Les syndromes myélodysplasiques (SMD) peuvent être conçus comme des conditions pré-leucémiques dans lesquelles l’apoptose avorte les produits de différenciation de cellules souches mutées, potentiellement malignes. Néanmoins, peut-être à cause d’une inhibition progressive de l’apoptose, les SMD se transforment fréquemment en leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Nos données indiquent que les SMD à faible risque se caractérisent par l’absence d’activation de NF-κB au sein des cellules portant des altérations cytogénétiques typiques. Par contre, dans les SMD à haut risque de transformation en LAM (ainsi que dans les LAM post-SMD), les cellules souches hématopoïétiques et leurs produits de différenciation montrent une translocation activatrice des sous-unités p50/p65 de NF-κB. L’utilisation d’antagonistes de IKK provoque une inhibition de NF-κB conduisant à une apoptose accélérée, ainsi l’activation de NF-κB serait responsable de la suppression progressive de l’apoptose et donc de la transformation maligne. Ce projet de thèse a consisté à comprendre les mécanismes impliqués dans la dérégulation de l’apoptose dans les SMD/LAM ; ainsi qu’à utiliser des technologies de criblage pour permettre une meilleure compréhension des voies de signalisation impliquées, et à adapter de nouveaux outils d’analyse. Au cours d’une première étude, nous avons montré que les inhibiteurs de méthyltransférase de l’ADN et les inhibiteurs d’histones déacétylases induisent efficacement l’apoptose dans la lignée cellulaire SMD/LAM P39, parallèlement à une inhibition de la translocation de NF-κB du cytoplasme au noyau. Dans une seconde étude, nous avons montré que l’inhibition pharmacologique du récepteur Flt3 induit une inhibition de la voie NF-κB, et pourrait être une cible thérapeutique pertinente. Dans une troisième étude, nous avons montré que l’auto-activation d’ATM chez les patients atteints de SMD/LAM joue un rôle dans l’activation constitutive de NF-κB suggérant qu’ATM serait également une bonne cible thérapeutique dont l’inhibition pourrait réduire le défaut d’apoptose des cellules SMD et LAM. Et enfin, grâce à l’optimisation d’une technique d’analyse d’images à haut débit, nous avons identifié deux composés capables d’induire la mort cellulaire des lignées cellulaires LAM in vitro : le zinc pyrithione et la ouabain. Leurs effets d’inhibition du signal de survie NF-κB, conduisant à une réduction de l’expression de protéines anti-apoptotiques, suggèrent que ces composés pharmaceutiques pourraient être utilisés comme des agents anti-leucémiques. Ce projet de thèse nous a permis de mettre en évidence le potentiel anti-leucémique de différents agents impliqués dans les principales voies de signalisation de l’apoptose dérégulées dans les SMD/LAM, qui pourraient prochainement servir de cibles pour de nouveaux essais thérapeutiques. / Myelodysplastic syndrome (MDS) is a group of hematopoietic stem cell disorders that is characterized by an ineffective hematopoiesis (finaly leading to blood cytopenias) and by a high risk of progression to acute myeloid leukemia (AML). It can therefore be viewed as a preleukemic condition in which apoptosis aborts the differentiation products of potentially malignant mutated (stem) cells. The progression of MDS into AML is associated with progressive inhibition of apoptotsis (by e.g. the expression of antiapoptotic proteins) and a negative prognostic value, suggesting that loss of the apoptotic program could favor the MDS-to-AML transition. Therefore the present project aimed at understanding the mechanisms involved in the deregulation of apoptosis in MDS and AML and the characterization of their underlying signaling pathways by means of standard biochemical and high throughput screening approaches. Our previous work showed that inhibitors of DNA methyltransferases and histone deacetylases effectively induced apoptosis in AML cells in vivo which was associated with an inhibition of NF-κB-dependent transactivation of survival signals. We further found that the pharmacological inhibition of the Flt3 receptor in AML cells decreased NF-κB activation and might therefore constitute a relevant therapeutic target for the treatment of AML. In line with these findings we demonstrated that the constitutive activation of ATM in high-risk MDS and AML patients accounts for the activation of NF-κB suggesting ATM as yet another drugable target for antileukemic therapy. Finally we generated a high throughput image based screening platform, which enabled us to perform large scale drug screening approaches and to identify two compounds with antileukemic properties. Both agent, pyrithione zinc (PZ) and Ouabain (OUA) efficiently induced cell death in AML cells in vitro associated with the inhibition of NF-κB. PZ and OUA exerted significant anticancer effects in vivo, on human AML cells xenografts as well as ex vivo, on CD34+ (but not CD34-) malignant myeloblasts from AML patients. Summarizing this project allowed us to shed some light on the importance of NF-κB during MDS to AML progression and at the same time it helped to identify drugable targets and agents with potential anticancer properties for the treatment of leukemia.

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont un ensemble d’hémopathies clonales de la cellule souche. Ils touchent les sujets âgés et se caractérisent par une hématopoïèse inefficace, une différenciation anormale et une transformation fréquente en leucémie aiguë myéloblastique (LAM). La prise en charge thérapeutique a considérablement évolué ces dix dernières années, principalement avec l’arrivée de la 5-azacytidine (Aza) dans les SMD de haut risque. Malheureusement, il existe fréquemment un échec ou une perte de réponse rapide au traitement responsable d’une survie médiane globale de seulement quelques mois. La compréhension des mécanismes d’action des agents hypométhylants, la mise en évidence des facteurs biologiques impliqués dans la résistance à l’Aza ou encore l’identification de nouvelles associations de molécules constitue donc un enjeu majeur. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont démontré que l’erlotinib (Erlo) (inhibiteur de l’activité kinase de l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)) possède des effets antinéoplasiques dans les SMD/LAM. Compte tenu de sa toxicité modérée, cet inhibiteur de tyrosine kinase est actuellement en essai clinique en France et aux États-Unis dans les SMD en échec d’Aza. Dans ce travail, nous avons tenté de comprendre les mécanismes d’action impliqués dans l’activité de l’Aza et de l’Erlo seuls ou en association. Nous avons observé que l’Aza et la décitabine (un autre agent hypométhylant) induisent la déphosphorylation et la translocation dans le noyau du facteur de transcription FOXO3A où il réactive l’expression de gènes cibles tels que les facteurs pro apoptotiques PUMA et BIM. Cet effet observé rapidement, suggère un effet « off target » non lié à une reprogrammation épigénétique. La phosphorylation constitutive de FOXO3A étant considérée comme un facteur de mauvais pronostic dans les LAM, cette observation soulève l’intérêt potentiel des agents hypométhylants dans cette pathologie. Nous avons également identifié deux nouvelles cibles de l’Erlo : les SRC-kinases et la voie mTOR/p70S6K dont l’inhibition par des inhibiteurs biochimiques induit un arrêt du cycle cellulaire en G0/G1 sans apoptose ni différenciation confirmant l’hypothèse d’une action « multikinase » de l’Erlo. Par ailleurs, nous avons mis en évidence une activité synergique sur l’apoptose de l’association Aza et Erlo sur des lignées cellulaires de SMD/LAM et sur des cellules de patients. Cet effet n’a pas été retrouvé avec la décitabine ni les autres inhibiteurs de tyrosine kinase testés. La potentialisation de l’apoptose semble liée à plusieurs mécanismes associant l’augmentation de la concentration intracellulaire d’Aza via l’inhibition des transporteurs ABC, un arrêt de la prolifération, une activation des voies apoptotiques caspases-dépendantes et indépendantes et une activation des dommages à l’ADN. En conclusion, ce travail a permis l’identification de nouvelles cibles de l’Erlo et de l’AZA et a révélé un effet synergique entre ces deux molécules. Ces résultats précliniques encourageants suggèrent que cette association pourrait apporter un potentiel bénéfice chez les patients atteints de SMD/LAM, notamment ceux devenus réfractaires à l’Aza. / Myelodysplasic syndromes (MDS) constitute a diverse group of malignant clonal disorders that typically occur in elderly people. MDS are characterized by ineffective hematopoiesis, refractory cytopenias, morphologic dysplasia and increased potential to transform into acute myeloid leukemia (AML). Treatment of MDS has progressed considerably in recent years with the emergence of new approval agents such as azacytidine (aza)(a hypomethylating agent (HMA)) in higher-risk MDS. However, there are still a significant proportion of patients who do not respond to therapy with aza. Therefore, understanding the mechanisms of action of HMAs, identifying predictive factors for aza resistance and combining HMAs with other active compounds in MDS represent a challenging area to improve MDS/AML treatment. Previous works showed that erlotinib (an inhibitor of the epidermal growth factor receptor (EGFR)) exhibits antineoplastic effects in MDS/AML. Due to its limited toxicity profile, this tyrosine kinase inhibitor is currently being evaluated after failure of aza in two clinical trials. In this project, we aimed at understanding the molecular mechanisms involved in the activity of aza and erlo alone or in combination. We observed that aza and decitabine (another HMA related to aza) induces dephosphorylation and translocation to nucleus of the transcriptional regulator FOXO3A promoting the upregulation of the pro-apoptotic factors PUMA and BIM. This effect could be an “off target” effect and could contribute the bebenfical role of HMA in AML as constitutive phosphorylation of FOXO3A has been shown to be an adverse prognostic factor. We discovered new target for erlo, Src-kinase kinases and mTOR that are implicated in the cell-cycle arrest but not in the induction of apoptosis or differentiation confirming the “multikinase” activity of erlo. We found that the combination of aza and erlo demonstrated synergistic induction of apoptosis in MDS/AML cell lines and in some patient cells. This effect was not observed with decitabine or other tyrosine kinase inhibitors frequently used in onco-hematology. We demonstrated that potentiation of cell death is associated with different mechanisms such as intracellular accumulation of aza (via inhibition of ABC transporters), cell cycle arrest with inhibition of leukemic cells growth, caspase-dependent and -independent induction of apoptosis and DNA damage level. In conclusion, this work identified new targets of aza and erlo and revealed a synergistic induction of apoptosis upon co-treatment suggesting that this drug combination might be promising for SMD/AML treatment SMD/AML, especially the resistant patients.

De nombreuses altérations épigénétiques ont été décrites dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Nous avons récemment mis en évidence un enrichissement anormal en la marque histone H3K27me3, située sur 70 kb du cluster HIST1 (6p22) dans 50% des échantillons de patients atteints d'une LAM avec un caryotype normal (CN). Nous étudions dans ce travail, les conséquences cliniques et moléculaires de cette marque. H3K27me3 HIST1high est associé à 1) une meilleure survie des patients en analyse multivariée 2) la sous-expression du mRNA de plusieurs gènes histones (HIST1H1D, HIST1H2BG et HIST1H2BH) 3) un enrichissement fonctionnel en gènes associés à la réponse immunitaire ou inflammatoire, en faveur d’un engagement dans la différenciation granulocytaire, surexprssion confirmée pour trois de ces gènes (CYBB, FCN1 et CLEC4A) par RT-qPCR dans les blastes de patients H3K27me3 HIST1high 4) une diminution de la quantité absolue de protéine histone linker H1d par spectormétrie de masse et par Western blot et 5) une meilleure sensibilité à la différenciation induite par l'acide rétinoïque dans la lignée OCI-AML3 avec un KD de H1d (augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation CD11B et CD11C, présence de granules intra-cytoplasmiques et expression des gènes CYBB et ITGAM). En conclusion, le biomarqueur H3K27me3 HIST1high est associé à une meilleure survie dans les LAM-CN NPM1mut, un phénotype plus différencié des blastes et une sous-expression génique et protéique de certains histones incluant le sous-type histone linker H1d. H1d semble être important dans la différenciation des blastes de LAM NPM1mut et pourrait constituer une cible thérapeutique. / The epigenetic machinery is frequently altered in acute myeloid leukemia (AML). We previously described an abnormal histone H3K27me3 repressive enrichment covering 70 kb on the HIST1 cluster (6.p22). In the present work, we further studied the medical significance and the molecular impact of this new epigenetic biomarker. We observed that H3K27me3 HIST1high is associated with 1) a better patients' outcome in multivariate analysis, 2) a lower histone mRNA expression of several histone genes (HIST1H1D, HIST1H2BG and HIST1H2BH), 3) a mature granulocytic gene expression profile including immune or inflammatory responsive genes, (we confirmed the higher expression of three of these genes, CYBB, FCN1 and CLEC4A, using qPCR in the H3K27me3 HIST1high patients' samples), 4) a decrease in histone linker H1d absolute protein abundance by Mass spectrometry and by Western blot analyses and 5) a better retinoic acid sensitization of the H1d KD OCI-AML3 cell line (i.e. increase of CD11B and CD11C expression on cell surface, higher percentage of cytoplasmic granules and mRNA up-expression of two mature granulocytic genes, CYBB and ITGAM). To conclude, this study showed that epigenetic silencing of the HIST1 locus by the H3K27me3 mark is associated with a better outcome, but also a mature gene expression profile in the NPM1mut subgroup of patients. We suggested that H1d has an important role of histone linker expression in AML blast cell differentiation. This protein could constitute a new epigenetic target.

La famille des facteurs de transcription lkaros, est composée des protéines lkaros, Helios, Aiolos et Eos. Elles sont exprimées pendant le développement et régulent la différenciation des lymphocytes B et T. Ces protéines présentent une forte homologie de leurs séquences nucléiques et protéiques et sont toutes impliquées dans l'apparition de leucémies lymphoblastiques T ou B. Ces facteurs présentent toutefois de très fortes divergences dans leurs profils d'expression, leurs fonctions et leurs gènes cibles. Ce travail à partir d'une lignée cellulaire T immature déficiente pour lkaros à permis d'étudier les différences fonctionnelles et moléculaires des membres de la famille. La réexpression d'lkaros, d'Aiolos et d'Helios permet la différenciation et la diminution de la prolifération de ces cellules. Cette expérience a montré que les différents membres de la famille avaient des capacités distinctes pour activer ou réprimer certains gènes cibles. Un échange des séquences des domaines de liaison à l'ADN de Aiolos et d'lkaros, a permis de montrer que la spécificité fonctionnelle est en partie déterminée par le domaine de liaison à l'ADN, mais aussi par les autres régions d'lkaros et d'Aiolos. / The lkaros transcription factor family is made of the proteins lkaros, Helios, Aiolos and Eos. They are expressed during the development and regulate the differentiation of lymphocytes B and T. These proteins present a strong homology between their nucleic and protein sequences and are involved the appearance of T or B lymphoblastic leukaemia. However these factors present strong differences in their profiles of expression, their functions and their target genes. An immature T cell line, deficient for lkaros, allows us to study the functional and molecular differences of members of the family. There-expression of lkaros, Aiolos and Helios allows the differentiation and the decrease of the proliferation of these cells. I also showed that the various members of the family had different capacities to activate or repress certain target genes. An exchange of the protein sequences coding for the DNA binding domain (DBD), shows that the functional specificity is partially determined by the DBD domain, but also by the other regions of lkaros and Aiolos.

Les cellules T maturent dans le thymus lors d’un processus très régulé par l’intermédiaire de facteurs intrinsèques, comme des facteurs de transcription, et des facteurs extrinsèques (par exemple des cytokines des cellules stromales). L’acquisition du potentiel T au cours de la thymopoïèse, à partir d’un précurseur médullaire, se réalise grâce à des étapes successives définies par l’expression de molécules de surface et par les différents réarrangements des gènes du TCR qui sont ordonnés : le TCRd étant le premier à se produire, suivi par le TCRg et TCRb, pour finir par le TCRa. Les réarrangements du TCR restent également parfaitement ordonnancés dans les leucémies aigues lymphoblastiques T et ce malgré l’accumulation successive d’évènements oncogéniques. Il est ainsi possible de définir trois sous-groupes immunogénétiques de LAL-T ; (i) les formes immatures n’exprimant pas de TCRb cytoplasmique (ii) les LAL-T matures exprimant un TCR de surface et enfin (iii) les LAL-T intermédiaires, dites pré-ab, exprimant le TCRb en intracytoplasmique sans expression membranaire d’un hétérodimère ab ou gd. Dans ce dernier sous groupe de LAL-T de phénotype cortical, deux oncogènes à homéodomaines, TLX1 et TLX3, appartenant à la famille des gènes homéotiques orphelins NKL, sont souvent dérégulés. Nous avons précédemment mis en évidence le rôle direct des oncoprotéines TLX dans le processus de l’arrêt de maturation, grâce à leur interaction avec le facteur de transcription ETS1, bloquant l’expression et les réarrangements du TCRa. Néanmoins, une partie des LAL-T corticales ne surexprime ni TLX1 ni TLX3, posant la question de l’implication potentielle d’autres gènes de la famille NKL dans le blocage de maturation. Nous avons donc réalisé une analyse transcriptionnelle de l’ensemble des 46 gènes de la famille NKL dans une large série de LAL-T et comparé les résultats avec ceux obtenus dans des sous populations thymiques humaines triées. Nous avons ainsi identifié 10 gènes dérégulés de manière ectopique dans notre série de LAL-T, incluant 6 gènes dont la dérégulation était inconnue dans ce contexte. Par ailleurs, nous avons mis au point une approche complexe combinant une analyse en CGH-array haute résolution, le dosage allélique du locus TCRa et un système de RT-PCR multiplex afin d’étudier de manière exhaustive le statut du locus TCRa dans cette même série de LAL-T. Nos résultats ont ainsi montré que ces nouveaux gènes NKL aboutissent aussi à une répression du TCRa par un mécanisme similaire à celui observé avec les oncoprotéines TLX. Les lymphomes anaplasiques (ALCL), qui sont caractérisés par une expression aberrante d’ALK, issue de la t(2;5), expriment des marqueurs d’activation T (CD30), cytotoxique (granzyme, perforin, TIA1) et des réarrangements clonaux du TCR, mais sans signalisation du TCR/CD3. Le stade du développement lymphoïde T où est initié la lymphomagenèse est inconnu, il est possible que cette translocation se produise avant l’expulsion thymique. Pour étudier cette hypothèse, nous avons analysé l’ensemble des TCR (d,g,b,a) par PCR et CGH array dans une série d’ALCL humain et utilisé un modèle murin de lymphomagénèse T dans lequel NPM-ALK est exprimé à l’aide du promoteur de CD4. Nous avons croisé ce premier modèle avec des souris transgéniques RAG déficient et/ou en présence d’un transgène TCR (OT1), afin d’étudier le rôle du TCR dans le développement tumoral. Le modèle de lymphomagenèse identifié est basé sur une expression de NPM-ALK dès les stades précoces de la différenciation thymique, lorsque le transcrit de fusion peut remplacer le TCRb, et lors de l’expansion des thymocytes corticaux au niveau de la « b-sélection ». Un TCR est cependant nécessaire pour la sortie du thymus, bien que perdu lors du développement des ALCL en périphérie. En conclusion, nous avons montré l’implication du TCR dans deux modèles d’oncogenèse. (...) / T cells mature in the thymus through a highly regulated process mediated by intrinsic factors (e.g. transcription factors) and extrinsic factors (e.g. cytokines or stromal cells). The acquisition of T lymphoid commitment during thymopoiesis, originating from a bone marrow precursor, is carried out through successive stages defined by the expression of various surface molecules and the precisely ordered TCR gene rearrangements; TCRd being the first to occur, followed by the TCRg and TCRb, and finally TCRa. TCR rearrangements are also highly coordinated in T acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) despite the successive accumulation of oncogenic events. It is thus possible to define three immunogenetic subgroups of T-ALL; (I) the immature forms that do not express cytoplasmic TCRb, (ii) mature T-ALL which express a surface TCR and finally (iii) intermediate T-ALL, termed preab, which express intracytoplasmic TCRb without membrane expression of a TCR ab or gd Complex. In the latter subgroup, classically termed cortical T-ALL, two oncogenic transcription factors belonging to the NKL family of homeobox genes, TLX1 and TLX3, are commonly deregulated. We have previously demonstrated the direct role of TLX oncoproteins in the process of maturation arrest through their interaction with the ETS1 transcription factor, which blocks expression and rearrangements of TCRa. Not all cortical T-ALL cortical overexpress TLX1 nor TLX3, however, suggesting that other NKL family genes might be involved in the maturation arrest. We therefore, conducted a transcriptional analysis of all 46 NKL family genes in a large series of T-ALL and compared the results with those obtained in sorted human thymic subpopulations. We identified 10 ‘ectopic’ deregulated genes in T-ALL, including 6 genes whose deregulation was previously unknown in this leukemia. By combining high resolution CGH array, allelic of TCRa locus dosage and a novel TCRa RT-PCR multiplex, we show that these deregulated NKL genes also lead to inhibition of TCRa rearrangement, similar to that observed with TLX. These date demonstrate that homeobox inhibition of TCRa rearrangement is likely to explain the maturation arrest in the majority of cortical T-ALL, the commonest and most emblematic subgroup in this leukemia. Anaplastic lymphoma (ALCL), which are characterized by t(2;5) driven aberrant expression of ALK, express T activation markers (CD30), cytotoxic (granzyme, perforin, TIA1), and clonal TCR rearrangements in the intriguing absence of TCR/CD3 signaling. It is not clear at what stage of development ALCL lymphomagenesis is initiated, but as the expression of NPM is ubiquitous, it is possible that this translocation occurs before thymic egress. To investigate this, we analyzed all TCR(a,b,g,d) by PCR and CGH array in a series of human ALCL and compared these results with a T lymphomagenesis murine model in which NPM-ALK is regulated by the CD4 promoter. We crossed this first model with RAG deficient transgenic mice in the presence or not of a TCR transgene (OT1), to study the role of the TCR in tumor development. NPM-ALK expression from the earliest stages of thymic differentiation allow the fusion transcript to replace TCRb during the cortical thymic cellular expansion process known as "beta-selection". A TCR is, however, necessary for thymus egress, but is subsequently lost during the development of ALCL in the periphery, suggesting that the coexistence of TCR and NPM-ALK signaling is not compatible with lymphomagenesis and that the TCR may act as a tumor suppressor gene. In conclusion, we have delineated the involvement of TCRa in two models of oncogenesis. In T-ALL, NKL oncoproteins NKL prevent TCRa rearrangements and block cells at the highly proliferative TCRb-selection cortical thymic stage. In ALCL, a functional TCR appears to act as a tumor suppressor gene. Both models pave the way to differentiation therapy via TCR modulation.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont caractérisées par la prolifération maligneincontrôlée de précurseurs lymphoïdes T bloqués dans la différenciation. Les stades d’arrêt dematuration observés dans les LAL-T reproduisent fidèlement les différentes étapes de la maturationthymique humaine. Ainsi nous avons montré que le facteur de transcription myéloïde CEBPA, expriméuniquement dans les précurseurs thymiques les plus immatures (ETP), est réprimé par un mécanismed’hyperméthylation dans les LAL-T à l’exception des formes les plus immatures. Il est aujourd’huicommunément admis que les LAL-T constituent une pathologie dite « multi-hits » où les oncogènesde type A affectent la différenciation tandis les oncogènes de type B sont impliqués dans la régulationdu cycle cellulaire, l’auto-renouvellement et/ou l’engagement dans la lignée T. La voie de signalisationde NOTCH, cruciale pour le développement lymphoïde T, est constitutivement activée par la survenuede mutations des gènes NOTCH1 et/ou FBXW7 (N/F) dans environ 60% des LAL-T. La valeurpronostique de ces mutations est controversée. Dans notre travail, nous avons montré que lesmutations de N/F sont plus fréquentes dans les LAL-T arrêtées à un stade de maturation cortical etconfèrent un bon pronostic qui semble toutefois dépendre de la chimiothérapie administrée. Grâce àl’étude de cette large cohorte de LAL-T nous avons pu également établir la fréquence de l’anomalieoncogénique CALM-AF10. Cette dernière est très fréquente dans les LAL-T qui se développent àpartir des ETP dites de mauvais pronostic. Nous avons montré que c’est la présence de l’anomalieCALM-AF10 qui confère le pronostic défavorable à ce sous-type de LAL-T. Contrairement à lalittérature nous n’avons pas retrouvé de valeur pronostique liée à la surexpression des gènes ERG etBAALC. L’étude des anomalies génétiques des LAL-T permet de mieux comprendre l’oncogénèse etd’identifier les anomalies avec une valeur pronostique. L’intérêt de ces travaux est d’apporter une aideaux cliniciens pour une stratification thérapeutique adaptée afin de donner les meilleures chances desurvie aux patients. / T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) are lymphoid neoplasms characterized by theproliferation of malignant T lymphoblasts arrested at early stages of maturation. Maturation arrest in TALLmirrors normal lymphopoiesis. Thus we have shown that the myeloid transcription factor CEBPA,expressed only in the most immature thymic precursors (ETP), is commonly repressed byhypermethylation in T-ALL with the exception of the most immature subset. It is now widely acceptedthat T-ALL is a “multi-hits” disease where the type A oncogenes affect the differentiation while type Boncogenes are involved in cell cycle regulation, self-renewal and T-cell commitment. The Notchsignaling pathway, crucial for T cell development, is constitutively activated by the occurrence ofmutations in NOTCH1 and /or FBXW7 (N / F) genes in approximately 60% of T-ALL. The prognosticvalue of these mutations is controversial. In our study, we showed that N/F mutations are morefrequently observed in T-ALL arrested at a cortical stage of maturation and confer a good prognosiswhich seems to be influenced by the therapeutic regimen. In this large cohort of T-ALL we could alsodetermine the frequency of the CALM-AF10 oncogenic abnormality. The latter is very common in TALLdeveloped from ETP wich are of very poor prognosis. We have shown that this is the presence ofCALM-AF10 which confers the poor prognosis in this subtype of T-ALL. Contrary to the litterature wedid not find any prognostic value associated with the overexpression of ERG and BAALC genes. Thestudy of genetic abnormalities in T-ALL provides a better understanding of oncogenesis and identifyabnormalities with prognostic value. The interest of this work is to assist clinicians for an efficienttherapeutic stratification to overcome the poor outcome of T-ALL patients.

Le microenvironnement, composé de différents éléments cellulaires et de la matrice extracellulaire, joue un rôle primordial dans le développement tumoral et la dissémination métastatique. Ainsi, l’étude de ces interactions cellulaires est importante pour que des thérapies ciblées luttent contre la chimiorésistance des cellules tumorales. Ce travail de thèse a pour but d’étudier le rôle du facteur de croissance IGF-I dans la chimiorésistance des cellules du cancer de l’ovaire et des leucémies myéloïdes présente au sein du microenvironnement.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la chimiorésistance des cellules du cancer de l’ovaire, acquise grâce aux cellules hôtes (hospicells), est liée à la sécrétion de IGF-I par ces cellules. Nous avons également montré que IGF-I est impliqué dans la régulation de certains gènes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, et BCRP) via les voies de STAT3, Jak2, PI3K et ERK.Dans les leucémies myéloïdes, nous avons montré que IGF-I a un effet sur la prolifération des cellules tumorales. Il induit l’expression de la protéine P-gp ainsi que la chimiorésistance des cellules sensibles à la chimiothérapie. Nous avons également déterminé le rôle de IGF-I dans la résistance des cellules leucémiques en présence des hospicells. Ces dernières ont une activité hyperangiogénique in vivo, lié à l’HIF-1 et au VEGF, et inhibent les réponses immunes des lymphocytes T par production de NO.Nous avons déterminé le rôle crucial de MMP-9 dans la migration des cellules résistantes du cancer du sein exprimant la protéine P-gp et dans la formation d’un réseau tubulaire, suggérant un lien existant entre l’expression de P-gp et de MMP-9. / The microenvironment, composed of several cellular elements and extracellular matrix, plays an important role in tumor development and metastasis. Thus, the study of these interactions is important for cell targeted therapies fighting against chemoresistant tumor cells. This thesis aims to investigate the role of growth factor IGF-I in the chemoresistance of ovarian cancer cells and myeloid leukemia, present in the microenvironment.As a first step, we demonstrated that drug resistance of ovarian cancer cells gained by host cells (hospicells) is related to the secretion of IGF-I by these cells. We have also demonstrated that IGF-I is involved in the regulation of genes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, and BCRP) via STAT3, Jak2, PI3K et ERK signaling pathways.In myeloid leukemia, we have shown that IGF-I has an effect on cell proliferation. It induces the expression of P-gp protein and chemoresistance of cells sensitive to chemotherapy. We also determined the role of IGF-I in the resistance of leukemic cells in the presence of hospicells. These cells have an in vivo hyperangiogenic activity, related to HIF-1 and VEGF, and inhibit immune responses of T cells by NO production.We determined the crucial role of MMP-9 in resistant cells migration of breast cancer expressing P-gp protein and in the formation of a tubular network, suggesting a link between the expression of P-gp and MMP-9.

Les macrophages (Mɸ) infiltrés dans les tumeurs orchestrent les différentes étapes du développement tumoral. De par leur capacité à internaliser les nanoparticules (NPs) et leur plasticité phénotypique, ils sont impliqués dans l’efficacité thérapeutique des actifs vectorisés par un rôle de réservoir de NPs ou une modulation de leur réponse envers les cellules néoplasiques. Le calcitriol, métabolite actif de la vitamine D, possède des activités à la fois anticancéreuse et immunomodulatrice. Sa vectorisation via des NPs est une approche thérapeutique intéressante pour potentialiser ses activités tout en limitant les effets secondaires s’opposant à son utilisation clinique dans le cadre de la chimiothérapie. Une étude de formulation a permis de développer des NPs à base d’acide poly(D,L)lactique et de triglycérides (ratio 1:2) d’une taille de 200 nm et présentant une libération prolongée du calcitriol. Des études in vitro menées sur les cellules de cancer du sein MCF-7 ont permis de mettre en évidence l’avantage d’une libération prolongée du calcitriol vis-à-vis de son activité antiproliférative aboutissant à une réduction de 65% de la viabilité cellulaire après 10 jours par rapport au contrôle, non observable avec le calcitriol libre. La participation active des M? à l’activité cytotoxique du calcitriol sur les lignées cellulaires de cancer du sein MCF-7 et de leucémie MV4-11 a aussi été mise en évidence par un modèle de co-culture in vitro. En effet, les NPs de calcitriol, après internalisation par les Mɸ, provoquent une action cytotoxique prolongée contre les cellules MCF-7 en co-culture au bout de 10 jours avec seulement 20% de cellules viables vs 70% en l’absence de Mɸ / Tumor associated macrophages (Mɸ) orchestrate the different stages of tumor development. They are able to internalize nanoparticles (NPs) and are known for their phenotypic plasticity, which make them interesting targets for cancer treatment through the storage of NPs or a modulation of their activity towards the neoplastic cells. Calcitriol, the active metabolite of vitamin D, exerts both anticancer and immunomodulatory activities. Its vectorization via NPs is an interesting therapeutic approach to potentiate its activities while limiting its side effects, which hamper its current clinical use in chemotherapy. We developed poly (D, L) lactic acid and triglyceride-based NPs (1:2 ratio) measuring 200 nm and exhibiting a sustained release of calcitriol. In vitro studies, performed on breast cancer cells (MCF-7), showed the advantages of a sustained release of calcitriol regarding its antiproliferative activity with a 65%-decrease in cell viability after 10 days compared to unexposed cells, while it was unobservable for free calcitriol. The implication of Mɸ in the cytotoxic activity of calcitriol towards MCF-7 cells and MV4-11 cells (leukemia) cells has been demonstrated using an in vitro co-culture model. Calcitriol-NPs showed a sustained cytotoxic activity towards MCF-7 cells in co-cultures after 10 days, through their uptake by Mɸ, with a decrease in cell viability of 80% vs 30% in mono-cultures

Les leucémies aiguë myéloïde (LAM) sont un groupe d’hémopathies malignes, dont le traitement est généralement composé de deux génotoxiques : la cytarabine (Ara-C) et la daunorubicine (DNR). Nous avons montré que l’Ara-C et la DNR induisent la déconjugaison rapide de SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier) de ses protéines cibles. Cette deSUMOylation est dûe à l'inactivation des enzymes E1 et E2 de SUMOylation par les espèces réactives de l'oxygène (ROS) produites par l’Ara-C et la DNR et est impliquée dans l'activation de l'apoptose. En outre, cet axe ROS/SUMO est anergisé dans les LAM chimiorésistantes. Cependant, il peut être réactivé par des pro-oxydants ou par inhibition de la voie SUMO par l'acide anacardique. Pour identifier les protéines contrôlées par l’axe ROS/SUMO nous avons effectué une approche de spectrométrie de masse quantitative (SILAC). Parmi les 1000 protéines SUMOylées identifiées, la plupart des 114 protéines qui perdent leur SUMOylation lors du traitement sont impliquées dans la régulation de l'expression des gènes. De plus, un ChIP-Seq avec des anticorps anti SUMO-2 a permis de montrer que les génotoxiques, en particulier la DNR, induisent une diminution massive de la présence de protéines SUMOylées sur la chromatine. La recherche de motifs au sein des séquences fixant SUMO a permis d’identifier le motif de liaison de CTCF à l’ADN. De plus, CTCF a été trouvé dans la SILAC comme l’une des protéines déSUMOylées par les traitements. En utilisant des données publiques de Chip-Seq pour CTCF, nous avons identifié 55 gènes qui fixent à la fois CTCF et SUMO et dont l’expression est régulée par les traitements. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons étudié le groupe de 19 protéines dont la SUMOylation augmente suite aux traitements génotoxiques. Parmi ces protéines, nous avons trouvé diverses protéines centromériques, y compris CENP-B et CENP-C. En utilisant le PLA (Proximity Ligation Assay) nous avons pu montrer que CENP-B et CENP-C colocalisent avec SUMO et yH2AX après traitement. Cela suggère que la SUMOylation des protéines centromériques se produit sur les sites de cassure et pourrait jouer un rôle dans la réparation des dommages de l'ADN. / Acute Myeloid Leukemias (AML) are a group a severe hematological malignancies, which treatment is generally composed of two genotoxics: Cytarabine (Ara-C) and Daunorubicin (DNR). We have shown that these drugs induce the rapid deconjugation of the Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO) from its target protein. This is due to the inactivation of SUMO E1 and E2 enzymes by Reactive oxygen species (ROS). This deSUMOylation participated in the activation of specific genes and is involved the induction of apoptosis. In addition, this ROS/SUMO axis is anergized in chemoresistant AMLs. However, it can be reactivated by pro-oxidants or inhibition of the SUMO pathway with anacardic acid, an inhibitor of the SUMO E1. To identify which proteins are regulated by this ROS/SUMO axis, we performed a quantitative mass spectrometry approach. Among the 1000 identified SUMO targets, most of the 114 proteins, which SUMOylation decrease upon treatment, are involved in the regulation of gene expression. In addition, we showed by ChIP-Seq with SUMO-2 antibodies that genotoxics, in particular DNR, induce a massive decrease of the presence of SUMOylated proteins on the chromatin. Motif search analysis of the SUMO binding sequences in these genes identified CTCF binding motif. Interestingly, CTCF was found in the SILAC as deSUMOylated by the drugs. Using publicly available ChIP-Seq data for CTCF, we found 55 genes which are occupied by both SUMO-2 and CTCF and which expression is regulated by the drugs. In the last part of this work, we got interested in the 19 proteins that get up-SUMOylated upon treatment. Among them, we found centromeric proteins, including CENP-B and CENP-C. Using Proximity Ligation Assay, we could show that CENP-B and CENP-C colocalize with both SUMO and yH2AX upon DNR treatment. Altogether, this suggests that centromeric protein up-SUMOylation occurs at sites of DNA damage and might play a role in DNA damage repair.

CD20 est une cible thérapeutique validée pour l’immunothérapie des néoplasmes lymphoïdesdes cellules B, incluant la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Nous avons comparé les effets de rituximab et de GA101 (nouvel anticorps anti-CD20) contre les cellules LLC fraiches in vitro. Le marquage avec Annexine V a démontré une induction de l’apoptose après l’exposition au rituximab et GA101.Contrairement au rituximab, GA101 induisait une réduction du potentiel transmembranaire mitochondrial, uneffet qui peut être partiellement inhibé par la cyclosporine A et qui est partiellement caspase-dépendant. GA101induisait aussi la production des espèces d’oxygènes réactives. L’analyse du niveau d’expression des protéinespro- et anti-apoptotiques après exposition aux anticorps a démontré une forte hétérogénéité entre les échantillons.Bax subissait une activation de conformation et une translocation mitochondriale suite à l’exposition aux anticorps d’une manière caspase-indépendante. GA101, mais pas rituximab, induisait le clivage des caspase-8, -9et -3. En transfectant les cellules LLC avec un siRNA ciblant Bcl-xL utilisant la sonoporation, nous avons trouvéque la réduction du niveau d’expression de Bcl-xL est associée à une augmentation de la sensibilité aux anticorps. Nos résultats suggèrent que les voies de signalisation apoptotiques diffèrent entre rituximab et GA101avec une implication de la voie mitochondriale avec le GA101. L’inhibition de Bcl-xL peut constituer une façon pour sensibiliser les cellules LLC aux effets apoptotiques des anticorps anti-CD20. / CD20 is a validated target for the immunotherapy of B lymphoid neoplasms, including ChronicLymphocytic Leukemia (CLL). We compared the activities of rituximab and GA101 (novel anti-CD20 antibody)on fresh human CLL cells in vitro. AnnexinV staining demonstrated induction of apoptosis after exposure torituximab or GA101. Unlike rituximab, GA101 induced a reduction of the mitochondrial transmembranepotential, an effect which could be partially inhibited by cyclosporin A and which was partially caspasedependent.GA101 was also found to induce the production of Reactive Oxygen Species. Analysis of pro- andanti-apoptotic protein content after exposure to antibodies demonstrated a strong degree of heterogeneity between samples. Bax underwent conformational activation and mitochondrial translocation upon exposure toantibodies in a caspase-independent manner. GA101 but not rituximab induced cleavage of caspase-8, -9 and -3.By transfecting CLL cells with anti-Bcl-xL siRNA using a sonoporation method, we found that reduction of BclxLcontent was associated with increased sensitivity to these antibodies. Our results suggest that apoptoticsignalization pathways differ between rituximab and GA101 with a greater involvement of the mitochondrialpathway for GA101. Inhibition of Bcl-xL could constitute an approach to sensitize CLL cells to the apoptoticeffects of anti-CD20 antibodies.