Durante a resposta inflamatória, diversos mediadores são liberados localmente com o objetivo de estimular a resposta imune celular e humoral. Por meio da ação das enzimas ciclooxigenases e lipoxigenases ocorrerão modificações estruturais na cadeia do ácido araquidônico levando a síntese de prostaglandinas ou leucotrienos e lipoxinas, respectivamente. Tais mediadores são responsáveis pela regulação da expressão dos genes RANK, RANKL e OPG, moduladores da osteoclastogênese. Dessa maneira, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) para as enzimas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, ciclooxigenase-2 (COX-2) e 5- lipoxigenase (5-LO), e para os mediadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG) no tecido ósseo, após inoculação de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) nos canais radiculares de molares de camundongos. Posteriormente foi investigado o efeito do bloqueio farmacológico da via COX-2 induzida pelo LPS, na expressão de mediadores da osteoclastogênese e de genes envolvidos no metabolismo ósseo. Foram utilizados 144 camundongos C57BL/6, com 6 semanas de idade, pesando de 18 a 20 gramas, nos quais os canais radiculares dos primeiros molares foram inoculados com uma solução contendo lipopolissacarídeo bacteriano de E. coli (0,1, 1,0 e 10mg/ml). Decorridos os períodos experimentais de 7, 14, 21 e 28 dias, os animais foram submetidos à eutanásia e os blocos contendo dente e osso foram removidos para extração do RNA total. Em seguida, foi realizada a avaliação da expressão gênica por meio de transcrição reversa e reação da polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR). A análise global da expressão de RNAm para proteínas envolvidas no metabolismo ósseo foi realizada por meio de um ensaio de PCR Array (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). Os valores de expressão relativa de cada RNAm, para cada grupo, foram comparados por meio da análise de variância (ANOVA) de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni ou por ANOVA de uma via seguido pelo pós-teste de Dunnett (&alpha = 0,05). A inoculação de LPS nos canais radiculares de molares de camundongos foi capaz de induzir a expressão dos genes PTGS2 e ALOX5, responsáveis pela codificação das enzimas COX-2 e 5-LO, envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, concomitantemente à modulação da expressão dos genes TNFRSF11A, TNFSF11 e TNFRSF11B, responsáveis pela codificação dos moduladores da osteoclastogênese RANK, RANKL e OPG, respectivamente. A administração de Indometacina, um inibidor não seletivo de COX-2, inibiu a expressão de RNAm para RANK e RANKL e estimulou a expressão de OPG durante os períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares. A inibição da via COX-2 de metabolismo do ácido araquidônico nos períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares modulou diferencialmente a expressão de genes envolvidos no catabolismo e anabolismo ósseo, indicando possíveis papéis para os mediadores derivados no ácido araquidônico na regulação do metabolismo ósseo. Estes resultados sugerem alvos terapêuticos importantes para intervenção precoce em doenças inflamatórias, como lesões periapicais para evitar a reabsorção do tecido ósseo. / During an inflammatory response, several mediators are locally released in order to stimulate cellular and humoral immune response. Through the action of cyclooxygenase and lipoxygenase enzymes structural changes occur in the arachidonic acid chain leading to synthesis of prostaglandins or leukotrienes and lipoxins, respectively. Such mediators are responsible for the regulation of RANK, RANKL and OPG gene expression, osteoclastogenesis modulators. Thus, the objective of this study was to evaluate the expression of messenger RNA (mRNA) for the enzymes involved in arachidonic acid metabolism, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LO), and the osteoclastogenesis mediators (RANK, RANKL and OPG) in bone tissue after injection of bacterial lipopolysaccharide (LPS) in murine dental root canals. Then, COX-2 pathway was pharmacologically blocked for investigation of expression of osteoclastogenesis mediators and genes involved in bone metabolism. We used 144 C57BL/6 mice, 6 weeks-old, weighing 18-20 grams, which had the first molars root canals inoculated with a solution containing LPS from E. coli (0.1, 1.0 and 10 mg/ml). After 7, 14, 21 and 28 days the animals were euthanized and the tooth-and-bone blocks were removed for total RNA extraction. Subsequently, the evaluation of gene expression was performed by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time (qRT-PCR). Global analysis of mRNA expression for proteins involved in bone metabolism was performed using PCR arrays (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). The values for relative expression of each mRNA for each group were compared using two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post-test or one-way ANOVA followed by Dunnett\'s test (α=0.05). The injection of LPS into the root canals was induced expression of genes PTGS2 and ALOX5, responsible for encoding COX-2 and 5-LO enzymes, involved in the metabolism of arachidonic acid, simultaneously to the modulation of gene expression of TNFRSF11A, TNFSF11 and TNFRSF11B, responsible for encoding the osteoclastogenesis modulators RANK, RANKL and OPG, respectively. Administration of Indomethacin, a non-selective inhibitor of COX-2, inhibited the expression of mRNA for RANK and RANKL and stimulated the expression of OPG during the initial response to the root canals contamination with LPS. Inhibition of the COX-2 pathway from arachidonic acid metabolism in the initial periods of response to LPS injection into the root canals differentially modulated the expression of genes involved in bone catabolism and anabolism, indicating possible roles for mediators derived from arachidonic acid in the regulation of bone metabolism. These results suggest important therapeutic targets for early intervention in inflammatory diseases such as apical periodontitis to avoid resorption of bone tissue.

Durante a resposta inflamatória, diversos mediadores são liberados localmente com o objetivo de estimular a resposta imune celular e humoral. Por meio da ação das enzimas ciclooxigenases e lipoxigenases ocorrerão modificações estruturais na cadeia do ácido araquidônico levando a síntese de prostaglandinas ou leucotrienos e lipoxinas, respectivamente. Tais mediadores são responsáveis pela regulação da expressão dos genes RANK, RANKL e OPG, moduladores da osteoclastogênese. Dessa maneira, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) para as enzimas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, ciclooxigenase-2 (COX-2) e 5- lipoxigenase (5-LO), e para os mediadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG) no tecido ósseo, após inoculação de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) nos canais radiculares de molares de camundongos. Posteriormente foi investigado o efeito do bloqueio farmacológico da via COX-2 induzida pelo LPS, na expressão de mediadores da osteoclastogênese e de genes envolvidos no metabolismo ósseo. Foram utilizados 144 camundongos C57BL/6, com 6 semanas de idade, pesando de 18 a 20 gramas, nos quais os canais radiculares dos primeiros molares foram inoculados com uma solução contendo lipopolissacarídeo bacteriano de E. coli (0,1, 1,0 e 10mg/ml). Decorridos os períodos experimentais de 7, 14, 21 e 28 dias, os animais foram submetidos à eutanásia e os blocos contendo dente e osso foram removidos para extração do RNA total. Em seguida, foi realizada a avaliação da expressão gênica por meio de transcrição reversa e reação da polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR). A análise global da expressão de RNAm para proteínas envolvidas no metabolismo ósseo foi realizada por meio de um ensaio de PCR Array (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). Os valores de expressão relativa de cada RNAm, para cada grupo, foram comparados por meio da análise de variância (ANOVA) de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni ou por ANOVA de uma via seguido pelo pós-teste de Dunnett (&alpha = 0,05). A inoculação de LPS nos canais radiculares de molares de camundongos foi capaz de induzir a expressão dos genes PTGS2 e ALOX5, responsáveis pela codificação das enzimas COX-2 e 5-LO, envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, concomitantemente à modulação da expressão dos genes TNFRSF11A, TNFSF11 e TNFRSF11B, responsáveis pela codificação dos moduladores da osteoclastogênese RANK, RANKL e OPG, respectivamente. A administração de Indometacina, um inibidor não seletivo de COX-2, inibiu a expressão de RNAm para RANK e RANKL e estimulou a expressão de OPG durante os períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares. A inibição da via COX-2 de metabolismo do ácido araquidônico nos períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares modulou diferencialmente a expressão de genes envolvidos no catabolismo e anabolismo ósseo, indicando possíveis papéis para os mediadores derivados no ácido araquidônico na regulação do metabolismo ósseo. Estes resultados sugerem alvos terapêuticos importantes para intervenção precoce em doenças inflamatórias, como lesões periapicais para evitar a reabsorção do tecido ósseo. / During an inflammatory response, several mediators are locally released in order to stimulate cellular and humoral immune response. Through the action of cyclooxygenase and lipoxygenase enzymes structural changes occur in the arachidonic acid chain leading to synthesis of prostaglandins or leukotrienes and lipoxins, respectively. Such mediators are responsible for the regulation of RANK, RANKL and OPG gene expression, osteoclastogenesis modulators. Thus, the objective of this study was to evaluate the expression of messenger RNA (mRNA) for the enzymes involved in arachidonic acid metabolism, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LO), and the osteoclastogenesis mediators (RANK, RANKL and OPG) in bone tissue after injection of bacterial lipopolysaccharide (LPS) in murine dental root canals. Then, COX-2 pathway was pharmacologically blocked for investigation of expression of osteoclastogenesis mediators and genes involved in bone metabolism. We used 144 C57BL/6 mice, 6 weeks-old, weighing 18-20 grams, which had the first molars root canals inoculated with a solution containing LPS from E. coli (0.1, 1.0 and 10 mg/ml). After 7, 14, 21 and 28 days the animals were euthanized and the tooth-and-bone blocks were removed for total RNA extraction. Subsequently, the evaluation of gene expression was performed by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time (qRT-PCR). Global analysis of mRNA expression for proteins involved in bone metabolism was performed using PCR arrays (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). The values for relative expression of each mRNA for each group were compared using two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post-test or one-way ANOVA followed by Dunnett\'s test (α=0.05). The injection of LPS into the root canals was induced expression of genes PTGS2 and ALOX5, responsible for encoding COX-2 and 5-LO enzymes, involved in the metabolism of arachidonic acid, simultaneously to the modulation of gene expression of TNFRSF11A, TNFSF11 and TNFRSF11B, responsible for encoding the osteoclastogenesis modulators RANK, RANKL and OPG, respectively. Administration of Indomethacin, a non-selective inhibitor of COX-2, inhibited the expression of mRNA for RANK and RANKL and stimulated the expression of OPG during the initial response to the root canals contamination with LPS. Inhibition of the COX-2 pathway from arachidonic acid metabolism in the initial periods of response to LPS injection into the root canals differentially modulated the expression of genes involved in bone catabolism and anabolism, indicating possible roles for mediators derived from arachidonic acid in the regulation of bone metabolism. These results suggest important therapeutic targets for early intervention in inflammatory diseases such as apical periodontitis to avoid resorption of bone tissue.

Células apresentadoras de antígeno (APCs) controlam as respostas de linfócitos T por múltiplos mecanismos, que incluem a expressão de moléculas co-estimuladoras, a produção de citocinas e outros mediadores. Estes mecanismos exercem influência não só na proliferação, diferenciação e polarização dos linfócitos T, mas também interferem na sobrevivência destas células. No presente trabalho, foi demonstrado que fator(es) solúvel(eis) produzido(s) por APCs ativadas via receptores do tipo Toll (TLRs) suprimem a morte induzida por ativação (AICD) de linfócitos T. Este efeito foi observado em APCs não estimuladas, porém foi significativamente maior após estimulação das APCs com lipopolissacarídeo (LPS). Através do uso de diferentes camundongos nocautes, foi mostrado que a produção do fator protetor induzida por LPS é dependente da via de TLR4/MyD88 e independente de TLR2 e CD14. Este fator foi identificado como prostaglandina E2 (PGE2) e foi demonstrado que os sobrenadantes derivados de APC e a PGE2 sintética bloqueiam a expressão de CD95L em linfócitos T estimulados via TCR/CD3. A inibição da expressão de CD95L reduz tanto a AICD como a morte de macrófagos, alvos do ataque citotóxico dos linfócitos T ativados. Foi demonstrado também que, ao invés de bloquear a via do CD95, a PGE2 potencializa a morte induzida por anticorpos anti-CD95 agonistas. Os receptores de PGE2, EP2 e EP4, parecem ser os responsáveis por mediar os efeitos supressores da PGE2 na AICD, já que a estimulação farmacológica destes receptores mimetiza o efeito protetor da PGE2 e seus respectivos antagonistas interferem com a proteção conferida pelos sobrenadantes de APCs e pela PGE2 sintética. A ativação do EP2 e do EP4 age sinergicamente na ativação das vias dependentes da PKA e de EPAC, que contribuem para a inibição da AICD. Por fim, a ativação dos principais fatores de transcrição envolvidos com a expressão de CD95L (NFAT, AP-1 e NF-kB) não é bloqueada por PGE2. Por outro lado, PGE2 induziu a expressão de ICER, um repressor transcripcional, através da ativação de CREB. Em conjunto, estes resultados indicam que as APCs podem modular os níveis de expressão de CD95L através da secreção de PGE2 em resposta ao LPS, através de uma via dependente de TLR4 e MyD88, com conseqüências tanto para a morte de linfócitos T quanto para a sua própria sobrevivência. / Antigen-presenting cells (APCs) control T-cell responses by multiple mechanisms, including the expression of co-stimulatory molecules and the production of cytokines and other mediators that control T-cell proliferation, survival and differentiation. In this present work, it was demonstrated that soluble factor(s) produced by Toll-like receptor (TLR)-activated APCs suppress activation-induced cell death (AICD). This effect was observed in non-stimulated APCs, but it was significantly increased after lipopolysaccharide (LPS) treatment. Using different KO mice, it was found that the LPS-induced protective factor is dependent on TLR4/MyD88 and independent of TLR2 and CD14. The protective factor was identified as prostaglandin E2 (PGE2) and it was shown that both APC-derived supernatants and PGE2 prevented CD95L upregulation in T cells in response to TCR/CD3 stimulation, thereby avoiding both AICD and activated T cell killing of target macrophages. It was also demonstrated that instead of blocking CD95 pathway, PGE2 enhanced T cell death induced by agonistic anti-CD95 antibodies. The PGE2 receptors, EP2 and EP4, appear to be involved in AICD suppression since pharmacological stimulation of these receptors mimics the protective effect on T cells and their respective antagonists interfere with the protection induced by either APCs derived or synthetic PGE2. The engagement of EP2 and EP4 synergistically activates protein kinase A (PKA) and exchange protein directly activated by cAMP pathways to prevent AICD. Finally, the activation of the main transcription factors involved in CD95L expression (NFAT, AP-1 and NF-kB) is not avoided by PGE2. On the other hand, PGE2 induces the expression of ICER, a transcriptional repressor of CD95L, through CREB activation. Taken together, these results indicate that APCs can regulate T-cell levels of CD95L by releasing PGE2 in response to LPS through a TLR4/MyD88-dependent pathway, with consequences for both T cell and their own survival.

Orientador: Roberto Carlos Burini / Resumo: O aumento da permeabilidade intestinal promove o influxo de toxinas bacterianas do lúmen intestinal para o interior do hospedeiro, desencadeando em resposta inflamatória de baixo grau, semelhante à observada na expansão do tecido adiposo e na etiologia das doenças crônicas. Foi realizado estudo transversal para identificar os determinantes das concentrações plasmáticas de proteína ligadora de lipopolissacarídeo (LBP) em mulheres adultas ingressantes em programa para mudança do estilo de vida. Foram avaliadas 74 mulheres com idade entre 35 a 67 anos, as quais foram submetidas à avaliação sociodemográfica e clínica, antropométrica, de composição corporal e consumo alimentar, coleta sanguínea e bioquímica padrão. Todas as análises foram efetuadas pelo programa estatístico SPSS versão 19.0, e o nível de significância adotado foi de 5%. Observou-se que as concentrações da LBP foram significativamente maiores em mulheres com excesso de peso e que este biomarcador apresentou correlações moderadas com a circunferência abdominal, a pressão arterial e com o índice de gordura hepática. Similarmente, notou-se que a ingestão de frutose e de gordura poli-insaturada, a pressão arterial diastólica, a transaminase glutâmico-pirúvica e o percentual de gordura corporal total, influenciaram os níveis plasmáticos da LBP de maneira independente das demais variáveis. Desta forma, o presente estudo demonstra que a LBP está relacionada a dois componentes da síndrome metabólica e ao acúmulo hepático d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neuroinflammation is a neuropathological finding in a number of neurodegenerative diseases. Intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) induces neuroinflammation and memory deficit. Spermine and spermidine are endogenous polyamines that physiologically modulate the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor in mammals by binding to the polyamine-binding site at the NMDA receptor. Since polyamines improve memory in cognitive tasks, we tested whether the post-training administration of spermine reverses the deficits of memory induced by LPS in the object recognition task in mice. While spermine (1 mg/kg, i.p.) increased, ifenprodil (10 mg/kg, i.p.), a noncompetitive GluN2B-containing NMDA receptor antagonist, decreased the discrimination score on novel object recognition task. Spermine, at dose that did not alter memory (0.3 mg/kg, i.p.), reversed the cognitive impairment induced by LPS (250 μg/kg, i.p.). Ifenprodil (0.3 mg/kg, i.p.) reversed the protective effect of spermine against LPS-induced memory deficits in the novel object recognition task. However, spermine failed to reverse the LPS-induced increased of cortical and hippocampal cytokines levels. The results indicate that spermine protects from LPS-induced memory deficits in mice by mechanisms other than decreasing LPS-induced cytokine production. / A inflamação periférica desencadeia a produção central de citocinas inflamatórias, gerando um quadro de neuroinflamação. Essa condição altera as transmissões no receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA) o que prejudica a memória e a plasticidade sináptica. A injeção de Lipopolissacarídeo (LPS) induz a neuroinflamação e prejudica a memória. A espermina e a espermidina são poliaminas endógenas que modulam fisiologicamente o receptor NMDA em mamíferos. Uma vez que as poliaminas melhoram a memória em tarefas cognitivas, investigamos se a administração pós-treino de espermina reverte o prejuízo de memória induzido por LPS sistêmico na tarefa de reconhecimento de objetos em camundongos. Enquanto a espermina (1 mg/kg, ip) aumentou, o ifenprodil (10 mg/kg, ip), antagonista não competitivo do receptor NMDA contendo GluN2B, diminuiu a discriminação na tarefa de reconhecimento de objetos. A espermina, em doses que não alteram a memória (0,3 mg/kg, ip), reverteu o dano cognitivo induzido por LPS (250 μg/kg, ip). O ifenprodil (0,3 mg/kg, ip) impediu o efeito protetor da espermina contra o prejuízo de memória induzido por LPS na tarefa de reconhecimento de objetos. No entanto, a espermina não reverteu o aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias induzido por LPS no hipocampo e córtex cerebral. Os resultados do presente estudo indicam que a espermina protege a piora da memória induzida por LPS em camundongos. O mecanismo desta proteção envolve o sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA, e não envolve mecanismos anti-inflamatórios.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-07-07T15:09:57Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1854233 bytes, checksum: 535d273c615cebce265419e27f74439a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T15:09:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1854233 bytes, checksum: 535d273c615cebce265419e27f74439a (MD5) Previous issue date: 2016-10-17 / Ouabain is a cardiotonic steroid initially described as a substance of plant origin. In 1991, the endogenous production of higher mammals was identified and since then their physiological actions have been studied. Work of our group have demonstrated that ouabain modulates the acute inflammatory response induced by different phlogistic agents, also being able to interfere negatively in inflammatory profile triggered by Leishmania (L.) amazonensis. Acute lung injury (ALI) is a serious inflammatory disease characterized by acute inflammation, extensive accumulation of polymorphonuclear leukocytes and accumulation of proinflammatory mediators, which culminates with diffuse alveolar damage and which may cause the patient died due to severe hypoxemia. There is no data in the literature on the effects of ouabain in ALI. Objectives: Evaluate the immunomodulatory effect of ouabain in a murine model of ALI induced by LPS. Methods: BALB / c mice were treated intraperitoneally with ouabain at a dose of 0.56 mg / kg for a period of three consecutive days, 1 hour after the last treatment the animals were challenged intranasally with 40μl of an LPS solution (2 5 mg / kg); 24 hours after challenge, the animals were euthanized, the collected biological sample and inflammatory parameters, including cell migration, protein exudates, cytokine production, TLR4 expression and histopathological changes were then evaluated. Data were analyzed by PRISMA software. Results: The treatment with ouabain decreased total leukocytes migration to the inflamed site (48,84%), this event associated with decreased neutrophil migration (70,71%) and independent of macrophage migration. The ouabain also decreased the exudate protein in the broncho-alveolar region (26,32%) and production of the cytokines TNF-α (14,80%), IL-6 (47,07%) and IL1-β (33,59%), however this reduction in the production of these mediators was not related to the expression of TLR4. Additionally, the ALI histopathology changes were also reduced by treatment with ouabain. Conclusions: The results show that ouabain has anti-inflammatory action in ALI induced by LPS. / A Ouabaína é um esteroide cardiotônico inicialmente descrito como uma substância de origem vegetal. Em 1991, a sua produção endógena por mamíferos superiores foi identificada e desde então suas ações fisiológicas vêm sendo estudadas. Trabalhos do nosso grupo demonstraram que a ouabaína modula a resposta inflamatória aguda induzida por diferentes agentes flogísticos, sendo também capaz de interferir negativamente no perfil inflamatório desencadeado pela Leishmania (L.) amazonensis. A lesão pulmonar aguda (LPA) é uma doença inflamatória caracterizada por inflamação aguda e extenso acúmulo de polimorfonucleares e de mediadores pró-inflamatórios, que culmina com dano alveolar difuso podendo levar o paciente a óbito por hipoxemia severa. Não há dados na literatura sobre os efeitos da ouabaína na LPA. Objetivos: Avaliar o efeito imunomodulador de ouabaína em modelo murino de LPA induzida por LPS. Métodos: Camundongos BALB/c machos foram tratados via intraperitoneal com ouabaína na dose de 0,56 mg/Kg por um período de três dias consecutivos, 1h após o último tratamento os animais foram desafiados via intranasal com LPS (2,5 mg/Kg); 24h após o desafio, os animais foram eutanásiados, as amostras biológicas coletadas e os parâmetros inflamatórios, incluindo migração celular, exsudato proteico, produção de citocinas, expressão de TLR4 e alterações histopatológicas foram então avaliados. Os dados foram analisados pelo software PRISMA. Resultados: O tratamento com a ouabaína diminuiu a migração de leucócitos totais para o sítio inflamado (48,84%), evento este, associado a diminuição da migração de neutrófilos (70,7%) e independente da migração de macrófagos. Ouabaína também diminuiu o exsudato proteico na região bronco-alveolar (26,32%) e a produção das citocinas TNF-α (14,80%), IL-6 (47,07%) e IL1-β (33,59%), entretanto essa redução na produção desses mediadores não mostrou relação com a expressão do TLR4. Adicionalmente, as alterações histopatológicas características da LPA também foram reduzidas pelo tratamento com ouabaína. Conclusões: Os resultados obtidos demonstram que ouabaína possui ação anti-inflamatória na LPA induzida por LPS.

Submitted by Caroline das Neves Mendes Nunes null (ca.mendes.nunes@gmail.com) on 2018-03-13T17:18:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertação do Mestrado Completa - Entrega.pdf: 2225273 bytes, checksum: 1a95f4918cc1bde4f9a8dcde06993a94 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-03-13T19:53:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nunes_cnm_me_bot.pdf: 2225273 bytes, checksum: 1a95f4918cc1bde4f9a8dcde06993a94 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-13T19:53:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nunes_cnm_me_bot.pdf: 2225273 bytes, checksum: 1a95f4918cc1bde4f9a8dcde06993a94 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O aumento da permeabilidade intestinal promove o influxo de toxinas bacterianas do lúmen intestinal para o interior do hospedeiro, desencadeando em resposta inflamatória de baixo grau, semelhante à observada na expansão do tecido adiposo e na etiologia das doenças crônicas. Foi realizado estudo transversal para identificar os determinantes das concentrações plasmáticas de proteína ligadora de lipopolissacarídeo (LBP) em mulheres adultas ingressantes em programa para mudança do estilo de vida. Foram avaliadas 74 mulheres com idade entre 35 a 67 anos, as quais foram submetidas à avaliação sociodemográfica e clínica, antropométrica, de composição corporal e consumo alimentar, coleta sanguínea e bioquímica padrão. Todas as análises foram efetuadas pelo programa estatístico SPSS versão 19.0, e o nível de significância adotado foi de 5%. Observou-se que as concentrações da LBP foram significativamente maiores em mulheres com excesso de peso e que este biomarcador apresentou correlações moderadas com a circunferência abdominal, a pressão arterial e com o índice de gordura hepática. Similarmente, notou-se que a ingestão de frutose e de gordura poli-insaturada, a pressão arterial diastólica, a transaminase glutâmico-pirúvica e o percentual de gordura corporal total, influenciaram os níveis plasmáticos da LBP de maneira independente das demais variáveis. Desta forma, o presente estudo demonstra que a LBP está relacionada a dois componentes da síndrome metabólica e ao acúmulo hepático de gordura em mulheres adultas. Elevações plasmáticas deste biomarcador podem refletir o consumo de alimentos industrializados, o excesso de peso e as alterações metabólicas que são provocadas ou agravadas pela permeabilidade intestinal aumentada. / Increased intestinal permeability promotes the influx of bacterial toxins from the intestinal lumen into the host, triggering low grade inflammatory response similar to that observed in the expansion of adipose tissue and in the etiology of chronic diseases. A cross-sectional study was conducted in adult women to identify the determinants of plasma lipopolysaccharide binding protein (LBP) concentrations in adult women entering a lifestyle modification program. A total of 74 women aged 35-67 years were assessed, which were submitted to sociodemographic and clinical, anthropometric, body composition and food consumption evaluations, blood collection and standard biochemistry. All analyzes were performed by the SPSS software version 19.0 and the significance level adopted was 5%. It was observed that LBP concentrations were significantly higher in overweight women and this biomarker showed moderate correlations with waist circumference, blood pressure and liver fat index. Similarly, the ingestion of fructose and polyunsaturated fat, diastolic blood pressure, glutamic-pyruvic transaminase and total body fat percentage influenced plasma LBP levels independently of the other variables. Thus, the present study demonstrates that LBP is related to two components of metabolic syndrome and to the hepatic accumulation of fat in adult women. Plasma elevations of this biomarker may reflect consumption of processed foods, overweight, and metabolic changes that are caused by increased intestinal permeability. / 130378/2016-0

Células apresentadoras de antígeno (APCs) controlam as respostas de linfócitos T por múltiplos mecanismos, que incluem a expressão de moléculas co-estimuladoras, a produção de citocinas e outros mediadores. Estes mecanismos exercem influência não só na proliferação, diferenciação e polarização dos linfócitos T, mas também interferem na sobrevivência destas células. No presente trabalho, foi demonstrado que fator(es) solúvel(eis) produzido(s) por APCs ativadas via receptores do tipo Toll (TLRs) suprimem a morte induzida por ativação (AICD) de linfócitos T. Este efeito foi observado em APCs não estimuladas, porém foi significativamente maior após estimulação das APCs com lipopolissacarídeo (LPS). Através do uso de diferentes camundongos nocautes, foi mostrado que a produção do fator protetor induzida por LPS é dependente da via de TLR4/MyD88 e independente de TLR2 e CD14. Este fator foi identificado como prostaglandina E2 (PGE2) e foi demonstrado que os sobrenadantes derivados de APC e a PGE2 sintética bloqueiam a expressão de CD95L em linfócitos T estimulados via TCR/CD3. A inibição da expressão de CD95L reduz tanto a AICD como a morte de macrófagos, alvos do ataque citotóxico dos linfócitos T ativados. Foi demonstrado também que, ao invés de bloquear a via do CD95, a PGE2 potencializa a morte induzida por anticorpos anti-CD95 agonistas. Os receptores de PGE2, EP2 e EP4, parecem ser os responsáveis por mediar os efeitos supressores da PGE2 na AICD, já que a estimulação farmacológica destes receptores mimetiza o efeito protetor da PGE2 e seus respectivos antagonistas interferem com a proteção conferida pelos sobrenadantes de APCs e pela PGE2 sintética. A ativação do EP2 e do EP4 age sinergicamente na ativação das vias dependentes da PKA e de EPAC, que contribuem para a inibição da AICD. Por fim, a ativação dos principais fatores de transcrição envolvidos com a expressão de CD95L (NFAT, AP-1 e NF-kB) não é bloqueada por PGE2. Por outro lado, PGE2 induziu a expressão de ICER, um repressor transcripcional, através da ativação de CREB. Em conjunto, estes resultados indicam que as APCs podem modular os níveis de expressão de CD95L através da secreção de PGE2 em resposta ao LPS, através de uma via dependente de TLR4 e MyD88, com conseqüências tanto para a morte de linfócitos T quanto para a sua própria sobrevivência. / Antigen-presenting cells (APCs) control T-cell responses by multiple mechanisms, including the expression of co-stimulatory molecules and the production of cytokines and other mediators that control T-cell proliferation, survival and differentiation. In this present work, it was demonstrated that soluble factor(s) produced by Toll-like receptor (TLR)-activated APCs suppress activation-induced cell death (AICD). This effect was observed in non-stimulated APCs, but it was significantly increased after lipopolysaccharide (LPS) treatment. Using different KO mice, it was found that the LPS-induced protective factor is dependent on TLR4/MyD88 and independent of TLR2 and CD14. The protective factor was identified as prostaglandin E2 (PGE2) and it was shown that both APC-derived supernatants and PGE2 prevented CD95L upregulation in T cells in response to TCR/CD3 stimulation, thereby avoiding both AICD and activated T cell killing of target macrophages. It was also demonstrated that instead of blocking CD95 pathway, PGE2 enhanced T cell death induced by agonistic anti-CD95 antibodies. The PGE2 receptors, EP2 and EP4, appear to be involved in AICD suppression since pharmacological stimulation of these receptors mimics the protective effect on T cells and their respective antagonists interfere with the protection induced by either APCs derived or synthetic PGE2. The engagement of EP2 and EP4 synergistically activates protein kinase A (PKA) and exchange protein directly activated by cAMP pathways to prevent AICD. Finally, the activation of the main transcription factors involved in CD95L expression (NFAT, AP-1 and NF-kB) is not avoided by PGE2. On the other hand, PGE2 induces the expression of ICER, a transcriptional repressor of CD95L, through CREB activation. Taken together, these results indicate that APCs can regulate T-cell levels of CD95L by releasing PGE2 in response to LPS through a TLR4/MyD88-dependent pathway, with consequences for both T cell and their own survival.

Lipopolissacarídeos (LPS), pode tanto proteger quanto exacerbar o desenvolvimento da asma. LPS inicia a ativação da resposta imune via ligação da molécula Toll-like receptor 4 (TLR4) que sinaliza por duas vias distintas, as moléculas adaptadoras MyD88 e TRIF. LPS é um adjuvante que induz resposta do tipo Th1, enquanto que o hidróxido de alumínio (Alum) desperta respostas Th2, porém, a mistura de ambos adjuvantes na indução da resposta alérgica pulmonar ainda não foi investigada. No presente estudo, nós determinamos o efeito de dois agonistas de TLR4, um natural (LPS) e outro sintético (ER-803022) adsorvidos ao Alum sobre o desenvolvimento de doença alérgica pulmonar. Os animais foram sensibilizados pela via subcutânea com os antígenos, Ovoalbumina (OVA) ou Toxóide Tetânico (TT) na presença ou ausência de agonistas de TLR4 co-adsorvidos ao Alum e desafiados com os respectivos antígenos pela via intranasal. Nossos resultados mostraram que a sensibilização com OVA ou TT e LPS coadsorvidos ao Alum, impede o estabelecimento da resposta alérgica mediada por linfócitos Th2, tais como, influxo de eosinófilos, produção de citocinas do tipo 2, hiperreatividade brônquica, secreção de muco, e produção de IgE ou IgG1 anafilática. Apesar dos níveis de IgG2a, isotipo associado com as respostas Th1 estarem aumentados, análise da histopatologia pulmonar não revelou um desvio para o padrão Th1 de inflamação. Verificamos que a presença das moléculas TLR4, MyD88, IL-12/IFN-g mas não TRIF foram necessários para LPS exercer seu efeito inibitório. O agonista sintético de TLR4, menos tóxico que LPS, também protegeu contra o desenvolvimento de inflamação alérgica pulmonar. Em conclusão, nosso trabalho esclarece o efeito da sinalização do TLR4 na sensibilização alérgica e indica que agonista sintético de TLR4 com baixa toxicidade, pode ser utilizado para modular a capacidade adjuvante do Alum e conseqüentemente diminuir a indução de alergias. / Epidemiological and experimental data suggest that bacterial lipopolysaccharides (LPS) can either protect from or exacerbate allergic asthma. LPS triggers immune responses through Toll-like receptor (TLR) 4 that in turn activates two major signaling pathways via either MyD88 or TRIF adaptor proteins. LPS is a pro-Th1 adjuvant while aluminum hydroxide (Alum) is a strong Th2 adjuvant, but the effect of mixing both adjuvants on development of lung allergy has not been investigated. We determined whether natural (LPS) or synthetic (ER-803022) TLR4 agonists adsorbed onto alum adjuvant affect allergen sensitization and development of airway allergic disease. To dissect LPS-induced molecular pathways we used TLR4, MyD88, TRIF, or IL-12/IFN-g deficient mice. Mice were sensitized subcutaneously to allergens such as ovalbumin (OVA) or tetanus toxoid (TT) with or without TLR4 agonists coadsorbed onto Alum and challenged twice via intranasal route with the same allergens. The development of type 2 immunity was evaluated 24 h after last allergen challenge. We found that sensitization with OVA or TT plus LPS co-adsorbed onto Alum impaired allergeninduced Th2-mediated responses such as airway eosinophilia, type 2 cytokines secretion, airway hyperreactivity, mucus hyper production and serum levels of IgE or IgG1 anaphylactic antibodies. Although the levels of IgG2a, a Th1 affiliated isotype increased, investigation into the lung-specific effects revealed that LPS did not induce a Th1 pattern of inflammation. LPS impaired the development of Th2 immunity, signaling via TLR4 and MyD88 molecules via the IL-12/IFN-g axis, but not through TRIF pathway. Moreover, the synthetic TLR4 agonists that proved to have a less systemic inflammatory response than LPS also protected against allergic asthma development. TLR4 agonists co-adsorbed with allergen onto Alum down modulate Th2 immunity and prevent the development of polarized T cell-mediated airway inflammation. Thus, our work clarifies the effect of TLR4 signaling in allergic sensitization and indicates that TLR4 agonists with low toxicity might be useful for down regulating the pro-Th2 adjuvant activity of alum and consequently decrease the induction of allergy.

O tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). A importância da imunidade adaptativa para este processo não está totalmente esclarecida, entretanto a inflamação persistente está associada à ocorrência de infecções e exacerbação da DPOC. O nosso objetivo foi desenvolver um modelo experimental de exacerbação da DPOC utilizando a exposição à fumaça de cigarro e instilação de lipopolissacarídeo (LPS), visando investigar os aspectos imunológicos. Camundongos machos (C57BL/6), foram divididos em 4 grupos. Grupo controle salina (CSAL) e grupo controle LPS (CLPS) que foram expostos ao ar filtrado durante 12 semanas e receberam duas instilações intratraqueais (50µl) de salina ou LPS (1mg/kg) com intervalo de 15 dias entre cada instilação e o grupo fumo salina (FSAL) e grupo fumo LPS (FLPS) que foram expostos à fumaça de cigarro e também receberam duas instilações intratraqueais de salina ou LPS com o mesmo intervalo de tempo entre as instilações e a mesma dosagem. Após 3 dias da última instilação os animais foram anestesiados, traqueostomizados e acoplados a um ventilador para pequenos animais para avaliação da mecânica respiratória. Em seguida, fizemos a coleta do lavado broncoalveolar (LBA) para avaliar o perfil inflamatório e posteriormente, os pulmões foram removidos e feitos cortes para análise do intercepto linear médio (Lm) subpleural e peribronquial, além da espessura epitelial. Também avaliamos a densidade de macrófagos, neutrófilos, células T CD4+, CD8+ e células T regulatória (Treg), células positivas para Stat3/5 e FosfoStat3/5 no parênquima pulmonar por imuno-histoquímica. Além disso, foram analisados por ELISA no homogenato pulmonar os fatores quimiotáticos (KC/CXCL1 e MIP-2/CXCL2) e interleucina (IL) (-17, -6, -10) e interferon gama (IFN-y). Observamos alteração da mecânica do sistema respiratório com aumento da resistência tecidual (Gtis) e elastância tecidual (Htis) nos animais expostos á fumaça de cigarro e desafiados com LPS. Nos grupos FSAL e FLPS observamos aumento de Lm (regiões subpleurais), e no grupo FLPS também observamos aumento de Lm nos espaços peribrônquicos e espessamento epitelial. A associação da fumaça de cigarro e o LPS, além de ter causado dano ao parênquima pulmonar mais difuso tanto em regiões subpleurais quanto em espaços peribrônquicos intensificou a resposta inflamatória com aumento de neutrófilos, macrófagos, células T CD4+, células positivas para Stat3, FosfoStat5 e CXCL2. A densidade das células Treg, os níveis de IL-17 e IL-6 aumentaram em ambos os grupos LPS, enquanto o nível de IL-10 aumentou apenas no grupo CLPS. O aumento das células positivas para Stat3 -5, FosfoStat3 -5, corrobora com valores mais elevados para as células IL-17 e Treg. Assim, nosso estudo demonstrou que embora a associação da fumaça de cigarro e o LPS tenha induzido a diferenciação das células Th17 e Treg, não observamos aumento da expressão de IL-10 e sim da expressão de IL-17 sugerindo que uma falha na produção de IL-10 desempenha um papel fundamental na exacerbação do processo inflamatório / The tobacco smoking is the main risk factor for the development of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD). The importance of adaptive immunity for this process is not completely clear, however there are studies attesting the association of infection with COPD exacerbation. We propose an experimental model of COPD exacerbation using a traditional method of cigarette smoke (CS) combining with lipopolysaccharide (LPS) instillations, focusing on the adaptive immunity response. C57BL/6 male mice were exposed to room air or to CS and after 3 months, they received two instillations of saline or LPS (Control/SAL; Control/LPS; CS/SAL and CS/LPS groups). Animals were anesthetized to perform the respiratory mechanics and inflammatory profile in broncho alveolar lavage (BAL) and lungs were removed to evaluate the mean linear intercept (Lm), the density of macrophages, neutrophils, CD4+ and CD8+ cells, regulatory T cells (Treg), signal transducer and activator of transcription (Stat) 3, 5 and phosphoStat 3, 5. The chemotactic factors (CXCL1 and CXCL2); interleukins (IL): -17, -6, -10 and INF-y were measured in lung using Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). We observed a change in the mechanics of the respiratory system with increased tissue resistance (Gtis) and tissue elastance (Htis) in CS/LPS group. In addition, in CS/Sal and CS/LPS groups we observed increase of Lm (subpleural), and in CS/LPS group we observed the increase in Lm in peribronchial spaces. CS exposure and LPS challenge induced an increase in neutrophils, macrophages, CD4+ and CD8+ T cells. CS/LPS challenge association intensified this response and lung parenchyma damage. Treg density cells, IL-17 and IL-6 levels was increased in both LPS groups, while IL-10 level was increased only in Control/LPS group. The increase of Stat3, -5, PhosphoStat3, -5 positive cells corroborates with higher values for IL-17 and Treg cells. Although the CS/LPS challenge association induced both Th17 and Treg cells differentiation, there is no increase for IL-10 expression, suggesting that a failure in IL-10 production play a pivotal role in the inflammatory process exacerbation