Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KeniaSMA_DISSERT.pdf: 1150269 bytes, checksum: 54d277c76ed42d8d5e0470e502ceca2f (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / This study was aimed at researching anti-Leptospira spp. and anti-Brucella spp. agglutinins in cattle slaughtered in public slaughterhouses in the State of Rio Grande do Norte, as well as confirm the presence of these agents through PCR in the ovaries and epididymides of the slaughtered animals. For such purpose, serum, and ovary or epididymides were collected from cattle at the public slaughterhouses of that state. Sampling was performed during normal slaughter line, without any interference as the order, sex, age, or origin of the slaughtered animals. The screening of animal reagent to leptospirosis was made through the Microscopic Agglutination Test (MAT). To search for brucellosis, animals were screened by the Buffered Acidified Antigen test (BAA) and as a confirmatory test 2-mercaptoethanol (2-ME) was used. To detect bacterial DNA in samples of ovary and epididymides the Polymerase Chain Reaction (PCR) was used. Of all the 306 animals evaluated, 189 (61.76%) were positive for the MAT, where the predominant serovar was Hardjo (24.9%). The second most frequent serovar was Wolffi (14.8%), followed by Butembo, Icterhaemorrragiae, and Hebdomadis who contributed with frequencies ranging from 6.9% to 2.6%. Lower frequencies were found for the serovars Australis (1.6%), Pomona (1.1%), Grippotyphosa (1.1%) and Patoc (1.1%). Canicola, Autumnalis, and Sentot had frequencies lower than 1%. Three animals were positive for the BAA test, however only one of these reacted positively to 2-ME. Not one of the samples was positive for Brucella spp. and Leptopira spp. DNA through the PCR technique. Given the above mentioned data it was concluded that the Leptospira spp. infection in cattle in the semiarid region of Rio Grande do Norte occurs at higher frequency with the serovar Hardjo during the dry season of the year. The Brucella spp. infection is present but has very low frequency, and no DNA from Leptospira spp. and Brucella spp. was detected in the ovary and epididymis samples of the cattle examined / Objetivou-se pesquisar aglutininas anti-Leptospira spp. e anti-Brucella spp. em bovinos de abatedouros públicos no Estado do Rio Grande do Norte, bem como confirmar através da PCR, a presença desses agentes nos ovários e epidídimos desses animais. Para isso, foram colhidos durante a linha normal de abate, o sangue e ovário ou epidídimo, de 306 animais no período de dezembro de 2010 a agosto de 2011. Através da Reação de Soroaglutinação Microscópica (SAM) foram detectados 189 (61,76%) animais sororeagente para Leptospira spp., sendo o sorovar Hardjo (24,9%) o mais predominante, seguido do Wolffi, Butembo, Icterhaemorrragiae e Hebdomadis que contribuiram com frequências que variaram de 14,8% a 2,6%. Os sorovares Australis, Pomona, Grippotyphosa, Patoc, Canícola, Autumnalis e Sentot foram menos frequentes. Em análise em separado, o sorovar Hadjo apresentou maior ocorrência no período seco do que no chuvoso (p=0,031). Para a brucelose os animais foram triados através da prova do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e confirmados pela prova do 2-mercaptoetanol (2-ME). Três animais foram positivos ao AAT, desses apenas um reagiu positivamente ao 2-ME. A PCR foi utilizada para detecção do DNA bacteriano nas amostras de ovário e epidídimo. Nenhuma amostra foi positiva na PCR para detecção de DNA da Brucella spp. e Leptospira spp. Diante do exposto conclui-se que a infecção por Leptospira spp. em bovinos ocorre no semiárido do Rio Grande do Norte com maior frequência para o sorovar Hardjo durante o período seco do ano. A brucelose foi detectada, mas com baixa frequência. Através da PCR não foi detectado DNA de Leptospira spp. e Brucella spp. nos ovários e epidídimos dos animais

Leptospira is a basal genus in an ancient group of bacteria, the spirochetes. The pathogenic species are responsible for leptospirosis, a disease with worldwide distribution and of public health importance in developed tropical countries. L. interrogans serovar Copenhageni is the agent for the majority of human leptospirosis in Brazil. In this work, we used a great variety of experimental approaches to characterize the SOS system in this serovar, to identify its impact in general DNA damage response, as well as to assess the DNA repair toolbox owned by pathogenic and saprophytic leptospires. We identified an additional repressor LexA, acquired by lateral gene transfer, exclusively in serovar Copenhageni. We also observed that UV-C irradiation led to massive death of cells and blockage of cell division in the survivors. Both repressors were active and we identified the sequences responsible for binding to promoters. However, the LexA1 SOS box was redefined after a de novo motif search on LexA1 ChIP-seq enriched sequences. This regulator was able to bind to at least 25 loci in the genome. DNA damage also caused a massive rearrangement of metabolism: increase in expression was observed in transposon and prophage genes, in addition to DNA repair pathways and mutagenesis inducers; on the other hand, motility, general metabolism and almost all virulence genes were repressed. Two induced prophages provided several proteins with useful functions. We also assessed the DNA repair-related genes presented by the three species of Leptospira: the saprophytic L. biflexa, the facultative pathogen L. interrogans and the obligatory pathogen L. borgpetersenii. There are more diversity and redundancy of repair genes in L. interrogans in comparison with the other species. Lateral gene transfer seems to be an important supplier of DNA repair functions. In addition, leptospires share characteristics of both Gram-positives and Gram-negatives bacteria. Representative genes from several different pathways were induced during infection of susceptible mice kidneys, suggesting DNA repair genes are active while causing disease. All these data suggest mobile genetic elements are the major forces in leptospiral evolution. Moreover, during DNA damage response, several SOS-dependent and independent mechanisms are employed to decrease cell growth and virulence in favor of controlled induction of mechanisms involved in genetic variability. / Leptospira é um gênero basal em um grupo já considerado um dos mais ancestrais, as espiroquetas. As espécies patogênicas são responsáveis pela leptospirose, uma doença presente em todo o mundo e de principal importância em países tropicais em desenvolvimento. L. interrogans sorovar Copenhageni é o agente da maior parte dos casos no Brasil. Nesse trabalho, utilizamos diversas abordagens experimentais para caracterizar o sistema SOS nesse sorovar, identificar seu impacto na resposta geral a danos no DNA, assim como avaliar as funções de reparo de DNA disponíveis em leptospiras patogênicas e saprofíticas. Identificamos um repressor LexA adicional, adquirido por transferência horizontal e exclusivo do sorovar Copenhageni. Observamos também que irradiação por UV-C causou significativa morte celular e bloqueio da divisão celular dos sobreviventes. Ambos os repressores são ativos e identificamos as sequências que utilizam para se ligar aos promotores dos genes regulados. Entretanto, o SOS box de LexA1 foi redefinido após uma busca de novo por motivos enriquecidos nas sequências recuperadas por ChIP-seq. Esse regulador ligou-se ao menos a 25 locais do genoma. A maioria desses alvos teve aumento de expressão após UV-C. Danos no DNA também causaram um importante rearranjo metabólico: houve aumento de expressão em transposons e profagos, além de indutores de mutagênese e vias de reparo; por outro lado, mobilidade, crescimento celular e quase todos os fatores de virulência foram reprimidos. Dois profagos induzidos durante essa resposta, possivelmente proporcionam algumas proteínas de funções importantes. Nós também avaliamos a presença de genes envolvidos no reparo de DNA em três espécies de leptospira: L. biflexa, L. interrogans e L. borgpetersenii. L. interrogans é a espécie com maior diversidade e redundância de genes de reparo. Além disso, transferência horizontal parece ser um importante fornecedor de funções de reparo nesse gênero. Leptospiras também apresentam genes característicos tanto de bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas. Genes representando diferentes vias de reparo foram induzidos durante infecção em modelo animal, sugerindo que essas vias estão ativas no curso da doença. Todos esses dados, em conjunto, sugerem que elementos genéticos móveis são de extrema importância na evolução do gênero e das vias de reparo. Assim, durante a resposta a danos no DNA, diversos mecanismos dependentes e independentes de SOS são empregados para frear o crescimento celular e virulência em favor da indução controlada de mecanismos para aumentar variabilidade genética.

Leptospirose é uma zoonose causada pela espiroqueta pertencente ao gênero Leptospira. LipL32 é um antígeno de superfície altamente conservado somente entre as espécies de leptospiras patogênicas e é expresso em altos níveis tanto in vitro com in vivo. HlyX é relatada como sendo uma proteína que possui um provável peptídeo sinal e cinco tetratricopeptídeos repetidos (TPR) em sua sequência de aminoácidos. Neste trabalho, mostrou-se que HlyX é expressa somente em cepas patogênicas, não sendo detectada a sua expressão na cepa saprofítica. HlyX foi reconhecida somente por soros de pacientes da fase convalescente da doença. Em constraste, LipL32 foi reconhecida por soros de pacientes colhidos tanto na fase aguda quanto na fase convalescente da infecção. Nossos resultados de immunoblot indicam que os domínios imunodominantes da proteína são os fragmentos C-terminal e intermediário. Uma resposta IgM foi detectada exclusivamente contra o fragmento C-terminal de LipL32 em ambas as fases da infecção. Com relação à capacidade de LipL32 e HlyX de interagir com componentes de matriz extracelular (CME), foi observada uma interação específica e dose-dependente de LipL32 e HlyX com colágeno tipo IV e fibronectina plasmática. O fragmento C-terminal de LipL32 é responsável por esta interação. Tanto a heparina quanto a gelatina foram capazes de inibir a ligação de LipL32 à fibronectina plasmática de forma dose-dependente, indicando que os domínios de ligação à heparina (30 kDa) e gelatina (45 kDa) da fibronectina estão envolvidos nesta interação. Por outro lado, apenas o domínio de ligação à heparina participa da interação da fibronectina com a proteína HlyX. A capacidade protetora das duas proteínas estudadas foi avaliada através de ensaios de imunização e desafio realizados em modelo animal (hamsters). A proteína HlyX induziu altos títulos de anticorpos IgG (1:128.000), mas somente a co-administração HlyX e LipL32 e a proteína LipL32 pura conferiram proteção, 100% e 80% respectivamente. HlyX não foi capaz de conferir proteção quando administrada apenas com o adjuvante Al(OH)3. Em conclusão, os resultados indicam que o domínio C-terminal de LipL32 é reconhecido desde o início da infecção e este domínio é responsável por mediar a interação de LipL32 com CME. Os dados obtidos com HlyX demonstram um possível papel desta proteína na patogênese, pelo fato de ser expressa e conservada em cepas patogênicas, e também por interagir com CME. Porém, apesar de HlyX apresentar altos títulos de anticorpos IgG, não conferiu atividade protetora quando administrada individualmente. / Leptospirosis, a spirochaetal zoonotic disease caused by Leptospira, has been recognized as na important emerging infectious disease. LipL32 is a surface lipoprotein which is highly conserved among pathogenic Leptospira species and is also expressed at high levels either during cultivation and natural infection. Regarding HlyX, it has been annotated as a protein containing a signal peptide and five tetratricopeptide repeats (TPR). Immunoblot analyses concerning HlyX distribution on Leptospira spp. indicate that this protein is expressed exclusively by pathogenic species. Moreover, HlyX was only recognized by sera of patients in the second week of leptospirosis infection. In contrast, LipL32 was recognized by acute and convalescent sera from leptospirosis patients. Our immunoblot results indicate that both the C-terminal and the intermediate domains of LipL32 are recognized by sera of patients. An IgM response was detected exclusively against the LipL32 C-terminus in both the acute and convalescent phases of illness. Concerning the capacity of LipL32 and HlyX to interact with extracellular matrix (ECM) components, a dose-dependent specific binding of LipL32 and HlyX to collagen IV and plasma fibronectin was observed. The LipL32 binding capacity could be attributed to the C-terminal portion of this molecule. Both heparin and gelatin could inhibit LipL32 binding to fibronectin in a concentration-dependent manner, indicating that the 30-kDa heparin- and the 45-kDa gelatin-binding domains of fibronectin are involved in this interaction. However, HlyX binding to fibronectin could only be inhibited by heparin in a concentration-dependent manner. We also evaluated whether HlyX and LipL32 could induce protective immunity against the challenge with a homologous serovar in hamsters. Although high anti-HlyX (IgG) titers (1:128,000) have been achieved upon immunization, no protection was observed. However, a combined HlyX and LipL32 immunization could induce a protective response (100%). The protection observed for LipL32 immunization was 80%. Altogether, the results provide evidence that the LipL32 C-terminus is recognized early in the course of infection and is the domain responsible for mediating interaction with ECM proteins. HlyX protein may contribute to the pathogenesis of the disease by interacting with host proteins. However, HlyX is not a protective antigen when administered alone.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Se analizaron muestras serológicas de 69 equinos de tiro urbano, provenientes de cinco comunas de la Región Metropolitana de Chile, con el objetivo de determinar la frecuencia de reacciones positivas a Leptospira interrogans y Leptospira borgpetersenii, determinar las comunas que presentan mayor frecuencia y determinar los serovares más frecuentes. Las muestras fueron sometidas a la prueba de microaglutinación en placa (microMAT) con una dilución inicial de 1:100 frente a cuatro serovares de la especie Leptospira interrogans y dos serovares de la especie Leptospira borgpetersenii. La vivienda de cada ejemplar fue georreferenciada según reacción positiva o negativa. La frecuencia de sueros que presentaron reacción positiva para todos los equinos testeados fue 33,33%. Se obtuvo una mayor frecuencia en la comuna de Huechuraba (100%), seguida de La Pintana (40%), San Bernardo (31,82%) y Quilicura (17,65%). La comuna de Recoleta no presentó equinos positivos. Los serovares detectados con mayor frecuencia fueron ballum (38,46%) y canicola (26,92%), seguidos de icterohaemorrhagiae (11,54%), autumnalis (11,54%) y pomona (7,69%). La menor frecuencia de presentación fue para hardjo (3,85%). Se obtuvieron títulos de 1:100 hasta 1:1600. Ningún ejemplar presentaba signos clínicos al momento de la toma de muestra. Estos resultados confirman que los equinos de tiro urbano analizados en este estudio están expuestos a la infección por Leptospira interrogans y Leptospira borgpetersenii. Caninos y roedores podrían constituir importantes fuentes de transmisión. Las reacciones positivas a la microMAT demuestran contacto con el agente patógeno y no respuestas cruzadas frente a la vacuna. / U-Inicia 121017019102049

Foi investigada a existência de proteção cruzada entre bacterinas bivalentes formuladas com um de três representantes do Sorogrupo Sejroe: hardjo (bacterina A), wolffi (bacterina B) e guaricura (bacterina C), e uma estirpe do sorovar pomona, empregada por ser patogênica para hamsters (Mesocricetus auratus) e possibilitar a realização do teste de potência com desafio. Os ensaios foram efetuados em hamsters machos, comparando-se os níveis de anticorpos aglutinantes e neutralizantes, respectivamente obtidos nos testes de soroaglutinação microscópica (SAM) e inibição de leptospiras in vitro (ICL). Os animais receberam duas doses de vacinas via subcutânea; aos dez dias da segunda dose, foram inoculados com culturas não inativadas dos respectivos sorovares do Sorogrupo Sejroe. Aos 21 dias pós-infecção (d.p.i.), os animais foram sangrados, os soros (n=8) foram agrupados em pools e submetidos aos testes de SAM e ICL. O teste de potência com desafio para o sorovar pomona foi adaptado do protocolo preconizado pelo United States Department of Agriculture, mas as vacinas não foram diluídas e o esquema de imunização empregou duas aplicações de 1,0mL pela via subcutânea em intervalo de dez dias; o desafio foi efetuado aos dez dias da segunda aplicação; os óbitos por leptospirose foram registrados e, aos 21 d.p.i., os sobreviventes foram sacrificados e a condição de portadores renais foi investigada através de cultivos de tecido renal para isolamento de leptospiras. No teste de potência com o sorovar pomona, o número de doses infectantes empregado para desafio (100) situou-se dentro da faixa preconizada (10 a 100); respectivamente para as bacterinas A, B e C, as proporções de mortes por leptospirose entre os animais vacinados foram de 1/10, 0/10 e 3/10, e as de portadores renais de leptospiras entre os sobreviventes foram 2/9, 1/10 e 2/7. Os resultados do teste SAM revelaram que a bacterina A induziu reações para os sorovares hardjo e wolffi; a bacterina B, para hardjo, wolffi e guaricura, e a bacterina C, apenas para a guaricura, e do teste de ICL, que animais vacinados com as bacterinas B ou C apresentaram proteção para hardjo, wolffi e guaricura; entretanto, a bacterina A conferiu proteção apenas para wolffi. Apesar das variações no poder imunogênico segundo a estirpe de leptospira empregada para a produção das bacterinas, houve proteção cruzada entre os sorovares hardjo, wolffi e guaricura. / The existence of cross-protection among bivalent bacterins, produced with one of three leptospires belonging to Serogroup Sejroe: hardjo (bacterin A), wolffi (bacterin B) and guaricura (bacterin C), and a strain of serovar pomona (included because of its pathogenicity to hamsters and the possibility of performing potency assay with challenge), was investigated in male hamsters (Mesocricetus auratus) by comparison of agglutinating and neutralizing antibodies titers, respectively measured by microscopic agglutination (MAT) and in vitro growth inhibition (GIT) tests. All animals received two doses of bacterins by subcutaneous route; after ten days from the second dose, they were inoculated with non-inactivated cultures of respective serovars of Serogroup Sejroe. At 21 post-challenge day (p.c.d.), all animals were bled and their sera (n=8) were joined in pools and tested by MAT and GIT. The potency assay with challenge performed only with serovar pomona was modified from protocol of USDA, but vaccines were not diluted and the immunization schedule employed two 1.0 mL vaccine doses by subcutaneous route with 10?day interval; the challenge was performed after ten days from the second dose; the number of deaths due to leptospirosis was registered; at 21 p.c.d., the survivors were sacrificed and their renal carrier state was investigated by culture of renal tissue for leptospires isolation. In the potency assay with serovar pomona, the number of infectious doses employed for challenge (100 infective units) was in accordance with the recommended range (10-1,000 infective units); respectively to bacterins A, B and C, proportions of deaths due to leptospirosis among vaccinated animals were 1/10, 0/10 and 3/10, and proportions of leptospires renal carrier among survivors were 2/9, 1/10 and 2/7. Results of MAT showed that bacterin A induced reactions against serovars hardjo and wolffi; bacterin B, against hardjo, wolffi and guaricura, and bacterin C, against guaricura; results of GIT revealed that vaccinated animals with bacterins B or C presented protection against serovar hardjo, wolffi and guaricura; however, bacterin A induced protection only against wolffi. A cross?protection was observed among serovars hardjo, wolffi and guaricura, although variations exist in the immunogenic capacity according to the strain of leptospires used for the bacterins production.

Antecedentes: El síndrome febril agudo representa un importante desafío para la salud en la población de la Amazonía peruana, debido a sus diversas etiologías y la falta de disponibilidad de métodos diagnósticos específicos. En Perú, Madre de Dios es una de las regiones más endémicas del dengue y la leptospirosis, así como de otros agentes etiológicos bacterianos emergentes, como la bartonelosis y la rickettsiosis, cuya prevalencia generalmente no se reporta. Objetivo: Identificar molecularmente la presencia de Bartonella bacilliformis, Leptospira spp. y Rickettsia spp. en muestras de suero de pacientes con síndrome febril de Madre de Dios, Perú. Metodología: Se analizaron 139 muestras de suero de pacientes con síndrome febril mediante RT-PCR para detectar la presencia de Bartonella bacilliformis, Leptospira spp. y Rickettsia spp. Resultados: Bartonella bacilliformis fue la bacteria más prevalente identificada en el 21,6% (30/139) de las muestras, seguida de Leptospira spp. en 11.5% (16/139) y Rickettsia spp. en el 6,5% (9/139). Los síntomas más frecuentes asociados con fiebre fueron cefaleas, mialgias y artralgias. Conclusiones: En este estudio B. bacilliformis (21.6%), Leptospira spp. (11.5%) y Rickettsia spp. (6.5%) fueron las bacterias más frecuentes. Superior al 29.5% de muestras con etiología viral de Chikungunya y Oropouche, como los más frecuentes, obtenidos en un estudio previo. Este estudio confirma que la falta de especificidad de los signos y síntomas no solo se asocia con infecciones arbovirales, sino también con la presentación clínica de infecciones bacterianas endémicas. Es crucial implementar herramientas de diagnóstico más sensibles y específicas en los programas nacionales de vigilancia. / Background: Acute febrile illness (AFI) represent a significant health challenge in the population of the Peruvian Amazon, due to their diverse etiologies and the unavailability of specific on-site diagnostic methods. In Peru, Madre de Dios is one of the most endemic regions to dengue and leptospirosis, as well as other emergent bacterial etiologic agents of AFI, such as bartonellosis and rickettsiosis, whose prevalence is not usually reported. Aim: Identify molecularly the presence of Leptospira spp., Bartonella bacilliformis, and Rickettsia spp. in serum samples from patients with AFI from Madre de Dios in Peru. Methods: 139 Serum samples from patients with acute febrile illness were analyzed by RT-PCR for detecting the presence of Bartonella bacilliformis, Leptospira spp. and Rickettsia spp. Results: Bartonella bacilliformis was the most prevalent bacteria identified in 21.6% (30/139) of the samples, followed by Leptospira spp.in 11.5% (16/139) and Rickettsia spp.in 6.5% (9/139). The most frequent symptoms associated with fever among all groups, were headaches, myalgias, and arthralgias. Conclusions: In this study B. bacilliformis (21.6%), Leptospira spp. (11.5%) and Rickettsia spp. (6.5%) were the most common bacteria. Superior to 29.5% of samples with viral etiology, with Chikungunya and Oropouche as the most frequent, obtained in a previous study. This study confirms that the un-specificity of signs and symptoms is not only associated with arboviral infections, but also with the clinical presentation of endemic bacterial infections. It is crucial to implement more sensitive and specific diagnostic tools in national surveillance programs. / Tesis

Orientador: Luiz Augusto do Amaral / Banca: Fernando Antonio de Avila / Banca: Gisele Maria de Andrade / Banca: Halim Atique Netto / Banca: Anna Monteiro Lima Ribeiro / Resumo: O objetivo desse trabalho foi verificar a ação de marcas diferentes de estreptomicinas polivalentes para o tratamento da leptospirose bovina em dose única (25 mg de estreptomicina por kg de peso corpóreo). O trabalho foi realizado com 14 touros adultos sorologicamente reagentes para Leptospira interrogans sorovar Hardjo, com título mínimo de 800 e com cultivo positivo. Os animais foram separados em 2 grupos de acordo com a marca da estreptomicina utilizada no tratamento, grupo 1: estreptomicina A e grupo 2: estreptomicina B. Os bovinos controles não receberam nenhum tratamento. Foram obtidas amostras de sangue e urina dos animais tratados e controles nos dias -1, 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 e 25; considerando-se o dia do tratamento como dia 0. Na urina dos bovinos tratados e controle foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) e isolamento com inoculação em hamsters. Observou-se que a estreptomicina da marca A, em dose única de 25 mg/kg de peso corpóreo, conseguiu eliminar a leptospirúria no grupo de touros após 24h do tratamento. Já no grupo de touros tratados com a estreptomicina da marca B, foi constatado a leptospirúria entre 48h e 72h, após o tratamento. Em ambos os grupos tratados, a resposta sorológica apresentou uma variação da queda dos níveis dos títulos de anticorpos aglutinantes, sendo que embora a estreptomicina A tenha aparentemente apresentado um melhor eficiência quando comparada com as médias geométricas dos títulos do grupo tratado com a estreptomicina B as médias não diferiram entre si pelo Teste de Tukey (P > 0,05). Nos bovinos tratados a leptospirúria foi intermitente e a média geométrica dos títulos foi menor que a média geométrica dos títulos dos bovinos controles. A diferença do efeito da ação das diferentes marcas de estreptomicina está possivelmente na qualidade da matéria prima produzida pelos laboratórios / Abstract: The objective of the present work was to evaluated two different commercial streptomycin brands used for the treatment of bovine leptospirosis, administrated in a single dose (25mg/body weight). Thirty serologically reactive bulls for Leptospira interrogans serovar Hardjo were utilized. The bulls presented a 800 minimum antibody titer and positive results at urine samples isolation test. The animals were separated into 2 groups according to the streptomycin brand. Treatments consisted of: group 1: streptomycin A and group 2: streptomycin B. The control animals received no application of any streptomycin product. Blood and urine samples of treated and controls bulls were collected at -1, 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 and 25 days considering the treatment day as D0. Detection of leptospira genetic material was carried out in all bulls urine samples using the PCR assay. It was observed that the streptomycin A eliminated leptospiruria 24h after treatment. The elimination of leptospiruria was evidente 48 and 72hs in bulls treated with the streptomycin B. In both treated groups, the serological response varied considering antibodies titers decreasing. Streptomycin A group 1 showed a better performance accordingly to geometric means in comparison to antibodies titers of the streptomycin B group 2, although there were no significant difference found by the Tukey Test (P > 0.05). In the bovine control group the leptospiruria was intermittent and the treated bovines antibody titers average was lower than the average of the bovine controls, during all the experimental period. The action effect difference of the diferent streptomycin brands used is possibly due to the quality of the raw material used to produced the products manufactured by the pharmaceutical laboratories / Doutor

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Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-30T12:11:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:11:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:12:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T19:12:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 tese_amilton_seixas_neto.pdf: 1214618 bytes, checksum: 70b8eeecc3cf0dfb3f4b6426f0b70ca4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-08-06 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - FAPERGS / A leptospirose é uma zoonose que possui distribuição mundial, causando um importante impacto econômico no setor agropecuário. Atualmente, as vacinas empregadas para a prevenção da enfermidade são formuladas com culturas de leptospiras inteiras inativadas, as quais possuem sucesso limitado, já que induzem uma imunidade de curta duração e proteção sorovar-específica. Resultados preliminares revelaram que fragmentos recombinantes das proteínas Ligs (Leptospiral immunoglobulin-like) são antigênicas, imunogênicas e conferem proteção total ou parcial contra o desafio homólogo em hamsters. Dessa forma, fragmentos rLigs são candidatos potenciais para uma vacina de subunidade contra a leptospirose humana e animal. Assim sendo, a proposta deste projeto foi avaliar preparações vacinais com as proteínas recombinantes LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) e LigA131-1224aa (rLigAFull) quando administradas com Hidróxido de Alumínio como adjuvante, individualmente ou combinadas, a fim de identificar quais formulações serão capazes de induzir uma resposta protetora contra o desafio homólogo. Hamsters machos e fêmeas foram imunizados com as preparações através da via intramuscular, nos dias 0 e 14, e o desafio homólogo foi realizado através da via intraperitoneal, no dia 28, utilizando Leptospira interrogans sorovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130. Após a expressão e purificação das quatro proteínas, obteve-se quatro lotes com pureza de 90%. Todas as quatro proteínas recombinantes apresentaram antigenicidade, reagindo contra soro de humanos e animal convalescentes de leptospirose. A imunização dos hamsters contendo as preparações com rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11 e rLigAFull conferiram proteções variáveis (0-100%) contra o desafio homólogo. Embora nenhuma preparação tenha induzido a uma proteção esterilizante, evidenciada através das técnicas de reisolamento e imunofluorescência, a associação entre rLigANI e rLigBRep foi capaz de conferir proteção significativa (p<0,05) em todos os experimentos. Em contrapartida, o fragmento inteiro de LigA, assim como rLigB7-11, não conferiram proteção. Nosso estudo propôs uma nova abordagem para o desenvolvimento de uma vacina recombinante contra a leptospirose. É o primeiro estudo que testou a proteína LigA recombinante em sua forma inteira. Além disso, foi possível obter a sua expressão na forma solúvel. Embora a proteína obtida tenha sido reconhecida por soros de humanos convalescentes in vitro, foi capaz de conferir apenas níveis de sobrevivência significativa (p<0,05) aos animais desafiados, mas não em relação à mortalidade. Por outro lado, a associação entre rLigBRep e rLigANI, outra abordagem inédita, demonstrou que mesmo testando-se em diferentes doses (40g ou 60g) de cada alvo, tanto a análise de mortalidade quanto a de sobrevivência revelou resultados significativos (p<0,01) em três dos cinco experimentos realizados. Os resultados obtidos em nosso estudo representam uma contribuição importante para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis, causing a major economic impact on the agricultural sector. Currently, the vaccines used to prevent disease in cattle are formulated with inactivated Leptospira whole-cell bacterins, which have limited success, since they induce an immunity of short duration and serovar-specific protection. Preliminary results from our group showed that recombinant fragments of Lig (leptospiral immunoglobulin-like) proteins are antigenic, immunogenic and confer full or partial protection against homologous challenge in hamster model. Thus, rLigs fragments are potential candidates for a subunit vaccine against human and animal leptospirosis. Therefore, the purpose of this study was to evaluate vaccine preparations with recombinant proteins LigA625-1224aa (rLigANI), LigB131-649aa (rLigBRep), LigB625-1044aa (rLigB7-11) and LigA131-1224aa (rLigAFull) when administered with Alum Hydroxide as adjuvant, either individually or combined, in order to identify formulations that are capable of inducing a protective response against homologous challenge. Male and female hamsters were immunized with the preparations by intramuscular injection on days 0 and 14, and the homologous challenge was performed using Leptospira interrogans serovar Copenhageni strain Fiocruz L1-130, by intraperitoneal injection on day 28. Following expression and purification of the four proteins were obtained four batches with a purity of 90%. All four recombinant proteins showed antigenicity, reacting against human sera with convalescent leptospirosis. Immunization of hamsters with preparations containing rLigANI, rLigBRep, rLigB7-11, and rLigAFull conferred variable protection (0-100%) against homologous challenge. Although no preparation has induced a sterilizing protection, evidenced by the isolation and immunofluorescence techniques, the association between rLigANI and rLigBRep was able to confer significant protection (p <0.05) in all experiments. In contrast, the LigAFull as well as rLigB7-11, did not provide protection. Our study has proposed a new approach for the development of a recombinant vaccine against bovine leptospirosis. It is the first study that tested the rLigA in its entire form. Furthermore, it was possible to obtain expression in soluble form. Although the protein obtained has been recognized by sera from convalescent human in vitro, it was only capable of conferring significant levels of survival (p <0.05) to challenged animals but not in relation to mortality. Moreover, the association between rLigBRep and rLigANI, another novel approach, testing showed that even at different doses (40 g ou 60 g) of each target, both the analysis of the mortality and survival showed significant results (p <0.01) in three of the five experiments. The results obtained in our study represent an important contribution to the development of a vaccine against leptospirosis.

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-08-30T14:07:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_julia_labonde.pdf: 678599 bytes, checksum: d233ff13ddb416df716b9ee25c98978d (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:13:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_julia_labonde.pdf: 678599 bytes, checksum: d233ff13ddb416df716b9ee25c98978d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-09-01T19:14:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_julia_labonde.pdf: 678599 bytes, checksum: d233ff13ddb416df716b9ee25c98978d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T19:14:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_julia_labonde.pdf: 678599 bytes, checksum: d233ff13ddb416df716b9ee25c98978d (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A leptospirose é uma doença infecciosa de importância mundial, que afeta humanos e animais, causada por espiroquetas patogênicas pertencentes ao gênero Leptospira. Para a área epidemiológica e clínica é fundamental que os laboratórios tenham a capacidade de identificar e classificar com precisão as espécies de Leptospira que causam doença, para que sejam tomadas decisões coerentes com relação à saúde pública. Neste estudo, nós relatamos pela primeira vez a utilização de ferramentas de mineração de dados para fins de classificação de cepas do gênero Leptospira. Vinte e cinco loci referentes a 15 genes foram selecionadas e analisados em 600 genomas rascunho de Leptospira, com o propósito de buscar polimorfismos que pudessem ser utilizados na classificação de cada espécie. Para isso, foram utilizados os algoritmos baseados em mineração de dados C4.5, Naive Bayes e Support Vector Machine. Todos os algoritmos computacionais de mineração de dados utilizados neste trabalho apresentaram valores de acurácia acima de 93% para classificação de Leptospira a nível de espécie, no entanto, o algoritmo C4.5, além de atingir a melhor acurácia de classificação (95.6%), também apresentou os genes que contribuíram para o resultado final da análise. O mesmo banco de dados genômicos utilizado pelos algoritmos computacionais foi submetido a testes com a metodologia MLST – técnica mais utilizada para classificação molecular de espécies deste gênero – no entanto, nenhum dos testes apresentou acurácia superior a 80%. Visto o algoritmo de mineração de dados C4.5 atingir uma acurácia superior aos outros algoritmos, pode-se concluir que C4.5 é uma ferramenta de mineração de dados bastante promissora para classificar espécies de Leptospira. / Leptospirosis is an infectious disease of global importance that affects humans and animals caused by pathogenic spirochetes belonging to the genus Leptospira. For epidemiological and clinical areas, it is essential that laboratories have the ability to identify and classify accurately species of Leptospira that cause disease, to take decisions consistent with respect to public health. In this study, we report for the first time the use of data mining tools for the purposes of strain classification of the genus Leptospira. Twenty-five loci related to 15 genes were selected and analyzed in 600 Leptospira draft genomes in order to search polymorphisms that could be used for the classification of each species. For this, data mining-based algorithms - C4.5, Naive Bayes and SVM - were used. All data mining computational algorithms used in this study showed accuracy levels above 93% for Leptospira classification species, however, the C4.5 algorithm achieve the best accuracy rating (95.6%) and presented the genes that contributed to the final result of the analysis. The same genomic database used by computer algorithms has been tested with the MLST methodology – most used technique for molecular classification of species of this genus - however, none of the tests show accuracy higher to 80%. Because data mining algorithm C4.5 achieve better accuracy than other algorithms, it can be concluded that C4.5 is a very promising data mining tool to classify species of Leptospira.