Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-01-24T03:12:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343406.pdf: 2002837 bytes, checksum: ff407242a5f915cc84b7ae3d8ed7b097 (MD5) Previous issue date: 2016 / As lipases (triacilglicerol hidrolases) são uma classe de enzimas amplamente distribuídas entre os microrganismos, plantas e animais. Estes biocatalisadores possuem elevada seletividade, reagem em condições brandas produzindo menos subprodutos. A imobilização e o reuso são alternativas promissoras para ampliar o uso de enzimas nas indústrias reduzindo o custo do processo. Neste trabalho foi proposto o uso de suportes em dimensões nanométricas, sintetizados com ultrassom, possuindo propriedades paramagnéticas, com o objetivo de imobilizar as lipases de Rhizomucor miehei e de Candida antarctica B. Foram utilizadas técnicas de caracterização para a verificação da estrutura química e cristalina do suporte, suas propriedades magnéticas, área superficial e perfil termogravimétrico. Este suporte foi aplicado e na adsorção de lipases sendo a seguir aplicado na síntese de monocaprilina. Comparando com a técnica sem ultrassom, o uso deste fez com que a carga elétrica superficial fosse menor e o tamanho e estabilidade das partículas fossem maiores. A análise por difração de raios-X comprova que a técnica usada produziu somente magnetita. A análise de magnetização comprovou a característica paramagnética do suporte, comparável à da magnetita pura. Constatou-se que 80 % da imobilização da lipase ocorreu durante a primeira hora de contato da solução enzimática com o suporte. A análise de infravermelho mostrou os grupos químicos presentes no suporte antes da imobilização e comprovou que esta ocorreu através da identificação de grupos químicos associados a proteínas adsorvidas. A análise de microscopia eletrônica de transmitância mostrou que as partículas possuem tamanho médio de 10 nm. A análise do potencial zeta das partículas mostrou a baixa carga superficial destas indicando que estas tendem a aglomerar, porém, mantendo a área superficial superior às daquelas sintetizadas sem ultrassom. Os testes de estabilidade a solventes mostraram que a polaridade deste afeta a atividade enzimática sendo que quanto mais apolar for o solvente maior foi a elevação da atividade hidrolítica da lipase. Os testes de reuso mostraram que as enzimas imobilizadas foram usadas por até 16 ciclos de hidrólise. A síntese de monocaprilina foi usada como exemplo de aplicação. A melhor condição encontrada foi utilizando excesso molar de glicerol (razão 6:1, glicerol: ácido), 60 °C e 800 rpm utilizando a lipase CALB imobilizada a qual rendeu 40 % em massa de monocaprilina.<br> / Abstract : Lipases (triacylglycerol hydrolase) are a class of enzymes widely distributed in microorganisms, plants and animals. These biocatalysts have high selectivity, react under mild conditions producing less by-products. Immobilization and reuse are promising alternatives to expand the use of enzymes in industry by reducing the cost of the process. This work proposes the use of nanometric supports with paramagnetic properties synthesized under ultrasound waves with the purpose of immobilize the lipase Rhizomucor miehei and Candida antarctica B. Characterization techniques were used to verify the chemical and crystalline structure of the support, their magnetic properties, surface area and thermogravimetric profile. This support was used and studied in lipase adsorption isotherms and after it was applied in monocaprylin synthesis. Comparing with the ultrasound technique, without the ultrassound the surface charge was lower and the particle size and stability of the particles were larger. Analysis by X-ray diffractometry, shows that the technique used yielded only magnetite. The magnetization analysis proved the paramagnetic characteristic of comparable support of pure magnetite. It was found that 80 % of lipase immobilization occurred during the first hour of contact of the enzyme solution with the support. The infrared analysis showed the support chemical groups prior to immobilization and proved that this occurred through the identification of chemical groups associated with the adsorbed proteins. The analysis of electron microscopy transmittance showed that the particles have an average size of 10 nm. The analysis of the zeta potential of the particles showed the low surface charge of these indicating that they tend to agglomerate, but keeping the upper surface area of the synthesized those without ultrasound. The stability tests showed that the polarity solvents affect this enzymatic activity being the nonpolar solvents responsible by the elevation of the hydrolytic activity of lipase. Reuse tests showed that the immobilized enzymes were used for hydrolysis up to 16 cycles. The monocaprylin synthesis was used as the application example. The best condition was found using molar excess of glycerol (ratio 6:1 glycerol acid), 60 ° C and 800 rpm using immobilized lipase CALB which yielded 40% by weight of monocaprylin.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-19T21:42:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 191338.pdf: 1309653 bytes, checksum: 416d539a24e1aac50f6a62f6a85f477c (MD5) / A busca por fontes alternativas de energia tem sido tema de interesse em diversos setores da sociedade e da comunidade científica. Neste trabalho estudou-se a transformação do óleo de soja refinado, degomado e oxidado termicamente (usado em frituras e aquecido em laboratório), em ésteres alquílicos, biodiesel, através da reação de transesterificação enzimática usando lipases comerciais e álcoois de cadeias curtas, metanol e etanol hidratado. As etapas do trabalho compreenderam a caracterização física e química dos óleos utilizados; imobilização das lipases de Candida rugosa (CRL) e Lipolase por adsorção em carvão ativo de casca de coco, de pinus, bauxita ativada, e por aprisionamento em gel de ágar. Foram também realizadas análises da decomposição térmica dos suportes e da CRL, através de análises termogravimétricas. A eficiência do biocatalisador (CRL imobilizada), antes da utilização nas reações de transesterificação dos óleos, foi verificada na reação de esterificação do ácido láurico com n-pentanol, e os melhores resultados foram obtidos com o sistema CRL/gel. A transesterificação dos óleos com metanol e etanol foi realizada com a CRL e a Lipolase imobilizadas em carvão de coco e gel de ágar. Os resultados foram comparados com os obtidos com a Lipozyme imobilizada em resina aniônica, onde foi também, avaliada a reutilização dos biocatalisadores. As características dos ésteres obtidos por via enzimática, foram comparadas com as dos mesmos obtidos por via química, através de análises de RMN 1H e medidas de viscosidade utilizando-se curvas de calibração. Os resultados das reações de transesterificação dos óleos, mostraram que os suportes (carvão de coco, de pinus e bauxita), apesar de possuirem grandes áreas superficiais, não foram adequados para a imobilização das lipases. O gel de ágar foi um bom suporte, sendo que as conversões foram superiores aos obtidos com as lipases livres, especificamente com a Lipolase, incluindo a reutilização da mesma. Por outro lado, na reutilização da Lipozyme na etanólise dos óleos, os ésteres etílicos foram obtidos com conversão inferior a 5 %.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-19T15:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 190480.pdf: 2386699 bytes, checksum: 16697c30e43653cbfaa531ced0f4b4ba (MD5) / Os químicos, procurando sintetizar substâncias enantiopuras, dependem da disponibilidade de materiais de partida quirais. Neste trabalho foi pesquisada a obtenção de ácidos, ésteres, aminas e amidas enantiomericamente puros, através da resolução de ácidos e aminas racêmicos. Dentre as resoluções de ácidos racêmicos, o mais explorado foi o ácido hidroxi(fenil)acético por possuir um grupo hidroxila e um grupo carboxílico. Para obter seus enantiômeros oticamente puros, foram realizadas reações de esterificação do grupo carboxílico e acilação da hidroxila. As reações de esterificação com 1-pentanol forneceram uma conversão em éster de 10 % usando lipase de Pseudomonas sp. imobilizada em gel de ágar (PSL/ágar) após 336h e de 26 % utilizando lipase de Candida antarctica (CAL) após 840h a 25 °C. As reações de acilação foram realizadas após derivatização prévia do ácido em seu éster metílico. O éster foi acilado usando acetato de vinila, PSL livre ou imobilizada em filme de poli(óxido)etileno (PSL/PEO) ou em gel de ágar, em vários solventes orgânicos. Excelentes resultados foram obtidos usando PSL/PEO e éter isopropílico como solvente. Para este sistema, os excessos enantioméricos (ee) para o substrato e produto foram > 99% com conversão de 50%. A enantiosseletividade (E) alcançada foi excelente (E = 1057) contra um E de 230 usando PSL livre, com enantiopreferência para o isômero S. Os demais ácidos submetidos à resolução enzimática através de reação de esterificação com álcoois aquirais foram 2 e 3-alquilalcanóicos e 2-bromoalcanóicos. Neste processo empregaram-se lipases livres e imobilizadas. Os resultados alcançados para a resolução destes ácidos foram modestos, com E variando 1,2 a 10. Também foi avaliada a aminólise biocatalítica de (R,S)-hidroxi(fenil)acetato de metila e (R,S)-2-(4-clorofenoxi)propanoato de metila com 1-butilamina e 1-octilamina catalisada pela CAL. As correspondentes amidas foram obtidas com E variando de 1,2 a 2,7, sendo o enantiômero R, o mais reativo. Na resolução das aminas racêmicas (1-etilpentilamina, 1-metilheptilamina, 1-metilhexilamina, 1-feniletilamina, 1,2-dimetilpropilamina, 2-etilhexilamina) através da aminólise catalisada por CAL, observou que o grau de enantiosseletividade foi dependente da amina de partida e que R foi o enantiômero mais reativo. As aminas discriminadas enantiomericamente foram a 1-metilheptilamina, 1-metilhexilamina, 1-feniletilamina e 1,2-dimetilpropilamina, com valores de E variando 24 a 79. Além disso, alguns compostos racêmicos (ácidos, ésteres e amidas) e enantiomericamente puros (amidas) foram avaliados em teste farmacológico. Os ácidos 2-bromoalcanóicos, hidroxi(fenil)acetato de metila e seus derivados amidas, administrados por via intraperitoneal foram capazes de reduzir significativamente a nocicepção causada pelo ácido acético em camundongos.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-05-28Bitstream added on 2014-11-10T11:58:42Z : No. of bitstreams: 1 000789693.pdf: 3140266 bytes, checksum: 8020e0cbe99572a2e4a68115eacf1d3e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Lipases são hidrolases (triacilglicerol acil hidrolases, EC 3.1.1.3) capazes de hidrolisar ésteres carboxílicos de cadeia longa liberando monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Em adição, as lipases são eficientes em reações de síntese como esterificação, glicerólise, aminólise e transesterificação, essa capacidade relacionada ao deslocamento do equilíbrio da reação no sentido de hidrólise ou síntese dependendo da concentração de água presente no meio, característica que as tornam biocatalizadores muito versáteis, com importantes aplicações biotecnológicas, como em indústrias de alimentos, detergentes, farmacêutica, couro, têxtil, cosméticos e papel. O presente trabalho objetivou identificar as seis espécies de fungos lipolíticos, otimizar a produção dessa enzima pela linhagem selecionada, bem como purificar e caracterizar parcialmente a lipase produzida em condição otimizada. A atividade lipase foi determinada após cultivos submersos, objetivando o aumento da produção da enzima. Os fatores avaliados no processo de otimização da produção de lipase foram: meios minerais, tempo de cultivo, fontes de carbono e nitrogênio e suas concentrações, pH e inóculo. A avaliação das melhores condições de cultivo foi realizada pela atividade lipase, determinada pelo íon ρ-nitrofenol (pNP) liberado na hidrólise do substrato sintético ρ-nitrofenil palmitato a 37 °C. O uso de marcadores moleculares permitiu identificar os seis fungos lipolíticos até espécie, exceto para a linhagem Fusarium sp. CBMAI 1227. A metodologia de triagem dos fungos para produção de lipase em meio neutro permitiu a seleção do isolado Trichodemra harzianum CBMAI 1229 como melhor produtor. A melhor condição para produção de lipase (231,58 ± 35,59 U mL-1) foi alcançada após 120 horas de cultivo a 25 °C e 150 rpm de agitação utilizando meio mineral Olson e Johnson (1948), suplementado com óleo... / Lipases are hydrolases (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) capable of hydrolyzing carboxyl esters of long-chain acylglycerol release mono- or diacyglycerol, free glycerol and fatty acid. In addition, the lipases are effective for synthesis reactions such as esterification, glycerolysis, transesterification and aminolysis, this capability related to the displacement of the equilibrium of the reaction towards synthesis or hydrolysis inherent in the concentration of water present in the medium, the characteristic that makes biocatalysts very versatile, with important biotechnological applications. Such as food, detergents, pharmaceutical, textile, leather, paper and cosmetics industries. This work aimed to identify six species of fungi that produce lipase, optimize the production of this enzyme by lineage selected and purify and characterize partially the lipase produced in optimal condition. Enzyme activity was determined after submerged cultures, aiming to increase enzyme production. The factors measured in this optimization process of lipase production were: mineral components, time of cultivation, source of carbon and nitrogen and their concentration, pH and inoculum. The use of molecular markers allowed us to identify the six lipolytic fungi until species, except for strain Fusarium sp. CBMAI 1227. The methodology of screening of fungi for the production of lipase in neutral medium allowed the selection of the isolated Trichodemra harzianum CBMAI 1229 as best producer. The evaluation of improved cultivation conditions was assayed by lipase activity, determined through hydrolysis releasing íon ρ-nitrofenol (pNP) of ρ-nitrophenyl-palmitate (pNPP) as substrate synthetic at 37 °C. The best condition for lipase production (231,58 ± 35,59 U mL-1) was reached after 120 hours of cultivation, 25 °C and 150 rpm in medium mineral Olson & Johnson (1948), suplemented with sunflower oil 3,0% (v/v), peptone 2,0% (w/v), yeast extract 0,2%...

Orientador : Profª Drª Nadia Krieger / Co-orientadores : Profª Drª Gisella Maria Zanin / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 04/05/2015 / Inclui referências : f. 140-158 / Resumo: Neste trabalho, uma nova lipase isolada de uma biblioteca metagenômica, LipC12, foi imobilizada e sua aplicação na síntese de ésteres foi estudada. Inicialmente, LipC12, que contém uma cauda composta de 6 histidinas (cauda His) em sua estrutura, foi purificada em coluna de níquel e imobilizada por adsorção em polipropileno em pó (Accurel MP-1000) e em sílica em pó (Celite 545), e por ligação covalente em um copolímero acrílico (Immobead 150) e em uma membrana de polipropileno funcionalizada com glutaraldeído. Preparações com cargas de proteína de 10 mg g-1 (proteína/suporte) foram utilizadas na síntese do oleato de etila em n-hexano, utilizando etanol e ácido oleico numa razão molar (RM) de 3:1. LipC12 imobilizada no Immobead 150 proporcionou uma maior conversão em éster (95% em 4 h). Isto levou à investigação da imobilização de LipC12 diretamente do extrato bruto (EB) no Accurel MP-1000 e Immobead 150. No entanto, Accurel MP-1000 não proporcionou imobilização seletiva de LipC12, sendo a eficiência de imobilização (E) muito baixa (29%), provavelmente devido à imobilização de outras proteínas do EB no suporte. Estudos de saturação do suporte Immobead revelaram que, com carga de proteína de 200 mg g-1 de suporte, o preparado imobilizado (Ibead-EBLipC12) utilizado na síntese do oleato de etila em n-hexano (RM 3:1, 40 °C, 250 rpm) proporcionou conversão em éster de 99% em 60 min. Ibead-EBLipC12 foi reutilizada em 10 ciclos sucessivos de 60 min na mesma reação, obtendo-se conversões acima de 90%. Em seguida, Ibead-EBLipC12 foi utilizada para catalisar reações em sistemas livres de solvente, e na síntese do oleato de etila com RM de 1:1, uma reação modelo para a síntese de ésteres do biodiesel, obteve-se uma conversão de aproximadamente 30%, mas toda a atividade foi perdida em 12 h. No entanto, quando a reação foi repetida com a adição do etanol em seis alíquotas iguais durante a reação, foi encontrada uma conversão em éster de 85% em 48 h. Por outro lado, na síntese do caprilato de etila, um éster de aroma, a conversão foi de apenas 6% após 96 h, mesmo com a adição do etanol em etapas. Na reação de síntese de um lipídio estruturado, utilizando ácido caprílico e azeite de oliva (RM 2:1, 40 °C, 250 rpm) Ibead-LipC12 promoveu a inserção de 23% de ácido caprílico nas posições sn-1 e sn-3 dos triacilgliceróis do azeite de oliva, tornando-o um lipídio estruturado do tipo MLM (ácidos graxos de cadeia média nas posições sn-1,3 e ácido graxo de cadeia longa na posição sn-2). Estes resultados mostram que Ibead-EBLipC12 tem um bom potencial para ser utilizada na síntese enzimática de biodiesel e de lipídios estruturados. Além disso, a possibilidade de imobilizar LipC12 diretamente a partir do extrato bruto de proteínas, evita a necessidade de purificá-la antes da imobilização. Palavras-chave: metagenômica, lipases, LipC12, imobilização, síntese de ésteres, biodiesel, lipídeos estruturados, aromas. / Abstract: In this work, a new metagenomic lipase, LipC12, was immobilized and its characterization and application in the synthesis of esters was studied. Initially, LipC12, which contains a histidine tag (His-tag) in its structure, was purified on a nickel column and immobilized by adsorption on the supports Accurel MP-1000 and Celite 545, and by covalent bonding on Immobead 150 and on a functionalized polypropylene membrane. Preparations obtained with 10 mg of protein per gram of support were compared with respect to the synthesis of ethyl-oleate in n-hexane, using an ethanol to oleic acid molar ratio of 3:1. LipC12 gave a better conversion of oleic acid when immobilized on Immobead 150 (95% in 4 h). This led us to investigate the immobilization of His-tagged LipC12 directly from the crude extract on Immobead 150 and Accurel MP-1000. However, Accurel MP-1000 did not provide selective immobilization of LipC12, and probably due to immobilization of other proteins of the EB in support, the immobilization efficiency (E) was too low. At a protein loading of 200 mg g-1, the immobilized preparation ("Ibead-CELipC12") gave a conversion of oleic acid of 99% in 60 min, for reactions performed in n-hexane (molar ratio 3:1, 40 °C, 250 rpm) and could be reused in successive cycles of 60 min in the same reaction to give conversions above 90%. When Ibead-CELipC12 was used to catalyze the esterification of oleic acid with ethanol in a solvent-free system (standard reaction for the synthesis of esters biodiesel) at an ethanol to oleic acid molar ratio of 1:1, all activity was lost within 12 h, with a conversion of oleic acid of around 30%. However, when the reaction was repeated with the addition of ethanol in six equal aliquots during the course of the reaction, a conversion of oleic acid of 85% in 48 h was achieved. Moreover, in the synthesis of ethyl caprylate, an aroma ester, the conversion was only 6% after 96 h, even with the addition of ethanol in aliquots. In the synthesis of a structured lipid, using caprylic acid and olive oil (molar ratio 2:1, 40 °C, 250 rpm), Ibead-CELipC12 promoted the insertion of 23% of caprylic acid in the sn-1 and sn-3 positions of the triacylglycerols of the olive oil, making it a structured lipid MLM, i.e a triacylglycerol containing medium-chain fatty acids (M) at positions sn-1 and sn-3 and a long-chain fatty acid (L) at position sn-2. These results demonstrate that LipC12 has good potential to be used in the enzymatic synthesis of biodiesel and structured lipids. The results are particularly encouraging because it was possible to immobilize His-tagged LipC12 directly from the crude extract, thereby avoiding the need to purify the enzyme prior to immobilization. Keywords: metagenomic, lipases, LipC12, immobilization, ester synthesis, biodiesel, structured lipids, aroma.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-20Bitstream added on 2014-06-13T19:14:46Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_bh_me_rcla.pdf: 1162673 bytes, checksum: f5fe030f67c2007c0812e4e797484647 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Dentre as principais enzimas utilizadas em biocatálise destacam-se as lipases, pois apresentam capacidade de catalisar reações tanto em meio aquoso como em meio orgânico. Do ponto de vista econômico e industrial, as lipases obtidas de micro-organismos são as mais utilizadas, devido a sua relativa facilidade de produção e abundância de micro-organismos capazes de sintetizá-las. A principal barreira à implantação de lipases em sistemas de biocatálise é seu custo elevado. A utilização de técnicas como método de planejamento fatorial e análise de superfície tem sido utilizadas para a otimização das condições de cultivo e catálise, visando aumento de atividade e redução de custos de fermentação. Outra estratégia importante tem sido o desenvolvimento de técnicas de imobilização enzimática, permitindo a recuperação e reutilização da enzima após a catálise. A adsorção é a abordagem de imobilização mais utilizada, devido à facilidade de uso e baixo custo. Este trabalho apresenta a otimização da produção de lipase pelo fungo filamentoso Fusarium oxysporum, utilizando delineamento fatorial (DCCR) e análise de superfície de resposta (MSR), a imobilização da enzima em diferentes suportes e a caracterização da lipase imobilizada. Inicialmente, foram estudados separadamente oito fontes de carbono e cinco fontes de nitrogênio. No DCCR foram avaliadas quatro variáveis na produção de lipase: concentração da fonte de carbono, concentração da fonte de nitrogênio, surfactante Triton X-100 e adição de extrato de levedura. Após o estudo de condições de cultivo, a enzima foi imobilizada em diferentes suportes: encapsulação em gel de polióxido de etileno (PEO) e alginato de cálcio e, adsorção em Celite® 545 e Octil Sepharose CL-4B. Neste trabalho também foi estudada a caracterização bioquímica... / Of the main enzymes used in biocatalysis lipases stand out, since they have the ability to catalyze reactions in both aqueous and in organic medium. From the economical and industrial point of view, lipases obtained from microorganisms are the most used due to their relative ease of production and the abundance of microorganisms capable of synthesizing them. The main barrier to implementation of lipases in biocatalysis systems is their high cost. The use of techniques such as method of factorial design and response surface methodology has been used for the optimization of culture conditions and catalysis, aiming to increase activity and reduce costs of fermentation. Another important strategy has been the development of techniques for immobilizing enzymes, allowing the recovery and reuse of the enzyme after catalysis. The adsorption is the approach most widely used for immobilization, due to ease of use and low cost. This work presents the optimization of lipase production by the filamentous fungus Fusarium oxysporum, using central composite design (CCD) and response surface methodology (RSM), the enzyme immobilization in different media and characterization of immobilized lipase. Initially were studied eight separate carbon sources and five nitrogen sources. In CCD four variables were evaluated in the production of lipase: carbon source concentration, nitrogen source concentration, surfactant Triton X-100 and yeast extract adding. After the study of the cultivation conditions, the enzyme was immobilized onto various matrix: encapsulation in polyethylene oxide (PEO) gel and calcium alginate, and adsorption on Celite® 545 and Octyl Sepharose CL-4B. This work also studied partial biochemical characterization of free and immobilized enzyme on Celite. Among the carbon sources studied, the oils that gave the highest values of lipase... (Complete abstract click electronic access below)

Orientadora : Nadia Krieger / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Química. Defesa: Curitiba, 2007 / Inclui bibliografia / Área de concentração : Química organica

Orientador: Lara Durães Sette / Coorientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Rubens Monti / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Resumo: Lipases são hidrolases (triacilglicerol acil hidrolases, EC 3.1.1.3) capazes de hidrolisar ésteres carboxílicos de cadeia longa liberando monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Em adição, as lipases são eficientes em reações de síntese como esterificação, glicerólise, aminólise e transesterificação, essa capacidade relacionada ao deslocamento do equilíbrio da reação no sentido de hidrólise ou síntese dependendo da concentração de água presente no meio, característica que as tornam biocatalizadores muito versáteis, com importantes aplicações biotecnológicas, como em indústrias de alimentos, detergentes, farmacêutica, couro, têxtil, cosméticos e papel. O presente trabalho objetivou identificar as seis espécies de fungos lipolíticos, otimizar a produção dessa enzima pela linhagem selecionada, bem como purificar e caracterizar parcialmente a lipase produzida em condição otimizada. A atividade lipase foi determinada após cultivos submersos, objetivando o aumento da produção da enzima. Os fatores avaliados no processo de otimização da produção de lipase foram: meios minerais, tempo de cultivo, fontes de carbono e nitrogênio e suas concentrações, pH e inóculo. A avaliação das melhores condições de cultivo foi realizada pela atividade lipase, determinada pelo íon ρ-nitrofenol (pNP) liberado na hidrólise do substrato sintético ρ-nitrofenil palmitato a 37 °C. O uso de marcadores moleculares permitiu identificar os seis fungos lipolíticos até espécie, exceto para a linhagem Fusarium sp. CBMAI 1227. A metodologia de triagem dos fungos para produção de lipase em meio neutro permitiu a seleção do isolado Trichodemra harzianum CBMAI 1229 como melhor produtor. A melhor condição para produção de lipase (231,58 ± 35,59 U mL-1) foi alcançada após 120 horas de cultivo a 25 °C e 150 rpm de agitação utilizando meio mineral Olson e Johnson (1948), suplementado com óleo... / Abstract: Lipases are hydrolases (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) capable of hydrolyzing carboxyl esters of long-chain acylglycerol release mono- or diacyglycerol, free glycerol and fatty acid. In addition, the lipases are effective for synthesis reactions such as esterification, glycerolysis, transesterification and aminolysis, this capability related to the displacement of the equilibrium of the reaction towards synthesis or hydrolysis inherent in the concentration of water present in the medium, the characteristic that makes biocatalysts very versatile, with important biotechnological applications. Such as food, detergents, pharmaceutical, textile, leather, paper and cosmetics industries. This work aimed to identify six species of fungi that produce lipase, optimize the production of this enzyme by lineage selected and purify and characterize partially the lipase produced in optimal condition. Enzyme activity was determined after submerged cultures, aiming to increase enzyme production. The factors measured in this optimization process of lipase production were: mineral components, time of cultivation, source of carbon and nitrogen and their concentration, pH and inoculum. The use of molecular markers allowed us to identify the six lipolytic fungi until species, except for strain Fusarium sp. CBMAI 1227. The methodology of screening of fungi for the production of lipase in neutral medium allowed the selection of the isolated Trichodemra harzianum CBMAI 1229 as best producer. The evaluation of improved cultivation conditions was assayed by lipase activity, determined through hydrolysis releasing íon ρ-nitrofenol (pNP) of ρ-nitrophenyl-palmitate (pNPP) as substrate synthetic at 37 °C. The best condition for lipase production (231,58 ± 35,59 U mL-1) was reached after 120 hours of cultivation, 25 °C and 150 rpm in medium mineral Olson & Johnson (1948), suplemented with sunflower oil 3,0% (v/v), peptone 2,0% (w/v), yeast extract 0,2%... / Mestre

Orientador: Valéria Marta Gomes de Lima / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Alessandra Machado Baron / Resumo: Dentre as principais enzimas utilizadas em biocatálise destacam-se as lipases, pois apresentam capacidade de catalisar reações tanto em meio aquoso como em meio orgânico. Do ponto de vista econômico e industrial, as lipases obtidas de micro-organismos são as mais utilizadas, devido a sua relativa facilidade de produção e abundância de micro-organismos capazes de sintetizá-las. A principal barreira à implantação de lipases em sistemas de biocatálise é seu custo elevado. A utilização de técnicas como método de planejamento fatorial e análise de superfície tem sido utilizadas para a otimização das condições de cultivo e catálise, visando aumento de atividade e redução de custos de fermentação. Outra estratégia importante tem sido o desenvolvimento de técnicas de imobilização enzimática, permitindo a recuperação e reutilização da enzima após a catálise. A adsorção é a abordagem de imobilização mais utilizada, devido à facilidade de uso e baixo custo. Este trabalho apresenta a otimização da produção de lipase pelo fungo filamentoso Fusarium oxysporum, utilizando delineamento fatorial (DCCR) e análise de superfície de resposta (MSR), a imobilização da enzima em diferentes suportes e a caracterização da lipase imobilizada. Inicialmente, foram estudados separadamente oito fontes de carbono e cinco fontes de nitrogênio. No DCCR foram avaliadas quatro variáveis na produção de lipase: concentração da fonte de carbono, concentração da fonte de nitrogênio, surfactante Triton X-100 e adição de extrato de levedura. Após o estudo de condições de cultivo, a enzima foi imobilizada em diferentes suportes: encapsulação em gel de polióxido de etileno (PEO) e alginato de cálcio e, adsorção em Celite® 545 e Octil Sepharose CL-4B. Neste trabalho também foi estudada a caracterização bioquímica... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Of the main enzymes used in biocatalysis lipases stand out, since they have the ability to catalyze reactions in both aqueous and in organic medium. From the economical and industrial point of view, lipases obtained from microorganisms are the most used due to their relative ease of production and the abundance of microorganisms capable of synthesizing them. The main barrier to implementation of lipases in biocatalysis systems is their high cost. The use of techniques such as method of factorial design and response surface methodology has been used for the optimization of culture conditions and catalysis, aiming to increase activity and reduce costs of fermentation. Another important strategy has been the development of techniques for immobilizing enzymes, allowing the recovery and reuse of the enzyme after catalysis. The adsorption is the approach most widely used for immobilization, due to ease of use and low cost. This work presents the optimization of lipase production by the filamentous fungus Fusarium oxysporum, using central composite design (CCD) and response surface methodology (RSM), the enzyme immobilization in different media and characterization of immobilized lipase. Initially were studied eight separate carbon sources and five nitrogen sources. In CCD four variables were evaluated in the production of lipase: carbon source concentration, nitrogen source concentration, surfactant Triton X-100 and yeast extract adding. After the study of the cultivation conditions, the enzyme was immobilized onto various matrix: encapsulation in polyethylene oxide (PEO) gel and calcium alginate, and adsorption on Celite® 545 and Octyl Sepharose CL-4B. This work also studied partial biochemical characterization of free and immobilized enzyme on Celite. Among the carbon sources studied, the oils that gave the highest values of lipase... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Na indústria coureira há uma grande preocupação com o meio ambiente, já que a maioria das etapas para o processamento do couro são realizadas através de processos químicos. Estes processos devem ser controlados para um baixo impacto ambiental e menor custo de tratamento de resíduos. Este trabalho visa desenvolver um extrato enzimático completamente biodegradável, constituído por lipases de microrganismos, para diminuir o uso de tensoativos nos curtumes. Para tal foi necessário o uso de microrganismos que produzem lipases de maneira eficiente para substratos específicos com a variação no espectro de temperatura e pH utilizados nos processos de processamento do couro. Portanto, foi realizado o isolamento de diversos microrganismos em um curtume e estes foram submetidos à análise da produção de lipases induzida por gordura animal. A partir destes isolados foram selecionados e identificados os melhores produtores de lipases: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris e Proteus sp. Dentre estes microrganismos, o mais promissor, foi a levedura P. pastoris. A produção de lipases é afetada por diferentes fatores ambientais, assim foram testados, em escala piloto, a influência do tempo de cultivo, pH, temperatura de cultivo e agitação. Além disso, também foram testados o uso de goma arábica e três diferentes surfactantes no cultivo para o possível aumento da produção da enzima. As melhores condições de crescimento para uma maior produção de lipase por P. pastoris foram otimizadas em 72 h, 28ºC, pH 8,0 e 200 rpm. A adição de Triton X-100 ao final do cultivo também aumentou a atividade de lipase. A partir destes resultados a levedura foi submetida ao cultivo em reator de 10 L e determinados o melhor tempo de cultivo, o consumo de glicose e a densidade óptica a 600 nm. O melhor tempo de cultivo manteve-se em 72 h. Ao final deste cultivo, o extrato bruto foi utilizado para determinar a estabilidade da enzima à formulação empregada nos processos de curtimento, já que as condições destes processos podem afetar a atividade de algumas enzimas. A enzima não se mostrou estável aos químicos utilizados no processamento de couros. Por isto, para testar a eficácia da enzima em relação aos produtos encontrados no mercado algumas etapas foram reformuladas para que a enzima pudesse manter a sua atividade original. Os resultados destes experimentos mostraram-se satisfatórios, provando que a produção e utilização desta enzima no mercado é promissora. / The tanning industry has a great concern with the environment, since the majority of stages for leather processing is carried out using chemicals. These processes must be controlled for a low ambient impact and lesser cost of residues treatment. This work aims to develop a completely biodegrading enzymatic extract consisting of microbial lipases, to diminish the use of surfactants in the tanneries. For this product production is necessary the use of efficient microorganisms producing lipases for specific substrates with the variation in the specter of temperature and pH used in the tannery. Therefore, the screening of diverse microorganisms in a tannery was carried out and these had been submitted to the analysis of the induced lipases production with animal fat. It had been selected and identified the best lipases producers: Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Pichia pastoris and Proteus sp. Among these microorganisms, the most promising was P. pastoris. The lipase production is affected by different ambiental factors, thus it was tested, in scale pilot, the influence of the growth time, pH, growth temperature and agitation. Moreover, also the use of arabic gum and three different surfactants in the culture for the possible increase of the enzyme production was tested. The best growth conditions for the best lipase production of P. pastoris are 72 h, 28ºC, pH 8.0 and 200 rpm. The addition of Triton X-100 in the cultivation end also increases the lipase activity. Through these results the yeast was grown in 10 L culture reactor. During this cultivation the best growth time, the glucose consumption and the optical density at 600 nm were determined. The best growth time remained in 72 h. This culture crude extract was used to determine the enzyme stability to the formulation used in the tanning processes, since the conditions of these processes may affect enzyme activity. The enzyme was not stable in the presence of these chemicals. To compare the enzyme effectiveness with the chemicals and commercial enzymes, some processing stages were improved, so that the enzyme could keep its original activity. These results were satisfactory, suggesting that this enzyme production and its commercial use are promising.