Les petits ARN nucléolaires (snoARN) sont d'abondants petits ARN non codants impliqués dans la modification post-transcriptionnelle des ARN ribosomiques. Plus récemment, ils ont été associés à de nouvelles fonctions et des dérégulations dans les cancers. La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l'hémopathie maligne la plus courante dans les pays occidentaux. Cette pathologie, bien qu'indolente, est toujours incurable et est très hétérogène en termes d'évolution et de réponse au traitement. Il est ainsi nécessaire de découvrir de nouveaux marqueurs permettant de stratifier le risque d'évolution de la LLC afin d'améliorer la prise en charge thérapeutique des patients. Le but de mon projet a été d'étudier les profils d'expression des snoARN dans la LLC et de les corréler aux données cliniques et biologiques. Par des expériences de PCR quantitative à grande échelle (Fluidigm), j'ai mis en évidence la dérégulation des snoARN dans la LLC. De plus, j'ai pu montrer qu'une signature spécifique était capable de définir un nouveau sous-groupe de mauvais pronostic au sein des patients IGHV-mutés, initialement classés dans un groupe de bon pronostic. La surexpression de la signature est corrélée à un temps de survie sans traitement plus court et semble être principalement activée par les signaux de prolifération. Ainsi, cette étude démontre l'intérêt d'étudier la valeur pronostique des snoARN dans la LLC et plus largement dans les hémopathies malignes. / Small nucleolar RNAs (snoRNAs) are an abundant class of small non-coding RNAs responsible for the post-transcriptional modifications of ribosomal RNAs. They have been recently associated with new functions and described as deregulated in many cancers. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent leukemia in the western world. This disease has a slow progression rate but is still incurable and is also very heterogeneous in terms of clinical course and response to therapy. Thus, it is essential to find new molecular markers allowing improvement of patient therapeutic care. This study aimed at establishing the expression profiles of snoRNAs in a CLL cohort and to correlate them to the clinico-biological parameters. By means of high-throughput quantitative PCR, I showed that snoRNAs were deregulated in CLL. Moreover, a specific signature was able to define a new adverse prognostic subgroup among IGHV-mutated patients, initially classified as good prognosis cases. The overexpression of the signature is correlated to a shorter treatment-free survival and seems to be mainly activated by proliferation signals. All in all, this study demonstrates the prognostic value of snoRNAs in CLL and prompts us to further explore their deregulation in hematological malignancies.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) sont des facteurs épigénétiques dont le rôle est de maintenir la répression de leurs gènes cibles au niveau de la chromatine via la modification des protéines histones. EZH2 est une protéine clé dans les mécanismes de régulation puisqu’elle catalyse la mise en place de la marque répressive H3K27me3. Dans le cadre de ma thèse, je me suis intéressée au modèle des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) dans lesquelles, contrairement à d’autres pathologies myéloïdes, des mutations affectant EZH2 ou des membres Polycomb ne sont retrouvées que très rarement (˂1%). Des études ont montré que dans ce type de leucémies, de nombreux gènes cibles d’EZH2 sont dérégulés bien que son activité répressive soit toujours présente, mettant en évidence d’éventuels défauts de recrutement de cette protéine. Parmi les facteurs de transcription susceptibles de réguler l’association des protéines PcG à la chromatine, se trouve PLZF qui est un candidat intéressant. En effet, le laboratoire a mis en évidence une interaction entre PLZF et la protéine Polycomb BMI-1 et a montré que la distribution génomique de PLZF concorde avec celle de certains composants des Polycomb. L’objectif de mon travail de thèse a donc été de déterminer dans quelle mesure PLZF intervient dans le recrutement ou l’activité d’EZH2. / Polycomb group (PcG) proteins are epigenetic factors which play a major role in maintaining epigenetic silencing via histone modifications at the chromatin level. EZH2 is a key regulator that catalyzes the trimethylation of H3K27, which is a repressive mark. During my PhD, I was interested in the acute myeloid leukemia (AML) model in which, unlike other myeloid malignancies, EZH2 or other PcG protein mutations are very rare (˂1%). Studies have shown that in this type of leukemia, many of EZH2 target genes are deregulated although its repressive activity is still present highlighting possible EZH2 recruitment defects. Among the transcription factors that regulate the association of PcG proteins to chromatin, the transcription factor PLZF is an interesting candidate. Indeed, the laboratory has demonstrated an interaction between PLZF and the Polycomb protein BMI -1 and showed that the genomic distribution of PLZF is consistent with that of some Polycomb components. The aim of my thesis was therefore to determine in which extent PLZF is involved in the recruitment or activity of EZH2.

Les progrès thérapeutiques réguliers ont transformé le pronostic des enfants atteints de leucémie aiguë, posant avec une grande acuité le problème des effets secondaires tardifs, de l'insertion sociale mais aussi de la qualité de vie des patients et de leur entourage, ainsi que des déterminants mis en jeu. L'ensemble des acteurs du système de soins ont la responsabilité de l'étude de ces effets secondaires tardifs et de leur prise en compte. En 2004, le projet LEA (Leucémie de l'Enfant et de l'Adolescent) a débuté avec pour objectif d'évaluer l'état de santé et la qualité de vie à moyen et long terme de patients traités pour une leucémie aiguë de l'enfance après 1980. La volonté était de mettre en oeuvre un système pouvant produire de la connaissance dans une démarche de recherche traditionnelle, mais aussi de s'inscrire rapidement dans une démarche pragmatique de production d'informations susceptibles de modifier les pratiques de prise en charge et de suivi. L'objectif général de ce travail cherche à démontrer l'utilité de dispositifs lourds comme la mise en oeuvre d'une cohorte, dans la double logique de fournir une information d'une part directement utile à la décision clinique, et d'autre part susceptible d'éclairer la décision publique. Les travaux scientifiques s'articulent autour de : 1. La visibilité de la cohorte LEA au regard des autres dispositifs existants au niveau international ; 2. Les conséquences à distance des traitements lourds reçus par les patients ; 3. La qualité de vie de l'entourage à distance de l'épisode aigu de la maladie ; 4. L'utilité d'un suivi systématisé dans la diminution des inégalités d'accès au système de santé entre les classes sociales. / Regular advances in cancer treatment have dramatically improved the prognosis of children with acute leukemia, raising with a great acuity the problem of the late physical side effects, social integration, quality of life of the patients and their family as well as identification of the determinants of these outcomes. It is the responsibility of all the care system actors to consider these objective and subjective late effects. The LEA project (Leucémie de l'Enfant et de l'Adolescent - childhood and adolescent leukemia) was initiated in 2004 with the aim of studying the long-term health status and quality of life of children treated for leukemia after January 1980. As soon as the project began, the aim was to implement a system that can produce knowledge in a traditional research approach, but also to rapidly become a pragmatic approach of producing information that could affect both care and monitoring practices. The general objective of this manuscript seeks to demonstrate the utility of heavy plan such as the implementation of a cohort, in the double approach of providing information on the one hand directly relevant to clinical decision, and on the other hand likely to enlighten public decision. The present scientific works are based on: 1. The visibility of LEA in relation to other cohorts of childhood cancer survivors existing internationally; 2. The long-term impact of the heavy modalities of treatment, as the hematopoietic stem cell transplantation or irradiation; 3. The quality of life of the family long after the completion of cancer therapy; 4. The usefulness of a systematic follow-up in reducing inequalities in access to health care among social classes.

Les modèles animaux actuellement disponibles pour l’étude des leucémies humaines ne sont pas adaptés pour le développement optimal de nouvelles thérapies ciblées. Au cours de ce projet, qui s’inscrit dans une double perspective fondamentale et industrielle, nous avons cherché à générer un modèle versatile de leucémogénèse humaine chez la souris humanisée BRGS (BALB/c Rag2-/- IL-2Rγc-/- SIRPα.NOD). Les animaux sont greffés avec des progéniteurs hématopoïétiques transduits par des vecteurs lentiviraux surexprimant les oncogènes MYC et BCL2 et placés sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire (EF1α ou SFFV). Le suivi longitudinal des animaux sur une période de 5 mois montre que seule la construction SFFV/Myc-T2A-Bcl2 entraîne la transformation des progéniteurs hématopoïétiques. Entre 12 à 14 semaines post-greffe, >90% des animaux développent des lympho-proliférations de type pro-B (CD19+CD10+CD9+CD20-cytIgM-) infiltrant principalement la rate et la moelle osseuse, et circulant en abondance dans le sang. Le caractère transmissible des tumeurs est validé par des greffes secondaires de tumeurs spléniques. Les cultures in vitro de progéniteurs hématopoïétiques suggèrent que l’émergence des blastes est liée à la réactivation d’un programme B latent dans les précurseurs T, dont le développement est bloqué. Nous avons développé en parallèle un modèle de tumeur autologue. L’ensemble de ces résultats valide le modèle de leucémogénèse humaine développé chez la souris humanisée BRGS et ouvre des perspectives pour la caractérisation fonctionnelle des mécanismes de leucémogénèse, et la validation préclinique de nouvelles stratégies anti-tumorales. / Existing animal models for the study of human leukemia are not accurate for the proper development of innovative, targeted therapies. The aim of this project, which contains both a fundamental and an industrial perspective, therefore was to develop a new, versatile model of human leukemogenesis in the BRGS (BALB/c Rag2-/- IL-2Rγc-/- SIRPα.NOD) humanized mouse. Animals are grafted with hematopoietic progenitors transduced with lentivirals vectors to allow overexpression of MYC and BCL2 proteins under the control of an ubiquitous promotor (EF1α or SFFV). Longitudinal monitoring of the animals over five months shows that only the SFFV/Myc-T2A-Bcl2 construction induces the transformation of humans hematopoietics progenitors. Between 12 and 14 weeks post-transplantation, more than 90% of the animals develop pro-B lympho-proliferations (CD19+CD10+CD9+CD20-cytIgM-), with tumor cells being mainly found in the spleen, the bone marrow and in blood. Tumor transferability is achievable through secondary transplantation in immunodeficient mouse recipients. In vitro culture of bone marrow T cell progenitors suggest that the blasts arise from these cells after reactivation of a latent B cell program with blockade of their T cell development. In parallel, we have also developed an autologous tumor model. Altogether, these results validate the human leukemogenesis model constructed here in humanized BRGS mice and provide attractive prospects regarding the functional characterization of leukemogenesis and a preclinical validation of new anti-tumor strategies.

La leucémie lymphoblastique aiguë touche 30% des enfants atteints de cancer. 60% des patients atteints de leucémies lymphoblastiques aigües de type T (T-ALL) expriment de façon aberrante les gènes LMO1/2 (LIM -only2 and LMI-only1) suite à des translocations. Contrairement à leur rôle en tant que facteur de transcription qui est bien connu, leur rôle au niveau de la réplication de l’ADN et son impact oncogénique reste à étudier. Nous avons précédemment montré que LMO2 interagit avec le complexe de réplication et que son expression aberrante induit la réplication de l'ADN. Fait intéressant, des données préliminaires du laboratoire montrent une augmentation des dommages à l’ADN au stade pré-leucémique lorsque LMO1 est surexprimé dans les thymocytes. De plus, 90% des patients atteints de leucémies T-ALL présentent une délétion des gènes CDKN2A/B, des régulateurs importants de la sénescence. Afin de mettre en évidence l’importance du rôle de LMO1/2 dans la réplication de l’ADN, j’ai étudié l’interaction entre LMO2 et les protéines du complexe réplicatif, sa conséquence fonctionnelle ainsi que l’induction de sénescence pouvant en découler. L'analyse des séquences des clones issus d’un crible de double hybride pour des partenaires d’interaction avec LMO2 (POLD1, MCM6, PRIM1 et KAT7) a permis d’identifier des domaines potentiellement importants pour ces interactions, plus spécifiquement, un domaine en doigt de zinc dans la protéine KAT7. Une seconde approche bio-informatique de la dépendance génique et de sensibilité aux drogues en utilisant les bases de données Depmap et CancerRX des lignées leucémiques a permis de mettre en évidence un stress réplicatif spécifique aux lignées cellulaires leucémiques. Fait intéressant, 6 lignées cellulaires leucémiques sur 7, présentent dans la base de données CancerRX, (6 sur 7) qui présentent une sensibilité aux médicaments causant des dommages à l'ADN expriment des oncogènes LMO1 ou LMO2. Enfin, grâce au marquage intracellulaire par FACS, la surexpression de LMO1 et de son partenaire SCL dans les thymocytes conduit à une augmentation du niveau d’expression de la protéine P16, un marqueur de sénescence, au stade pré-leucémique. Nos résultats révèlent l’impact des oncogènes LMO1 et LMO2 dans les leucémies T-ALL, en particulier, sur la réplication de l'ADN. Ce stress réplicatif et la sensibilité spécifique des lignées cellulaires leucémiques au médicament causant des dommages à l'ADN pourraient donc expliquer l’efficacité de certains traitements en clinique contre la leucémie. / The acute lymphoblastic leukemia affects 30% of children with cancer. Chromosomal rearrangement implicating LMO1 or LMO2 are found in 60% of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cases. Contrary to their known transcriptional role, their precise function in DNA replication is still unclear. We previously showed that LMO2 interacts with the replication complex and its aberrant expression induce DNA replication. Interestingly, preliminary data show that overexpression of LMO1 in mice lead to an increase in DNA damage at the pre-leukemic stage. Moreover, 90% of T-ALL patients present a deletion of CDKN2A/B genes, which are important regulators of senescence. In order to demonstrate the importance of the role of LMO1/2 in DNA replication, I studied the interaction between LMO2 and proteins from the replicative complex, its functional consequence as well as the induction of senescence that may result from it. Sequence analysis of yeast two-hybrid clones of interaction with LMO2 (POLD1, MCM6, PRIM1 and KAT7) identified important domains for these interactions, more specifically, a zinc finger domain in KAT7 protein. A second bioinformatic approach of gene dependency and drug sensitivities using the Depmap and CancerRX databases has revealed a specific DNA replicative stress in leukemic cell lines. Interestingly, the majority of leukemic cell lines (6 out of 7) which present a sensitivity to drug causing DNA damage expresses either LMO1 or LMO2 oncogenes. Finally, using FACS intracellular labelling, the overexpression of LMO1 and its partner SCL in thymocytes lead to an increase in p16 protein levels, a marker of senescence, at the pre-leukemic stage. Our results revealed the impact of LMO1 and LMO2 oncogenes overexpression in T-ALL leukemia, in particular, on DNA replication. This replicative stress and the specific sensitivity of leukemic cell lines to drug causing DNA damage could therefore explain the effectiveness of certain clinical treatments against leukemia.

L’hématopoïèse est initiée à partir de cellules souches hématopoïétiques et aboutit à la production continue et contrôlée des cellules sanguines matures. Runt-related transcription factor 1 (RUNX1) code pour un facteur de transcription qui joue un rôle clé dans l'hématopoïèse. Des dérégulations de RUNX1 sont fréquemment associées à des cancers hématologiques, en particulier dans les leucémies aiguës lymphoblastiques à précurseurs B chez l'enfant (LAL-B). De plus, son activité transcriptionnelle est contrôlée par le recrutement de cofacteurs. Pour comprendre le mécanisme impliqué dans le contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 nous avons réalisé des immunoprécipitations de RUNX1 couplées à de la spectrométrie de masse et identifié Far Upstream Element binding protein 1 (FUBP1) comme un partenaire protéique potentiel de RUNX1. FUBP1 est un régulateur multifonctionnel impliqué dans divers processus cellulaires. Il a notamment été décrit récemment comme essentiel à l’expansion et à l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques. Par ailleurs, une surexpression du gène et des mutations potentiellement oncogéniques ont été décrits dans des cas de leucémies lymphoblastiques. Nous avons montré, grâce à la technique de PLA (Proximity Ligation Assay) que nous avons optimisé sur cellules non-adhérentes, que FUBP1 est un nouveau cofacteur de RUNX1 et qu’ils peuvent faire partie d’un même complexe régulateur dans les lymphoblastes pré-B humains. Par des expériences de ChIP couplées à du séquençage, nous avons localisé les régions de la chromatine sur lesquelles étaient fixées RUNX1 et FUBP1 de façon commune. Nous avons identifié l’oncogène c-KIT comme un gène cible commun et nous avons caractérisé deux régions régulatrices fixées par RUNX1, FUBP1 et des marques d’activation de la chromatine, au niveau du premier intron de c-KIT : une à +700 pb et l’autre au niveau d’un enhancer à +30 kb. De plus, nous avons déterminé les motifs de liaison de RUNX1 et FUBP1 essentiels pour l'activation de l’enhancer. Enfin nous avons démontré que la surexpression de FUBP1 et RUNX1 conduit à une augmentation de l’expression de c-KIT en ARNm et en protéine, augmente une des voies activées par c-KIT en présence de son ligand, favorise la prolifération cellulaire in vitro et in vivo et rend les cellules moins sensibles à un inhibiteur de c-KIT. En conclusion, nous avons démontré que FUBP1 est un nouveau partenaire de RUNX1 et qu’ensembles, ils activent la transcription de l’oncogène c-KIT en se fixant sur un enhancer commun, favorisant ainsi la prolifération cellulaire. Par conséquent, puisque FUBP1 et RUNX1 sont surexprimés dans certains types de leucémie, des altérations de cette régulation pourraient participer à l'apparition ou au maintien de leucémies. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives sur la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et sur les hémopathies malignes associées à des dérégulations de RUNX1, FUBP1 ou c-KIT. / Hematopoiesis is initiated from hematopoietic stem cells and results in the continuous and controlled production of mature blood cells. RUNX1 (Runt-related transcription factor 1) encodes a transcription factor playing a key role in hematopoiesis. Abnormal functions of this protein are implicated in blood cancer, notably in pediatric B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL). Moreover, its transcriptional activity is controlled by the recruitment of cofactors. To unravel the mechanisms behind the regulation of RUNX1 transcriptional activity, we performed RUNX1 specific immunoprecipitation experiments followed by mass spectrometry and identified the Far Upstream Element Binding Protein 1 (FUBP1) as a potential cofactor of RUNX1. FUBP1 is a multifunctional regulator involved in diverse cellular processes. FUBP1 has recently been described to be essential for expansion and self-renewal of hematopoietic stem cells and to function as a potential cancer driver gene in lymphoblastic leukemia. We have shown, with a proximity ligation assay that we have optimized in non-adherent cells, that FUBP1 is a new cofactor of RUNX1 and that these two proteins can be part of the same regulatory complex in human pre-B lymphoblasts. By chromatin immunoprecipitation combined with sequencing, we have localized common chromatin regions bound by RUNX1 and FUBP1. We have identified the oncogene c-KIT as a common target gene, and characterized two regulatory regions bound by both RUNX1, FUBP1 and active histone marks, within the first c-KIT intron: one at +700 bp and the other on an enhancer at +30 kb. Moreover, we have determined RUNX1 and FUBP1 binding sites essential for the enhancer activation. Finally, we have demonstrated that RUNX1 and FUBP1 overexpression in a pre-B cell line increases the expression of c-KIT both at mRNA and protein levels, exacerbates one of the c-KIT downstream pathways, promotes cell proliferation in vitro and in vivo and renders cells more resistant to a c-KIT inhibitor. In conclusion, we have demonstrated that FUBP1 is a new cofactor of RUNX1 and that they activate the transcription of the c-KIT oncogene by binding on a common enhancer, thus promoting cell proliferation. Therefore, since FUBP1 and RUNX1 are overexpressed in some types of leukemia, alterations in this regulation may contribute to the onset or maintenance of leukemias. These new findings open new perspectives on understanding the control of RUNX1 transcriptional activity, and on leukemias related to RUNX1, FUBP1 or c-KIT deregulations.

Il existe actuellement plusieurs tests globaux permettant l’évaluation de l’hémostase. Ces outils ont l’avantage, contrairement aux dosages individuels de facteurs ou aux tests classiques de coagulation (temps de prothrombine, temps de thromboplastine partielle activée), d’explorer le potentiel de coagulation global d’un individu, résultant de l’action combinée des facteurs pro et anti coagulants. Parmi ces tests, le test de génération de thrombine et les tests viscoélastiques ont retenu notre attention. Ils ont été utilisés pour explorer trois pathologies.La première partie de ce travail s’est focalisée sur l’évaluation du potentiel hémostatique chez les enfants atteints de leucémie aiguë lymphoblastique pendant le traitement par asparaginase native ou pégylée. L’asparaginase et les corticoïdes sont des molécules importantes du traitement, mais comportent différents effets indésirables, entre autre sur le système hémostatique avec l’apparition de thromboses. Le test de génération de thrombine a été exploré chez 56 enfants atteints de leucémie et a permis de mettre en évidence un potentiel de coagulation augmenté au diagnostic et pendant le traitement d’induction. Cet effet était moins marqué pour les patients sous asparaginase pégylée que sous asparaginase native.La deuxième étude a exploré l’hémostase chez les patients drépanocytaires greffés. Ces derniers ayant un profil hypercoagulable, l’étude a évalué l’influence de la greffe sur la balance hémostatique. Dix-sept patients ont été inclus. Les résultats confirment un profil hypercoagulant en situation pré-greffe et une correction, certes incomplète, de ce profil vers un profil normal en situation post-greffe.La troisième partie a étudié l’efficacité in vitro de l’acide tranexamique sur la fibrinolyse, particulièrement dans la chirurgie cardiaque pédiatrique. Pendant ce type d’intervention, le système vasculaire du patient est exposé à toute une série d’agressions qui conduisent à un risque non négligeable de saignement. Afin d’accroitre la stabilité du caillot, l’acide tranexamique, agent antifibrinolytique, est largement utilisé. La concentration plasmatique minimale à cibler, permettant une inhibition complète de la fibrinolyse est peu renseignée surtout dans la population pédiatrique. Afin de répondre à cette interrogation, la dose minimale d’acide tranexamique nécessaire pour inhiber la fibrinolyse a été déterminée, après sensibilisation d’un test viscoélastique à la fibrinolyse. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La télomérase est présente dans un nombre limité de cellules, telles que la plupart des cellules cancéreuses où son activité est indispensable pour l’immortalisation de ces dernières. C’est pourquoi cette enzyme a été proposée comme cible prometteuse pour des thérapies anticancéreuses. Ainsi, il est d’un intérêt certain d’identifier les mécanismes par lesquels elle est régulée, notamment via sa sous-unité catalytique, hTERT. Les rétinoïdes sont des inducteurs bien connus de la maturation granulocytaire associée à une répression de hTERT dans les blastes de leucémie aiguë promyélocytaire (LAP). Dans une lignée cellulaire LAP résistant à la maturation induite par les rétinoïdes (NB4-LR1), a précédemment été identifiée une nouvelle voie de répression transcriptionnelle de hTERT en absence de différenciation. De plus, mon laboratoire d’accueil a isolé un variant de la lignée NB4-LR1 résistant à cette répression transcriptionnelle de hTERT, la lignée NB4-LR1SFD. Ensemble, ces lignées cellulaires, qui se comportent différemment face à un traitement à l’ATRA, fournissent un outil unique et puissant pour obtenir plus d’informations sur plusieurs problèmes de la régulation de la biologie moléculaire de la télomérase. Dans cette étude, en utilisant plusieurs approches complémentaires (immunoprécipitation de la chromatine combinée à une technique d’analyse à haut débit du positionnement des nucléosomes et de la méthylation de l’ADN et une approche de FISH), j’ai pu obtenir une vue intégrée des événements épigénétiques qui promeuvent la transition du promoteur de hTERT d’un état silencieux à un état actif et inversement. Cette information sera cruciale pour le développement de stratégies anticancéreuses ciblant l’expression de hTERT. / Telomerase is present in a limited number of cells, most of them cancerous where its activity is crucial for their immortalisation. Thus, that enzyme has been proposed as a promising target for anticancer therapies. Therefore, it is of great interest to identify the mechanisms by which it is regulated, notably through its catalytic subunit hTERT. Retinoids are well-known inducers of granulocytic maturation associated with hTERT repression in acute promyelocytic leukemia (APL) blasts. However, in NB4-LR1, a maturation-resistant APL cell line, was previously identified a new pathway of retinoid-induced hTERT transcriptional repression independent of differentiation. Furthermore, my host lab reported the isolation of a variant of NB4-LR1 cells resistant to this repression: NB4-LR1SFD. These two cell lines, which behave distinctly in response to ATRA treatment, provide a unique and interesting tool to gain further insights into the molecular biology of telomerase regulation. In this thesis project, using several complementary approaches (chromatin immunoprecipitation combined to a high-resolution, single-molecule nucleosome positioning assay and DNA methylation, and a FISH approach) allowed me to shed more light on the integrated epigenetic events that lead to hTERT promoter transition from its silent to its active state and vice versa. The information obtained could be crucial for the development of anticancer strategies targeting hTERT expression.

Les hélicases sont des protéines qui utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP ou du GTP pour catalyser la disjonction des doubles hélices d'ADN ou d'ARN. Cette activité de déroulement de double brin leur confère un rôle essentiel dans le métabolisme des acides nucléiques, le maintien de la stabilité du génome et les processus de signalisation cellulaire. En conséquence, ils sont impliqués dans des processus aussi divers que le vieillissement, l'apparition de cancers, l'immunité innée. Cette thèse est axée sur la compréhension de la fonction et des mécanismes moléculaires de deux hélicases différentes et le manuscrit est donc divisé en deux parties. Le premier est dédié à l'hélicase RIG-I, une hélicase à ARN, exprimée lorsque les cellules leucémiques cessent de proliférer et sont induites à se différencier en granulocytes, indispensables à la reconnaissance de l'ARN double brin des virus, initiant la protection des cellules contre la réplication des génomes viraux. Le mécanisme d'action de RIG-I est bien décrit dans le contexte d'une infection virale. Mais dans le cas de la différenciation des cellules myéloïdes, l'intervention de RIG-I et son rôle dans la balance la prolifération / différenciation restent incomplets. En effet, les interactions RIG-I en particulier avec les ligands cellulaires ne sont pas totalement comprises. La première partie de mon travail consistait à tenter d'isoler et de caractériser les partenaires de RIG-I lors de la différenciation des cellules leucémiques NB4. La seconde est consacrée à l'étude des mécanismes sous-jacents aux G-quadruplexes résolus par les hélicases. Plusieurs questions subsistent quant aux interactions entre la structure particulière des G-quadruplexes et ces enzymes. Une hélicase de Bacteroides sp 3_1_23, BsPif1, a été choisie pour comparer et caractériser l'interaction entre les G-quadruplexes et l'ADN canonique de Watson-Crick. Dans les deux parties du travail, les interactions ont été étudiées par des techniques biochimiques utilisant soit une lignée cellulaire ou une protéine purifiée et des acides nucléiques synthétiques. / Helicases are proteins that utilize the energy provided by the hydrolysis of ATP or GTP to catalyse the disjunction of double DNA or RNA helices. This double strand unwinding activity gives them an essential role in the metabolism of nucleic acids, the maintenance of the genome stability and cell signalling processes. As a result, they are involved in processes as diverse as aging, the appearance of cancers, innate immunity. This thesis is focused on the understanding of the function and the molecular mechanisms of two different helicases and the manuscript is therefore divided in two parts. The first one is dedicated to the RIG-I helicase, an RNA helicase, expressed when leukemic cells stop proliferate and are induced to differentiate in granulocytes, which are essential in the recognition of double-stranded RNA of viruses, initiating the protection of the cells against the replication of the viral genomes. The mechanism of action of RIG-I is well described in the context of viral infection. But in the case of the differentiation of myeloid cells, the intervention of RIG-I and its influence on the equilibrium proliferation / differentiation remains incomplete. Indeed, RIG-I interactions in particular with cellular ligands are not fully understood. The first part of my work consisted in an attempt to isolate and characterize RIG-I partners during differentiation of NB4 leukemic cells. The second one is devoted to the study of mechanisms underlying G-quadruplexes resolving by helicases. Several questions remain about the interactions between the particular structure of G-quadruplexes and these enzymes. A Bacteroides sp 3_1_23 helicase, BsPif1, was chosen to compare and characterize the interaction between G-quadruplexes and canonical Watson-Crick DNA. In the two parts of the work, the interactions were investigated by biochemical techniques using either a cell line or purified protein and synthetic nucleic acids.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) represents approximately 25% of all pediatric cancers diagnosed every year. In about 80% of cases, pediatric patients will attain a 5-year event-free survival. Unfortunately, patients who are resistant to treatment or who relapse have a poor prognosis. Hence, novel therapeutic approaches are necessary to increase survival rates. Epigenetic alterations, such as DNA methylation and histone modifications, are involved in disease development, progression, and in particular, resistance to treatment. These reversible alterations represent novel targets in ALL. We recently discovered candidate epigenetic drugs in FDA-approved drug libraries. We performed a secondary screen to test the activity of these drugs in a panel of cancer cell lines. We found that a cardiac glycoside, called proscillaridin A, had anticancer specificity against pediatric leukemia cell lines. Thus, we hypothesize that proscillaridin A has some drug repositioning potential in pediatric ALL. To characterize its epigenetic mechanism of action, we treated two ALL cell lines Nalm-6 (pre-B ALL) and Molt-4 (T-ALL) in vitro for different time points (2-96h) with clinically relevant concentrations of proscillaridin A and analyzed cell growth, cell cycle, gene expression and chromatin modifications. We observed dose-dependent growth inhibition in both cell lines, where 50% of growth inhibition (IC50) was obtained at 3.0 and 2.3 nM in Nalm-6 and Molt-4, respectively. Our results using BrdU staining indicate a cell cycle block in the G2/M phase. By western blot, we detected significant decreases in histone 3 acetylation levels (H3K14ac, H3K9ac, and H3K27ac). Decreases in histone acetylation were associated with a significant reduction in histone acetyltransferase expression (CBP, P300 and TIP60) as well as the CMYC oncogene. By RNA sequencing and gene set enrichment analysis, we observed an upregulation of apoptosis and cell differentiation genes, as well as a decrease in cell proliferation and C-MYC target genes. These promising results illustrate the potential of using the cardiac glycoside proscillaridin A as a novel drug in treatment of relapsed or refractory ALL.