Perdas devido à natimortalidade, mumificação fetal, abortamentos e morte embrionária são responsáveis por uma considerável queda no desempenho da indústria suinícola no Brasil e no mundo. Dentre os agentes mais freqüentemente descritos como causadores de falhas reprodutivas em suínos pode-se citar o Parvovírus suíno, Leptospira spp. O diagnóstico das causas infecciosas de mortalidade embrionária e fetal torna-se muitas vezes inviável pelo estado de autólise do material ou dificuldades inerentes às características de crescimento do vírus ou bactéria envolvido. O presente estudo teve por objetivo avaliar os resultados obtidos no período de oito anos de detecção de Parvovirus suíno e Leptospira spp. em falhas reprodutivas e discutir alguns aspectos relativos ao diagnóstico destas infecções. Foram avaliados 1901 fetos, sendo coletadas de cada animal, uma amostra de pool de órgãos e uma de conteúdo gástrico, perfazendo um total de 3642 análises. Observou-se uma freqüência de 27,6% dos fetos positivos para Parvovirus suíno, 19,8% positivos para Leptospira spp e 1,1% positivos para os dois agentes em associação. Dentre as 339 granjas avaliadas em oito Estados Brasileiros, 48,5% foram positivas para um ou ambos agentes pesquisados. Avaliou-se a freqüência de fetos positivos em casos de abortamento, natimortalidade e mumificação fetal e comparou-se a eficiência da pesquisa dos agentes em amostras de órgãos, conteúdo gástrico e em ambos. Os resultados obtidos indicam a grande importância destes agentes infecciosos nos quadros de falha reprodutiva em granjas de suínos no Brasil, apesar da ampla utilização de vacinas contra os mesmos. . / Losses due to stillbirths, mummification, embryonic death and abortions account for a considerable drop in performance of the pig industry in Brazil and the world. Among the agents most frequently described as causes of reproductive failure in pigs may be mentioned the swine parvovirus, Leptospira spp. The diagnosis of infectious causes of fetal and embryonic mortality it is often impossible for the state of autolysis of the material or the difficulties inherent growth characteristics of the virus or bacteria involved. Present study has the goal evaluate the results obtained in eight year period of Parvovirus and Leptospira spp. detection in reproductive failure and discuss some aspects related to diagnosis of these infections. A total of 1901 fetuses were examined, and from each animal a sample of different tissues and a sample of gastric contents were collected, representing 3642 analysis. A frequency of 27.6% of Parvovirus positive fetuses were observed, followed by 19.8% of Leptospira spp. positive fetuses, and 1.1% positive to both agents. Among 339 swine herds evaluated from eight Brazilian States, 48,5% were positive to one or both infectious agents. The frequency of positive fetuses in abortion, stillbirths and mummification, and the efficiency of virus and bacterial detection from organs and gastric contents were compared. The results obtained indicate the high importance of these infectious agents in reproductive failure in Brazilian swine herds, beside the large utilization of commercial vaccines against then.

La leptospirosis es una zoonosis bacteriana de gran impacto en la salud pública a nivel mundial. Los perros y otros animales, pueden infectarse, sufrir la enfermedad, constituyendo así, un factor importante en la diseminación de la bacteria hacia humanos. La infección es causada por cualquiera de los 250 serovares patógenos, de los 25 serogrupos de Leptospira spp. El estudio tuvo como objetivo identificar a los serogrupos de Leptospira spp. presentes en caninos domésticos. Para ello, se obtuvieron 305 muestras de suero sanguíneo, de perros con diagnóstico clínico presuntivo de Leptospirosis, mayores de 6 meses de edad, no vacunados o con un tiempo mayor a seis meses desde la última vacunación contra Leptospirosis. Las muestras fueron remitidas por Médicos Veterinarios al Laboratorio de Microbiología – Sección Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, provenientes de 31 distritos de Lima Metropolitana. Se realizó la Prueba de Microaglutinación (MAT), estableciéndose títulos ≥1/100 de serorreactividad como seropositivos, utilizando cepas de referencia de los 25 serogrupos, incluyendo al nuevo serogrupo Iquitos serovar varillal 10, aislado y reportado en casos humanos en Perú. Se detectaron 177 seropositivos (58.03%), de los cuales 31 (10.16%) fueron coaglutinaciones. Los serogrupos de mayor frecuencia fueron: Iquitos (46/305; 15.08%), Tarassovi (37/305; 12.13%), Canicola (37/305; 12.13%), Australis (14/305; 4.59%), Icterohaemorrhagiae (13/305; 4.26%), Pomona (12/305; 3.93%), Mini (10/305; 3.28%) y Ballum (8/305; 2.62%). No se identificó serorreactores a los serugrupos Bataviae, Celledoni, Hebdomadis, Lousiana, Panama, Ranarum, Sarmin. Palabras claves: Perros, leptospirosis, leptospira, MAT, serovar, serogrupo / Leptospirosis is an important bacterial zoonosis on worldwide. Dogs and other animals can be infected and suffered the disease, they constituting an important role in the spread of the bacteria to humans. The infection is caused by any of the 250 pathogenic serovars, grouped in 25 serogroups of Leptospira spp. The aim of this study was to identify the serogroups of Leptospira spp. circulating in domestic dogs. For this, 305 serum samples were obtained from dogs, who had a presumptive clinical diagnosis of Leptospirosis, over 6 months old, unvaccinated or more than six months since the last vaccination against Leptospirosis, The samples were submitted by veterinarians to Microbiology Lab - Bacteriology, Faculty of Veterinary Medicine of Universidad Nacional Mayor de San Marcos, from 31 districts of Lima. The microagglutination test (MAT) was performed, establishing seroreactivity titles ≥ 1/100 as seropositive using reference strains of the 25 serogroups, including the new serogroup Iquitos, serovar Varillal, Var 10 strain, isolated and reported human outbreaks in Peru. 177 seropositive samples (58.03%) were detected, 31 of them (10.16%) were co-agglutinations. Seropositive reacted against 18 serogroups, the most frequent were: Iquitos (46/305; 15.08%), Tarassovi (37/305; 12.13%), Canicola (37/305; 12.13%), Australis (14/305; 4.59%), Icterohaemorrhagiae (13/305; 4.26%), Pomona (12/305; 3.93%), Mini (10/305; 3.28%) and Ballum (8/305; 2.62%). There were no seroreactors to serogroups: Bataviae, Celledoni, Hebdomadis, Lousiana, Panama, Ranarum, and Sarmin. Keywords: Dog, leptospirosis, leptospira, MAT, serovar, serogroup.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Resumo: A leptospirose é uma zoonose de grande importância em saúde pública, considerada antropozoonótica com alta incidência e prevalência, negligenciada e de caráter ocupacional. Funcionários da linha de produção e manipuladores de sangue e vísceras em frigoríficos, podem infectar-se pelo contato direto com estes produtos, assim como os trabalhadores rurais nas propriedades, pelo contato e exposição direta a fômites e secreções destes animais. Esta enfermidade representa perdas econômicas importantes nos rebanhos, pois pode ocasionar abortos e fetos natimortos e, na sua forma subclínica, é comumente assintomática em bovinos. Amostras biológicas de sangue, fígado e rins de 144 bovinos abatidos em frigorífico localizado no centro-oeste paulista foram utilizadas para o diagnóstico da leptospirose com as técnicas de Soroaglutinação Microscópica (SAM) e Reação em Cadeia da Polimerase convencional (cPCR) para Leptospira spp. Os resultados sorológicos demostraram 71/144 (49,3%) animais reagentes à SAM para os seguintes sorovares: Djasiman (56,3%), Hardjoprajtino (40,8%), HardjoCTG (12,7%), Hardjo (11,3%), Hardjobovis (11,3%), Pyrogenes (9,8%), Wollfi (8,4%), Castellonis (7,0%), Pomona (4,2%), Grippotyphosa (1,4%), Hardjomini (1,4%), Icterohaemorrhagiae (1,4%) e Bratislava (1,4%). Os resultados moleculares evidenciaram a presença de DNA de Leptospira spp. em 25 animais (17,4%), sendo em rins de 21 animais, em fígado de cinco animais, em fígado e rins de dois animais e em sangue, de um (01)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leptospirosis is a zoonosis of great importance in public health, considered anthropozoonotic with high incidence and prevalence, neglected and of occupational character. Production line workers and handlers of blood and viscera in slaughterhouses can be infected by direct contact with these products, as well as rural workers on the farms, by contact and direct exposure to fomites and secretions of these animals. This disease represents important economic losses in the herds, since it can cause abortions and stillborn fetuses and, in its subclinical form, is commonly asymptomatic in cattle. Biological blood, liver and kidneys samples from 144 cattle slaughtered in a slaughterhouse located in central-western São Paulo were used for the diagnosis of leptospirosis using the Microscopic Agglutination Test (MAT) and Conventional Polymerase Chain Reaction (cPCR) techniques for Leptospira spp. The serological results showed 71/144 (49.3%) animals reactive to MAT for the following serovars: Djasiman (56.3%), Hardjoprajtin (40.8%), HardjoCTG (12.7%), Hardjo 3%), Hardjobovis (11.3%), Pyrogenes (9.8%), Wollfi (8.4%), Castellonis (7.0%), Pomona (4.2%), Grippotyphosa, Hardjomini (1.4%), Ichterohaemorrhagiae (1.4%) and Bratislava (1.4%). Molecular results evidenced the presence of Leptospira spp. in 25 animals (17.4%): the kidneys of 21 animals, in the liver of five animals, in the liver and kidneys of two animals and in blood of one (01) animal. These results indicate an alert to the sani... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A leptospirose é uma zoonose, amplamente difundida pelo mundo, causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais de animais silvestres e domésticos. A transmissão ocorre, principalmente, pelo contato direto com água e solo contaminados com a urina de animais infectados que podem ser clinicamente assintomáticos. As leptospiras patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através da penetração da pele lesada ou mucosas da boca, narina e olhos. Logo após ultrapassar as superfícies de contato, as bactérias chegam rapidamente à corrente sanguínea e espalham-se para todos os órgãos causando lesões, principalmente, no fígado e rins onde produzem hemorragia e necrose tecidual. Após a entrada no hospedeiro, a progressão da infecção envolve a adesão das bactérias às células eucarióticas e às proteínas de matriz extracelular seguida pela invasão aos tecidos. Estudos recentes demonstraram que as leptospiras são capazes de se translocarem através das monocamadas celulares, o que poderia ser um mecanismo de evasão do sistema imune e também facilitaria a entrada e saída da corrente sanguínea para infectar órgãos-alvo. O mecanismo envolvido na invasão do patógeno através das barreiras extracelulares não está bem elucidado. Enzimas capazes de degradar proteínas da matriz extracelular poderiam contribuir com a motilidade e quimiotaxia das bactérias durante a invasão. Bactérias patogênicas sintetizam e secretam diferentes tipos de proteases, que atuam degradando colágeno e glicoproteínas entre outras proteínas do hospedeiro. Recentemente, um estudo, utilizando gelatina e caseína como substratos e lisado bacteriano, mostrou haver uma variedade de proteases em Leptospira spp. Análises do genoma indicam a presença de vários genes que codificam prováveis proteases. A comprovação experimental da existência e a caracterização funcional destas proteínas poderão contribuir no entendimento da patogenia da leptospirose. Neste sentido, este trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e caracterização funcional de uma provável colagenase (ColA) de L.interrogans sorovar Copenhageni. As sequências codificantes do domínio de colagenase 1 (D1), do domínio de colagenase 2 (D2) e de ambos os domínios (Full) da ColA foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico de Leptospira e clonadas no vetor de expressão pAE. Os fragmentos D1, D2 e Full da ColA foram expressos em E. coli BL21 - SI e purificados a partir das frações insolúveis por cromatografia de afinidade a níquel. Os fragmentos recombinantes purificados foram utilizados na obtenção dos antissoros policlonais, e as atividades enzimáticas de cada um foram avaliadas. Os antissoros policlonais produzidos em coelho apresentaram elevados níveis de anticorpos detectados por ELISA. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína ColA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. As proteínas Full e D2 apresentaram atividade catalítica sobre o colágeno desnaturado e sobre peptídeo sintético e atividade hemorrágica em camundongos. Estes resultados indicam que ColA é provavelmente uma proteína de leptospira envolvidas na invasão de tecidos do hospedeiro. / Leptospirosis is a zoonosis widespread throughout the world, caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira, which colonize the renal tubules of wild and domestic animals. Transmission occurs mainly through direct contact with water and soil contaminated with urine of infected animals that may be clinically asymptomatic. Pathogenic leptospires invade host tissues by penetrating damaged skin or the mucous membranes of the mouth, nostrils and eyes. Soon after passing the contact surfaces, leptospires come quickly into the bloodstream and spread to all organs causing damage mainly in the liver and kidneys where they produce hemorrhage and tissue necrosis after entering the host, the progression of the infection involves the adhesion of bacteria to eukaryotic cells and extracellular matrix proteins followed by invasion of tissues. Recent studies have shown that leptospires are able to translocate across cell monolayers, which could be a mechanism for evasion of the immune system and also facilitate the entry and exit from the bloodstream to infect target organs. The mechanism involved in pathogen invasion through extracellular barriers is not well elucidated. Enzymes capable of degrading extracellular matrix proteins could contribute to motility and chemotaxis of bacteria during the invasion. Pathogenic bacteria synthesize and secrete different types of proteases that degrade collagen and glycoproteins among other host proteins. Recently, a study using gelatin and casein as substrates and bacterial lysate showed a variety of proteases in Leptospira spp. Analysis of the genome indicate the presence of several genes encoding probable protease. The experimental proof of the existence and functional characterization of these proteins may contribute to the understanding of the pathogenesis of leptospirosis. In this sense, this work aimed the cloning, expression and functional characterization of a probable collagenase (ColA) from L.interrogans serovar Copenhageni. Coding sequences of the collagenase domain 1 (D1), collagenase domain 2 (D2), and both domains (Full) of the ColA gene were amplified by PCR from genomic Leptospira DNA and cloned into the pAE expression vector. The D1, D2 and Full fragments of ColA protein were expressed in E. coli BL21-SI and purified from the insoluble fractions by nickel affinity chromatography. The purified fragments were used to obtain the polyclonal antiserum, and their enzymatic activities were evaluated by zymography. Rabbit polyclonal antiserum against the recombinant protein fragments were produced with a high antibody level detected by ELISA. Western-blotting experiments demonstrated the presence of ColA protein in different pathogenic serovars of Leptospira. The Full and D2 proteins showed catalytic activity on denatured collagen and synthetic peptide and hemorrhagic activity in mice. These results indicated that ColA is probably a leptospiral protein involved in invasion of host tissues.

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Em hospedeiros suscetíveis, as leptospiras patogênicas se espalham no organismo resultando em uma doença febril com icterícia, seguida de falência renal, hepática e cardíaca, que com frequência leva à morte. A vacinação é a abordagem profilática mais efetiva contra a leptospirose. A bacterina é a única vacina licenciada, sendo usada em todo o mundo para algumas espécies animais, enquanto o uso em humanos é permitido em apenas alguns poucos países. A razão para isso é a resposta imune de curta duração e sorovar-específica induzida por essa vacina, que apresenta ainda, efeitos colaterais adversos. Vários esforços para desenvolver uma vacina recombinante protetora contra diferentes sorovares e com resposta de longa duração, falharam. O pouco conhecimento sobre os fatores de virulência e a patogênese de Leptospira spp. são as principais razões para o lento avanço na descoberta de antígenos protetores. Esta tese apresenta várias abordagens diferentes de estudos em leptospirose na tentativa de acrescentar ao conhecimento acerca da doença e seu agente etiológico: O cenário atual de desenvolvimento de novas vacinas contra a leptospirose é devidamente revisado. Uma nova cepa virulenta de L. interrogans isolada de um cão com leptospirose aguda foi caracterizada e pode ser utilizada em experimentos de infecção em modelo animal, ou, ainda, para o entendimento de mecanismos de virulência. Foi desenvolvido um protocolo para obtenção de leptospiras adaptadas ao hospedeiro, através do cultivo destes organismos dentro de Câmaras de Membrana de Diálise (DMC) implantadas na cavidade peritoneal de ratos. Este protocolo foi utilizado para identificar, a partir do sequenciamento de RNA total (RNA-seq), genes relacionados com as mudanças sofridas pela Leptospira spp. para se adaptar ao hospedeiro durante a infecção, novos fatores de virulência e seleção de alvos para mutagênese. Finalmente, uma via alternativa para infecção de hamsters por L. interrogans virulenta foi descrita, mimetizando a entrada natural pela via transcutânea de leptospiras no hospedeiro. Esta metodologia pode substituir a injeção intraperitoneal de leptospiras. Juntos, estes achados representam um progresso substancial no campo de estudo da leptospirose e possivelmente irão contribuir para a descoberta futura de antígenos protetores para utilização no desenvolvimento de vacinas aperfeiçoadas contra leptospirose. / Leptospirosis is a widespread neglected tropical zoonotic disease responsible for at least 873,000 human cases and 49,000 deaths each year globally. The causative agent belongs to the genus Leptospira, a unique and genetically and antigenically diverse group of spirochetes divided into nine pathogenic species, 24 serogroups and more than 250 serovars. Leptospires can infect virtually any mammalian species. Rodents can carry spirochetes in their renal tubules and shed large numbers in their urine, the main source of leptospires for new infections. In susceptible hosts, pathogenic leptospires spread throughout the body, resulting in a febrile icteric illness, followed by renal, hepatic and cardiac failure that can lead to death. Vaccination is the most effective approach for leptospirosis prophylaxis. Bacterins are the only licensed vaccines, and are used worldwide in certain animals, however, human vaccination is approved in only a few countries. The reason for this is that the vaccine induces a serovar specific, short-term immune response that has several adverse side effects. Efforts to develop a new recombinant vaccine with long-term, cross-protective immunity have failed. The lack of knowledge of Leptospira spp. virulence factors and pathogenesis is the main reason for the slow progress in the discovery of protective antigens. This thesis describes several different approaches in leptospirosis studies in an attempt to improve understanding of the disease and its causative agent: The current scenario of leptospirosis vaccine development is comprehensively reviewed. A new L. interrogans virulent strain isolated from a dog presenting with acute leptospirosis was characterized and can be used for experimental infections in animal models, or for understanding virulence mechanisms. A protocol to obtain host-adapted leptospires cultivated within Dialysis Membrane Chambers (DMC) implanted in rat peritoneum was developed. This protocol was applied to the identification, by total RNA sequencing (RNA-seq), of several genes related to the changes that leptospires undergo during adaptation to infection, new virulence determinants and selection of targets for mutagenesis. Finally, an alternative route of infection of hamsters by virulent L. interrogans is described, mimicking the natural transcutaneous entry of leptospires into the host. This methodology could replace the intraperitoneal injection of leptospires. Together, these findings represent substantial progress in the field of leptospirosis, possibly contributing to the future discovery of protective antigens for the development of improved vaccines against leptospirosis.

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Banca: Márcia Marinho / Banca: Fábio Hiroto Shimabukuro / Resumo: A leptospirose é uma enfermidade infecto-contagiosa causada por diversas cepas da bactéria Leptospira interrogans, as quais infectam animais domésticos, silvestres e o homem. Os animais silvestres podem exercer papel fundamental na epidemiologia da doença, devido a grande disseminação de leptospiras para o meio ambiente e a possibilidade de infecção entre os animais e o homem, constituindo-se, portanto, em uma importante zoonose. Quando esses animais vivem em cativeiro, como em zoológicos, a infecção e a disseminação de patógenos podem ocorrer entre os animais silvestres do próprio zoológico, animais sinantrópicos, funcionários e o público visitante. Com o intuito de conhecer melhor a ocorrência e epidemiologia da leptospirose em animais silvestres e também em roedores sinantrópicos comensais, que co-habitam o local, foi realizado um estudo com animais em cativeiro e de vida livre, procedentes do Centro de Conservação da Fauna Silvestre de Ilha Solteira- SP (CCFS). Foram colhidas amostras sanguíneas de 41 animais em cativeiro e de 59 animais de vida livre, assim como 13 amostras de rim e fígado de ratos. As técnicas diagnósticas utilizadas foram a Soroaglutinação Microscópica (SAM), Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leptospira spp. e cultivo de rim e fígado de ratos em meio de Fletcher. Pela SAM obteve-se 89 (89%) amostras positivas para um ou mais sorovares de Leptospira spp.; com prevalência do sorovar Andamana. Para a pesquisa do agente em fragmentos de fígado e rim dos ratos, 13 amostras de cada tecido foram cultivadas em meio de Fletcher, apresentando sete (53,8%) amostras positivas, sendo três amostras de rim e quatro de fígado e todos os animais com sorologia positiva. Pela técnica de PCR a partir do sangue dos animais de vida livre e em cativeiro 38 animais (38%) foram positivos para Leptospira spp., a partir de órgãos (rim e fígado) dos roedores sinantrópicos ... / Abstract: Leptospirosis is a disease caused by various strains of the spirochete bacterium Leptospira interrogans, which can infect domestic and wildlife animals, as well humans. Wild animals may play a key role in the epidemiology of the disease, due to the large spread of leptospires into the environment and the possibility of infection between animals and man, becoming therefore an important zoonosis. When these animals live in captivity in zoos, the infection and spread of pathogens can occur between the wild animals of the zoo itself, synanthropic animals, employees and visitors. In order to better understand the occurrence and epidemiology of leptospirosis in wild animals and in synanthropic rodents, which co-inhabit the place, a study was conducted with free-living animals and in captivity, found in Wild Fauna Conservation Center from Ilha Solteira-SP. Blood samples were collected from 41 animals in captivity and 59 free-living animals, as well as 13 samples of kidney and liver of rats. The diagnostic techniques used were the Microscopic Agglutination Test (MAT), the Polymerase Chain Reaction (PCR) and cultivation in Fletcher medium. MAT was positive in 89 (89%) samples for one or more serovars of Leptospira spp., with prevalence of serovar Andamana. For the research of agent into fragments of liver and kidney of rodents, 13 samples of each fragment were grown in Fletcher medium, with seven (53,8%) positive samples (three kidney samples and four liver samples). All rats were reactive by MAT. Related to PCR from the blood of free-living animals and in captivity, 38 animals (38%) were positive for Leptospira spp.; nine rodents (69,2%) presented positive fragments at PCR and four animals (30,8%) presented positive samples of the culture of the fragments at PCR for Leptospira spp. According to the results, we observed the occurrence of infection among the animals, needing the adoption of prophylactic measures to control this zoonosis in this place / Mestre

La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de importancia mundial en salud pública. La enfermedad en humanos está asociada a la presencia de la bacteria Leptospira spp. en los animales, en las zonas urbanas los animales domésticos como el perro juegan un rol importante en la transmisión de la enfermedad. Los caninos domésticos pueden desarrollar la enfermedad o ser portadores asintomáticos que eliminan la bacteria en grandes cantidades en la orina. El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar e implementar una técnica de PCR en tiempo real con sondas TaqMan para detectar la presencia de leptospiras patógenas en muestras de orina de caninos domésticos infectadas experimentalmente con cepas patrón de Leptospira spp. Las muestras de orina fueron obtenidas de un perro clínicamente sano y negativo a la prueba de microaglutinación (MAT). Se utilizaron los cebadores Lepto R y Lepto F, específicos para Leptospira spp., y una sonda TaqMan Lepto probe, que amplifican e hibridan respectivamente una porción del gen rrs, capaces de diferenciar entre especies patógenas y no patógenas de leptospira. Se estandarizó el protocolo de PCR en 35 ciclos, con un proceso de desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, seguida por una desnaturalización a 95°C por 15 segundos y finalmente el alineamiento y extensión en un solo paso a 60°C por 1 minuto. Los valores de Ct determinados durante la estandarización de la PCR, estuvieron en un rango de 12.53 a 18.21 para las 25 cepas patógenas de Leptospira spp., las cepas saprófitas y otros géneros bacterianos no dieron productos específicos. El estándar fue detectado hasta una dilución de 10² con un Ct de 29.98 a una eficiencia de 1.13 y con un coeficiente de correlación (R²) de 0.993. Se detectó ADN en las muestras de orina infectada desde la dilución de 10⁷ leptospiras/ml con un valor de Ct de 17.54 hasta una mínima dilución de 10² leptospiras/ml con un valor de Ct de 29.87. Palabras claves: caninos domésticos, PCR en tiempo real, sondas TaqMan, Leptospira spp., Leptospirosis, orina / Leptospirosis is a zoonotic disease of global importance in public health. The disease in humans is associated with the presence of the bacteria Leptospira spp. in animals; in urban areas domestic animals such as dogs play an important role in the transmission of the disease. Domestic canines infected with the bacteria can develop the disease or be asymptomatic carriers, eliminating bacteria in large quantities in their urine. This study aimed to standardize and implement a TaqMan Real-Time PCR assay to detect the presence of pathogenic leptospires in urine samples of domestic canines experimentally infected with standard strains of Leptospira spp. Urine samples were obtained from a clinically healthy dog, negative to the Microagglutination Test (MAT). The primers Lepto R and Lepto F specific for Leptospira spp. and a Lepto TaqMan probe were used, which amplified and hybridized respectively a portion of the rrs gene, differentiating between pathogenic and nonpathogenic species of Leptospira. Thermocycling program was standardized with 35 cycles of 95° C for 15 seconds and 60° C for 1 minute with an initial cycle of 95° C for 5 minutes. Ct values determined during the standardization of PCR were from 12.53 to 18.21 for the 25 pathogenic strains of Leptospira spp. In contrast saprophytic leptospira and other species of bacteria did not produce any specific Ct value. The standard strain was detected up to a dilution of 10² with a Ct value of 29.98 at an efficiency of 1.13 and a correlation coefficient (R²) of 0.993. DNA was detected in infected urine samples from the dilution of 10⁷ leptospires/ml with a Ct value of 17.54 to a minimum dilution of 10² leptospires/ml with a Ct value of 29.87. Keywords: domestic canines, real time PCR, TaqMan probe, Leptospira spp., Leptospirosis, urine / Tesis

Indaga sobre la presencia de anticuerpos contra Leptospira spp. en primates de vida libre del género Saguinus de la Estación Biológica Los Amigos (Madre de Dios, Perú). Se colectaron 56 muestras de sangre, de las cuales 26 pertenecían a Saguinus fuscicollis y 30 a Saguinus imperator, las cuales fueron evaluadas a través de la prueba de Microaglutinación en campo oscuro (MAT), enfrentándolas a 24 serovares agrupados en 21 serogrupos de Leptospira spp. El 51.8% (29/56) fueron positivas para al menos un serogrupo evaluado, siendo los serogrupos más frecuentes Iquitos 39.3% (22/56) e Icterohaemorrhagiae 14.28% (8/56) y los menos frecuentes Pomona 3.57% (2/56) y Autumnalis 1.78% (1/56). Además, 3 muestras reaccionaron frente a más de un serogrupo, una de ellas frente a los serogrupos Iquitos e Icterohaemorrhagiae, otra muestra contra Iquitos, Icterohaemorrhagiae y Pomona, y una tercera contra Icterohaemorrhagiae y Autumnalis. Estos resultados indican que existe exposición natural a Leptospira spp. en la población de Saguinus en el área estudiada. Consecuentemente, se podría considerar a estos primates como una posible fuente de transmisión hacia otros animales y a los humanos. / Tesis

Fueron estudiados 255 perros de áreas suburbana y rural de Azul mediante la técnica de microaglutinación con antígeno vivo (MAT). Se encontraron 98 perros sero-reactores (38,43) correspondiendo la mayor participación a las serovariedades Icterohaemorrhagiae (31), Hardjoprajitmo (26), Ballum (14) y Pyrogenes (12). / A serological study on dogs from suburban and rural areas of Azul was carried out, in order to know which serovar of leptospires those animals have. Have been tested 255 samples for the microagglutination test with living antigen (MAT). 98 sera proved to be positive (38,43), most of athem belonging to Icterohaemorrhagiae (31), Hardjoprajitmo (26), Ballum (14) and Pyrogenes (12)

The study of leptospiral pathogenesis is hampered by the lack of efficient mutagenesis methodologies. Thus research has focused on alternative approaches including genome sequencing, comparative genomics, transcriptomics and proteomics. In this thesis a comparative proteomic approach was used to identify leptospiral proteins with a potential role in the leptospiral infection process. Identification of proteins was followed by characterization of target proteins with potential roles in the infection process and ultimately led to the identification of a novel leptospiral virulence factor. Specifically, comparative proteomics using isobaric tags for relative and absolute quantitation complemented with two-dimensional gel electrophoresis were used for mass spectrometry-based protein identification and quantitation. These methodologies were utilised to identify and quantitate leptospiral proteins altered in expression in response to growth media limited in iron supply and/or supplemented with serum. These conditions were designed to mimic a subset of variables encountered by the bacteria within the host. These experiments led to the identification of five proteins with potentially novel roles in the leptospiral infection process. One of these proteins was further characterized as a periplasmic catalase, KatE. Using insertion mutagenesis it was demonstrated that KatE enhances extracellular H2O2 resistance and is required for virulence in guinea pigs and hamsters. Proteomic analyses also led to the identification of glutamic acid methylation of a protein that was further characterised to be surface exposed and expressed during leptospiral colonization of hamster liver and kidneys. This was the first description of glutamic acid methylation of a surface exposed protein in Leptospira. / Graduate