CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A lipase do tipo B de Candida antarctica recombinante expressa em Pichia pastoris pela inserÃÃo de um DNA externo (LIPB) foi imobilizada em sÃlica mesoporosa nanoestruturada (SBA-15) pelo mÃtodo da adsorÃÃo (SBA-15-LIPB) e ligaÃÃo covalente (SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB). A influÃncia do tempo de contato enzima-suporte e do pH do meio foram avaliados para a produÃÃo dos biocatalisadores. A estabilidade tÃrmica das enzimas imobilizadas foi avaliada e os resultados mostraram que o SBA-15-APTES-GA-LIPB possui maior estabilidade tÃrmica com um t1/2 = 36,91 min enquanto o derivado SBA-15-APTES-DVS-LIPB teve t1/2= 11,83 min e o SBA-15-LIPB teve t1/2= 8,5 min, a 50 ÂC. No entanto, o SBA-15-LIPB possui maior estabilidade em solventes orgÃnicos do que os biocatalisadores produzidos por ligaÃÃo covalente. Assim, o biocatalisador SBA-15-LIPB (CondiÃÃes otimizadas: 100 % de atividade recuperada em um tempo de contato de 1 hora, pH 7) foi aplicado em uma reaÃÃo modelo de esterificaÃÃo, que à a sÃntese de Ãsteres de cadeia curta, o butirato de metila e etila. Os resultados mostraram que, em condiÃÃes otimizadas de esterificaÃÃo (temperatura: 37 ᵒC, tipo de solvente: hexano para o butirato de metila e iso-octano para a sÃntese do butirato de etila, a concentraÃÃo de substrato: 0,2 M, proporÃÃo molar de substratos de 1: 1, tempo de reaÃÃo: 12 h), as conversÃes foram: 79,25% para a sÃntese de butirato de metila e 86,52% para a sÃntese de butirato de etila. O biocatalisador SBA-15-LIPB exibiu elevada atividade e estabilidade operacional na sÃntese do butirato de metila e butirato de etila, por esterificaÃÃo, depois de cinco e seis ciclos sucessivos de 12 horas cada, respectivamente. Os biocatalisadores SBA-15-APTES-GA-LIPB e SBA-15-APTES-DVS-LIPB foram aplicados em uma reaÃÃo modelo de hidrÃlise, que à a resoluÃÃo cinÃtica do acetato de feniletila. Os dados experimentais mostraram que foram obtidos resultados positivos para ambos os biocatalisadores, mas o biocatalisador SBA-15-APTES-GA-LIPB foi mais eficiente, produzindo excessos enantiomÃricos de 99 %, conversÃo de 50 % e razÃo enantiomÃrica de 1057. / A recombinant Candida antarctica lipase B expressed in Pichia pastoris by insertion of an external DNA (LIPB) was i mmobilized in nanostructured mesoporous silicas of SBA - 15 type by physical adsorption (SBA - 15 - LIPB) and covalent attachment (SBA - 15 - APTES - GA - LIPB e SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB ) . Influence of contact time enzyme - support and the medium pH were ev aluated to the production of biocatalyst s . T he thermal stability of immobilized enzymes were evaluated and the results showed that the SBA - 15 - APTES - GA - LIPB has the best thermal stability with t 1/2 = 36,91 min while the SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB has t 1/2 = 11,83 min and the SB A - 15 - LIPB has t 1/2 = 8,5 min, a t 50 ÂC . However, the SBA - 15 - LIPB has high stability in organic solvents than the biocatalysts produced by covalent attachment. Therefore, the biocatalyst SBA - 15 - LIPB (Optimized conditions: 100 % of the recovery activity an 1 hour of contact time, pH 7) was applied in a model esterification reaction in the short chain esters synthesis, the methyl and ethyl butyrate. The results showed that in optimized conditions of esterification (temperatur e: 37 ᵒ C, solvent type: hexane for the methyl butyrate and isooctane for ethyl butyrate synthesis, substrate concentration: 0,2 mol/L, molar ratio of substrates 1:1, time of reaction: 12 h) the conversions were: 79.25 % for the methyl butyrate synthesis an d 86.52 % for ethyl butyrate synthesis. The biocatalyst SBA - 15 - LIPB exhibited high activity and operational stability on the methyl and ethyl butyrate synthesis by esterification after five and six successive cycles of 12 h each, respectively. The biocatalysts SBA - 15 - APTES - GA - LIPB and SBA - 15 - APTES - DVS - LIPB were applied in a model hydrolysis reaction in the kinetic resolution of the phenylethyl acetate . The experimental data showed that were obtained positive results for both biocatalysts, but t he biocatalyst SBA - 15 - APTES - GA - LIPB was more efficient, producing enantiomeric excess 99 %, conversio n 50 % and enantiomeric ratio 1057.

Orientadores: Maria Regina Wolf Maciel, Gláucia Maria Ferreira Pinto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T04:47:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fregolente_PatriciaBogalhosLucente_D.pdf: 1646847 bytes, checksum: 3d6492736154ef2a22cb3203e984dd70 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A produção de monoacilglicerol (MAG) e diacilglicerol (DAG) foi conduzida de forma enzimática catalisada por diferentes lipases comerciais. MAG é importante emulsificante utilizado nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e cosméticas. DAG, assim como os MAG, são utilizados como emulsificantes e atualmente pesquisas têm apontado os DAG como substituto aos óleos de triacilglicerol (TAG) em alimentos. A produção de MAG e DAG pode ocorrer por via química ou enzimática. A rota enzimática, mais limpa ambientalmente, dispõe ainda de duas alternativas de processo: sistema livre de solventes ou sistema utilizando solventes orgânicos. Além da preocupação em utilizar tecnologia enzimática a fim de desenvolver processos que não agridam o meio ambiente, a produção de MAG e DAG vem como alternativa para a utilização da glicerina excedente do processo de produção de biodiesel. A proposta de integrar ambos os processos de produção de ésteres com a glicerólise para produção de MAG e DAG utilizando a glicerina sem que haja descarte inadequado é uma alternativa que viabiliza a própria produção de biodiesel. Durante a produção de MAG e DAG, observou-se a possibilidade de reutilização de lípases imobilizadas sem que houvesse retirada dos biocatalisadores do meio reacional e sem necessitar de tratamento para posterior utilização (filtração das lípases, limpeza, estocagem). A lipase imobilizada foi reutilizada por, no mínimo, 9 ciclos de reação semicontínua sem perdas significativas na conversão de TAG. Do mesmo modo que para a lipase imobilizada, a lipase livre também foi reutilizada no processo por 8 ciclos de reação, demonstrando ser possível, nesse caso em particular, o reuso de lípases não imobilizadas. Após as reações enzimáticas, MAG e DAG foram separados por destilação molecular sem degradação térmica dos produtos em temperaturas de destilação de no máximo 250 oC. Foram utilizados dois equipamentos de destilação molecular: um destilador molecular centrifugo de escala laboratorial importado e um destilador molecular centrífugo de escala piloto desenvolvido com tecnologia nacional pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Desenvolvimento de Processos de Separação (LDPS) onde este trabalho de tese foi desenvolvido. Foram obtidos MAG com 80% (m/m) de pureza e óleo rico em DAG com concentração (m/m) de 53%. Os produtos destilados foram caracterizados segundo suas massas molares massa específica e temperatura de degradação / Resumo: A produção de monoacilglicerol (MAG) e diacilglicerol (DAG) foi conduzida de forma enzimática catalisada por diferentes lipases comerciais. MAG é importante emulsificante utilizado nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e cosméticas. DAG, assim como os MAG, são utilizados como emulsificantes e atualmente pesquisas têm apontado os DAG como substituto aos óleos de triacilglicerol (TAG) em alimentos. A produção de MAG e DAG pode ocorrer por via química ou enzimática. A rota enzimática, mais limpa ambientalmente, dispõe ainda de duas alternativas de processo: sistema livre de solventes ou sistema utilizando solventes orgânicos. Além da preocupação em utilizar tecnologia enzimática a fim de desenvolver processos que não agridam o meio ambiente, a produção de MAG e DAG vem como alternativa para a utilização da glicerina excedente do processo de produção de biodiesel. A proposta de integrar ambos os processos de produção de ésteres com a glicerólise para produção de MAG e DAG utilizando a glicerina sem que haja descarte inadequado é uma alternativa que viabiliza a própria produção de biodiesel. Durante a produção de MAG e DAG, observou-se a possibilidade de reutilização de lípases imobilizadas sem que houvesse retirada dos biocatalisadores do meio reacional e sem necessitar de tratamento para posterior utilização (filtração das lípases, limpeza, estocagem). A lipase imobilizada foi reutilizada por, no mínimo, 9 ciclos de reação semicontínua sem perdas significativas na conversão de TAG. Do mesmo modo que para a lipase imobilizada, a lipase livre também foi reutilizada no processo por 8 ciclos de reação, demonstrando ser possível, nesse caso em particular, o reuso de lípases não imobilizadas. Após as reações enzimáticas, MAG e DAG foram separados por destilação molecular sem degradação térmica dos produtos em temperaturas de destilação de no máximo 250 oC. Foram utilizados dois equipamentos de destilação molecular: um destilador molecular centrifugo de escala laboratorial importado e um destilador molecular centrífugo de escala piloto desenvolvido com tecnologia nacional pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Desenvolvimento de Processos de Separação (LDPS) onde este trabalho de tese foi desenvolvido. Foram obtidos MAG com 80% (m/m) de pureza e óleo rico em DAG com concentração (m/m) de 53%. Os produtos destilados foram caracterizados segundo suas massas molares massa específica e temperatura de degradação / Abstract: Monoacylglycerol (MAG) and diacylglycerol (DAG) were produced through lipasecatalyzed glycerolysis reaction employing commercial lipases. The first product MAG is widely used as emulsifiers in foods, cosmetics and pharmaceutical products. DAG, the same way of MAG, is usually used as emulsifiers. Nowadays, DAG replacing triacylglycerol (TAG) oil in food has been studied. MAG and DAG production can be carried out through chemical or enzymatic syntheses. The enzymatic route, more friendly environmentally, can be done by solvent-free system or employing organic solvents. To obtain more quality products, produced by green technologies and minimizing the production of toxic waste, this research focused preferably on the solvent-free lipasecatalyzed process. Besides the concern of using enzymatic technology to develop processes friendly to the environment, the MAG and DAG production is an alternative for glycerol from biodiesel production. The proposal to incorporate both processes of esters (biodiesel) with the glycerolysis to MAG and DAG production is an alternative that enables the biodiesel production, employing the glycerol surplus adding value to it avoiding the discard. During the enzymatic syntheses of the emulsifiers MAG and DAG, it was observed that additional processes of separation and preparation of immobilized lipases for new cycles of enzymatic reaction could be avoided. The immobilized lipase could be used at least for nine times without essential loss of TAG conversion. As the same way, the free lipase could be reused at least for 8 times, showing that, for this particular case, the reuse of non-immobilized lipase was possible. After the enzymatic reactions, MAG and DAG were separated through molecular distillation process without thermal degradation of products in distillation temperatures of 250 oC at most. Two equipments were used for the molecular distillations: an imported centrifugal molecular distiller, laboratory scale, and a centrifugal molecular distiller, pilot scale, a national technology developed by this research group at the Laboratory of Separation Process Development (LDPS). MAG of 80% of purity was obtained and also na oil rich in DAG (53 wt%). The distilled products were characterized according to their characteristics of molar weight, density and degradation temperature / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:40:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prazeres_JanainaNicanuziados_D.pdf: 4737437 bytes, checksum: ec3f9eaf0835996e8527fb6b9970354f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Recentemente, a aplicação industrial de lipases microbianas tem sido estendida a muitas áreas, como por exemplo, na modificação de triglicerídeos, síntese de vários compostos de ésteres e detergentes. As lipases podem ser aplicadas na limpeza de maquinários industriais ou em detergentes como sabões em pó na remoção de manchas de lipídeos em tecidos. A linhagem de fungo Fusarium oxysporum 152B foi selecionada entre 216 linhagens de microrganismos isolados de amostras de frutas e solo do Nordeste do Brasil, como maior produtora de lipase alcalina extracelular em meio de cultura. Os efeitos da composição do meio, pH e temperatura foram investigados para a produção de lipase alcalina de Fusarium oxysporum. A máxima quantidade de atividade lipolítica produzida foi 7,12 U.mL-1 em meio contendo óleo de oliva, peptona e extrato de levedura como fontes de carbono e nitrogênio, em pH 10,0 e 30 °C. Um desenho experimental 22 com configuração estrela, totalizando 11 experimentos, foi desenvolvido para estudar os efeitos do pH e temperatura de incubação e o máximo de atividade encontrada foi de 33 U.mL-1 em pH 6,0 e a 30 °C. Um segundo desenho experimental 22 foi desenvolvido para estudar duas variáveis, composição do meio e a concentração de óleo de oliva. Máxima atividade enzimática foi produzida em meio de cultura suplementado com óleo de oliva (2% m/v). A atividade enzimática da lipase de Fusarium oxysporum foi avaliada na presença de diferentes detergentes comerciais e surfactantes, através de ensaios com pnitrofenilpalmitato (pNPP). A enzima foi compatível com vários surfactantes iônicos e não-iônicos como também com detergentes comerciais. Atividade lipolítica foi fortemente inibida por SDS, mas não por Triton X-100 e Triton X-114. A enzima mostrou-se estável em pH alcalino e manteve 93% da atividade durante 1 h de incubação a 60°C. A maior atividade lipolítica foi medida com triglicerídeos de ácidos graxos de cadeia média e longa (C8-C18). Esta enzima mostrou ampla especificidade hidrolítica para várias gorduras e óleos. Todas estas propriedades e sua resistência a vários surfactantes e detergentes comerciais fazem desta lípase um aditivo em potencial para formulação de detergentes. Esta lipase alcalina extracelular foi purificada cerca de 20 vezes através de cromatografia em colunas de DEAE-Sepharose e Sephacyl-200. A preparação de lipase purificada apresentou três isoenzimas em gel IEF-PAGE, com pontos isoelétricos 7,15, 6,84 e 4,55. As massas moleculares das lipases Lip 1 e Lip 2 foram verificadas em gel SDS-PAGE, 30 e 29 kDa, respectivamente. Comparandose as seqüências de aminoácidos, confirmou-se que as lipases Lip 1 e Lip 2 são isoenzimas que apresentam alta similaridade com a lipase de F. heterosporum. A lipase purificada apresentou atividade ótima em pH 8,0 e 40°C, utilizando o substrato p-nitrofenilpalmitato. A lipase purificada mostrou-se termoestável, perdendo cerca de 50% de atividade durante 1h de incubação a 40°C em pH 8,0. Um método de separação e purificação foi estudado para a obtenção da lipase do meio de cultura. Os experimentos foram desenvolvidos com o surfactante nãoiônico Triton X-114. Dois parâmetros foram estudados, pH e taxa de fluxo de nitrogênio. A máxima recuperação desta lipase foi verificada em pH 8,5 e fluxo de 60 mL N2 min-1. Após otimização, uma taxa de enriquecimento de 8,77 e um fator de purificação de 5,86 foram atingidos para esta enzima com uma recuperação de 93,56%. O fracionamento com espuma foi aplicado com sucesso para a concentração da lipase do meio de cultivo / Abstract: Recently, industrial application of the microbial lipases has been extended in many areas, exemplified by their use in modification of triglycerides, synthesis of various ester compounds and additives in detergents. Lipases are potentially suitable for lipid stain removal applications in washing industrial machine and household detergents. One strain Fusarium oxysporum 152B was isolated from fruit and soil samples from Northeast of Brazil, which produced the largest amount of extracellular alkaline lipase in the culture media. The effects of medium composition, pH and incubation temperature conditions were investigated to alkaline lipase production. The maximum amount of lipolytic activity produced was 7.12 U.mL-1 in medium containing olive oil, peptone and yeast extract, as carbon and nitrogen sources, at pH 10.0 and 30 °C. A 22 factorial design with star configuration, totaling 11 experiments, was carried out to study the effect of pH and incubation temperature conditions and the maximum lipase activity was found of pH 6.0 and 30 °C conditions (33 U.mL-1). A second experimental design, 22 factorial was developed to study two variables, medium composition and olive oil concentration. Maximum enzyme activity was produced in culture medium supplemented with olive oil (2% w/v). Enzymatic activities of lipase from Fusarium oxysporum were compared through spectrophotometric p-nitrophenylpalmitate (pNPP) assay at different commercial detergents and surfactants. The enzyme was compatible with various ionic and nonionic surfactants as well as commercial detergents. Lipase activity was strongly inhibited by SDS, but not by Triton X-100 and Triton X-114. The enzyme was stable at alkaline pH and remained 93% of activity during 1 h incubation at 60°C. The highest lipase activity was measured with triglycerides of middle and long chain fatty acids (C8-C18). This enzyme showed a broad specificity/hydrolytic activity towards various fats and oils. All these properties and its resistance towards various surfactants and detergents make this lipase a potential additive for detergent formulation. The extracellular alkaline lipase from Fusarium oxysporum was purified 20-fold, using DEAE-Sepharose and Sephacyl-200 chromatography. The purified lipase presented three isoenzymes in IEF-PAGE, with the following isoelectric points 7.15, 6.84 and 4.55. The molecular mass were determined to Lip 1 and Lip 2 in SDSPAGE as 30 and 29 kDa, respectively. Comparing the amino acids sequences, Lip 1 and Lip 2 were confirmed to be isoenzymes and high similarity with the lipase from F. heterosporum. The purified lipase showed optimum activity in pH 8.0 and 40°C, using p-nitrophenylpalmitate as substrate. The purified lipase showed to be termostable, losing around 50% of activity under 1h incubation at 40°C in pH 8.0. A separation method was performed to recover alkaline lipase from F. oxysporum cultures. Experiments were carried out with non-ionic surfactant Triton X-114. Two parameters were studied, pH and nitrogen flow rate. The maximal recovery of this lipase was verified at pH 8.5 and 60 mL N2 min-1 conditions. After optimization, an enrichment ratio of 8.77 and a purification factor of 5.86 were achieved for this enzyme along with 93.56 % recovery. Foam fractionation showed to be an efficient method for lipase recovery from culture broths / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Nesse trabalho foi desenvolvido um método de síntese quimioenzimática de organo-seleno aminas (1-((2, 3 ou 4 selenocianato)fenil)etanonas) e amidas (N-(1-(2, 3 ou 4-(etilseleno)fenil)etil)acetamida) enantiomericamente enriquecidas. Inicialmente, as organo-seleno aminas, na forma racêmica, foram sintetizadas a partir das orto-, meta- e para- aminoacetofenonas. A incorporação do átomo de selênio nas cetonas aromáticas foi realizada através da reação de selenocianato de potássio com sais de diazônio, preparados a partir das aminoacetofenonas, para levar as o, m ou p-selenocianato acetofenonas (28-65 %). Reações desses compostos com NaBH4, formaram os intermediários organo-selenoboro, que foram posteriormente alquilados com haletos de alquila de modo a formar as organo-seleno acetofenonas (1-(2, 3 ou 4-(etilseleno)fenil)etanona) (63-78 %). As Organo-seleno aminas racêmicas foram preparadas por aminação redutiva das cetonas correspondentes (39-73 %). Após desenvolvido o protocolo de síntese das organo-seleno aminas, nós estudamos a resolução cinética desses compostos através de reação de acetilação mediada por lipases. Um estudo inicial foi conduzido com a amina para substituído, como substrato modelo, de modo a buscar a lipase, solvente, temperatura, razão lipase/substrato e acilante apropriados para a resolução cinética. De acordo com os resultados obtidos, as condições ideais para se conduzir a resolução cinética foi CAL-B como biocatalisador, hexano como solvente e acetato de etila ou metóxi-acetato de etila como acilante a 30°C. Utilizando esse protocolo, as organo-seleno amidas foram preparadas com excelentes excessos enantioméricos (99 %). / In this work, we have developed a chemoenzymatic method to enantiomerically synthesize enriched organoselenium amines (1-(2, 3 or 4 -(ethylselanyl)phenyl)ethanamine) and amides (N-(1-(2, 3 or 4-(ethylselanyl)phenyl)ethyl)acetamide). Initially, the organoselenium amines, in the racemic form, were synthesized from ortho-, meta- and para- aminoacetophenones. The incorporation of the selenium atom into the aromatic ketones was achieved by the use of reaction of potassium selenocyanate and diazonium salts, prepared from aminoacetophenones, to afford selenocyanate acetophenones (28-65 %). These compounds were alkylated with alkyl halide to yield the organoselenium acetophenones (1-(2, 3 or 4-(ethylselanyl)phenyl)ethanone) (63-78 %) which were converted into their corresponding racemic organoselenium amines by reductive amination (39-73 %). After developing the protocol for the synthesis of racemic organoselenium amines, we studied the kinetic resolution of these compounds by their acetylation mediated by lipases. An initial study was carried out with the organoselenium amine para substituted, as a model substrate, in order to screen for appropriate lipase, solvent, temperature, lipase/substrate ratio and acylant. This study showed that the ideal condition to conduct the kinetic resolution was CAL-B as biocatalyst, hexane as solvent and ethyl acetate or ethyl methoxyacetate as acylant at 30°C. By using this protocol, the organoselenium amides were prepared in excellent enantiomeric excess (99 %).

Este trabalho envolveu reações de biocatálise com objetivo de obter compostos enantiomericamente puros. Assim foram realizadas reações de redução de derivados de acetofenonas, resolução enzimática de alcoóis e azido-alcoóis e imobilização de células fúngicas em suportes sólidos para aplicação em biocatálise. Foi realizada a redução enantiosseletiva da 1-(4-metoxifenil)etanona (1) através da triagem com nove fungos marinhos (Aspergillus sydowii CBMAI 935, A. sydowii CBMAI 934, A. sclerotiorum CBMAI 849, Bionectria sp. CBMAI 936, Beauveria felina CBMAI 738, Cladosporium cladosporioides CBMAI 857, Mucor racemosus CBMAI 847, Penicillium citrinum CBMAI 1186, P. miczynskii CBMAI 930). Os fungos A. sydowii CBMAI 935 e Bionectria sp. CBMAI 936 catalisaram a biorredução estereosseletiva da 1-(4-metoxifenil)etanona (1) para o correspondente (R)-1-(4-metoxifenil)etanol (1a) com excelentes excessos enantioméricos (>99%). Os fungos B. felina CBMAI 738 e P. citrinum CBMAI 1186 catalisaram a biorredução estereosseletiva da cetona 1 para o correspondente S-álcool 1a com 69% de excesso enantiomérico. Os fungos marinhos (A. sclerotiorum CBMAI 849, A. sydowii CBMAI 934, B. felina CBMAI 738, M. racemosus CBMAI 847, P. citrinum CBMAI 1186, P. miczynskii CBMAI 931, P. miczynskii CBMAI 830, P. oxalicum CBMAI 1185, Trichoderma sp. CBMAI 932) foram utilizados na bioconversão assimétrica das iodoacetofenonas 2-4 para os correspondentes iodofeniletanois 2a-4a. Todos os fungos marinhos produziram exclusivamente (S)-o-iodofeniletanol (2a) e (S)-m-iodofeniletanol (3a) com diferentes valores de excessos enantioméricos (62-99%). Os fungos B. felina CBMAI 738, P. miczynskii CBMAI 830, P. oxalicum CBMAI 1185 e Trichoderma sp. CBMAI 932 produziram o correspondente (R)-p-iodofeniletanol (4a) com excessos enantioméricos de 32-99%. A bioconversão da p-iodoacetofenona (4) com células microbianas do P. oxalicum CBMAI 1185 mostrou uma competição entre a reação de redução e oxidação. Também foram realizadas as reduções das ceto-azidas 13-16 com fungos marinhos fornecendo bons resultados de seletividade (28-99% ee). As células microbianas dos fungos A. sclerotiorum CBMAI 849 e P. citrinum CBMAI 1186 foram imobilizadas em suportes de sílica gel, xerogel de sílica e quitosana. As células do P. citrinum CBMAI 1186 imobilizadas em quitosana catalisaram a redução da 1-(4-metoxifenil)-etanona (1) para o correspondente (S)-1-(4-metoxifenil)-etanol (1a) com excelente excesso enantiomérico (>99%). O fungo P. citrinum CBMAI 1186 imobilizado em quitosana também catalisou a biorredução de 2-cloro-1-feniletanona (7) para o 2-cloro-1-feniletanol (7a), mas neste caso, sem seletividade. Neste trabalho também foram realizadas as resoluções quimio-enzimáticas dos (±)-o-iodofeniletanol (2a), (±)-m-iodofeniletanol (3a), (±)-p-iodofeniletanol (4a), (±)-2-azido-1-feniletanol (13a), (±)-2-azido-1-(4-metoxifenil)etanol (14a), (±)-2-azido-1-(4-bromofenil)etanol (15a), (±)-2-azido-1-(4-nitrofenil)etanol (16a) e (±)-2-azido-1-(4-clorofenil)etanol (17a) com a lipase CALB. Os (S)-m-iodofeniletanol (3a) e (S)-p-iodofeniletanol (4a) foram obtidos com excelentes excessos enantioméricos (>99%) e posteriormente foram utilizados na síntese de compostos bifenílcos quirais por reação de acoplamento Suzuki fornecendo bons rendimentos (63-65%). A resolução quimio-enzimática dos azido-alcoóis 13a-17a foram realizadas com lipase Candida atarctica e os (R)-2-azido-1-feniletanol (13a), (R)-2-azido-1-(4-metoxifenil)etanol (14a), (R)-2-azido-1-(4-bromofenil)etanol (15a), (R)-2-azido-1-(4-nitrofenil)etanol (16a) obtidos foram utilizados na síntese dos triazóis quirais (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)-1-feniletanol (13), (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)-1-(4-metoxifenil)etanol (14), (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)-1-(4-bromofenil)etanol (15) e (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)-1-(4-nitrofenil)etanol (16) e (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-il)-1-(4-clorofenil)etanol (17), obtidos com ótimos rendimentos (79-85%). / This work involved reactions of biocatalysis in order to obtain enantiomerically pure compounds. Thus reactions were performed reduction of acetophenones derivatives, enzymatic resolution of azido-alcohols, secondary alcohols and immobilization of fungal cells on solid supports for use in biocatalysis. We performed the enantioselective reduction of 1-(4-methoxyphenyl)ethanone (1) by screening with nine marine fungi (Aspergillus sydowii CBMAI 935, A. sydowii CBMAI 934, A. sclerotiorum CBMAI 849, Bionectria sp. CBMAI 936, Beauveria felina CBMAI 738, Cladosporium cladosporioides CBMAI 857, Mucor racemosus CBMAI 847, Penicillium citrinum CBMAI 1186, P. miczynskii CBMAI 930). The fungi A. sydowii CBMAI 935 and Bionectria sp. 936 CBMAI catalyzed stereoselective bioreduction of 1-(4-methoxyphenyl)ethanone (1) to the corresponding (R)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol (1a) with excellent enantiomeric excess (>99%). Fungi B. felina CBMAI 738 and P. citrinum 1186 CBMAI catalyzed stereoselective bioreduction of ketone 1 to the corresponding S-alcohol 1a with 69% enantiomeric excess. The marine fungi (A. sclerotiorum CBMAI 849, A. sydowii CBMAI 934, B. felina CBMAI 738, M. racemosus CBMAI 847, P. citrinum CBMAI 1186, P. miczynskii CBMAI 931, P. miczynskii CBMAI 830, P. oxalicum CBMAI 1185, Trichoderma sp. CBMAI 932) were used in the bioconversion of asymmetric iodoacetophenones 2-4 to the corresponding iodophenylethanols 2a-4a. All marine fungi produced exclusively (S)-o-iodophenylethanol (2a) and (S)-m-iodophenyletanol (3a) with different values of enantiomeric excess (62-99%). Fungi B. felina CBMAI 738, P. miczynskii CBMAI 830, P. oxalicum CBMAI 1185 and Trichoderma sp. CBMAI 932 produced the corresponding (R)-p-iodophenylethanol (4a) with enantiomeric excess of 32-99%. The bioconversion of p-iodoacetophenone (4) with microbial cells of P. oxalicum CBMAI 1185 showed a competition between oxidation and reduction reaction. Were also performed reductions of azido-ketones 13-16 with marine fungi providing good results of selectivity (28-99% ee). Microbial cells of fungi A. sclerotiorum CBMAI 849 and P. citrinum CBMAI 1186 were immobilized on supports of silica gel, silica xerogel and chitosan. Whole cells of P. citrinum 1186 CBMAI immobilized on chitosan catalyzed the reduction of 1-(4-methoxyphenyl)ethanone (1) to the corresponding (S)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol (1a) with excellent enantiomeric excess (>99%). The fungus P. citrinum 1186 CBMAI immobilized on chitosan also catalyzed the bioreduction of 2-chloro-1-phenylethanone (7) to 2-chloro-1-phenylethanol (7a), but in this case without selectivity. In this work were also performed chemo-enzymatic resolutions of (±)-o-iodophenylethanol (2a), (±)-m-iodophenylethanol (3a), (±)-p-iodophenylethanol (4a), (±)-2-azido-1-phenylethanol (13a), (±)-2-azido-1-(4-methoxyphenyl)ethanol (14a), (±)-2-azido-1-(4-bromophenyl)ethanol (15a), (±)-2-azido-1-(4-nitrophenyl)ethanol (16a) and (±)-2-azido-1-(4-chlorophenyl)ethanol (17a) with the lipase Candida atarctica. The (S)-m-iodophenylethanol (3a) and (S)-p-iodophenylethanol (4a) were obtained with excellent enantiomeric excess (>99%) and were subsequently used in the synthesis of chiral biphenyl compounds by the Suzuki reaction with good yields (63-65%). Chemoenzymatic resolution of azido-alcohols 13a-17a were carried out using lipase CALB and (R)-2-azido-1-phenylethanol (13a), (R)-2-azido-1-(4-methoxyphenyl)ethanol (14a), (R)-2-azido-1-(4-bromophenyl)ethanol (15a), (R)-2-azido-1-(4-nitrophenyl)ethanol (16a) obtained were used in the synthesis of chiral triazoles (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-yl)-1-phenylethanol (13), (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-yl)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol (14) (R)-2-(1H-benzo [d][1,2,3]triazol-1-yl)-1-(4-bromophenyl)ethanol (15) and (R)-2-(1H-benzo[d][1,2,3]triazol-1-yl)-1-(4-nitrophenyl)ethanol (16) and (R)-2-(1H-benzo[d] [1,2,3]triazol-1-yl)-1-(4-chlorophenyl)ethanol (17) obtained in good yields (79-85%).

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ohara_Andre_M.pdf: 6935792 bytes, checksum: 553cf8492d7af096c35b5c595ec6e3a1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A bioprospecção de micro-organismos representa um grande potencial tecnológico para produção de biocompostos de interesse comercial. Dentre estes compostos estão as enzimas lipolíticas, como as lipases (triacilglicerol acil-hidrolases EC 3.1.1.3) que apresentam um enorme potencial para aplicações biotecnológicas. Outro tipo de biocomposto de relevante interesse comercial são as vitaminas do complexo B, as quais possuem função essencial na atividade de enzimas que regulam reações do metabolismo. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi isolar e selecionar linhagens de leveduras do solo de diferentes biomas do Estado de São Paulo com potencial para produção de lipase e de vitaminas do complexo B (biotina e riboflavina). Para tanto, foram isoladas 132 leveduras de amostras de solos provenientes da Mata Atlântica e da região de transição (Mata Atlântica e Cerrado). Essas linhagens foram depositadas na coleção de micro-organismos do laboratório de Bioquímica de Alimentos da FEA-UNICAMP, que já contava com 300 leveduras provenientes da região de Cerrado. As 432 linhagens presentes na coleção foram então avaliadas quanto ao potencial para a produção de lipase extracelular através de seleção em meio sólido diferencial e cultivo em meio líquido, sendo a atividade de lipase determinada no sobrenadante por titulometria de neutralização. O potencial para a produção de biotina e riboflavina extracelular foi avaliada por meio de seleção em meio de cultivo líquido, sendo as concentrações das vitaminas determinadas no sobrenadante por espectrofotometria e fluorimetria. Desta forma 33 leveduras apresentaram potencial para produção de lipase alcançando valores de atividade enzimática que variaram de 6,51 U/mL a 21,44 U/mL. Em relação à produção das vitaminas do complexo B, 38 linhagens apresentaram concentrações de biotina no sobrenadante do cultivo que variaram de 0,28 µg/mL a 18,61 µg/mL e 64 linhagens apresentaram concentrações de riboflavina que variaram de 0,03 µg/mL a 0,77 µg/mL. A linhagem RP.C153 apresentou potencial para produção de lipase e riboflavina, enquanto a linhagem RP.J1308 para produção de lipase e biotina. A linhagem RP.C153 foi classificada como Pichia caribbica e a linhagem RP.J1308 como Candida oleophila / Abstract: The bioprospection of microorganisms represents a great technological potential for the production of biocompounds of commercial interest. Among these compounds are the lipolytic enzymes, such as lipases (triacilglicerol acilhidrolases EC 3.1.1.3) which have currently a huge potential for biotechnological applications. B vitamins are another type of biocompound with relevant commercial interest, which have essential role in the activity of enzymes that regulate metabolic reactions in living organisms. Therefore, the aim of this work was to isolate and select strains of yeasts from the soil of different biomes present in the State of São Paulo for the biotechnological production of lipase and B vitamins (biotin and riboflavin). Thus, 132 yeasts were isolated from soil samples of the Atlantic Forest (Ilha Bela - SP) and the transition region between the Atlantic Forest and Savanna (Campinas - SP). These strains were deposited in the collection of microorganisms of the Food Biochemistry Laboratory FEA - UNICAMP, which already had 300 yeasts from the Savanna region (Ribeirão Preto - SP). Therefore 432 strains present in the collection were then evaluated for their potential to produce extracellular lipase by selection on solid selective differential and liquid medium culture, and the enzyme activity in the supernatant was determined by neutralization titration. The potential production of extracellular biotin and riboflavin was assessed by selection in medium liquid culture, and the concentrations of those vitamins were measured in the supernatant by spectrophotometry and fluorimetry. Therefore 33 yeasts demonstrated potential for the production of lipase, reaching values of enzymatic activity ranging from 6.51 U/mL to 21.44 U/mL. In relation to the production of B vitamins, 38 strains presented concentrations of biotin in the supernatant culture ranging from 0.28 µg/mL to 18.61 µg/mL and 64 strains demonstrated concentrations of riboflavin ranging from 0.03 µg/mL to 0.77 µg/mL. The strain RP.C153 presented potential for production of lipase and riboflavin, while strain RP.J1308 for production of lipase and biotin. The RP.C153 strain was classified as Pichia caribbica and RP.J1308 strain as Candida oleophila / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:45:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_DanielleBranta_D.pdf: 3780152 bytes, checksum: ba7b4a54629ff27a24abae14e788d60c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os aromas despertam grande interesse entre consumidores e indústrias de alimentos, especialmente por estarem diretamente relacionados ao sabor dos alimentos. Dentre os aromas de maior importância industrial destaca-se o grupo das lactonas, presentes em uma grande variedade de produtos naturais e compostos biologicamente ativos. Em virtude do destaque apresentado por essa classe de substâncias, diversos métodos para sua produção têm sido relatados. Como alternativa aos processos químicos tradicionais, propõe-se nesta pesquisa a utilização da biotecnologia de micro-organismos e enzimas para a produção de compostos aromáticos a partir de substratos naturais, como óleos vegetais hidrolisados.A fermentação microbiana é considerada um caminho potencial para a produção de aromas naturais, sendo o grupo formado pelos fungos um dos mais utilizados para esse fim. A biocatálise também é uma alternativa muito vantajosa e capaz de catalisar um grande número de reações estéreo- e regiosseletivas, o que não é alcançado por meio de síntese química clássica. O uso de enzimas isoladas torna-se preferível em relação ao uso de micro-organismos quando existem limitações relacionadas à permeabilidade do substrato na membrana da célula ou quando ocorrem reações secundárias indesejáveis.Considerando-se os argumentos citados, neste trabalho foram estudados dois métodos para a produção de lactonas. O primeiro deles, a biotransformação, foi feita a partir do uso de micro-organismos para a produção dos compostos em questão. O segundo método, a biocatálise, foi realizado através da reação de lactonização com o uso de lipases microbianas brutas isoladas e liofilizadas. Os substratos utilizados no estudo foram os óleos vegetais de mamona e linhaça previamente hidrolisados por lipases fúngicas produzidas por Rhizopus sp. e Geotrichum sp. A produção de lactonas foi alcançada em ambos os métodos. Com o uso da biotransformação, todos os micro-organismos testados (Geotrichum sp., Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Linhagens 1068 e 1099) e Fusarium oxysporum) foram capazes de produzir diferentes tipos de lactonas, com destaque para o fungo Fusarium oxysporum, que produziu maior variedade delas (&61543;-decalactona, 2-cumaranona, mevalonolactona e pantolactona), além de alcançar o maior rendimento na produção de &61543;-decalactona (18,93 &956;L L-1), após 48 horas de reação e empregando-se os óleos de mamona e linhaça previamente hidrolisados pela lipase produzida pelo fungo Rhizopus sp.. Através do uso da biocatálise, ótimos resultados também foram alcançados, e a produção de lactonas foi possível ao se utilizar as lipases produzidas pelos fungos Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Linhagem 1068) e Fusarium oxysporum, sendo possível a produção de &61543;-undecalactona, &61543;-decalactona e &61543;-dodecalactona, dependendo da lipase empregada e do tempo de reação. A maior produtividade foi obtida na produção de &61543;-undecalactona ao se utilizar a lipase produzida pelo fungo Rhizopus sp. após 24 horas de reação, obtendo-se um rendimento de 21,78 &956;L L-1, também a partir do uso dos óleos de mamona e linhaça hidrolisados previamente pela lipase produzida por Rhizopus sp. As lipases produzidas pelos fungos Geotrichum sp. e Aspergillus sp. (Linhagem 1099), também estudadas neste trabalho, não foram capazes de produzir lactonas / Abstract: Aromas arouse great interest among consumers and food industry, especially because heir direct relationship with food taste. In the midst of the most important industrial flavorings stands lactones group, which are present in a wide variety of natural products and biologically active compounds. Due to the prominence of this class of substances, several methods for the production of lactones have been reported. As an alternative to traditional chemical processes, it is proposed in this research the use of microbial and enzyme biotechnology for the production of aromatic compounds natural substrates, such as hydrolyzed vegetable oils. The microbial fermentation is considered a potential pathway for the production of natural flavor, and fungi group is the most widely used for this purpose. Biocatalysis is also a very useful alternative and is able to catalyze a large number of stereo- and regioive reactions, which is not achieved by classical chemical synthesis. The use of isolated enzymes is preferable over the use of microorganisms when there are limitations concerning the permeability of the substrate in the cell membrane or when undesired side reactions occur. Considering these arguments, two methods were investigated in this work for the production of lactones. The first one, biotransformation, was made the use of microorganisms for the production of these compounds. The second method, biocatalysis, was performed by lactonization reaction using crude microbial lipases that was isolated and lyophilized. Substrates used were the vegetable castor and linseed oils previously hydrolyzed by fungal lipases produced by Rhizopus sp. and Geotrichum sp. Lactones production was achieved in both methods. Using biotransformation, all microorganisms tested (Geotrichum sp., Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Strains 1068 and 1099) and Fusarium oxysporum) were able to produce different lactone types, especially using the fungus Fusarium oxysporum, which produced a greater variety (&61543;-decalactone, 2-cumaranone, mevalonolactone and pantolactone), achieving the best performance in y-x decalactone production (18.93 &956;L L-1), after 48 h employing castor and linseed oils hydrolyzed by lipase Rhizopus sp. Through the biocatalysis use, excellent results were also obtained, and the lactones production was possible using lipases produced by fungi Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Strain 1068) and Fusarium oxysporum. The production of y-undecalactone, y-decalactone and y-dodecalactone was achieved depending on the lipase employed and the reaction time used. Highest yield was obtained in the &61543;-undecalactone production (21.78 &956;L L-1), using castor and linseed oils hydrolyzed by Rhizopus sp. lipase. Lipases produced by Geotrichum sp. and Aspergillus sp. (Strain 1099) was also studied in this work, but were unable to produce lactones / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

Les réserves d’huile de la graine d’Arabidopsis thaliana sont hydrolysées par des lipases au cours de la croissance post-germinative de la plantule. Une protéine capable de fixer un inhibiteur de lipase a été identifiée à partir d’un extrait de plantules de colza. La séquence de cette protéine ressemble à celles de lipases connues. L’expression transitoire du gène orthologue d’Arabidopsis chez Nicotiana benthamiana induit l’apparition d’une activité lipase. Ces données suggèrent que cette protéine est une lipase. Une étude de la localisation in vivo de cette enzyme chez Nicotiana benthamiana indique qu’elle est localisée au niveau des peroxysomes. Chez Arabidopsis, le gène codant pour cette lipase est exprimé essentiellement lors de la croissance des plantules, quand l’hydrolyse de l’huile est maximale. L’analyse d’un mutant montre que ce gène est responsable de l’essentiel de l’activité lipase mesurée pendant la mobilisation de l’huile de réserve. Ces données suggèrent que cette lipase pourrait être impliquée dans la mobilisation des réserves lipidiques pendant la croissance post-germinative. Néanmoins, l’hydrolyse des réserves n’est pas diminuée chez le mutant. Cela pourrait être lié à une compensation par d’autres lipases. / In germinating seedlings of Arabidopsis thaliana, fat storage breakdown is initiated by lipases. A protein capable to bind to a lipase inhibitor was identified from an extract of rape seedlings and its amino acid sequence found to resemble that of known lipases. Transient expression of the Arabidopsis orthologous gene led to a 100-fold increase in lipase activity in Nicotiana bethamiana leaves. Taken together, these data strongly suggest that this protein is indeed a lipase. In vivo localization studies using a GFP fusion protein in Nicotiana benthamiana as a transcient expression host showed a peroxisomal localization. In Arabidopsis, the gene coding for this lipase was found to be mainly expressed in seedlings during fat storage breakdown. Most lipase activity was abolished in germinating seedlings of an Arabidopsis mutant for this gene. These data suggest that this lipase is likely involved in the breakdown of fat storage in germinating seedlings of Arabidopsis. However, oil mobilization was not affected in Arabidopsis mutant plants. This might suggest that the effect of the mutation could be compensated for by other lipases.

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T11:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_PetrusPires_M.pdf: 1926670 bytes, checksum: c90fed5582358b0c850c13626f16e393 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A lipase é uma enzima de alto interesse comercial, com aplicabilidades diversas na indústria, desde aditivo de detergentes até ferramenta de síntese da indústria farmacêutica. O uso da enzima é limitado, no entanto, pelo alto custo de obtenção em nível de pureza adequado, de acordo com a finalidade. O objetivo desse trabalho foi imobilizar a lipase diretamente de seu extrato bruto, excluindo no processo outras proteínas, promovendo uma imobilização seletiva, atuando como extração, ou purificação de baixa resolução. A enzima foi produzida utilizando uma cepa de Burkholderia cepacia com óleo de oliva como indutor. O fermentado produzido pela bactéria foi caracterizado quanto à sua atividade lipolítica utilizando o p-npp como substrato. O extrato apresentou temperatura ótima de 50°C e pH ótimo 9,0. A enzima foi avaliada ainda quanto à sua afinidade pelo substrato utilizado, revelando um Km=18,4 mM, com uma velocidade máxima de atividade de 5,56 mM.min-1. Através dos dados da cinética foi possível calcular a energia de ativação da enzima em 38 kJ.mol-1.K-1. O extrato enzimático foi utilizado em procedimento de imobilização utilizando alginato de sódio em solução. As já documentadas interações entre o alginato e lipases permitiram realizar um processo de imobilização seletiva por precipitação com cloreto de cálcio. Foram estudadas, com o auxílio de planejamento estatístico de experimentos, as seguintes variáveis atuantes no processo: pH e concentração da solução de alginato, concentração da solução de cloreto de cálcio, tamanho das esferas produzidas e relação volume alginato/volume solução enzimática. As melhores condições encontradas para o processo foram concentração de alginato de 2%, pH da solução 3,68 e concentração de cloreto de cálcio 200mM, com uma relação de 40% de volume alginato/60% solução enzimática, produzindo esferas de 2 mm de diâmetro. Com essas condições obteve-se uma taxa de imobilização de 168,07%, que representa uma concentração da proteína alvo em 1,68 vezes, e recuperação superior a 99% em um procedimento de etapa única / Abstract: Lipase is an enzyme of high commercial value, with several applications in industry, from detergent additive to pharmaceutical synthesis tool. Nevertheless, the lipase use is limited by the high cost of its production in the necessary purity grade according to its use. The objective of this work was to entrap lipase directly from its crude extract excluding contaminant proteins in the process, promoting a selective entrapment, acting as a pre-purification or extraction. The enzyme was produced using a strain of Burkholderia cepacia and olive oil as inducer. The crude extract was characterized according to its lipolytic activity using p-npp as substrate. The crude extract presented optimal temperature of 50 °C and optimal pH of 9.0. Lipase was also evaluated according to its affinity for the substrate, revealing a Km of 18.4 mM and maximum velocity of 5.56 mM.min-1. From the data obtained it was also possible to calculate the activation energy of the enzyme: 38 kJ.mol-1.K-1. This crude extract was used in the immobilization procedure using sodium alginate solution. The already published data about the affinity of lipases and alginate allowed a performance of a selective entrapment by precipitation with calcium chloride. Using statistical design of experiments the following variables were studied in the process: concentration and pH of alginate solution, concentration of calcium chloride solution, diameter of the produced beads and relation alginate volume/enzyme solution volume. The best conditions found were: alginate concentration 2% at pH 3.68, 200 mM calcium chloride concentration and a relation 40% alginate solution volume/60% enzyme solution, producing 2 mm diameter beads. In these conditions, it was possible to obtain a immobilization yield of 168.07%, which represents a concentration of 1.68 times of the target protein and an enzyme recovery superior to 99% in a single step procedure / Mestrado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Ranulfo Monte Alegre, Jorge Alberto Vieira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:42:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Castiglioni_GabrielLuis_D.pdf: 2848307 bytes, checksum: 09e1e37498a764f275a4ed9afe996844 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Os avanços biotecnológicos na produção industrial de lipases têm proporcionado sua aplicação nos diferentes setores. Este interesse se deve à capacidade destas enzimas catalisarem algumas reações, dentre elas a transesterificação. Esta reação é reversível e resulta em altos rendimentos a partir da otimização de parâmetros experimentais, tais como, temperatura, concentração do catalisador, razão molar álcool:óleo, entre outros. Um grande número de trabalhos voltados para a produção de biodiesel por via enzimática vem sendo feito devido às vantagens a ela associada. Tendo em vista estas observações, o presente trabalho teve por objetivo o estudo da produção de lipase microbiana e sua aplicação na síntese de biodiesel. As etapas envolvidas neste projeto foram: produção de lipase por diferentes microrganismos utilizando fermentação submersa e semi-sólida; uso de diferentes reatores e meios de cultivo; escolha e caracterização da lipase que melhor apresentou vantagens em relação à produtividade e à atividade de transesterificação; estudo de imobilização e reutilização da lipase em diferentes resinas hidrofóbicas e de troca iônica; estudo da influência do tempo de reação, temperatura, pH, concentração de água, etanol e enzima, além da adição de co-solvente, goma arábica e íons metálicos na síntese do biodiesel. Efeitos positivos nos experimentos foram verificados quando se adicionou KH2PO4 e água de maceração de milho no processo de produção de lipase pela Burkholderia cepacia. Esta cepa apresentou maior potencial de produção de lipase com atividade de transesterificação do óleo de soja e etanol comparada com os demais microrganismos estudados. A caracterização da lipase demonstrou que os melhores resultados foram a 37°C e pH 8,0, seguindo modelo de inativação enzimática de primeira ordem. A resina de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB juntamente com a Amberlit IRA-900 apresentaram maior potencial de imobilização e utilização para a síntese do biodiesel. Nos experimentos de transesterificação, as variáveis estudadas apresentaram efeito na respostas de síntese de biodiesel. Os melhores resultados encontrados foram: pH igual a 6,0, temperatura em ttorno de 50ºC, uso de éter de petróleo como co-solvente, concentração de etanol próxima à quantidade estequiométrica e concentração de aproximadamente 42% de água. Por fim, na reutilização das resinas de poli(estireno-co-divinilbenzeno) com 35% de DVB e Amberlit IRA-900, foi observada uma diminuição no rendimento da reação devido à perda de parte da enzima por lixiviação. Os resultados referentes à primeira resina mostraram que a perda da atividade está relacionada ao número de usos e segue uma função de primeira ordem. A constante de perda da atividade foi de 3,017 e o tempo de meia vida do processo 18 usos. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx determinados na reação foram de 21,98% e 14,56%p.h-1, respectivamente. Já em relação à reutilização da lipase imobilizada na segunda resina, o tempo de meia vida foi de 6 usos. Com isso o presente trabalho apresenta uma contribuição significativa no que diz respeito ao uso de lipase de Burkholderia cepacia e agrega soluções para viabilizar o processo de transesterificação com esta enzima / Abstract: The technological advancements in the industrial production of lipases have been making its application viable in different sectors. This interest is due to these enzymes capacity to catalyze some reactions, like the transesterification. This reaction is reversible and the optimization of experimental parameters such as temperature, catalyst concentration and ethanol-to-oil molar ratio results in a high production efficiency. A great number of studies about the enzymatic production of biodiesel have been done due to its related advantages. Considering these observations, the objective of this work was to study the production of microbial lipase and its application in the synthesis of biodiesel. The stages involved in this project were: lipase production by different microorganisms using submerged and semisolid fermentation; use of different reactors and cultivation media; selection and characterization of the lipase that showed advantages related to the productivity and to the transesterification activity; study of the immobilization and reutilization of the lipase in different hydrophobic and ionic exchange resins; study of the influence of reaction time, temperature, pH, water, ethanol and enzyme concentrations and the addition of cosolvents, arabic gum and metallic ions in the synthesis of biodiesel. Positive effects were verified in the experiments when KH2PO4 and corn maceration liquor were added to the process of lipase production by Burkholderia cepacia. Compared with the other microorganisms studied, that strain showed greater potential for the production of lipase with activity of transesterification of soy oil and ethanol. The characterization of the lipase showed that the best results occurred at 37°C and pH 8.0, following the model of first order enzymatic inactivation. The poly(styrene-co-divinylbenzene) resin with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 presented greater potential for the immobilization and synthesis of the biodiesel. In the transesterification experiments, the studied variables affected the response of the biodiesel synthesis. The best results were found at pH 6.0, temperature of 50ºC, petroleum ether as co-solvent, ethanol concentration at stequiometric values and water concentration around 42%. Finally, due to the loss of enzyme by lixiviation, it was observed a decrease in the efficiency of the reaction when the poly(styrene-codivinylbenzene) resins with 35% of DVB and Amberlit IRA-900 were reused. The results referring to the first resin showed that the loss of activity is related to the number of utilizations and it follows a first order function. The activity loss rate was 3.017 and the half-life of the process was 18 uses. The kinetic parameters Km and Vmax determined for the reaction were respectively 21.98% and 14.56%p.h-1. Referring to the reutilization of the lipase immobilized in the second resin, the half-life was 6 uses. Thus, this work presents a relevant contribution to the use of the lipase of Burkholderia cepacia and adds solutions to make the process of transesterification with this enzyme viable / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos