Neste estudo investigamos os mecanismos reguladores associados à indução da inflamação pulmonar decorrente da /IR intestinal. A hipótese é que mediadores inflamatórios gerados no intestino, drenados pelo sistema linfático medeiam as repercussões pulmonares observadas na SDRA. Grupos de ratos foram submetidos à isquemia intestinal por meio da oclusão da artéria mesentérica superior (45 min) seguida da reperfusão intestinal por 2h. Grupos de ratos foram submetidos à obstrução do fluxo linfático (canulação do dueto torácico linfático, ou sua secção) previamente à indução da I/R intestinal. Os dados indicaram que a secção do dueto linfático torácico reduziu a atividade pulmonar de MPO (índice indireto de presença de neutrófilos), bem como a permeabilidade vascular (extravasamento do corante Azul de Evans) pulmonar e intestinal e aumento da atividade de LDH intestinal (índice de lesão tecidual). Sistemicamente, a ligação do dueto linfático antes da indução de l/R intestinal reduziu os níveis séricos de TNF-<font face=\"symbol\">a, IL- 1<font face=\"symbol\">b e elevou aqueles de IL-10, LTB4e TXB2. Ainda, observamos que a linfa coletada nesses animais é rica em TNF-<font face=\"symbol\">a, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, LTB4 e TXB2. O tratamento dos animais previamente à l/R intestinal com o inibidor de síntese de TNF-<font face=\"symbol\">a, pentoxifilina (PTX), reduziu a atividade de MPO pulmonar nos animais submetidos a l/R intestinal com o dueto linfático intaeto e a potencializou naqueles onde o dueto torácico linfático foi seccionado. A PTX reduziu o aumento de permeabilidade vascular pulmonar e intestinal em condições onde dueto linfático torácico foi mantido intacto. Por outro lado em animais l/R intestinal com o dueto linfático seccionado, a PTX não causou redução adicional da permeabilidade vascular, mas reduziu os níveis séricos de IL-1<font face=\"symbol\">b e aumentou os de LTB4, enquanto na linfa, o tratamento com PTX aumentou a concentração de IL-10 e LTB4 e reduziu a de IL-1<font face=\"symbol\">b e TXB2. A inibição não seletiva das NOS com o composto L-NAME causou aumento dos níveis séricos de TNF-<font face=\"symbol\">a, os quais foram reduzidos pela secção do dueto linfático. O bloqueio da geração do NO nos animais com dueto seccionado não alterou o perfil no soro de IL-10, mas elevou a concentração de IL-1<font face=\"symbol\">b. Ainda, na linfa dos animais tratados com L-NAME, houve aumento de IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, LTB4 e TXB2 e redução de TNF-<font face=\"symbol\">a. Nossos dados ainda revelaram que o pulmão dos animais I/R intestinal gerou IL1<font face=\"symbol\">b e IL-10 quando o dueto linfático estava intacto, e que sua secção reduziu os níveis gerados dessas citocinas. A PTX reduziu a geração de IL-1<font face=\"symbol\">b e aumentou a IL-10 no pulmão.O L-NAME aumentou a IL-1<font face=\"symbol\">b e IL-10 nos animais com o dueto intacto e interrupção do fluxo linfático aumentou os níveis de IL-1<font face=\"symbol\">b. A I/R intestinal, em animais com o dueto intacto, aumentou, enquanto na vigência da obstrução do fluxo linfático, houve redução da expressão de ICAM-1, Mac-1 e E-selectina no pulmão. Finalmente, os dados apresentados neste estudo sugerem que eventos isquêmicos intestinais seguidos de sua reperfusão, induzem a geração de mediadores inflamatórios locais (intestino) os quais uma vez drenados pelo sistema linfático mesentérico são transportados pela linfa e atingem o pulmão. Nessas condições observa-se inflamação pulmonar e geração adicional de mediadores inflamatÓrios os quais são lançadas à circulação e concorrem para o desenvolvimento da inflamação sistêmica e eventualmente para a falência múltipla dos órgãos. / In this study we investigated the role of lymphatic system on the mechanisms associated to the induction of lung inflammation afier intestinal I/R in rats. The hypothesis ofthe study was that upon intestinal I/R, inflammatory mediators are generated in the intestine and once drained by mesenteric lyrnphatic system interfere with the lung homeostasis contributing to lung dysfunction observed in ARDS. To these purposes groups of rats were submitted to occlusion of superior mesenteric artery (45 min) followed by intestinal reperfusion during 2h when the rats were killed. Groups of rats were subjected to thoracic lymphatic duct ligation previously to induction of the intestinal I/R. The data showed that the thoracic duct ligation significantly reduced the increased pulmonary MPO activity and the augrnented vascular perrneability (extravasation of the Evans blue dye) in lung and intestine. In addition, thoracic duct ligation increased the intestinal activity of LDH. Systemically, the obstruction of lymph flow, leaded to reduction of TNF in serum of rats upon intestinal I/R and increased the levels of IL-1O, LTB4 and TXB2. Elevated levels of TNF-<font face=\"symbol\">a, IL-l<font face=\"symbol\">b), IL-1O, LTB4 and TXB2 were also found in lymph ofrats upon intestinal I/R. The treatment of the animals previously to the intestinal I/R induction with inhibitor of TNF-<font face=\"symbol\">a synthesis, pentoxyfilline (PTX), reduced the lung MPO activity upon lymphatic duct intact that was exacerbated by thoracic duct ligation. PTX treatment reduced the increased vascular permeability of the lung and intestine conditions in rats with lymphatic duct intact. On the other hand, when the thoracic duct was ligated, the PTX did not cause additional reduction of vascular permeability in both tissues , but reduced the serum levels of IL-1<font face=\"symbol\">b) and increased those of LTB4. Lymph of rats treated with PTX revealed an increased leveI of IL-10 and LTB4 and a reduced leveI of IL-<font face=\"symbol\">b) and TXB2. L-NAME treatment increased the serum levels of TNF-<font face=\"symbol\">a, which were reduced by the thoracic lymphatic duct ligation. The blockade of NO synthesis in rats with lymphatic duct ligation did not modify the IL-10 serum levels, but increased those of IL-1<font face=\"symbol\">b). Lymph of rats upon L-NAME treatment, an increased level of IL-1<font face=\"symbol\">b), IL-1O, LTB4 and TXB2 and a reduction of TNF-<font face=\"symbol\">a levels were detected. Pulmonary tissue of Iymphatic duct intact rats after intestinal I/R were increased the release of IL-1<font face=\"symbol\">b) and IL-10 whereas the thoracic duct ligation reduced the release of these cytokines. PTX treatment reduced the levels of IL-1<font face=\"symbol\">b) and increased the IL-10 in the lung. L-NAME treatment increased the IL-1<font face=\"symbol\">b) and IL-10 in lung of intact duct rats but the obstruction of lymph flow caused an increase release of IL-1<font face=\"symbol\">b levels. Intestinal I/R in intact duct rats, increased whereas the thoracic duct ligation reduced the pulmonary expression of ICAM-1, Mac-1 and E-selectin. In conclusion, our data suggest that intestinal I/R, induces the generation of local inflammatory mediators (intestine) which drained by the mesenteric lymphatic system are carried by the lymph and reach the lung. ln these conditions we observed pulmonary inflammation and additional generation of inflammatory mediators and eventually the development of the systemic inflammation. Our data support the view that lymphatic system play a role a path underlying the spread oflung and gut injury after intestinal I/R.

Durante a vida fetal e no período neonatal, o timo é órgão de grande importância imunológica e, anatomicamente é o maior órgão linfático e com alta atividade linfopoiética, constando como precursor da linfopoiese. No que diz respeito à irrigação do timo em cães, a literatura é escassa, visto que os autores quando se reportam ao assunto fazem-no na sua maioria de maneira genérica. Com isso, aspectos morfológicos como número de vasos, tamanho do órgão foram estudados considerando as variáveis sexo e faixas etárias. Para este estudo, foram utilizados 24 fetos de cães domésticos, sem raça definida, machos e fêmeas, divididos em quatro grupos etários. Os timos foram processados para o estudo da microscopia de luz, e as análises estereológicas foram realizadas utilizando o método do disector físico associado com o princípio de ConnEulor. O volume do órgão (Vref), comprimento, espessura e largura aumentaram gradativamente com o desenvolvimento, sendo maior nos machos do que nas fêmeas. As variáveis estereológicas analisadas (densidade de comprimento do vaso - Lv, comprimento do vaso - L, densidade de superfície de área - Sv, superfície de área - S, estimação da densidade numérica vascular ? Nv(vasc) número total de vasos no órgão - N (vasc) ), tiveram um aumento gradativo, sendo que o Lv foi maior nas fêmeas e as demais os machos apresentaram maior valor. Aumento na Nv(vasc) e N (vasc) foi observado nos animais do grupo IV. / During phoetal life and neonatal period, the thymus is the organ that has a wide immunological relevance and, anatomically speaking is the largest lymphoid organ presenting high limphopoietic activity presented as the predecessor of limphopoiesis. The literature about thymus irrigation in dogs is scarce, becouse most authors refer to the subject in a general way. Then, morphological aspects as number, shape, size, irrigation, and quantitative were study considering sexy and differents ages of development of the dogs. To the study, were used twenty-four fetus of the mongrel domestics dogs, males and females, divided into four different well defined aged groups (fetus 30, 40, 50 and 60 days). The thymus were processed for the light microscopy study, and the stereological analyses were done using the physical disector method associated with the ConnEulor principle. The volume of the organ, length, thickness and wide increased gradually with the development, in males is great that female. The stereological variables analysed (length density ? Lv, length od vascullar ? L, surface area density ? Sv, surface area ? S, vascullar number density ? N.v(vasc) , and vascullar total number - N. (vasc) ), had the gradual high, the Lv was more in female and the others variables were more in males. The rise of N.v(vasc) and N. (vasc) was observed on the group four animals.

O timo é um órgão de grande importância imunológica durante a vida fetal e no período neonatal, para que o indivíduo se torne imunocompetente. É considerado, anatomicamente, o maior órgão com alta atividade linfopoiética no indivíduo jovem. O timo dos gatos apresenta duas porções, torácica e cervical, onde cada uma delas apresenta um lobo direito e esquerdo em sua maioria. A maior contribuição vascular origina-se da artéria torácica interna esquerda e do tronco braquiocefálico. Possui coloração rósea-pálido, localizado em região de mediastino cranial, entre os pulmões e na base do coração a porção torácica, e a porção cervical estende-se além das costelas em sentido cranial localizada ventralmente a traquéia. Foram utilizados 12 fetos de gatos domésticos, sem raça definida, machos e fêmeas, divididos em três grupos. Os timos foram processados para o estudo da microscopia de luz, e as análises estereológicas foram realizadas utilizando o método disector físico associado com o princípio de ConnEuler. As variações de volume, comprimento, espessura e largura de maneira geral apresentaram aumento conforme o desenvolvimento dos animais, com diferenças entre os sexos. As medidas estereológicas relativas a densidade numérica vascular (Nv(vasc)) apresentam-se maiores nas fêmea, ocorrendo uma diminuição gradativa e o número total de vasos no órgão (N(vasc)) apresentou valores maiores nos machos com uma diminuição gradual. A estimação da densidade do comprimento do vaso (Lv) e da densidade de superfície de área (Sv) apresentaram diminuição aos 45 dias de idade, e a densidade do comprimento do vaso (Lv) apresentou valor maior nos machos de 35 e 55 dias, enquanto que na densidade de superfície de área (Sv) os valores variaram entre os sexos. / During the phoetal life and neonatal period, the thymus has a great importance to became an individual healthy. Anatomically is the largest organ with high limphopoietic activity in young individual. The cat thymus presents two portions, thoracic and cervical, where each one of them presents a right and left lobe at the most. The major contribution initiates from the inner thoracic artery and from braquicephalicus trunk. The organ presents pink-pale color, located in region of cranial mediastine, between lungs and at the base of the heart; the thoracic portion and the cervical extend beyond the ribs located ventrally to the trachea. For this study were used twelve fetus of the mongrel domestic cats, males and females, divided into three groups. The thymus were processed for the light-microscopy, and the stereological analyses were done using the physical disector method associated with the ConnEuler principle. The volume of the organ, lenght, thickness and wide increased gradually with the development, with diferences between sex. The stereological variables related to vascular number density (Nv(vasc)) were greater in females, decreasing gradually and the vascullar total number (N(vasc)) were greater in males decreasing gradually. The lenght density (Lv) and the surface area density showed decreasing at forty-five days old, and the lenght density were greater in males ate thirty-five and fifty-five days old, while the surface area density the values were varied between sex.

O timo é um órgão de grande importância imunológica durante a vida fetal e no período neonatal, para que o indivíduo se torne imunocompetente. É considerado, anatomicamente, o maior órgão com alta atividade linfopoiética no indivíduo jovem. O timo dos gatos apresenta duas porções, torácica e cervical, onde cada uma delas apresenta um lobo direito e esquerdo em sua maioria. A maior contribuição vascular origina-se da artéria torácica interna esquerda e do tronco braquiocefálico. Possui coloração rósea-pálido, localizado em região de mediastino cranial, entre os pulmões e na base do coração a porção torácica, e a porção cervical estende-se além das costelas em sentido cranial localizada ventralmente a traquéia. Foram utilizados 12 fetos de gatos domésticos, sem raça definida, machos e fêmeas, divididos em três grupos. Os timos foram processados para o estudo da microscopia de luz, e as análises estereológicas foram realizadas utilizando o método disector físico associado com o princípio de ConnEuler. As variações de volume, comprimento, espessura e largura de maneira geral apresentaram aumento conforme o desenvolvimento dos animais, com diferenças entre os sexos. As medidas estereológicas relativas a densidade numérica vascular (Nv(vasc)) apresentam-se maiores nas fêmea, ocorrendo uma diminuição gradativa e o número total de vasos no órgão (N(vasc)) apresentou valores maiores nos machos com uma diminuição gradual. A estimação da densidade do comprimento do vaso (Lv) e da densidade de superfície de área (Sv) apresentaram diminuição aos 45 dias de idade, e a densidade do comprimento do vaso (Lv) apresentou valor maior nos machos de 35 e 55 dias, enquanto que na densidade de superfície de área (Sv) os valores variaram entre os sexos. / During the phoetal life and neonatal period, the thymus has a great importance to became an individual healthy. Anatomically is the largest organ with high limphopoietic activity in young individual. The cat thymus presents two portions, thoracic and cervical, where each one of them presents a right and left lobe at the most. The major contribution initiates from the inner thoracic artery and from braquicephalicus trunk. The organ presents pink-pale color, located in region of cranial mediastine, between lungs and at the base of the heart; the thoracic portion and the cervical extend beyond the ribs located ventrally to the trachea. For this study were used twelve fetus of the mongrel domestic cats, males and females, divided into three groups. The thymus were processed for the light-microscopy, and the stereological analyses were done using the physical disector method associated with the ConnEuler principle. The volume of the organ, lenght, thickness and wide increased gradually with the development, with diferences between sex. The stereological variables related to vascular number density (Nv(vasc)) were greater in females, decreasing gradually and the vascullar total number (N(vasc)) were greater in males decreasing gradually. The lenght density (Lv) and the surface area density showed decreasing at forty-five days old, and the lenght density were greater in males ate thirty-five and fifty-five days old, while the surface area density the values were varied between sex.

Durante a vida fetal e no período neonatal, o timo é órgão de grande importância imunológica e, anatomicamente é o maior órgão linfático e com alta atividade linfopoiética, constando como precursor da linfopoiese. No que diz respeito à irrigação do timo em cães, a literatura é escassa, visto que os autores quando se reportam ao assunto fazem-no na sua maioria de maneira genérica. Com isso, aspectos morfológicos como número de vasos, tamanho do órgão foram estudados considerando as variáveis sexo e faixas etárias. Para este estudo, foram utilizados 24 fetos de cães domésticos, sem raça definida, machos e fêmeas, divididos em quatro grupos etários. Os timos foram processados para o estudo da microscopia de luz, e as análises estereológicas foram realizadas utilizando o método do disector físico associado com o princípio de ConnEulor. O volume do órgão (Vref), comprimento, espessura e largura aumentaram gradativamente com o desenvolvimento, sendo maior nos machos do que nas fêmeas. As variáveis estereológicas analisadas (densidade de comprimento do vaso - Lv, comprimento do vaso - L, densidade de superfície de área - Sv, superfície de área - S, estimação da densidade numérica vascular ? Nv(vasc) número total de vasos no órgão - N (vasc) ), tiveram um aumento gradativo, sendo que o Lv foi maior nas fêmeas e as demais os machos apresentaram maior valor. Aumento na Nv(vasc) e N (vasc) foi observado nos animais do grupo IV. / During phoetal life and neonatal period, the thymus is the organ that has a wide immunological relevance and, anatomically speaking is the largest lymphoid organ presenting high limphopoietic activity presented as the predecessor of limphopoiesis. The literature about thymus irrigation in dogs is scarce, becouse most authors refer to the subject in a general way. Then, morphological aspects as number, shape, size, irrigation, and quantitative were study considering sexy and differents ages of development of the dogs. To the study, were used twenty-four fetus of the mongrel domestics dogs, males and females, divided into four different well defined aged groups (fetus 30, 40, 50 and 60 days). The thymus were processed for the light microscopy study, and the stereological analyses were done using the physical disector method associated with the ConnEulor principle. The volume of the organ, length, thickness and wide increased gradually with the development, in males is great that female. The stereological variables analysed (length density ? Lv, length od vascullar ? L, surface area density ? Sv, surface area ? S, vascullar number density ? N.v(vasc) , and vascullar total number - N. (vasc) ), had the gradual high, the Lv was more in female and the others variables were more in males. The rise of N.v(vasc) and N. (vasc) was observed on the group four animals.

Orientadores: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes, Dora Maria Grassi Kassisse / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_EricaAparecidaMariano_M.pdf: 3544834 bytes, checksum: d9515fe1a07bef154d0bed7c21be4a79 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A importância da validação científica de técnicas coadjuvantes a diversos tratamentos de saúde é inquestionável. Assim a influência da drenagem linfática manual na mobilização hidroeletrolítica, na taxa lipolítica, bem como, no sistema nervoso autonômico ainda precisa ser investigada. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da drenagem linfática manual na mobilização hidroeletrolítica, na taxa lipolítica e na modulação autonômica da frequência cardíaca em homens e mulheres. Foram estudados 11 homens; 11 mulheres não usuárias de anticoncepcional oral e 12 mulheres usuárias de anticoncepcional oral, com 21,3 ± 2,9 anos de idade, saudáveis, sedentários e eutróficos. As amostras urinárias foram coletadas em um dia, sem intervenção terapêutica, denominado controle e em outro dia com aplicação da drenagem linfática manual. Na urina, foram analisadas osmolaridade, concentração de sódio, fluxo e concentração de glicerol. A variabilidade da frequência cardíaca foi registrada no início, durante e ao final do experimento, nos dias controle e drenagem linfática manual. Os resultados mostram que a drenagem linfática manual promoveu em homens redução dos eletrólitos urinários e aumento do fluxo e em mulheres não usuárias de anticoncepcional oral houve apenas aumento do fluxo. A técnica induziu diluição urinária em homens e mulheres não usuárias de anticoncepcional, sugerindo que os mecanismos são sexo-dependentes. Para usuárias de anticoncepcional oral, a drenagem linfática manual não diferiu do dia controle, onde houve redução dos eletrólitos e aumento do fluxo urinário. A análise da concentração de glicerol urinário mostrou que a drenagem linfática manual não altera a taxa lipolítica nos voluntários dos grupos estudados. Os resultados da modulação autonômica da frequência cardíaca indicaram que a técnica promoveu predomínio simpático no grupo de homens sem alterações nos grupos das mulheres. Conclui-se que a drenagem linfática manual foi eficaz na diluição urinária de homens e mulheres não usuárias de anticoncepcional oral, assim como, foi eficaz em promover predomínio simpático em homens. A técnica não foi eficaz em promover alterações na taxa lipolítica / Abstract: The importance of scientific validation techniques supporting the various health treatments is unquestionable. Thus, the influence of manual lymphatic drainage in the electrolyte mobilization in lipolytic rate as well as in the autonomic nervous system has to be investigated. The objective of this study was to evaluate the effect of manual lymphatic drainage in the electrolyte mobilization in lipolytic rate and autonomic modulation of heart rate in men and women. 11 male patients; 11 women not using oral contraceptives and 12 women used oral contraceptives, with 21.3 ± 2.9 years old, healthy, sedentary and eutrophic. The urine samples were collected in one day, without therapeutic intervention, denominated as the control and on another day with application of manual lymphatic drainage. In the urine, were analyzed osmolality, sodium concentration, flow, and the concentration of glycerol. The heart rate variability was registered at the outset, during and at the end of the experiment, in the days control and manual lymphatic drainage. The results showed that the manual lymph drainage in men promoted reduction of urinary electrolytes and increased flow and in women non-users oral contraceptives there was only increased flow. The technique induced urinary dilution in men and women non-users oral contraceptives, suggesting that the mechanisms are sex-dependent. For oral contraceptive users, manual lymphatic drainage did not differ from control day where there was a reduction of electrolytes and increased urine flow. The analysis of urinary glycerol concentration showed that manual lymphatic drainage does not change the lipolytic rate in voluntary groups studied. The results of the autonomic modulation of heart rate indicated that the technique promoted sympathetic predominance in men group and without changes in women. We conclude that manual lymphatic drainage was effective in urinary dilution of men and women non-users oral contraceptives, as well as, it was effective in promoting sympathetic predominance in men. The technique was not effective in promoting changes in lipolytic rate / Mestrado / Fisiologia / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

A revascularização linfática é um desafio e o estabelecimento de novas estratégias terapêuticas podem melhorar a qualidade de vida de pessoas que sofrem de distúrbios linfáticos. O objetivo deste estudo foi verificar a capacidade de tratamento com VEGFC exógeno na melhoria da vascularização linfática de uma maneira dependente do tempo em membros pélvicos (MP) de camundongos após a remoção do linfonodo inguinal. O linfonodo inguinal esquerdo foi removido cirurgicamente para mimetizar patologias com diminuição da vascularização linfática. Densidade vascular linfática (Vv) e de comprimento (Lv) foram avaliadas por imunohistoquímica, seguidas de estereologia, após a cirurgia com ou sem o tratamento com VEGFC exógeno. O grupo controle não foi manipulado, mas recebeu soro fisiológico em vez de tratamento com VEGFC exógeno. As expressões do VEGFC e FLT4 local foram avaliadas por qPCR. Houve efeito do tempo sobre Vv e Lv no Grupo Cirurgia e diferença significativa entre os grupos Controle e Cirurgia nas três regiões estudadas (região proximal, média e distal) do MP esquerdo (MPE). A Lv mostrou diferença significativa entre os grupos Controle e Cirurgia somente na região média do MPE. A Vv e a Lv para o Grupo Tratamento foram maiores do que os outros grupos em todas as regiões do MPE. A expressão gênica do VEGFC e do FLT4 apresentou efeito do tempo em todas as regiões do MPE para os grupos Cirurgia e Tratamento. Ambas as expressões gênicas do VEGFC e do FLT4 apresentaram diferença significativa entre os grupos Controle e Cirurgia, entre os grupos Cirurgia e Tratamento e entre os grupos Controle e Tratamento. Os resultados mostraram que os camundongos são bons modelos experimentais para o uso de VEGFC exógeno como terapia de revascularização linfática, e o tratamento com VEGFC exógeno aumenta vascularização linfática já após 3 dias de dano linfático. / Lymphatic revascularization is a challenge and the establishment of new therapeutic strategies may improve quality of life from those suffering from lymphatic disorders. The objective of this study was to verify the VEGFC treatment capacity in improving lymphatic vascularization in a time-dependent manner in mouse hind limb (HL) after removal of inguinal lymphnode. The left inguinal lymphnode was surgically removed to mimetize pathologies with decreased lymphatic vascularization. Lymphatic vascular density (Vv) and length (Lv) were evaluated by immunohistochemistry followed by stereology after surgery and/or VEGFC treatment. Control group was not manipulated but received saline instead of VEGFC treatment. VEGFC and FLT4 local expression were assessed by qPCR. There was effect of time over Vv and Lv in the SG and significant difference between CG and SG in the three studied regions (proximal, medium and distal region) of the left HL (LHL). The Lv showed significant difference between CG and SG only in the medium region. The Vv and the Lv for TG were higher than the other groups in all regions of LHL. VEGFC and FLT4 gene expression presented time effect in all regions of the LHL for SG and TG. Both VEGFC and FLT4 gene expression presented significant difference between CG and SG, between SG and TG, and between CG and TG. The results show that mice are good experimental models for VEGFC use as therapy for lymphatic revascularization, and VEGFC treatment increased the lymphatic vasculature already after 3 days of lymphatic damage.

A isquemia/reperfusão intestinal (I/R-i) se associa ao desenvolvimento de inflamação pulmonar aguda, que pode ser modulada por mediadores inflamatórios presentes na linfa. Avaliamos os efeitos da I/R-i sob a inflamação pulmonar e a participação do sistema linfático. Wistar machos foram submetidos a 45 min de isquemia intestinal e 24, 72 ou 120 h de reperfusão. Outro grupo teve o ducto linfático bloqueado antes da isquemia. Os resultados revelaram maior inflamação pulmonar nos animais reperfundidos por 120 h em relação aos outros períodos de reperfusão estudados. Os animais apresentaram aumento de MPO e permeabilidade. Aumento de VEGF e de IL-1<font face=\"Symbol\">&#946 e diminuição de IL-10 no explante pulmonar. Diminuição de vWf e aumento de integrina <font face=\"Symbol\">&#9461, PECAM-1 e colágeno I e IV no endotélio pulmonar. Os dados indicam que mecanismos temporais modulam a resposta inflamatória decorrente da I/R-i. Mediadores na linfa e na circulação participam do desencadeamento/manutenção da inflamação pulmonar alterando a integridade do endotélio e ativando o pulmão que libera mediadores adicionais. / Intestinal ischemia/reperfusion (i-I/R) is associated with the development of acute lung inflammation, which can be modulated by inflammatory mediators present in the lymph. We evaluated the effects of i-I/R in lung inflammation and the involvement of the lymphatic system. Wistar rats were subjected to 45 min of intestinal ischemia and 24, 72 or 120 h of reperfusion. Another group had the lymphatic duct blocked before ischemia. The results revealed greater lung inflammation in animals reperfused for 120 h in comparison to other periods studied. These animals showed increased MPO and permeability. Increased VEGF and IL-1<font face=\"Symbol\">&#946 and decreased IL-10 in lung explants. Decreased vWf and increased <font face=\"Symbol\">&#9461 integrin, PECAM-1 and collagen I and IV in the pulmonary endothelium. These data indicate that temporal mechanisms modulate the inflammatory response due to i-I/R. Mediators in the lymph and circulation participate in the initiation / maintenance of lung inflammation by altering the integrity of the endothelium and activating the lung which release additional mediators.

El hígado cirrótico experimenta a lo largo de todo el desarrollo de la enfermedad una serie de cambios estructurales, debidos a la acumulación de matriz extracelular y a la inflamación crónica, que vuelven al tejido hipóxico. La hipoxia tisular provoca la liberación de agentes proangiogénicos, como VEGF-A, que aumentan la irrigación del tejido para compensar la falta de oxígeno. Además, muchas citoquinas sintetizadas por las células inflamatorias o por las células hepáticas estrelladas activadas, también tienen un alto poder angiogénico. Estos nuevos vasos son una puerta de entrada de más infiltrado inflamatorio, estableciéndose así un circuito que se retroalimenta entre angiogénesis e inflamación que lleva a perpetuar la enfermedad. En este contexto, las terapias antiangiogénicas clásicas dirigidas a bloquear VEGF o las vías de los receptores tirosina quinasa, han demostrado ser eficaces en disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepática, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias se han visto relacionadas con multitud de efectos adversos, como trombosis o hipertensión, ya que no sólo inhiben la angiogénesis patológica sino que también afectan a la vasculatura sana (Fischer et al., 2007; Wu et al., 2008). De manera que la necesidad de encontrar nuevas dianas terapéuticas más seguras destinadas a modular la angiogénesis en la cirrosis hepática sigue siendo uno de los objetivos de la investigación científica actual. Cuando la cirrosis pasa a ser descompensada, los pacientes cirróticos desarrollan importantes alteraciones en la homeostasis de los líquidos corporales que dan lugar a la acumulación de ascitis. La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos y constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se han descrito la implicación de diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua o la reactividad vascular (Arroyo and Jiménez, 2000). La probabilidad de fallecimiento a los 2 años en pacientes cirróticos, una vez que desarrollan ascitis, es del 40%. A pesar de la enorme relevancia clínica de este suceso, actualmente aun no se conocen con precisión todos los mecanismos moleculares implicados en la formación y mantenimiento de la ascitis en la cirrosis. El objetivo global de esta tesis doctoral fue el de investigar la implicación de la vasculatura, tanto sanguínea como linfática, en la patogenicidad de la cirrosis hepática. De manera específica, la tesis está dividida en dos estudios dirigidos a: I. Investigar el papel fisiopatológico del factor de crecimiento placentario (PlGF) en la angiogénesis, la inflamación y la fibrosis hepática. II. Caracterizar la funcionalidad y la estructura de la vasculatura linfática en la cirrosis e investigar su contribución a la formación de ascitis. Estudio I: Durante la progresión de gran cantidad de enfermedades hepáticas crónicas tiene lugar un proceso de neoangiogénesis hepática que agrava profundamente dichas patologías. Además, se ha demostrado que diversos factores angiogénicos también son capaces de activar diferentes subpoblaciones de células hepáticas estrelladas, estableciendo así un vínculo entre inflamación, angiogénesis y fibrosis hepáticas (Thabut et al., 2010; Semela et al., 2008). En este contexto, se ha demostrado que la administración de sunitinib y sorafenib a ratas cirróticas, dos inhibidores multidiana de receptores tirosina quinasa que actúan en las vías de señalización de PDGF y VEGF, conseguía disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepáticas, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias dirigidas a inhibir VEGF están asociadas a graves efectos adversos, como trombosis, hipertensión o una disminución de la densidad vascular en órganos sanos (Fischer et al., 2007), ya que VEGF también tiene importantes funciones en la angiogénesis fisiológica. Estudios recientes sugieren que las terapias enfocadas a inhibir el PlGF podrían tener un perfil de bioseguridad mucho más óptimo que las terapias antiangiogénicas clásicas (Fischer et al., 2007; Van de Veire et al., 2010). Esto es así porque la acción angiogénica de PlGF se reduce únicamente a situaciones patológicas (Autiero et al., 2003; Van Steenkiste et al., 2009). Resultados I: La cirrosis está asociada a una sobreexpresión de PlGF, tanto en humanos como en modelos experimentales. Cuando se bloquea la actividad de PlGF en cirrosis se consigue disminuir la angiogénesis hepática y en esplácnica, el infiltrado inflamatorio hepático, la fibrosis y la hipertensión portal; todo ello sin efectos adversos. Estudio II: Una de las complicaciones más severas durante la progresión de la cirrosis es la formación de ascitis, que está asociada con un incremento de la morbilidad y la mortalidad (Moore et al., 2003). Algunos de los mecanismos que contribuyen a la aparición y al mantenimiento de la ascitis son: 1) el incremento de la presión hidrostática intravascular, 2) el descenso de la presión oncótica en el plasma, 3) un aumento de la angiogénesis en el territorio esplácnico y 4) la retención renal de sal y agua (Gines et al., 2004; Van Steenkiste et al., 2009; Henriksen et al., 2005). Sin embargo, la función del sistema linfático en la patogénesis de la ascitis no está bien estudiada. En los pacientes cirróticos compensados, el sistema linfático ayuda a prevenir la aparición de ascitis reabsorbiendo el exceso de fluido, tanto en el hígado, como en las demás regiones de la zona esplácnica. Como consecuencia de esto aumenta el flujo linfático (Witte et al., 1969), lo que estimula la aparición de linfangiogénesis hepática (Tugues et al., 2005). A pesar de ello, este mecanismo compensatorio no es capaz de evitar la formación de ascitis en pacientes con cirrosis descompensada y esto hace hipotetizar que existe una disfunción del sistema linfático en los estadíos más avanzados de la enfermedad. Resultados II: En cirrosis, las células endoteliales linfáticas sobreexpresan eNOS y tienen una sobreproducción de NO que lleva a una pérdida de recubrimiento de los vasos linfáticos por células musculares lisas y a una disfunción del sistema linfático. Cuando se bloquea la actividad de eNOS se consigue recuperar el recubrimiento de vasos linfáticos por células musculares lisas, aumenta el drenaje del sistema linfático y disminuye el volumen de ascitis. / Study I: Placental growth factor (PlGF) is associated selectively with pathological angiogenesis, and PlGF blockade does not affect the healthy vasculature. Anti-PlGF is therefore currently being clinically evaluated for the treatment of cancer patients. In cirrhosis, hepatic fibrogenesis is accompanied by extensive angiogenesis. In this study, we evaluated the pathophysiological role of PlGF and the therapeutic potential of anti-PlGF in liver cirrhosis. Results I: PlGF was significantly up-regulated in the CCl4-induced rodent model of liver cirrhosis as well as in cirrhotic patients. Compared with wild-type animals, cirrhotic PlGF -/- mice showed a significant reduction in angiogenesis, arteriogenesis, inflammation, fibrosis, and portal hypertension. Importantly, pharmacological inhibition with anti-PlGF antibodies yielded similar results as genetic loss of PlGF. Notably, PlGF treatment of activated hepatic stellate cells induced sustained extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation, as well as chemotaxis and proliferation, indicating a previously unrecognized profibrogenic role of PlGF. In conclusion, PlGF is a disease-candidate gene in liver cirrhosis, and inhibition of PlGF offers a therapeutic alternative with an attractive safety profile. Study II: The lymphatic network plays a major role in maintaining tissue fluid homoeostasis. Therefore several pathological conditions associated with oedema formation result in deficient lymphatic function. However, the role of the lymphatic system in the pathogenesis of ascites and oedema formation in cirrhosis has not been fully clarified. The aim of this study was to investigate whether the inability of the lymphatic system to drain tissue exudate contributes to the oedema observed in cirrhosis. Results II: The cirrhotic (CH) rats had impaired lymphatic drainage in the splanchnic and peripheral regions compared with the control (CT) rats. LyECs isolated from the CH rats showed a significant increase in eNOS and nitric oxide (NO) production. In addition, the lymphatic vessels of the CH rats showed a significant reduction in smooth muscle cell (SMC) coverage compared with the CT rats. CH rats treated with L-NMMA for 7 days showed a significant improvement in lymphatic drainage and a significant reduction in ascites volume, which were associated with increased plasma volume. This beneficial effect of L-NMMA inhibition was also associated with a significant increase in lymphatic SMC coverage. In conclusion, the upregulation of eNOS in the LyECs of CH rats causes long-term lymphatic remodelling, which is characterised by a loss of SMC lymphatic coverage. The amelioration of this lymphatic abnormality by chronic eNOS inhibition results in improved lymphatic drainage and reduced ascites.

A isquemia/reperfusão intestinal (I/R-i) se associa ao desenvolvimento de inflamação pulmonar aguda, que pode ser modulada por mediadores inflamatórios presentes na linfa. Avaliamos os efeitos da I/R-i sob a inflamação pulmonar e a participação do sistema linfático. Wistar machos foram submetidos a 45 min de isquemia intestinal e 24, 72 ou 120 h de reperfusão. Outro grupo teve o ducto linfático bloqueado antes da isquemia. Os resultados revelaram maior inflamação pulmonar nos animais reperfundidos por 120 h em relação aos outros períodos de reperfusão estudados. Os animais apresentaram aumento de MPO e permeabilidade. Aumento de VEGF e de IL-1<font face=\"Symbol\">&#946 e diminuição de IL-10 no explante pulmonar. Diminuição de vWf e aumento de integrina <font face=\"Symbol\">&#9461, PECAM-1 e colágeno I e IV no endotélio pulmonar. Os dados indicam que mecanismos temporais modulam a resposta inflamatória decorrente da I/R-i. Mediadores na linfa e na circulação participam do desencadeamento/manutenção da inflamação pulmonar alterando a integridade do endotélio e ativando o pulmão que libera mediadores adicionais. / Intestinal ischemia/reperfusion (i-I/R) is associated with the development of acute lung inflammation, which can be modulated by inflammatory mediators present in the lymph. We evaluated the effects of i-I/R in lung inflammation and the involvement of the lymphatic system. Wistar rats were subjected to 45 min of intestinal ischemia and 24, 72 or 120 h of reperfusion. Another group had the lymphatic duct blocked before ischemia. The results revealed greater lung inflammation in animals reperfused for 120 h in comparison to other periods studied. These animals showed increased MPO and permeability. Increased VEGF and IL-1<font face=\"Symbol\">&#946 and decreased IL-10 in lung explants. Decreased vWf and increased <font face=\"Symbol\">&#9461 integrin, PECAM-1 and collagen I and IV in the pulmonary endothelium. These data indicate that temporal mechanisms modulate the inflammatory response due to i-I/R. Mediators in the lymph and circulation participate in the initiation / maintenance of lung inflammation by altering the integrity of the endothelium and activating the lung which release additional mediators.