A criação industrial de avestruzes no Brasil tem crescido nos últimos anos, mas avestruzes podem ser reservatórios de agentes com potencial zoonótico, como é o caso do vírus da influenza, rotavírus, vírus da encefalomielite eqüina do leste (EEEV) e do oeste (WEEV), salmonela, leptospira e micoplasma. O objetivo deste trabalho foi detectar rotavírus nas fezes de filhotes, anticorpos contra rotavírus, EEEV e WEEV, influenza A , leptospira, salmonela e micoplasma a partir do soro de reprodutores e efetuar o isolamento de Salmonella sp. a partir de de suabe cloacal. Para a detecção de rotavírus nas fezes utilizaram-se as técnicas de PAGE, isolamento viral e genotipagem pela RT-PCR. As técnicas de contraimunoeletroosmoforese, soroneutralização em cultura de células, inibição da hemaglutinação e aglutinação em placa foram utilizadas nos levantamentos sorológicos e a cultura bacteriológica foi utilizada para detecção de Salmonella spp. em suabes de cloaca. Rotavírus do grupo A com genotipos G[6], G[10], P[1] e P[7] foram detectados nas fezes de avestruzes e anticorpos anti-rotavírus em 10 amostras (10/182) de soros colhidos de avestruzes reprodutores. Foram detectados anticorpos para vários sorovares de Leptospira spp. (19/128), Salmonella pullorum (17/182), Mycoplasma gallisepticum (17/182) e Mycoplasma synoviae (47/182). Não foram detectados anticorpos anti-EEEV e WEEV e anti-vírus da Influenza A H3, bem como amostras de Salmonella spp. em suabes de cloaca. Estes resultados permitem sugerir o papel do avestruz na cadeia epidemiológica das rotaviroses e da leptospirose e dão bases para o aprimoramento sanitário do plantel brasileiro desta ave. / The industrial ostrich breeding in Brazil has grown in the last few years, but ostrich may be reservoirs of potentially zoonotic agents such as influenzavirus, rotavirus, eastern equine encephalitis virus (EEEV), western equine encephalitis virus (WEEV), Salmonella, Leptospira and Mycoplasma. The aim of the present study was to detect rotavirus in fecal samples of young ostriches, antibodies against rotavirus, EEEV and WEEV, influenza A , Leptospira, Sallmonela and Mycoplasma in sera from breeders and carry out Salmonella isolation in cloacal swabs. For the rotavirus detection, PAGE, viral isolation and genotyping by RT-PCR were used. Counterimmunoelectroosmophoresis, virus neutralisation assay in cell culture, hemagglutination inhibition and plate agglutination were used in the serological surveys and bacteriological culture was used to detetc Salmonella spp. in the cloacal swabs. Group A rotavirus with genotypes G[6], G[10], P[1] and P[7] was detected in the fecal samples and anti-rotavirus antibodies were detected in ten samples (10/182) from breeder ostriches. Antibodies to different serovars of Leptospira spp. (19/128), Salmonella pullorum (17/182), Mycoplasma gallisepticum (17/182) and Mycoplasma synoviae (47/182) were detected. Antibodies against EEEV, WEEV and influenzavirus A H3 were not detected, as well as Salmonella spp. in swab samples. These results allow one to suggest a role to ostriches in the epidemiological chain of rotavirus diseases and leptospirosis and give basis to the improvement of the sanitary condition of the Brazilian flocks.

O estabelecimento e a evolução da leptospirose em hamster (Mesocricetus auratus) pela infecção experimental com Leptospira interrogans sorovar Canicola, estirpe LO4, pela exposição cutânea íntegra e escarificada, tendo como controle a via intraperitoneal foram avaliados, bem como o efeito da freqüência de exposições e da concentração do inóculo infectante quanto ao estabelecimento da doença e do portador renal e/ou genital, o potencial de transmissão e disseminação ambiental entre hamsters doentes e saudáveis com pele íntegra e escarificada e a resposta humoral induzida pela infecção experimental e exposição ambiental. O experimento foi conduzido em duas fases. No experimento 1, foram utilizados 130 hamsters fêmeas divididos em 12 grupos de acordo com a concentração do inóculo infectante (30 e 100 leptospiras/campo), a freqüência de exposição (uma, duas e quatro exposições) e a via de inoculação (pele escarificada e pele íntegra). No experimento 2, foram formados dois grupos de 10 animais, separados em caixas de polipropileno: animais sadios com escarificação cutânea (G1); e animais sadios com pele íntegra (G2). Nas caixas de ambos os grupos foi introduzido um hamster previamente infectado com Leptospira interrogans sorovar Canicola, estirpe LO4, por escarificação cutânea na dose de 100 leptospiras/campo. As condições de umidade foram mantidas por borrifações diárias (duas vezes ao dia) com água, por um período de 21 dias. Em ambas as fases, os animais foram observados duas vezes ao dia, durante 21 dias. Os animais que vieram a óbito foram necropsiados e colhidos assepticamente rins, fígado, sistema genital (útero e ovário) e cérebro. Os animais sobreviventes foram eutanasiados após 21 dias. Foram ainda colhidas amostras de soro sanguíneo por punção cardíaca para a pesquisa de aglutininas antileptospiras nos animais sobreviventes. Para a detecção de leptospiras, foram utilizados microscopia direta a fresco, cultivo microbiológico e coloração pelo método de Whartin-Starry. Para a observação das alterações patológicas dos órgãos foi utilizada a coloração por Hematoxilina-Eosina. O teste de soroaglutinação microscópica (SAM) foi utilizado para a detecção de aglutininas antileptospiras. As técnicas de microscopia direta e o cultivo microbiológico foram eficientes na identificação de leptospiras nos órgãos de hamsters inoculados com o sorovar Canicola, estirpe LO4. A via cutânea escarificada induziu maior letalidade quando comparada com a pele integra nas duas concentrações do inóculo infectante, com estabelecimento e evolução da leptospirose com lesões típicas da doença; por outro lado, a via cutânea íntegra induziu mais freqüentemente o estado de portador renal e/ou genital para leptospirose. A freqüência de exposição e a concentração do inóculo infectante não influenciaram no estado de portador renal e/ou genital ou mesmo na presença de leptospiras no tecido cerebral nas duas condições cutâneas empregadas na infecção experimental. A estirpe LO4 apresentou baixo poder imunogênico, não apresentando soroconversão na SAM, em ambas as condições de inoculação cutânea. Foi possível a transmissão da bactéria entre hamsters pela exposição ao ambiente contaminado. / The establishment and evolution of leptospirosis in hamster (Mesocricetus auratus) by experimental infection with Leptospira interrogans serovar Canicola, strain LO4, by intact and scratched skin exposures, having as control the intraperitoneal route, were evaluated, as well as the effect of the frequency of exposures and concentration of the infectant inoculum regarding the establishment of the disease and the renal and/or genital carrier states, the potential of environmental transmission and spread among diseased and healthy hamsters with intact and scratched skin and the humoral response induced by experimental infection and environmental exposure. The experiment was conducted in two phases. In the experiment 1, 130 female hamsters were distributed in 12 groups according to concentration of the infectant inoculum (30 and 100 leptospires/microscopic field), frequency of exposure (one, two and four exposures) and inoculation route (intact and scratched skin). In the experiment 2, two groups of 10 animals were allocated in polypropylene boxes: healthy animals with scratched skin (G1); and healthy animals with intact skin (G2). A hamster previously infected with Leptospira interrogans serovar Canicola, strain LO4, by cutaneous scratch at a concentration of 100 leptospires/microscopic field was introduced inside the boxes. The humidity terms were kept by daily aspersions (twice in a day) with water, by a period of 21 days. In both phases, animals were observed twice in a day during 21 days. Animals that died were necropsied and kidneys, liver, genital tract (uterus and ovaries) and brain were aseptically collected. On the 21st post-inoculation day, surviving animals were euthanized. In these animals, serum samples were also collected by cardiac puncture to antileptospires agglutinins research. Fresh direct microscopy, microbiological culture and Whartin-Starry staining method were used for the detection of leptospires. For the observation of pathological changes in organs, Hematoxilin-Eosin staining method was used. Microscopic agglutination test (MAT) was carried out to the detection of anti-leptospires agglutinins. Direct microscopy and microbiological culture were efficient in the identification of leptospires in organs from hamsters inoculated with serovar Canicola, strain LO4. Scratched skin route induced larger lethality when compared to intact skin route at the two concentrations of the infectant inoculum, with establishment and evolution of leptospirosis with typical lesions of the disease; on the other hand, intact skin route induced renal and/or genital carrier state more frequently. The frequency of exposure and the concentration of the infectant inoculums had no influence in the renal and/or genital carrier state, as well as in the presence of leptospires in brain tissue in the two cutaneous routes employed to experimental infection. LO4 strain presented low immunogenic power, characterized by no soroconversion at the MAT in both cutaneous routes. The transmission of the bacterium among hamsters by exposure to contaminated environment was possible.

O presente estudo objetivou detectar a infecção por Leptospira spp. mediante ensaio sorológico, bacteriológico e molecular em 208 fêmeas bovinas do município de Novo Repartimento e em 58 fetos não abortados destas fêmeas. Em um matadouro municipal da região do Baixo Tocantins - PA foram colhidas amostras de soro sanguíneo, urina e fragmentos dos rins das fêmeas bovinas e amostras de líquidos cavitários, fragmentos dos órgãos e conteúdo gástrico dos fetos. Os testes empregados foram a soroaglutinação microscópica (SAM), o cultivo bacteriológico, a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e o sequenciamento de DNA. A frequência de fêmeas bovinas reagentes foi de 65,86% (137/208), com títulos variando de 100 a 3.200, sendo L. interrogans sorovar Hardjoprajitnoe L. borgpetersenii sorovar Hardjobovis os mais prevalentes. Não houve o isolamento de leptospiras, mas o DNA da bactéria foi detectado em 5,76% (12/208) das amostras de rins e em 14,90% (31/208) das amostras de urina. O sequenciamento de DNA direto dos produtos da PCR foi possível em 30 amostras, distribuídas em quatro espécies diferentes: L. borgpetersenii a mais prevalente com 56,70% (17/30), seguida por L. kirschneri com 33,30% (10/30), L. interrogans com 6,70% (2/30) e L. santarosai com 3,30% (1/30). Tanto o genótipo Hardjoprajitno como Hardjobovis foram identificados. Em nenhum dos fetos foi detectado anticorpos anti-Leptospira spp. nos líquidos cavitários e nem o DNA da bactéria no pool de órgãos e conteúdo gástrico, mesmo que em alguns fetos foram observadas alterações patológicas macroscópicas sugestivas de leptospirose. Estes resultados inéditos revelam uma diversidade e peculiaridade para a leptospirose bovina em Novo Repartimento, principalmente pela baixa prevalência de L. santarosai e mais surpreendente, a presença de L. kirschneri, comumente não encontrada em bovinos, diferentemente do que ocorre em outras regiões do país. / The present study aimed to detect the infection by Leptospira spp. using serological, bacteriological and molecular assays in 208 bovine females of the municipality of Novo Repartimento and in 58 non-aborted fetuses of these females. At a municipal slaughterhouse in the Baixo Tocantins - PA region were collected samples of blood serum, urine and kidney fragments from bovine females and samples of cavity liquids, fragments of the organs and gastric content of the fetuses. The tests used were microscopic agglutination test (MAT), bacteriological culture, polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing. The frequency of reactive bovine females was 65.86% (137/208), with titers varying from 100 to 3,200, with L. interrogans serovar Hardjoprajitno and L. borgpetersenii serovar Hardjobovis the most prevalents. There was no isolation of leptospires, but the DNA of the bacterium was detected in 5.76% (12/208) of the kidney samples and in 14.90% (31/208) of the urine samples. Direct DNA sequencing of PCR products was possible in 30 samples, distributed in four different species: L. borgpetersenii, the most prevalent with 56.70% (17/30), followed by L. kirschneri with 33.30% (10 / 30), L. interrogans with 6.70% (2/30) and L. santarosai with 3.30% (1/30). Both genotypes Hardjoprajitno and Hardjobovis were identified. In none of the fetuses was detected antibodies anti-Leptospira spp. in the samples of cavity liquids and neither the DNA of the bacterium in the pool of organs and gastric content, although in some fetuses macroscopic pathological changes suggestive of leptospirosis have been observed. These results reveal a diversity and peculiarity for the bovine leptospirosis in Novo Repartimento, mainly due to the low prevalence of L. santarosai and more surprising, the presence of L. kirschneri, not commonly found in cattle, differrently what happens in other regions of country.

Foi efetuada a avaliação comparativa da potência de vacinas anti-leptospirose canina comercializadas no Brasil, empregando no desafio estirpes de leptospiras dos sorovares Canicola e Copenhageni autoctones isoladas no Brasil. Foram comparadas nove bacterinas comerciais polivalentes produzidas para uso em cães, identificadas pelas letras A, B, C, D, E, F, G, H e I. O desafio foi efetuado com as estirpes L1-130 e LO4, respectivamente dos sorovares Copenhageni e Canicola tipificadas pela prova de anticorpos monoclonais. O protocolo adotado seguiu as normas técnicas americanas, 9 CFR 113.103 Leptospirose Canicola - 2006 . A dose infectante do sorovar Copenhageni empregada no desafio (5,4) foi inferior ao limite inferior estabelecido pela norma técnica (10) e a do sorovar Canicola foi de 10.000. Os animais foram observados por 21 dias consecutivos, contabilizando-se os que morreram por leptospirose. Ao final deste período, os sobreviventes foram submetidos à eutanásia por inalação de gás carbônico (câmara de CO2), e necropsiados para colheita dos rins e realização de cultivos destinados ao controle de infecção renal por leptospiras. Das nove vacinas avaliadas, sete foram reprovadas para os dois sorovares testados e duas foram aprovadas contra a doença clinica e infecção renal para o sorovar Canicola LO4, porém apenas contra a doença clínica para o sorovar Copenhageni L1-130. Os laboratórios fabricantes de bacterinas anti-leptospirose canina que estão sendo comercializadas no Brasil, necessitam rever a qualidade dos seus produtos no relativo a proteção contra a doença e infecção pelos sorovares Canicola e Copenhageni. / A comparative evaluation of the potency of canine anti-leptospirosis bacterins marketed in Brazil was conducted using as the challenge strains the indigenous leptospires, serovars Canicola and Copenhageni, isolated in Brazil. There were compared nine commercial polyvalent bacterial vaccines produced for use in dogs, identified by the letters A, B, C, D, E, F, G, H and I. The challenge was performed with L1-130 and LO4 strains, respectively, of the serovars Copenhageni and Canicola, which have been typified by the monoclonal antibodies (MABs). The adopted protocol followed the American standard techniques, 9 CFR 113.103 Leptospirosis Canicola 2006. The infectious dose of the serovar Copenhageni used in the challenge (5.4) was inferior to the lower limit established by the technical standard (10) and that of the serovar Canicola was of 10,000. The animals (hamsters) were observed for 21 consecutive days, registering those died of leptospirosis. At the end of the observation period, the survivors were subdued to the euthanasia by inhalation of carbon gas (CO2 chamber), and necropsied, taking the kidneys for bacterial culturing for the evaluation of renal infection by leptospires. Among nine evaluated vaccines, seven failed for the two serovars tested and two were approved against the clinical disease and renal infection by the serovar Canicola LO4, however serovar Copenhageni L1-130 was effective only against manifestation of the clinical disease. The manufacturers of the canine anti-leptospirosis bacterial vaccines which are being marketed in Brazil need to revise the quality of their products in respect to the protection conferred against the disease and against the infection by the serovars Canicola and Copenhageni.

O sequenciamento genômico da L. interrogans sorovar Copenhageni e os avanços das análises bioinformáticas permitiram a identificação de seis novos candidatos vacinais. Esses genes de Leptospira foram submetidos a ensaios de conservação do DNA genômico, RNA mensageiro e proteína nativa correspondente em doze sorovares de Leptospira, nos quais o gene LIC11469 foi o mais conservado. As proteínas recombinantes rLIC11469 e rLIC11030 foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal, e submetidas a ensaio de dicroísmo circular. Em ensaios de localização celular pudemos observar a presença das proteínas nativas correspondentes na membrana externa de Leptospira. Ensaios de adesão mostraram a ligação da proteína rLIC11469 à laminina e ao plasminogênio. Ensaios de imunização e desafio demonstraram que a proteína rLIC11030 conferiu proteção contra infecção letal de L. interrogans em hamsters. Ambas as proteínas apresentaram reatividade com anticorpos presentes em soros de pacientes com leptospirose, sugerindo sua expressão durante a infecção. / The genomic sequencing of the L. interrogans serovar Copenhageni and the advances of bioinformatics analysis allowed the identification of six new vaccine candidates. These genes were subjected to genomic DNA, mRNA and native protein conservation assays in twelve serovars from Leptospira, and the gene LIC11469 was the most conserved among these serovars. The recombinant proteins rLIC11469 and rLIC11030 were purified by metal affinity chromatography, and subjected to circular dichroism. Through cellular localization assays we could observe the presence of the corresponding native proteins on the outer membrane of Leptospira. In adhesion assays, the protein rLIC11469 showed binding to laminin and plasminogen. Immunization and challenge assays showed that the protein rLIC11030 afforded protection against lethal leptospiral inoculation in hamsters. Both proteins showed reactivity against sera of patients diagnosed with leptospirosis, suggesting that these proteins are probably expressed during infection.

A estirpe Fromm de Leptospira interrogans sorovar Kennewicki foi utilizada para produção de uma bacterina experimental anti-leptospirose. A extração do RNA total utilizado para transcrição reversa e quantificação dos antígenos LigA e LipL32 por PCR em Tempo Real, foi efetuada a partir de alíquotas colhidas das diluições da bacterina antes da sua inativação, as quais foram armazenadas à temperatura de -80ºC. O volume restante da bacterina foi inativado em banho-maria à 56ºC e mantido à temperatura de -20ºC para avaliação da sua potência em hamsters bem como da detecção e quantificação dos antígenos LigA e LipL32 em ensaios de ELISA Indireto e ELISA Sanduíche Indireto. Os resultados do ensaio de potência em hamsters demonstraram que a bacterina foi aprovada de acordo com as exigências dos padrões internacionais de qualidade até a diluição 1/6400, protegendo os hamters contra a infecção letal frente ao desafio com a diluição 10-6 (100 doses infectantes 50%/ 0,2mL). Os resultados das reações de Real Time PCR detectaram 3,2 x 103 e 2,3 x 101 cópias do mRNA que codifica a proteína LigA, na bacterina pura e diluída a 1:200, respectivamente. Apenas oito cópias do mRNA que codifica a proteína LipL32 foram detectadas na amostra de bacterina pura. Os ensaios com ELISA Indireto não detectaram a proteína LigA na amostra de bacterina inativada, mas demonstraram a detecção da proteína LipL32 até a diluição 1/1600 da bacterina. Os ensaios de ELISA Sanduíche Indireto apresentaram reações cruzadas nas placas controle, e, portanto seus resultados não puderam ser considerados nas análises. Os resultados da real time PCR não puderam ser correlacionados com o teste de potência em hamsters, mas os ensaios de ELISA Indireto para a proteína LipL32 demonstraram resultados condizentes com os apresentados pelo teste de potência em hamsters oferecendo uma possível alternativa in vitro para avaliação de potência de bacterinas anti-leptospirose. / Leptospira interrogans serovar Kennewicki strain Fromm was used for the production of a experimental leptospirosis bacterin. The extraction of total RNA used for reverse transcription and quantification of the antigens LigA and LipL32 for Real Time PCR was performed from the aliquots harvested of bacterin dilutions before inactivation that were separated and maintained at -80ºC. The remaining volume of bacterin was inativated at 56ºC and maintained at -20ºC for the evaluation bacterin potency in hamsters and detection and quantification of LigA and LipL32 antigens by Indirect ELISA assay and Indirect Sandwich ELISA. The results of potency assay in hamsters demonstrated that the bacterin was approved by the international patterns of quality until dilution 1/6400, protecting the hamters against lethal infection challenge by the dilution 10-6 (100 infectious doses 50%/0,2 mL). The results of Real Time PCR detected 3,2 x 103 e 2,3 x 101 copies of mRNA that encodes the LigA protein, in samples of pure bacterin and diluted 1:200, respectively. Few eight copies of mRNA that encodes LipL32 protein were detected in pure bacterin samples. Indirect ELISA assays not detected LigA protein in inactivated bacterin samples, but demonstrated LipL32 protein detection until dilution 1:1600 of bacterin. Indirect Sandwich ELISA presented cross-reaction in control plates, so the results cannot be considerated in the analysis. The results of real time PCR cannot be correlated with the potency assay in hamsters but Indirect ELISA assay for protein LipL32 demonstrated that the results were suitable with the results presented by the potency assay in hamsters offering a possible in vitro alternative for the evaluation of leptospirosis bacterins potency.

A leptospirose é a zoonose mais comum, distribuída em todas as regiões do mundo e causada por bactérias virulentas do gênero Leptospira spp. A apresentação clínica da leptospirose varia de uma doença febril inespecífica a quadros graves com insuficiência renal aguda, icterícia, hemorragias graves, choque cardiovascular e falência de múltiplos órgãos. Pouco se sabe sobre a resposta imune do hospedeiro e os mecanismos patogênicos associados com a leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. O baço tem sido estudado e considerado nos últimos anos como um órgão essencial na fisiopatologia da sepse/choque séptico, uma vez que nele ocorre perda de células da imunidade, secundária à apoptose. Objetivos: descrever os achados histológicos e a resposta imune in situ do baço de pacientes falecidos por leptospirose com hemorragia pulmonar e choque refratário, comparando-os com dois grupos controles, um formado por pacientes falecidos por choque séptico causado por bactérias Gram-positivas/-negativas e um segundo, formado por vítimas de trauma. Metodologia: retrospectivamente, 11 baços de pacientes com leptospirose grave e 10 baços de pacientes com choque séptico foram obtidos por necrópsia e comparados com 12 baços de vítimas de trauma abdominal fechado (controles normais), obtidos por esplenectomia. Os achados histológicos da polpa vermelha e da polpa branca esplênica foram analisados por meio de escore semi-quantitativo. A reação de imunohistoquímica (IH) foi empregada para a marcação de células NK, S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+ e CD20+, bem como para células expressando caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL-10, IL-4 e TGF. A contagem de células marcadas foi realizada utilizando-se gratículo sobre 10 campos da polpa vermelha e 10 campos da polpa branca, escolhidos aleatoriamente. IH também foi realizada nos baços dos casos de leptospirose para a detecção de antígenos de Leptospira spp. Resultados: os baços de pacientes do grupo leptospirose e do grupo choque séptico demonstraram similaridades na análise histológica, divergindo do grupo trauma, com as seguintes alterações: congestão difusa da polpa vermelha com infiltração moderada a intensa de plasmócitos e polimorfonucleares e folículos da polpa branca com atrofia. A IH para antígenos de Leptospira foi positiva em oito (72,7%) amostras de baços do grupo leptospirose. Pela análise quantitativa das células marcadas pela IH, os seguintes resultados foram estatisticamente significantes: alta contagem de células S100+ no grupo leptospirose; alta densidade de células CD68+ no grupo choque séptico; baixa quantidade de células NK e TCD4+ nos grupos leptospirose e choque séptico; baixa quantidade de células TCD8+ nos casos de choque séptico e alta contagem de células CD20+ nos grupos leptospirose e choque séptico. Quanto às células expressando citocinas, encontrou-se alta quantidade de TNF nos pacientes do grupo leptospirose e grande número de células positivas para IL-10 nos grupos leptospirose e choque séptico. A expressão de IL-6, IFN, IL-1 e IL-2r foi insignificante nos baços dos três grupos estudados. Células expressando IL-12 foram encontradas apenas na polpa vermelha de casos de leptospirose. Conclusões: Semelhantes clinicamente aos casos de choque séptico, pacientes com leptospirose grave com choque apresentam disfunção endotelial difusa no baço, esplenite aguda e sinais de comprometimento da imunidade inata e adaptativa in situ no baço, caracterizado por uma baixa densidade de células NK, de células TCD4+ e baixa expressão de IL-6, IL-1, IL-2r, IFN e IL-12, com alta expressão de IL-10. Estes resultados sugerem que um estado de imunossupressão pontua a resposta imune do hospedeiro no estágio terminal da leptospirose grave com hemorragia pulmonar e choque cardiovascular. A presença de antígenos de Leptospira nos baços de casos de leptospirose sugere que o agente etiológico contribui diretamente para a patogênese das lesões / Leptospirosis is the most common worldwide zoonosis caused by virulent bacteria from the genus Leptospira spp. The clinical presentation of leptospirosis ranges from unspecific febrile illness to severe forms with acute renal failure, jaundice, hemorrhages, shock and multi organ failure. Little is known about the hosts immune response and the pathogenic mechanisms involved in severe leptospirosis. In recent years the spleen has been considered a pivotal organ in the patophysiology of the sepsis/septic shock because immune cells are lost due to apoptosis in this organ Objectives: describe and compare the splenic histological features and the immune response in situ in patients who died of pulmonary hemorrhage and shock caused by leptospirosis, with spleens from patients who suffered from Grampositive/- negative septic shock and abdominal trauma. Methodology: in retrospect, 11 spleen tissue samples from patients with leptospirosis and 10 spleens from patients with septic shock were obtained by necropsy, and compared with 12 spleens obtained by splenectomy from patients with abdominal trauma. The histological features in the red pulp and white pulp were analyzed by a semi quantitative score. Immunohistochemistry (IH) methods for NK , S100+, CD68+, TCD4+, TCD8+, CD20+ cells, caspase-3, TNF, IFN, IL-1, IL-2r, IL-6, IL-12, IL- 10, IL-4 and TGF were carried out and the stained cells were counted using a grid scale in ten fields of red pulp and white pulp chosen randomly. Also, IH was performed for Leptospira antigens in the leptospirosis patients. Results: the trauma group was totally different from the leptospirosis and septic shock patients which demonstrated strong similarities in the histological analysis: diffuse congestion in the red pulp with a moderate to intense infiltration of plasma cells, and polymorph nuclear cells, and follicles with marked atrophy. The Leptospira antigen was positive in eight (72,7%) spleen tissue samples from the leptospirosis group. By the IH methods and quantitative analysis, the following results reached statistical significance: high account of S100+ cells in the leptospirosis group; high density of CD68+ cells in the septic group; low density of NK and TCD4+ cells in the leptospirosis and septic groups; low quantities of TCD8+ cells in the septic group; high density of CD20+ cells in the leptospirosis and septic groups; high expression of TNF in the leptospirosis group and a strong expression of IL-10 in the leptospirosis and sepsis groups. The expression of IL-6, IFN, IL-1 and IL-2r was insignificant in all groups. IL-12 was only expressed in the red pulp of leptospirosis cases. Conclusion: similar to patients with septic shock, cases of severe leptospirosis (with pulmonary hemorrhage and shock) are associated with a splenic diffuse endothelial dysfunction, splenitis and signs of splenic disturbance in the innate and adaptative immunity in situ, characterized by an low density of NK cells, TCD4+ cells and low expression of IL-6, IL-1, IL-2r, IFN and IL-12 with a high expression of IL-10. These results suggest that an immunosuppressive state develops in the hosts immune response at the terminal stage of severe leptospirosis with pulmonary hemorrhage and shock. Also, the presence of leptospiral antigens in the spleen of the leptospirosis patients suggests the ethyological agent contributes directly to the pathogenesis of the lesions

A leptospirose é uma zoonose causada por leptospiras patogênicas. Para estabelecer a infecção, estas bactérias desenvolveram estratégias de escape ao sistema complemento. Neste trabalho demonstramos que o sobrenadante de cultura de leptospiras patogênicas é capaz de inibir as três vias do complemento. Observamos que esse sobrenadante possui atividade proteolítica sobre C3, C3b e iC3b, além do FB (via alternativa), C2 e C4b (via clássica e das lectinas). As proteínas C3, C4, C2 e FB também foram clivadas quando soro humano normal (SHN) foi utilizado como fonte de complemento. Demonstramos que as proteases atuam em conjunto com os reguladores do hospedeiro Fator I e Fator H na clivagem de C3b. As clivagens foram inibidas pela 1,10-fenantrolina, sugerindo a participação de metaloproteases. Metaloproteases de leptospira da família das termolisinas foram produzidas como proteínas recombinantes e clivaram C3 no SHN. Concluímos que proteases de leptospiras patogênicas podem desativar moléculas do complemento e são potencias alvos para novas terapias em leptospirose. / Leptospirosis is a zoonotic disease caused by pathogenic Leptospira. To establish the infection, these bacteria have developed strategies to escape the complement system. In this work, we demonstrate that culture supernatant from pathogenic Leptospira is capable of inhibiting the three complement pathways. We observe that this supernatant possess proteolytic activity under C3, C3b and iC3b, FB (alternative pathway), C2 and C4b (classical and lectin pathways). The proteins C3, C4, C2 and FB were also cleaved when normal human serum (NHS) was used as a source of complement. We demonstrate that these proteases act together with the host regulators Factor I and Factor H in C3b cleavage. The cleavages were inhibited by 1,10-phenanthroline, suggesting the involvement of metalloproteinases. Leptospira metalloproteinases from the thermolysin family were produced as recombinant proteins and cleaved C3 in NHS. We concluded that proteases from pathogenic Leptospira can inactivate complement molecules and are potential targets for new therapies in leptospirosis.

Com a finalidade de se analisar a dinâmica da evolução dos anticorpos na fase aguda da infecção, através das reações de soroaglutinação microscópica e de fixação do complemento, trinta animais foram inoculados experimentalmente com leptospiras patogênicas, sendo quinze com o sorotipo icterohaemorrhagiae e quinze com o sorotipo canicola. Procurou-se também avaliar a potencialidade do emprego dos antígenos preparados com amostras de leptospiras aquícolas estirpes Patoc I, Rufino e Buenos Aires, em ambas as reações. Os anticorpos fixadores do complemento foram observados na circulação sanguínea a partir do 49 dia após a inoculação em ambos os grupos de animais, enquanto as aglutininas foram detectadas a partir do 7º dia. Estas persistem durante um período maior de tempo, pois 50% dos animais inoculados com o sorotipo icterohaemorrhagiae apresentaram anticorpos circulantes no 56º dia após a inoculação e 80% dos cães inoculados com o sorotipo canicola, no 63º dia pós-infecção. Nessa oportunidade, os anticorpos fixadores do complemento não foram observados nos soros dos animais de ambos os grupos. As estirpes Patoc I e Rufino não foram-eficientes em revelar anticorpos circulantes em ambos os grupos experimentais tanto pela reação de soroaglutinação microscópica como pela reação de fixação do complemento, em proporções que justifiquem seu emprego como antígeno único. Entretanto, 87% dos cães inoculados com o sorotipo icterohaemorrhagiae e 80% dos cães inoculados com o sorotipo canicola foram reagentes quando se empregou a estirpe Buenos Aires nas reações de soroaglutinação microscópica e de fixação do complemento. / In order to evaluate the antibody response to pathogenic leptospira from both serotypes icterohaemorrhagiae and canicola, dogs were experimentally inoculated with these two serotypes. Bach of the serotypes were inoculated in 15 dogs and the antibody response in the acute phase of infection was followed using agglutination, and complement fixation tests. These tests were also performed using non pathogenic leptospira such as Patoc l, Rufino and Buenos Aires. Complement fixing antibodies were detected in both groups, at the 4th day post-infection and agglutinins only appeared in circulation at the 7th day post-infection when homologous antigens were used. On the 63rd day post-infection with canicola serotype and on the 56th day post-infection with the serotype icterohaemorrhagiae complement fixing antibody could no longer be detected but, in both experimental groups, specific agglutinins were present in significant tittles. The antigens Patoc I and Rufino were inefficient to detect circulating antibodies in experimentally infected animals. However, when the Buenos Aires antigen was used 87 percent of the animals infected with the serotype icterohaemorrhagiae and 80 per cent of the animals infected with the serotype canicola showed significant tittles of antibody.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:17:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Gerson Silva de Lima.pdf: 864257 bytes, checksum: ca49b40df55461f84d34f8a4d94fd512 (MD5) Previous issue date: 2008-10-03 / Leptospirosis is considered a global health problem in human and veterinary medicine. It is a zoonotic disease caused by bacteria of the genus Leptospira, prevalent on every continent. The development of an effective macroscopic serum agglutination test against leptospirosis is justified, since the available ones are expensive, cumbersome and restricted to specialized laboratories. In Brazil, leptospirosis in pigs has been a major cause of reproductive failure in several states, mainly in the south and southeast regions of the country. Among the animals used in production of rural ecosystems, pigs have the most frequent clinical manifestations in the reproductive sphere with abortions, usually in the final third of pregnancy. Infertility, sterility or birth of debilitated or dead pigs which dies in the first days of life are signs of the presence of the bacteria in the breeding matrix. In the present study, six suspensions formulations of antigenic serovars pomona, icterohaemorrhagiae and copenhageni were used in single suspension form or in two serovars combinations. These were tested against pig serum with no clinical suspicion of leptospirosis compared with the microscopic agglutination test that is accepted as the gold standard by the World Health Organization (WHO). Among the six proposed suspensions the combination of serovars pomona + icterohaemorrhagiae showed the best result. The results demonstrates a percentage of 89% sensitivity and specificity of 89% for the suspension with the serovars combination of pomona + icterohaemorrhagiae and 87% for positive predictive value and 90% negative predictive value for the same combination, demonstrated by the statistics methods such as Chi-square, Kappa and Linear Logistic Model. Given the importance of leptospirosis in pigs and economic impact that it causes worldwide, in addition to the lack of current information, this study aimed to develop a screening rapid test for the diagnosis of pigs kept in variable dimension farms from rural regions of the Rio de Janeiro state. / A leptospirose ? considerada um problema global de sa?de na ?rea humana e veterin?ria. ? uma zoonose causada por bact?rias do g?nero Leptospira, prevalente em todos os continentes. O desenvolvimento de um teste de soro aglutina??o macrosc?pica eficaz contra a leptospirose se justifica, j? que os existentes s?o caros, trabalhosos e restritos a laborat?rios especializados. No Brasil, a leptospirose em su?nos tem sido uma das principais causas de falhas reprodutivas em v?rios estados, principalmente nas regi?es sul e sudeste do pa?s. Dentre os animais de produ??o explorados em ecossistemas rurais os su?nos apresentam as manifesta??es cl?nicas mais freq?entes na esfera reprodutiva com abortamentos, usualmente no ter?o final da gesta??o. A infertilidade, a esterilidade o nascimento de leit?es debilitados que morrem nos primeiros dias de vida s?o sinais da presen?a da bact?ria nas matrizes reprodutoras. No presente estudo, utilizou-se seis formula??es de suspens?es antig?nicas dos sorovares pomona, icterohaemorrhagiae e copenhageni em forma de suspens?o ?nica ou em combina??es de dois sorovares. Foram testadas frente a soros de su?nos sem suspeita cl?nica de leptospirose comparando com a soroaglutina??o microsc?pica que ? o teste aceito como padr?o ouro pela Organiza??o Mundial de Sa?de (OMS). Dentre as seis suspens?es propostas a combina??o dos sorovares pomona + icterohaemorrhagiae apresentou o melhor resultado. Os resultados obtidos demonstraram um percentual de 89% de sensibilidade e 89% de especificidade para a suspens?o com a combina??o dos sorovares pomona + icterohaemorrhagiae e de 87% de valor preditivo positivo e 90% de valor preditivo negativo para a mesma combina??o, comprovado pelos m?todos estat?sticos Qui-quadrado, Kappa e Modelo Linear Log?stico. Dada ? import?ncia da leptospirose em su?nos e o impacto econ?mico que causa mundialmente, al?m da car?ncia de informa??es atuais, este trabalho teve por objetivo desenvolver um teste r?pido de triagem para diagn?stico em su?nos mantidos em cria??es rurais de diferentes regi?es e tamanhos no Estado do Rio de Janeiro.