La vigueur de la réponse immunitaire générée par les cellules dendritiques (DC) a positionné ces cellules comme médiatrices centrales dans l’activation des lymphocytes T. La vulnérabilité des cellules cancéreuses de leucémie myéloïde chronique (LMC) à l’intervention immunitaire résulte apparemment de la capacité des cellules leucémiques de se différencier en DC. Ces DC ont alors la capacité de présenter des peptides provenant des cellules souches leucémiques aux lymphocytes T. Dans ce travail, nous démontrons que la plupart des patients atteints d’une LMC présentent un déficit important en DC au niveau du sang et de la moelle osseuse avant la greffe de cellules souches allogéniques. Les faibles niveaux de DC circulantes résultent en grande partie d’une perte de la diversité au niveau des cellules progénitrices CD34+ leucémiques au niveau de la moelle osseuse. Ces cellules progénitrices CD34+ présentent d’ailleurs une capacité réduite à se différencier en DC in vitro. Nous avons trouvé qu’un décompte faible de DC avant une greffe allogénique était associé à une diminution significative de la survie et une augmentation considérable du risque de développer une des complications mortelles. Puisque la reconstitution des DC suite à la greffe est absente, notre étude appuie aussi la thèse que ce sont les cellules DC pré greffe qui sont primordiales dans l'effet du greffon contre leucémie (GVL). Dans ce contexte, notre étude suggère que le compte des DC avant la greffe allogénique pourrait servir de marqueur pronostique pour identifier les patients LMC à risque de développer certaines complications suite à une greffe allogénique. / The intensity of the immune response that is generated by the dendritic cells (DCs) has established these cells as central mediators in the activation of T lymphocytes. The vulnerability of leukemic cells present in chronic myeloid leukemia is mostly attributable to the ability of the leukemic stems cell to differentiate themselves into potent DCs. The latter are then able to present peptides which come from endogenous origin and from leukemic stem cells to the T lymphocytes. In this thesis, we demonstrate that, before allogeneic stem cell transplant, the majority of patients afflicted by CML have a considerable lack of DCs in their peripheral blood as well as in their bone marrow. The low levels of circulating DCs result to a great extent from a loss of diversity in the CD34+ leukemic progenitor cells located in the bone marrow. Moreover, these CD34+ leukemic progenitor cells display a reduced capacity to differentiate themselves into DCs in vitro. Our findings show that having a low level of DCs prior to an allogeneic transplant is associated with a significant decline in survival rates as well as with increased risks of developing life threatening complications. Since the DCs’ reconstitution following an allogeneic bone marrow transplant is missing, our study supports the thesis that pre graft DCs are essential in the Graft versus leukemia effect (GVL).Therefore, our research suggests that tallying DC before proceeding with an allogeneic transplant could act as a prognostic marker to identify LMC patients who present risks of complications after an allogeneic transplant.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif rare traité par des inhibiteurs de tyrosine kinase, tel que l’imatinib. Malgré son efficacité, la résistance au traitement est un problème récurrent. Des variants génétiques responsables d’une altération de la mort cellulaire programmée (apoptose) pourraient notamment expliquer l’hétérogénéité de la réponse au traitement entre les patients. Dans un premier temps, l’objectif était de rechercher des variants candidats. Pour cela un panel de 45 gènes impliqués dans l’apoptose a été étudié par séquençage nouvelle génération chez 24 patients atteints de LMC, 12 répondeurs et 12 résistants au traitement par imatinib. A l’aide d’outils informatiques, 473 polymorphismes ont été détectés. Le nombre de patients étudiés étant limité, de nouvelles méthodes statistiques ont dû être développées pour analyser les résultats obtenus. Tout d’abord, les fréquences de survenue des variants chez les patients résistants et répondeurs ont été comparées aux fréquences observées dans la population générale et visualisées par une approche de statistiques descriptives. Cette stratégie a permis de réduire la liste à 95 polymorphismes pouvant être impliqués dans la résistance au traitement. Par la suite, les gènes ont été classés selon leur enrichissement en allèles variants. Au final, trois gènes candidats ont été choisis et séquencés chez 103 patients. Cette méthodologie, automatisée grâce à un algorithme informatique, a permis de mettre en évidence, un variant non synonyme dans le gène BCL RAMBO, retrouvé plus fréquemment chez les patients résistants de manière significative. Dans un second temps, l’objectif était de caractériser le rôle de ce variant dans la réponse à l’imatinib à l’aide de lignées cellulaires modifiées par la technologie CRISPR-Cas9. Des cellules n’exprimant plus la protéine ont été obtenues et ont permis de mettre en évidence le rôle majeur de la protéine BCL RAMBO dans l’inhibition de l’apoptose. Des lignées cellulaires portant le variant candidat ont également été créées à l’aide d’une nouvelle technique utilisant CRISPR-Cas9 : l’exon entier contenant le nucléotide d’intérêt a été remplacé par un exon modifié. La modification d’un acide aminé induite par le variant a été associé à une perte de la sensibilité au traitement par imatinib dans ces lignées, comme suggéré après séquençage des patients. Ces données indiquent que BCL-RAMBO, facteur anti-apoptotique dans une lignée modèle de LMC, pourrait devenir une nouvelle cible thérapeutique afin de surmonter la résistance à l’imatinib / Chronic myeloid leukemia (CML) is a rare myeloproliferative syndrome treated by tyrosine kinase inhibitors, such as imatinib. Despite its efficacy, resistance to treatment is a persistent clinical issue. Notably, genetic variants causing alterations in apoptosis may explain heterogeneity of imatinib sensitivity between patients. First, the goal was to look for candidate variants. For that purpose, a panel of 45 apoptotic genes was assessed by next-generation sequencing on 24 CML patients, 12 sensitive and 12 resistant to imatinib treatment. Using informatics tools, 473 polymorphisms were detected. As the number of sequenced samples was limited, novel statistical methods had to be developed to interpret the results. The variant frequency in resistant and sensitive patients was compared to variant frequency in the general population and visualized using descriptive statistics. This strategy allowed to obtain a restricted list of 95 polymorphisms that might be involved in resistance to the treatment. Then, genes were ranked according to variant allele enrichment. At the end, three candidate genes were chosen and sequenced for 103 CML patients. This methodology, automated using a computer algorithm, permitted to highlight a nonsynonymous variant in the BCL RAMBO gene, significantly found more often in resistant patients. Second, the objective was to characterize the role of this variant in response to imatinib using model cell lines modified by CRISPR-Cas9 technology. BCL-RAMBO knock-out cells were obtained and allowed to demonstrate the major role of BCL-RAMBO protein in apoptosis inhibition. Additionally, cell lines carrying the variant were created using a new CRISPR-Cas9 mediated technique: the whole exon carrying the nucleotide of interest was replaced with a variant exon. The amino acid change induced by the identified polymorphism was associated with a loss of sensitivity to imatinib treatment in these cell lines as suggested after patient sequencing. These data indicate that BCL-RAMBO, anti apoptotic factor in a CML cell line, could become a novel therapeutic target to overcome drug inefficacy for a subset of resistant patients.

Les Inhibiteurs de l'activité Tyrosine Kinase (ITK) de BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) et Dasatinib (DAS)) ont révolutionné le traitement de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC), mais la cinétique et l'intensité des réponses thérapeutiques restent variables. Par ailleurs, plusieurs travaux démontrent qu'il persiste chez la majorité des patients des cellules souches leucémiques (CSL) CD34+ résistantes aux ITK et capables de reconstituer la maladie. Partant du principe que la thérapie ciblée (les ITK) devait atteindre le compartiment cellulaire et du constat qu'aucune méthode ne permettait d'évaluer la quantité d'ITK dans les cellules malignes vivantes, nous avons développé un procédé en cytométrie en flux pour quantifier ces molécules dans les cellules de la LMC. Nous avons ainsi démontré que la mort cellulaire des lignées K562 et KCL22 à 24h est étroitement corrélée à la quantité d'IMA accumulée dès la 1ère heure. L'application du procédé aux cellules primaires a montré un taux intracellulaire d'ITK dépendant des caractéristiques des cellules et variable d'un sujet à l'autre (Article 1). Pour l'instant, en raison de l'hétérogénéité de notre cohorte, nous n'avons pas pu mettre en évidence de corrélation entre l'accumulation des ITK et la réponse thérapeutique de la LMC. Notre procédé nous a permis de suivre l'accumulation in vivo du DAS dans les blastes circulants d'un patient LMC en phase d'acutisation, en parallèle de la réactivation de pSyk348 - que nous avons identifié comme marqueur de progression - au moment de l'échappement au DAS (Article 2). Un avantage majeur du procédé est la possibilité d'analyser les différentes sous-populations, dont les cellules CD34+ de LMC. Ces dernières ont un taux d'ITK intracellulaire plus faible que les cellules matures, voire absent chez certains patients. Pour l'instant une corrélation significative avec les tests clonogéniques effectués en parallèle est retrouvée seulement avec le DAS. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent des différences entre les cellules CD34+ du sang et de la moelle. En conclusion, ce procédé permet d'évaluer la quantité d'ITK dans des sous-populations cellulaires précises et viables. Nous envisageons de poursuivre ce projet par l'évaluation de l'intérêt d'un dosage précoce du taux d'ITC intracellulaire in vivo (après la 4ème prise) d'une part et d'autre part par l'étude de l'influence du microenvironnement sur la résistance des CSL de LMC aux ITK et sur certaines dérégulations propres à ce compartiment cellulaire. / The Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) of BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) and dasatinib (DAS)) have revolutionized the treatment of Chronic Myeloid Leukemia (CML). However therapeutic responses remain variable. Moreover, several studies showed that most patients have persistent CD34+ leukemic stem cells (LSCs) resistant to TKI and the origin of disease relapse. Given that the targeted therapy (TKI) should reach malignant cells and that no method was able to assess the amount of TKI in viable target cells, we have developed a process by flow cytometry for TKI quantification in target cells. By using K562 and KCL22 cell lines we showed that cell death at 24hrs was closely related to IMA uptake after one hour of incubation. We then applied our method to primary cells and showed an intracellular level of IMA, NIL and DAS dependent on cell characteristics and heterogeneous from one subject to another (Article 1). Probably because of the heterogeneity of our series, we did not find any correlation between the accumulation of TKI and therapeutic response of CML. Moreover, we used our process to observe a decrease in DAS accumulation in vivo in circulating blasts of a CML patient with acute transformation, in spite of significant DAS uptake, we observed a recurrence of Syk phosphorylation in Y348 that we identified as a potential marker of acutisation, at the same time of disease resistance (Article 2). A major advantage of our process is the possibility to analyze the different cell subsets, including CD34+ CML cells. These cells had a lower (even absent in cells from some patients) level of intracellular TKI compared to mature cells. The clonogenic assays performed in parallel showed a significant correlation with DAS only. Finally, our preliminary results suggest differences between CD34+ cells from blood and those from bone marrow. In conclusion, our process allows evaluating the amount of TKI in viable cell subpopulations. This project will be continued with i) the study of the potential interest of the early evaluation of in vivo intracellular level of TKI (after the fourth dose) and ii) the influence of the microenvironment on CSL resistance to TKI and epigenetics deregulations.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie. / Chronic myeloid leukemia (CML) is a model of tumor evolution in human cancer. The evolution process of CML from the chronic phase (CP) to the blastic phase (BP) is characterized by a blockade of differentiation and acquisition of uncontrolled self-renewal capacity by hematopoietic stem or progenitor cells. CML-BP is associated with the presence of other genetic abnormalities in addition to the BCR-ABL1 fusion which results from chromosomal translocation t(9;22). Unlike patients in the CP, patients with CML-BP do not achieve a long-term complete molecular response to Imatinib mesylate, an inhibitor targeting the BCR-ABL1 tyrosine kinase (TK). Moreover, second and third generation TK inhibitors are less effective in CML-BP when leukemic cells have acquired a therapeutic resistance independent of BCR-ABL1 mutations. The molecular mechanisms of the signaling pathways responsible for CML progression from CP to BP are poorly understood. The aim of our project is to characterize novel genetic alterations in the BP of CML. We have identified by cytogenetics, four novel chromosomal translocations: t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) and t(2;12)(q31;p13) in leukemic cells of patients with CML-BP resistant to therapy. Using fluorescence in situ hybridization, RT-PCR and sequencing techniques, we have mapped chromosomal translocation breakpoints and identified rearranged genes encoding transcription factors which are key regulators of hematopoiesis, such as RUNX1, ETV6, PRDM16 and HOXA. The disruption of these genes could explain the differentiation blockade and/or uncontrolled self-renewal associated with the CML-BP. We identified RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 and ETV6-HOXD11 fusions created by chromosomal translocations t(1;21), t(7;17), t(8;17) and t(2;12) respectively. These fusions generate different alternative transcripts that both maintain and alter the open reading frame. Sequence analysis of chimeric transcripts identified in this project, including RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 and ETV6-HOXD11, allowed us to predict potential functional domains present in putative chimeric proteins. In-frame fusion transcripts can generate functional domains from both fusion partners. For example, in two RUNX1-PRDM16 transcripts, the RUNX1 DNA binding domain RHD (Runt homology domain) is fused to the majority of PRDM16 domains. Out-of-frame fusion transcripts resulted in truncated forms of RUNX1, MSI2 and ETV6. The juxtaposition of promoter regions of these genes to the 5’ part of their partners resulted in the activation of the oncogenic short form of PRDM16 in the t(1;21) or of different HOXA/D genes in t(7;17) and t(2;12), and in the aberrant expression of a novel alternative SOX17 transcript in the t(8;17). Our study allowed us to identify novel fusion genes and/or activation of genes that potentially cooperate with BCR-ABL1 fusion in the progression of CML and contribute to treatment resistance of this disease. The characterization of genetic events related to the blastic transformation of CML is an important step in the investigation of molecular pathways involved in this stage of the disease. Understanding treatment resistance of these patients might help to identify new therapeutic targets in this leukemia.

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une pathologie de la cellule souche hématopoïétique caractérisée par la présence de la translocation chromosomique t(9 :22) conduisant à l’expression de la kinase BCR-ABL responsable de la maladie. Un inhibiteur de l’activité de BCR-ABL a été identifié, l’Imatinib (IM). L’IM a révolutionné la prise en charge de la LMC en bloquant sélectivement la croissance des cellules tumorales, conduisant à la rémission des patients. Cependant, une majorité d’entre eux subissent des récidives en cas d’arrêt du traitement, et environ 15% développent des résistances à l’inhibiteur. BCR-ABL active de multiples voies de signalisation parmi lesquelles figurent les facteurs de signalisation STAT5. Nous avons analysé les rôles respectives des deux facteurs STAT5, STAT5A et STAT5B, dans les cellules souches hématopoïétiques normales et de LMC, par une approche d’ARN interférence. Nos observations indiquent que l’activité des deux facteurs STAT5 permet la survie et le maintien à long terme des cellules souches de patients LMC au diagnostic. Nous avons de plus montré qu’indépendamment de son activité transcriptionnelle, STAT5A aide les cellules normales et leucémiques à limiter leur stress oxydatif. Nous avons aussi pu observer que les cellules de patients présentant des résistances secondaires à l’IM, sans mutations ni surexpression de BCR-ABL, manifestent une dépendance caractéristique vis-à-vis de l’activité STAT5A. Pour mieux comprendre les mécanismes d’action des facteurs STAT5, nous avons recherché les gènes cibles de STAT5 par une approche transcriptomique et avons identifié le récepteur tyrosine kinase Axl dont l’expression est augmentée par STAT5A. L’inhibition d’Axl dans les cellules LMC sensibles à l’IM n’a aucun effet sur leur survie, alors qu’elle diminue fortement la survie des cellules LMC résistantes à l’IM. De plus, Axl contrôle le niveau des réactifs oxygénés dans les cellules de patients LMC. Nous avons analysé l’expression d’un des activateurs d’Axl, le ligand Gas6, et avons observé que son expression diminue fortement dans les cellules primaires de LMC par rapport aux contrôles sains. Ces résultats suggèrent que le tandem Gas6/Axl pourrait participer au processus leucémique de la LMC à différents niveaux. De manière globale, nos travaux montrent que les facteurs STAT5 favorisent le maintien des cellules souches de LMC, leur résistance au stress oxydatif et aux traitements thérapeutiques Ces deux dernières activités sont au moins en partie liées à l’activité d’une nouvelle cible de STAT5, le récepteur Axl, par ailleurs déjà impliqué dans la résistance aux traitements thérapeutiques. Les facteurs STAT5 représentent donc des nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans l’éradication de la maladie résiduelle. / The Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a clonal hematopoietic stem cell disorder characterized by the t(9:22) genetic translocation and expression of the oncogenic tyrosine kinase BCR-ABL . A first BCR-ABL Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI), Imatinib (IM), was identified that inhibits proliferation of BCR-ABL expressing hematopoietic cells and leads to disease remission. However, BCR-ABL mRNA remains detectable in the most immature HSCs and discontinuation of IM results in clinical relapse. STAT5 factors play a crucial role in the CML pathogenesis of human primary CML cells. However, the contribution of the two related STAT5 genes, STAT5A and STAT5B, was unknown. We used an RNAinterference based strategy to analyze STAT5A or STAT5B roles in normal and CML cells. We showed that STAT5A/5B double knock-down (KD) triggers normal and CML cell apoptosis and suppressed long-term clonogenic potential of immature hematopoietic stem and progenitor cells known to be resistant to TKI treatment and responsible for residual disease. STAT5A loss alone was ineffective at impairing growth of both normal and CML cells under standard conditions. In contrast, STAT5A loss was sufficient to enhance Reactive Oxygen Species (ROS) which correlated with enhanced DNA damages in both normal and leukemic cells. We reported that STAT5A regulates oxidative stress through unconventional mechanisms, in a non-transcriptional-dependent manner. We further showed that, in contrast to primary cells at diagnosis, IM-resistant cells exhibited enhanced STAT5A dependence, by being sensitive to STAT5A single KD. To investigate the molecular basis of STAT5A activity in TKI-resistance and oxidative stress, we performed a transcriptomic analysis of STAT5 regulated genes. We identified Axl, which encodes a receptor tyrosine kinase, recently shown to be crucial in TKI-resistant CML cells. Specifically, Axl expression is enhanced by STAT5A. We investigated the role of Axl and we found that Axl KD did not affect survival of IM-sensitive CML cells. However, Axl KD decreased survival of IM-resistant cells, miming the activity of STAT5A. Moreover, Axl loss increased ROS levels in CML cells, promoting STAT5A anti-oxidant activity. We further sought to determine the expression of the Axl ligand, Gas6. Gas6 expression is dramatically reduced in CML primary cells at diagnosis compared to healthy cells. The strong and consistent down-regulation of Gas6 in CML cells suggested a possible role in the pathophysiology. Collectively, our findings highlight the pro-survival, stress protection and drug resistance roles of STAT5 factors, providing new understanding for medical treatment of CML patients. We suggest that STAT5A acts in synergy with Axl to face exogenous insults and propose a new mechanism by which CML cells increase their proliferation and reduce their motility by down-regulating Gas6 expression.

Le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) par imatinib est un succès de thérapie ciblée en oncologie. Le principe de cette thérapie est de bloquer les processus biochimiques à l'origine du développement de la maladie, et de permettre à une majorité de patients de réduire leurs risques de progression mais aussi d'éviter des traitements lourds et risqués comme la greffe de cellules souches hématopoïétiques.Cependant, même si l'efficacité de l'imatinib à été prouvée dans un contexte clinique, il n'en demeure pas moins qu'une proportion non négligeable de patients n'obtient par de niveaux de réponse moléculaire jugés optimale. Le but de cette thèse est de tester l'hypothèse d'un lien entre des polymorphismes de gènes impliqués dans l'absorption des médicaments et de leurs métabolisme, et la réponse moléculaire dans la leucémie myéloïde chronique en phase chronique traitée par imatinib.Dans le but d'évaluer la réponse moléculaire des patients, des prélèvements sanguins sont réalisés tout les 3 mois afin de pratiquer le dosage d'un biomarqueur. Ce type particulier de suivi produit des données censurées par intervalles. Comme par ailleurs, les patients demeurent à risque de progression ou sont susceptible d'interrompre leurs traitements pour cause d'intolérance, il est possible que la réponse d'intérêt ne soit plus observable sous le traitement étudié. Les données ainsi produites sont censurées par intervalles dans un contexte de compétition (risques compétitifs).Afin de tenir compte de la nature particulière des données collectées, une méthode basée sur l'imputation multiple est proposée. L'idée est de transformer les données censurées par intervalles en de multiples jeux de données potentiellement censurées à droite et d'utiliser les méthodes disponibles pour l'analyser de ces données. Finalement les résultats sont assemblés en suivant les règles de l'imputation multiple. / Imatinib in the treatment of chronic myeloid leukemia is a success of targeted therapy in oncology. The aim of this therapy is to block the biochemical processes leading to disease development. This strategy results in a reduction of the risk of disease progression and allows patients to avoid extensive and hazardous treatments such as hematologic stem cell transplantation.However, even if imatinib efficacy has been demonstrated in a clinical setting, a significant part of patients do not achieve suitable levels of molecular response. The objective of this thesis, is to test the hypothesis of a correlation between polymorphisms of genes implied in drug absorption an metabolism and the molecular response in chronic myeloid leukemia in chronic phase treated by imatinib.In order to evaluate patients molecular response, blood biomarker assessments are performed every 3 months. This type of follow up produces interval censored data. As patients remain at risk of disease progression, or may interrupt their treatments due to poor tolerance, the response of interest may not be observable in a given setting. This situation produces interval censored competing risks data.To properly handle such data, we propose a multiple imputation based method.The main idea is to convert interval censored data into multiple sets of potentially right censored data that are then analysed using multiple imputation rules.

L’existance de cellules souches leucémiques (CSL) dans la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) prédit que que seule la destruction des CSL conduirait à une guérison. Une proportion importante de patients atteints de LMC développe une résistance aux drogues, environ ~ 30% des cas, Les mécanismes de résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI) dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) restent souvent obscures. Les cellules souches leucémiques de la LMC pourraient rester viables et en repos, malgré la présence de facteurs de croissance ou de médicaments qui semblent les protéger de l'apoptose. Nous avons montré dans la première parti de cette étude que certains transporteurs telles ABCG2, hOCT-1 pourraient jouer un rôle avec le micro environnement dans la résistance des lignées LMC en adhésion au stoma médullaire. De plus, dans deuxième parti nous avons montré que le gène TWIST-1 (est un acteur clé de l'embryogenèse) est déréglementé dans les cellules de LMC innée des résistants à l'imatinib, et que la sur-expression de l’oncogène TWIST-1 pourrait représenter un nouveau facteur clé de pronostiques potentiellement utiles pour améliorer la guérison de LMC aux TKI. De plus, nous avons pu également montrer que le gène TP73 est impliqué dans la résistance des CSL de LMC. Ce gène pourrait être un facteur prédictif pour identifier une résistance potentielle des patients de LMC au moment du diagnostic. Nous avons montré également que ce gène est régulé par le micro-environnement. Nous avons montrés une sur-expression des isoformes tronquées dans les lignées LMC avec l’adhésion au stroma. Les résultats suggèrent que les molécules intrinsèques comme TWIST-1, les transporteurs et les isoformes de p73 sont dérégulées dans les CSL par des mécanismes extrinsèques qui interviennent avec le micro environnement leucémique par le mécanisme d’adhésion dans le phénomène de résistance aux traitements. Ce mécanisme spécial de résistance due à la conservation de ces CSL dans l’état immature en adhésion avec son micro environnement. / The existence of Leukemia stem cells (CSL) in chronic myelogenous leukemia (CML) predicts that only the destruction of CSL lead to a cure. A significant proportion of CML patients develop resistance to drugs, ~ 30% cases, mechanisms of resistance to tyrosine kinase inhibitors (TKI) in chronic myeloid leukemia (CML) often remain obscure. Leukemic stem cells of CML could remain viable and quiet, despite the presence of growth factors or drugs that seem to protect them from apoptosis. We have shown in the first part of this study that some carriers such as ABCG2, hOCT could to be play a role with the microenvironment in the resistance among CML adhesion of stoma Bone marrow. Furthermore, in the second part we showed that the gene TWIST-1 (is a key player of the embryogenesis) is deregulated in cells of CML innately resistant to imatinib, and that overexpression of the oncogene TWIST-1 could represent a new prognostic factor key potentially useful for improving the querison CML to TKI. In addition, we also could show that the TP73 gene is involved in the resistance of CSL CML. This gene could be a predictor to identify potential resistance of CML patients at diagnosis. We have also shown that this gene is regulated by the microenvironment. We have shown an overexpression of truncated isoforms in CML cell lines with the accession to the stroma. The results suggest that intrinsic molecules such as TWIST-1 carriers and p73 isoforms are deregulated in CSL by extrinsic mechanisms involved with the leukemia microenvironment by the mechanism for participation in the phenomenon of drug resistance. This mechanism with its microenvironment.

Nous avons produit des CART-cells et des LT-mock ont été produits ex-vivo. L'efficacité de transduction est mesuré par l'expression CD3+/CD19+ (82% en moyenne, n=S), en cytométrie en flux. L'expression protéique de CAR a été vérifiée par western blot et en cytométrie en flux attestant de son expression membranaire. Nous avons testé la fonctionnalité de la cassette suicide iCaspase9/ AP1903 sur CART-cells après 48h de traitement à I' AP1903. Nous avons montré que plus de 90% des CART-cells entrent en apoptose (Marquage 7-AAD en cytométrie en flux). Nous avons ensuite réalisé des tests fonctionnels in-vitro des CART-cells contre des lignées LMC exprimant naturellement IL-lRAP ou contre des lignées transfectées pour exprimer la forme membranaire d'IL-lRAP. Après co­culture des CART-cells en présence des cellules cibles IL-lRAP+ nous avons montré qu'ils prolifèrent (test CFSE), qu'ils sécrètent de l'interféron y et des cytokines inflammatoires. Enfin, par marquage 7-AAD, nous avons démontré la cytotoxicité des CART-cells contre les cellules ILl-RAP+. Finalement, nous avons montré l'efficacité des CART-cells in vivo, dans un modèle de xénogreffe tumorales dans des souris immunodéficiences NSG greffées par la lignée K562-IL1RAP+ / Luciférase +. On constate une diminution de la masse tumorale 4 jours après injection des CART-cells, jusqu'à disparition totale. Cette preuve de concept laisse entrevoir des perspectives thérapeutiques alternatives dans le traitement de la LMC ou LAM, qui devront être optimiser dans des modèles murins (séquence et nombres d'injection, nombres de cellules, associations avec ITKS ou autres chimiothérapies) afin de conduire un essai clinique de phase I, pour démontrer la faisabilité et la sécurité de l'approche pour envisager une démonstration d'efficacité chez l'homme. La sécurisation par la cassette suicide permet d'envisager l'utilisation des CART-cells en situation autologue ou allogénique (Donor Lymphocytes infusion, DU) / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder and is characterized by the presence of a Philadelphia chromosome (Phl) encoding the BCR-ABL fusion protein with constitutive tyrosine kinase activity. The treatment by Tyrosine Kinase lnhibitors (ITK) is not curative. The problem today is ta target leukemic stem cells (HSCs) to prevent relapse of patients after stopping treatment with TKI and permanently eradicate the disease. Studies have identified the interleukin-1 accessory protein receptor (IL-lRAP) as a potential target for killing CSL (BCR-ABL1 positive) in CML or in acute myeloid leukemia (AML). We therefore propose to develop a cell therapy approach targeting IL-lRAP, using T cells (LT) redirected by a CAR (Chimeric Antigen Receptor) in the treatment of CML and AML. We produced a specific anti-lL-1RAP murine monoclonal antibody (mAb) called # A3C3. We tested the specificity of the antibody # A3C3 in flow cytometry, in Western blot, by immunohistochemistry or confocal microcopy, on positive human cell lines IL-1RAP (KU812) or IL-1RAP negative (Raji). Moreover, by using this antibody, we have demonstrated by immunohistochemistry, on 20 different normal tissues that our antibody does not recognize or very few non-specific (off-target) targets. Finally, we demonstrated that this antibody is able to detect positive IL-1RAP CSLs in primary bone marrow or peripheral blood samples of LMC patients at diagnosis or after ITK treatment. By molecular biology, we have sequenced and identified rearrangements of the heavy (lgH) and light {lgL) chains coding region for hypervariable regions of# A3C3. The coding sequence for the "single chain variable fragment" (scFv), lin king the 2 lgH and lgl chains, was cloned into a 3rd generation lentiviral skeleton securised by a suicide gene, inducible caspase 9 (iCASP9). We produced CART-cells and LT-mock ex-vivo. The transduction efficiency is measured by CD3 + / CD19 + expression (82% on average, n = 5), in flow cytometry. The functionality of the suicide cassette iCaspase9/AP1903 on CART-cells after 48h treatment with AP1903 was tested. We have shown the death of more than 90% of CART-cells (7-AAD labeling in flow cytometry). We then performed in-vitro functional tests of CART-cells against LMC lines naturally expressing IL-1RAP or against transfected lines to express the membrane form of IL-1RAP. After co-culture of CART-cells in the presence of IL-1RAP + target cells, we have shown that they proliferate (CFSE test), that they secrete interferon y and inflammatory cytokines (intracellular labeling and Cytokines Bead Array assay). They are able to degranulate (CD107a & b labeling). Finally, by 7 AAD labeling, we demonstrated the cytotoxicity of CART-cells against IL1-RAP + cells. Finally, we showed the effectiveness of CART-cells in vivo, in a tumor xenograft model in NSG immunodeficiency mice engrafted by the K562-IL1RAP+/Luciferase+ line. There is a decrease in the tumor load 4 days after injection of CART-cells, until complete disappearance.This proof of concept suggests alternative therapeutic perspectives in the treatment of CML or AML, which should be optimized in murine models (sequence and injection numbers, cell numbers, associations with ITKS or other chemotherapies) in order to Phase I clinical trial, to demonstrate the feasibility and safety of the approach to consider a demonstration of efficacy in human. Securing by the suicide cassette makes it possible to consider the use of CART-cells in an autologous or allogeneic situation (Donor Lymphocytes infusion, DU)

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Une des principales causes d’échec dans le traitement des cancers est le développement de résistances aux drogues par les cellules tumorales. Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont suspectées d’être responsables de ces rechutes, conduisant à la récurrence de la maladie et bien souvent au décès des patients. En clinique, il est donc nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques capables de cibler ces CSC résistantes et aboutir à la guérison des patients. Les CSC sont régulées par un ensemble de signaux aussi bien biologiques que physiques au sein de la niche tumorale. Mon projet a pour objectif de déterminer l’implication du microenvironnement tumoral (voie de signalisation BMP et contraintes mécaniques) dans le maintien et la résistance des cellules souches leucémiques (CSLs) de la leucémie myéloïde chronique (LMC). Pour cela, nous avons combiné tests fonctionnels et moléculaires ainsi que l’analyse de la niche tumorale sur plus de 200 échantillons de patients atteints de LMC. Nous avons ainsi démontré que l’altération de la voie BMP intrinsèque aux cellules immatures de la LMC corrompt et amplifie la réponse à BMP2 et BMP4, présents en quantités anormalement abondantes au sein de la niche tumorale. Ces résultats récemment publiés dans Blood nous ont amenés à évaluer le rôle de la voie BMP dans le maintien des CSLs sous traitement par les ITK. La microscopie à force atomique nous a permis de démontrer que l’expression de BCR-ABL est suffisante pour induire une augmentation de la rigidité des cellules immatures de LMC par rapport à des cellules saines. Enfin, l’utilisation d’un système de confinement cellulaire nous a permis de démontrer que le stress mécanique contrôle la prolifération des cellules leucémiques immatures en régulant l’expression de gènes mécano-sensibles comme Twist-1. Ces résultats pourraient expliquer comment des CSLs tirent profit des contraintes mécaniques issues de leur microenvironnement afin d’acquérir un avantage prolifératif par rapport aux cellules saines. Ultimement, nous espérons que cette approche transdisciplinaire permettra d’identifier les molécules clés de la transduction de signaux mécaniques potentiellement impliqués dans le maintien et la résistance des CSC et ainsi proposer de nouvelles cibles pour contrer ces effets. / One of the main causes of treatment failure in cancers is the development of drug resistance by cancer cells. The persistence of cancer stem cells (CSCs) might explain cancer relapses as they could allow reactivation of cancer cells proliferation following therapy, leading to disease persistence and ultimately to patients’ death. Clinically, it is crucial to develop therapeutic strategies able to target resistant CSCs in order to cure the patients. CSCs are controlled by a variety of biochemical and biomechanical signals from the leukemic niche. My project aims to determine the involvement of the tumor microenvironment (BMP signaling pathway and mechanical stress) in the maintenance and resistance of Leukemic Stem Cells (LSCs) in Chronic Myelogenous Leukemia (CML). For this, we combined functional and molecular assays to the analysis of tumor microenvironment on more than 200 CML patients’ samples. We demonstrated that alterations of intracellular BMP signaling pathway in CP-CML primary samples corrupt and amplify the response to exogenous BMP2 and BMP4, which are abnormally abundant in the tumor microenvironment. These results, recently published in Blood led us to evaluate the role of the BMP pathway in LSC maintenance under TKI treatment. Atomic force microscopy allowed us to demonstrate that BCR-ABL expression alone is sufficient to increases the rigidity of immature CML cells compared to healthy ones. Finally, using a unique cell confining system, we were able to demonstrate that mechanical stress controls the proliferation of immature leukemic cells by regulating the expression of mechano-sensitive genes such as Twist-1. These results could explain how LSCs can benefit from a mechanical stress exerted by their microenvironment to acquire a proliferative advantage over normal cells. Ultimately, we hope that this transdisciplinary approach will help to identify key molecules in the transduction of mechanical signals potentially involved in maintenance and resistance of CSCs and thus offer new targets to counter these effects.