa significativamente (p<0,001) mais MRP do que a pele. Quando se comparou os dois anticorpos verificou-se que o fígado, rins e adrenais expressam porcentagens semelhantes de células imunomarcadas e que o MRP é significativamente (p<0,01) mais reativo na pele que a gp-P. Esses resultados poderiam justificar a redução da carga parasitária na pele que se acompanha durante o tratamento. Todavia, a não obtenção da cura parasitológica poderia ser devido a alta expressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Canine visceral leishmaniasis (LVC) is a systemic immunomediated disease. It is caused by the protozoary from the Leishmania (L.) chagasi species, wich is transmitted to man and animals through the infected vector bite, the phlebotomine sand fly Lutzomyia longipalpis. Until present, there is no treatment leading to a parasitologic cure for dogs and the leishmanicide medicine arsenal is limited. Drug resistance is one of the important impediments for infirmity control and the resistance manifestation to multiple drugs is known as MDR. One of those multiple drugs resistance mechanisms is the increase of the glycoprotein-P (gp-P) expression, a xenobiotic efflux system encoded by the MDR1 gene. At the present research, it aimed to evaluate the possibility of resistance phenomenon the multiple drugs in dogs naturally parasited by Leishmania (L.) chagasi. The objectives of this study was to evaluate glycoprotein-P (gp-P) and multiple drugs resistance protein (MRP) immunohistochemical expressions in LVC infected dogs' liver, adrenals, kidneys, spleen and skin samples. Results showed that liver, kidneys and adrenals express significantly (p<0,001) more gp-P than skin and spleen; also, adrenals express significantly (p<0,001) more MRP than skin and spleen and that spleen express significantly (p<0,001) more MRP than skin. When the two antibodies were compared, it was verified that liver, kidneys and adrenals express similar percentages of immunomarked cells and that MRP is significantly more reactive in skin than gp-P. These results could justify the parasitary load reduction in skin during treatment. Nevertheless, the lack of parasitologic cure could be due to the high pg-P and MRP1 expressions in liver, adrenals and kidneys, which could increase the pharmac efflux at these organs / Orientadora: Mirela Tinucci Costa / Coorientador: Leucio Câmara Alves / Banca: Julieta Rodini Engracia de Moraes / Banca: Maria Cecilia Rui Luvizotto / Mestre

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:37:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao completa - Lenilton Silveira.pdf: 2646876 bytes, checksum: fbad76d9c78a2517359d01fc6fc96b45 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:37:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao completa - Lenilton Silveira.pdf: 2646876 bytes, checksum: fbad76d9c78a2517359d01fc6fc96b45 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Neste estudo nós realizamos um monitoramento cinético, ex vivo, da resposta imune do hospedeiro, induzida durante infecção murina por L. (L.) amazonensis. Fêmeas de camundongos BALB/c foram inoculadas subcutaneamente no coxim plantar esquerdo com 106 promastigotas de fase estacionária e o progresso da infecção foi monitorado por medição da área de lesão. Os linfócitos dos linfonodos poplíteos drenantes da lesão (LNs) foram analisados por citometria de fluxo (FACS - fluorescence-activated cell sorting) e por ressonância plasmônica de superfície (SPR - surface plasmon resonance). Os resultados de FACS indicaram que o perfil de linfócitos é definido na primeira semana de infecção e caracterizado por elevados níveis de linfócitos B e por uma diminuição de linfócitos T. O percentual de linfócitos B foi três vezes maior quando comparado com o dos camundongos não infectados e os linfócitos T eram 1,5 vezes mais baixo. Estes valores permaneceram constantes ao longo da infecção até o ultimo ponto analisado. Foi observado um discreto aumento (0.3 a 0.5) na relação CD8+/CD4+ nos animais infectados, enquanto nos não infectados esta relação permaneceu em torno de 0.35, até o último dia do estudo. Adicionalmente, nós realizamos ensaios de detecção de linfócitos T CD8+ dos LNs, em tempo real, por SPR, utilizando moléculas H-2 Ld:Ig ligadas à peptídeos da região COOH-terminal de cisteína-proteinase B de L. (L.) amazonensis (P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5= EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9= MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). Os peptídeos testados indicaram valores de constante de associação (0.16x107 – 22.0x107) e dissociação (0.047-0.123) favoráveis a formar complexos com os dímeros H-2 Ld em pH neutro, com valores de energia livre de Gibbs < 0. De forma geral, a ligação das células ao complexo H-2 Ld:Ig/peptídeo, mostrou uma resposta (RU - Response unit) de dissociação maior em células de animais infectados (113 RU – 465 RU) que nas dos animais não infectados (71 RU – 304 RU). A resposta aos complexos H-2 Ld:Ig/peptídeo revelou diferenças de reconhecimento nas semanas avaliadas, como alta resposta ao P1.10 (227 RU) na 3ª semana e ausência de resposta ao P1.7 na 16ª semana. Em uma mesma semana de análise, vimos que o nível de reconhecimento dos peptídeos difere entre eles, uns apresentando alto valor de RU e outros um valor mais baixo: 3ª (P1.10>P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4ª (P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6ª (P6.4>P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12ª (P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18ª semana (P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Embora, apenas, dois peptídeos tenham sido testados na 1ª semana, a maior resposta foi relacionada ao P1.7 (161 RU), seguido do P1.9 (115 RU). Os dados gerados indicaram uma flutuação na população dos linfócitos T e B, assim como o envolvimento de linfócitos T CD8+ direcionados a peptídeos da região COOH-terminal da CPB, ao longo da infecção / In this study, we performed a kinetic ex vivo monitoring of host immune responses during murine infection with Leishmania (Leishmania) amazonensis. Female BALB/c mice were injected subcutaneously in the left hind footpad with 106 promastigotes in stationary growth phase and the progression of infection was monitored by measuring lesion area expansion. Lymphocytes from lesion draining popliteal lymph nodes (LNs) were analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and surface plasmon resonance (SPR). FACS results indicated that the lymphocytes profile is defined in the first week post infection and was characterized by high levels of B cells and by a decrease in T cell numbers. The percentage of B lymphocytes was three times higher when compared to the non-infected mice and T lymphocytes were up to 1.5 times lower. These values remained constant throughout infection until the last point analyzed. It was observed a slight increase (0.3 to 0.5) in the CD8+/CD4+ ratio in the infected mice, whereas in the not infected group this ratio remained around 0.35, until the last assessed infection day. Additionally, we have performed an assay to detect CD8+ T lymphocytes from LNs in real time, by SPR, utilizing H-2 Ld:Ig molecules bound to peptides derived from the COOH-terminal region of cysteine-proteinase B from L. (L.) amazonensis (P6.3= EFCLGGGL, P6.4= CLGGGLCL, P6.5= EFCLGGGLC, P1.7= VMVEQVICF, P1.9= MVEQVICFD, P1.10= VEQVICFD). The peptides tested presented values of association (0.16x107 – 22.0x107) and dissociation constant (0.047-0.123) favorable to form complexes with H-2 Ld at neutral pH, with values of Gibbs free energy < 0. In general, the binding of cells to the H-2 Ld:Ig/peptide complexes showed a response unit (RU) of dissociation higher in cell preparations from infected mice (113 RU - 465 RU) than the cells from uninfected mice (71 RU – 304 RU). The recognition response to the complex H-2 Ld:Ig/peptide were assessed at different weeks as high response to P1.10 (227 RU) at 3th week and absence of response to P1.7 at 16th week. In the same week of analysis, we found that the level of recognition of peptides differs among them, some presenting a high value of RU and others a lower value: 3th (P1.10 >P6.3>P1.9>P1.7>P6.4>P6.5), 4th (P6.3.>P6.5>P1.9>P6.4>P1.7), 6th (P6.4> P1.10>P1.9>P1.7>P6.5), 12th (P1.9.>P6.3>P1.10>P6.5), 18th week (P6.4=P1.9>P6.3>P1.10>P1.7). Although only two peptides were tested at 1th week, the highest response was related to P1.7 (165 RU), followed by P1.9 (115 RU). Generated data indicated a fluctuation in the population of T and B lymphocytes, as well as the involvement of CD8+ T cells directed to peptides of the COOH-terminal region of the CPB, throughout the infection