A administração do componente bacteriano lipopolissacarídeo (LPS) durante o início de vida é um modelo animal comumente utilizado de infecção precoce. Os efeitos desse tratamento sobre o comportamento exploratório têm sido geralmente observados em ratos adultos. Contudo, sabe-se pouco sobre esses efeitos em etapas importantes do desenvolvimento como a adolescência. O presente trabalho analisou o efeito da inoculação repetida de LPS em ratos recém-nascidos, sobre o comportamento exploratório. No primeiro experimento, filhotes machos de ratos Wistar foram distribuídos em três grupos (N = 12) e receberam injeções intraperitoneais de solução veículo (PBS) ou de LPS (E. coli; 0,05 mg/kg), ou foram mantidos sem tratamento, nos dias 3 e 5 de vida. Na adolescência, entre os dias 40 e 46 de vida, os animais foram expostos aos seguintes testes comportamentais: labirinto em cruz elevado, campo aberto, reconhecimento de objeto novo, tábua de buracos, gradiente de aversão elevado e nado forçado. Os resultados mostraram que ratos adolescentes expostos a esse paradigma de inoculação exibiram um perfil de comportamento impulsivo caracterizado pelo aumento de locomoção, exploração de áreas abertas e baixa neofobia, quando comparados com os animais dos grupos controle. Esses animais exibiram também um estilo ativo de lidar com o estresse na primeira sessão do nado forçado. Semelhante ao procedimento utilizado no primeiro experimento, um segundo experimento foi realizado para determinar se uma inoculação diária mais prolongada de LPS (dias 2 a 7 de vida) poderia alterar o comportamento exploratório na adolescência. Os resultados mostraram que uma inoculação intensa alterou o estilo de enfrentamento do estresse em ratos adolescentes. Durante a primeira sessão do nado forçado, os ratos tratados com LPS escalaram durante menos tempo e permaneceram mais tempo na postura imóvel, quando comparados com animais dos grupos controle. No conjunto, os resultados dos dois experimentos mostraram que manipulações repetidas no início de vida podem aumentar a atividade exploratória e que a inoculação precoce de LPS resulta em aumento do número de levantadas. Discute-se o papel das citocinas no início de vida sobre o desenvolvimento de componentes relacionados à resposta de estresse, bem como a importância da experiência precoce com organismos infecciosos na elaboração de respostas adaptativas à novidade na adolescência. / The administration of the bacterial component lipopolysaccharide (LPS) during early life is a commonly used animal model of early infection. The effects of this treatment on exploratory behavior have generally been observed in adult rats. However, little is known about these effects on important stages of development such as adolescence. The present study analyzed the effect of repeated inoculation of LPS in newborn rats on the exploratory behavior. In the first experiment, male Wistar rat pups were divided into three groups (N = 12) and received intraperitoneal injections of either vehicle solution (PBS) or LPS (E. coli; 0.05 mg/kg) or were left undisturbed at 3 and 5 days of age. In adolescence, between 40 and 46 days of age, the animals were exposed to the following behavioral tests: elevated plus-maze, open-field, novel-object exploration task, hole-board, elevated aversion gradient and the forced swim test. The results showed that adolescent rats exposed to this paradigm of early inoculation exhibited a profile of impulsive behavior characterized by increased locomotion, high exploration of open areas and low neophobia when compared with control group animals. These animals also exhibited an active style of coping with stress in the first session of the forced swim test. Similar to the procedure used in the first experiment, a second experiment was conducted to determine whether prolonged daily inoculation of LPS (2 to 7 days of age) could alter the exploratory behavior during adolescence. The results showed that prolonged inoculation altered the stress coping style in adolescent rats. During the first session of the forced swim, rats treated with LPS spent less time climbing and spent more time in immobile posture, as compared with the control group animals. As a whole, the results of both experiments showed that repeated manipulations in early life may increase exploratory activity and early LPS inoculation leads to increased number of rearings. The role of cytokines in early life on the development of components related to stress response is discussed together with the importance of early experiences with infectious organisms in the development of adaptive responses to novelty during adolescence.

Tendo em vista a importância fisiológica e comportamental da relação entre ovelha e cordeiro, este trabalho teve por objetivo confirmar o perfil de alterações fisiológicas do lipopolissacarídeo (LPS) em ovelhas no terço final da gestação e se mães estressadas durante a gestação apresentam maior disponibilidade e estabilidade quanto aos cuidados maternos com seus filhos, intencionando minimizar prejuízos ao longo da vida como compensação das adversidades sofridas durante a gestação, além de analisar a influencia deste estresse na gestação sobre os parâmetros reprodutivos dos cordeiros. Foram utilizadas 39 ovelhas prenhes, mestiças da raça Santa Inês, nulíparas, com idade média de 12 meses e média de 45 kg de peso vivo (PV), dando origem aos 17 cordeiros machos que também fizeram parte do experimento. As ovelhas gestantes foram divididas em dois tratamentos, TF e TC, devido à indução ou não de LPS no final da gestação. Foram avaliadas alterações fisiológicas e a relação materna destes animais até a idade da desmama dos cordeiros, assim como análises do desenvolvimento reprodutivo destes animais até completarem um ano de idade. Os dados comportamentais foram analisados pela teoria de modelos lineares generalizados proposta por Nelder e Wenderburn (1972), as medidas fisiológicas e os parâmetros reprodutivos, após análise de variância foram comparadas pelo teste F e t de stundent ao nível de 5% de significância, utilizando-se o procedimento GLIMMIX do software SAS para todas as análises. Houve diferenças em relação ao cortisol sanguíneo e a temperatura retal (P<0,05) devido à ação do LPS durante a gestação. Cordeiros desafiados pelo LPS durante a gestação apresentaram maiores dificuldades de aprendizado e memória aos 30 dias de vida durante um teste cognitivo em um labirinto (P<0,05). Sendo encontrados também diferentes perfis (P<0,05), entre os tratamentos, no que diz respeito aos cuidados maternos medidos segundo a interação comportamental entre ovelha e cordeiro, do momento do parto até a idade da desmama destes animais. Os índices de mamada e o início do consumo de alimentos sólidos pelos cordeiros apresentaram-se como uma boa prática de observação para se mensurar a capacidade de independência dos cordeiros. Para os dados reprodutivos houve efeito de tempo, em relação à idade da puberdade fisiológica ao início da maturidade sexual dos animais, para a maioria das variáveis analisadas (P<0,05), havendo efeito também de tratamento para a qualidade espermática dos cordeiros neste mesmo período (P<0,01). O LPS provoca alterações fisiológicas em ovelhas no final da gestação, influencia nos cuidados maternos e na capacidade cognitiva dos cordeiros, assim como altera a qualidade espermáticas de machos do durante a puberdade fisiológica até o início da maturidade sexual. / Considering the physiological and behavioral importance of the relationship between sheep and lamb, this study aimed to confirm the profile of LPS physiological changes in sheep in the final third of gestation, and if mothers who are stressed during pregnancy present greater availability and stability regarding care maternal with their children, intending to minimize losses during the life as compensation of the adversities suffered during the gestation, besides analyzing the influence of this stress in the gestation on the reproductive parameters of the lambs. Thirty - nine pregnant ewes of Santa Inês breed, nulliparous, with a mean age of 12 months and an average of 45 kg of live weight were used, giving birth to the 17 male lambs that were also part of the experiment. Pregnant ewes were divided into two treatments, FT and CT, due to the induction or not of LPS at the end of gestation. Physiological and physiological values were evaluated in relation to the animals up to the weaned age of the lambs, as well as the responses to the reproductive development of the animals until one year of age. The behavioral data were analyzed by the theory of generalized linear models proposed by Nelder and Wenderburn (1972), the physiological measures and the reproductive parameters, after analysis of variance were compared by the test F et de stundent at the 5% level of significance, the SAS software GLIMMIX procedure is used for all analyzes. There were differences in blood cortisol and rectal temperature (P<0.05) due to the action of LPS during pregnancy. Lambs challenged by LPS during gestation presented greater learning difficulties and memory at 30 days of life during a cognitive test in a labyrinth (P<0.05). Different profiles (P<0.05) were also found among the treatments, in relation to the maternal care measured according to the behavioral interaction between sheep and lamb, from the moment of delivery until the weaning age of these animals. Feeding rates and the onset of solid food intake by lambs were a good observational practice in order to measure lambs\' independence. For the reproductive data, there was a time effect, in relation to the age of physiological puberty at the beginning of the sexual maturity of the animals, for most of the analyzed variables (P<0.05), also having an effect on the sperm quality of the lambs in this same period (P<0.01). LPS causes physiological changes in sheep at the end of gestation, influences maternal care and cognitive ability of lambs, as well as alter the sperm quality of males during physiological puberty until the onset of sexual maturity.

Em estudo anterior, observamos que o Met-RANTES, antagonista de receptores CCR1 e CCR5 para quimiocinas, injetado pela via endovenosa (i.v.) reduziu a resposta febril induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli, demonstrando o envolvimento da quimiocina RANTES (Regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais) nesta resposta. Além disso, a injeção intrahipotalâmica (i.h.) da RANTES dose-dependentemente aumentou a temperatura corporal de ratos, o qual foi caracterizado como febre, pois foi acompanhada de redução da temperatura da cauda, uma resposta termorregulatória para retenção de calor. Observamos também, que a RANTES aumenta a concentração de prostaglandinas no fluido cerebroespinhal (CSF) e que a febre por ela induzida é sensível aos inibidores não-seletivos para as ciclooxigenases e seletivo para COX-2 (Machado et al., 2007). No presente estudo, aprofundamos a investigação sobre os mediadores, incluindo as prostaglandinas, envolvidos na resposta febril induzida pela RANTES. Verificamos que o paracetamol reduziu, enquanto o diclofenaco de sódio aboliu a resposta febril induzida pela RANTES. Ainda, a injeção i.h. da RANTES promoveu significativa expressão do RNAm para COX-2 no hipotálamo, confirmando ser a COX-2 a enzima responsável pela síntese de prostaglandinas envolvidas no efeito pirogênico desta quimiocina. Através da administração de corante in situ e de cortes histológicos, pode-se averiguar o trajeto da cânula bem como a profundidade alcançada pela agulha durante a injeção na área pré-óptica hipotalâmica anterior (AH/POA). Padronizamos a dose do Met-RANTES (i.h.) que não seria capaz de alterar a temperatura retal dos animais. Posteriormente, avaliou-se o efeito de diferentes doses do Met-RANTES, administrado via intrahipotalâmica, na resposta febril induzida pelo LPS ou pela RANTES. Entretanto, nas doses administradas o pré-tratamento com o antagonista não foi capaz de reduzir a febre induzida por ambos os estímulos. Contudo, o Met-RANTES (i.v.) reduziu a febre induzida pelo TNF-alfa (i.h.), reproduzindo resultados anteriores. O pré-tratamento com Met-RANTES (i.v.) não modificou a febre induzida pela injeção central de interleucina (IL)-6, fator liberador de corticotropina (CRF) e bradicinina (BK). Adicionalmente, a injeção de LPS (i.v.) ou TNF-alfa (i.h.) elevou a concentração da RANTES no tecido hipotalâmico. Antalarmina (antagonista de receptores CRF1) e alfa-helical CRF9-41 (antagonista de receptores CRF1 e CRF2) que reduziram a febre induzida pelo CRF, não alteraram a febre induzida pela administração i.h. da RANTES. O antagonista de receptores B1 (DALBK) que reduziu a segunda fase da resposta febril induzida pela BK, não foi capaz de modificar a febre induzida pela RANTES. Da mesma forma, o antagonista de receptores B2 (Hoe-140) que reduziu a resposta febril induzida pela BK durante todo o período de experimentação, não modificou a febre promovida pela RANTES. Por outro lado, verificamos que o anticorpo anti-IL-6 administrado i.h. reduziu a febre induzida pela IL-6 e pela RANTES. Ainda, a injeção de LPS (i.v.) ou RANTES (i.h.) elevou a concentração de IL-6 no CSF, mas não de IL-1 e TNF-. A RANTES promoveu ativação do fator nuclear-kB (NF-kB) e aumentou a expressão do RNAm para as citocinas IL-1beta, TNF-alfa e IL-6 no hipotálamo dos animais. O pré-tratamento com Met-RANTES reduziu, na 2,5 e 6 h, a neutrofilia induzida pelo LPS. Em síntese, nossos resultados demonstram que durante a resposta febril induzida pelo LPS, este induz a síntese de TNF-alfa o qual promove a síntese da quimiocina RANTES que, ativando os receptores CCR1 e CCR5 promove a transmigração do NF-kB do citoplasma para o núcleo e a subseqüente síntese de IL-6 e de COX-2, esta última, a responsável pela síntese de prostaglandina E2 (PGE2), um dos mediadores finais da resposta febril induzida pelo LPS. Além disso, a RANTES parece ser um mediador da resposta de fase aguda, uma vez que, promove dois sinais importantes desta resposta, febre e neutrofilia. / We showed before that Met-RANTES, CCR1 and CCR5 receptor antagonist, intravenously injected (i.v.) reduced fever induced by lipopolysaccharide (LPS, E. coli), demonstrating the involvement of RANTES (Regulated on activation, normal T cells expressed and secreted) in this response. Also, intrahypothalamic (i.h.) injection of RANTES dose-dependently increased body temperature of rats, this increase was characterized as fever, because it was accompanied of a reduction in the tail skin temperature, a thermoregulatory response for heat retention. We also verified that RANTES increased the concentration of prostaglandin (PG)E2 in the cerebrospinal fluid (CSF), which was sensible to non-selective and selective blockers to cyclooxygenase (COX)-2 (Machado et al., 2007). In the present study, it was investigated which others mediators, including prostaglandins, are involved in the RANTES-induced fever. The effect of paracetamol and sodium diclofenac on fever induced by RANTES was also investigated. Paracetamol reduced, while sodium diclofenac abolished the RANTES-induced fever. The intrahypothalamic (i.h.) RANTES injection promoted a significant COX-2 mRNA expression in the hypothalamus, confirming the role of the COX-2 enzyme in the synthesis of prostaglandin involved in the pyrogenic effect of this chemokine. Through administration of dye in situ and histological analyses, we confirmed that the injection in the preoptic area of the anterior hypothalamus (AH/POA) was correct. Subsequently, we evaluated the effect of different doses of Met-RANTES (i.h.) in the fever induced by both LPS and RANTES. Centrally injected, Met-RANTES did not modify the fever induced by LPS or RANTES. On the other hand, Met-RANTES (i.v.) reduced TNF-alpha-induced fever, but did not modify the fever induced by interleukin (IL)-6, corticotrophin releasing factor (CRF) and bradykinin (BK). Additionally, the injection of LPS (i.v.) or TNF-alpha (i.h.) increased RANTES concentration in the hypothalamus. Antalarmin (a CRF receptor 1 antagonist) and alpha-helical CRF9-41 (CRF 1 and 2 receptor antagonist) that reduced CRF-induced fever did not modify the fever induced by RANTES (i.h.). DALBK (bradykinin B1 receptor antagonist) that reduced the second phase of BK-induced fever did not modify RANTES-induced fever. In the same way, Hoe-140 (bradykinin B2 receptor antagonist) that reduced the fever induced by BK during the whole period of observation, did not modify RANTES-induced fever. On the other hand, we verified that anti-rat IL-6 antibody (i.h.) reduced the fever induced by both IL-6 and RANTES. In addition, the administration of LPS (i.v.) or RANTES (i.h.) increased the CSF IL-6 concentration, but not of IL-1 and TNF-. RANTES promoted nuclear factor-kB (NF-kB) activation and increased IL-1beta, TNF-alpha and IL-6 mRNA expression in the hypothalamus. Pretreatment of the animals with Met-RANTES reduced the LPS-induced neutrophilia. In synthesis, our results suggest that in the fever induced by LPS, RANTES induces TNF- synthesis, which promotes the synthesis of RANTES that, activating CCR1/CCR5 receptors, promotes NF-kB transmigration of cytoplasm to the nucleus and subsequent synthesis of IL-6 and COX-2. The latter, in turn, is responsible by (PGE2) synthesis, one of the final mediators of the febrile response induced by LPS. Moreover, RANTES seem to be a mediator of the acute phase response since it promoted two important signs of this response, fever and neutrophilia.

A administração do componente bacteriano lipopolissacarídeo (LPS) durante o início de vida é um modelo animal comumente utilizado de infecção precoce. Os efeitos desse tratamento sobre o comportamento exploratório têm sido geralmente observados em ratos adultos. Contudo, sabe-se pouco sobre esses efeitos em etapas importantes do desenvolvimento como a adolescência. O presente trabalho analisou o efeito da inoculação repetida de LPS em ratos recém-nascidos, sobre o comportamento exploratório. No primeiro experimento, filhotes machos de ratos Wistar foram distribuídos em três grupos (N = 12) e receberam injeções intraperitoneais de solução veículo (PBS) ou de LPS (E. coli; 0,05 mg/kg), ou foram mantidos sem tratamento, nos dias 3 e 5 de vida. Na adolescência, entre os dias 40 e 46 de vida, os animais foram expostos aos seguintes testes comportamentais: labirinto em cruz elevado, campo aberto, reconhecimento de objeto novo, tábua de buracos, gradiente de aversão elevado e nado forçado. Os resultados mostraram que ratos adolescentes expostos a esse paradigma de inoculação exibiram um perfil de comportamento impulsivo caracterizado pelo aumento de locomoção, exploração de áreas abertas e baixa neofobia, quando comparados com os animais dos grupos controle. Esses animais exibiram também um estilo ativo de lidar com o estresse na primeira sessão do nado forçado. Semelhante ao procedimento utilizado no primeiro experimento, um segundo experimento foi realizado para determinar se uma inoculação diária mais prolongada de LPS (dias 2 a 7 de vida) poderia alterar o comportamento exploratório na adolescência. Os resultados mostraram que uma inoculação intensa alterou o estilo de enfrentamento do estresse em ratos adolescentes. Durante a primeira sessão do nado forçado, os ratos tratados com LPS escalaram durante menos tempo e permaneceram mais tempo na postura imóvel, quando comparados com animais dos grupos controle. No conjunto, os resultados dos dois experimentos mostraram que manipulações repetidas no início de vida podem aumentar a atividade exploratória e que a inoculação precoce de LPS resulta em aumento do número de levantadas. Discute-se o papel das citocinas no início de vida sobre o desenvolvimento de componentes relacionados à resposta de estresse, bem como a importância da experiência precoce com organismos infecciosos na elaboração de respostas adaptativas à novidade na adolescência. / The administration of the bacterial component lipopolysaccharide (LPS) during early life is a commonly used animal model of early infection. The effects of this treatment on exploratory behavior have generally been observed in adult rats. However, little is known about these effects on important stages of development such as adolescence. The present study analyzed the effect of repeated inoculation of LPS in newborn rats on the exploratory behavior. In the first experiment, male Wistar rat pups were divided into three groups (N = 12) and received intraperitoneal injections of either vehicle solution (PBS) or LPS (E. coli; 0.05 mg/kg) or were left undisturbed at 3 and 5 days of age. In adolescence, between 40 and 46 days of age, the animals were exposed to the following behavioral tests: elevated plus-maze, open-field, novel-object exploration task, hole-board, elevated aversion gradient and the forced swim test. The results showed that adolescent rats exposed to this paradigm of early inoculation exhibited a profile of impulsive behavior characterized by increased locomotion, high exploration of open areas and low neophobia when compared with control group animals. These animals also exhibited an active style of coping with stress in the first session of the forced swim test. Similar to the procedure used in the first experiment, a second experiment was conducted to determine whether prolonged daily inoculation of LPS (2 to 7 days of age) could alter the exploratory behavior during adolescence. The results showed that prolonged inoculation altered the stress coping style in adolescent rats. During the first session of the forced swim, rats treated with LPS spent less time climbing and spent more time in immobile posture, as compared with the control group animals. As a whole, the results of both experiments showed that repeated manipulations in early life may increase exploratory activity and early LPS inoculation leads to increased number of rearings. The role of cytokines in early life on the development of components related to stress response is discussed together with the importance of early experiences with infectious organisms in the development of adaptive responses to novelty during adolescence.

O fator de transcrição nuclear kappa B (NFKB), central na resposta inflamatória, é constitutivamente expresso em glândulas pineais de rato. A inibição da translocação nuclear deste fator em pineais de rato por corticosterona potencia, enquanto que a inibição pela citocina fator de necrose tumoral (TNF) inibe a síntese de melatonina por inibição da transcrição da Aa-nat. Esta redução da produção noturna de melatonina está implicada em favorecer a montagem da resposta inflamatória. Embora dados da literatura sugerirem redução da produção de melatonina durante processos infecciosos, não há evidências diretas da habilidade da glândula pineal em reconhecer o lipopolissacarídeo (LPS), a endotoxina da membrana de bactérias gram-negativas. Esta dissertação investigou se a glândula pineal de ratos expressa receptores para o reconhecimento do LPS e estabeleceu possíveis mecanismos de ação desta endotoxina na glândula pineal de ratos. Nossos resultados demonstram que a glândula pineal expressa de maneira constitutiva os receptores CD14 e o TLR4. LPS induz a translocação nuclear dos dímeros p50/p50 e p50/RelA e a síntese de TNF em glândulas cultivadas. A máxima produção de TNF no meio de cultura é coincidente com a máxima expressão do receptor TNFR1 em pinealócitos. Além disso, LPS inibe a síntese de N-acetilserotonina e melatonina. Em conclusão, neste estudo, demonstramos que a pineal é alvo para o componente de bactérias gram-negativas LPS, reforçando a proposta de que esta glândula reconhece e gera respostas a moléculas que sinalizam a montagem da resposta inflamatória. / Nuclear factor-kappa B (NFKB), a pivotal player in inflammatory responses, is constitutively expressed in the pineal gland. Corticosterone inhibits pineal NFKB leading to an enhancement of melatonin production, while tumor necrosis factor (TNF) leads to inhibition of Aa-nat transcription and the production of N-acetylserotonin (NAS) in cultured glands. The reduction of nocturnal melatonin surge favors the mounting of the inflammatory response. Despite these data, there is no clear evidence of the ability of the pineal gland to recognize molecules that signal infection. This study investigated whether the rat pineal gland expresses receptors for lipopolysaccharide (LPS), the endotoxin from the membranes of gram-negative bacteria, and to establish the mechanism of action of LPS. Here we show that pineal glands possesses both CD14 and toll-like receptor 4 (TLR4), membrane proteins that bind LPS and trigger the NFKB pathway. LPS induced the nuclear translocation of p50/p50 and p50/RELA dimers and the synthesis of TNF. The maximal expression of TNF in cultured glands coincides with an increase in the expression of TNF receptor 1 (TNFR1) in isolated pinealocytes. In addition, LPS inhibited the synthesis of N-acetylserotonin and melatonin. Therefore, the pineal gland transduces gram-negative endotoxin stimulation by producing TNF and inhibiting melatonin synthesis. Here we provide evidence to reinforce the idea of an immune-pineal axis, showing that the pineal gland is a constitutive player in the innate immune response.

Antibody combining sites are constructed from limited set of germ-line gene segments, yet are capable of both recognizing a broad range of common epitopes and eliciting an adaptive response to newly encountered pathogens. Carbohydrate antigens generally do not draw T cell help and concomitant affinity maturation in the humoral response. Therefore, anti-carbohydrate responses must rely more heavily on the primary germ-line gene repertoire. Antibodies are usually thought of as highly specific. It has been suggested that polyspecificity and cross-reactivity in germ-line antibodies is necessary to provide the protective mechanisms required to broaden the potential number of antigens recognized; however, the molecular mechanism underlying polyspecificity is poorly understood. To investigate the phenomena of specificity, cross-reactivity and polyspecificity in germ-line antibodies my thesis focuses first on the unique LPS inner core oligosaccharide of Chlamydiaceae, which contains variations within the conserved inner core trisaccharide Kdo(2→8)Kdo(2→4)Kdo (3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid). Antibodies raised against this family-specific trisaccharide showed strong V-region restriction with two sets of heavy and light chain V genes accounting for almost all clones isolated. These groups were named after their prototypic clones as the ‘S25-2 type’ and the ‘S25-23 type’. In contrast to the cross-reactive S25-2 and related antibodies, the S25-23 family of antibodies were shown to be specific for the Chlamydiaceae-specific trisaccharide antigen with no cross-reactivity to Kdo mono or disaccharides or to the Kdo(2→4)Kdo(2→4)Kdo trisaccharide antigen. Interest in S25-23 was sparked by its rare high μM affinity and strict specificity for the family-specific trisaccharide antigen. The structures of the antigen binding fragments of four S25-23-type mAbs have been determined to high resolution in complex with the Chlamydiaceae-specific epitope, revealing the molecular basis for their binding behaviour. The germ-line-encoded paratopes of these antibodies differ significantly from previously characterized S25-2-type mAbs. Unlike the terminal Kdo recognition pocket that promotes cross-reactivity in S25-2-type antibodies, S25-26 and the closely related S25-23 utilize a groove composed of germ-line residues to recognize the length of the trisaccharide antigen. Further S25-23-type antibodies are glycosylated on the variable heavy chain. Analysis of the glycan reveals a heterogeneous mixture with a common root structure that contains an unusually high number of terminal αGal-Gal moieties. One of the unliganded structures in S25-26 shows significant order in the glycan with appropriate electron density for nine residues. The elucidation of the three-dimensional structure of a Gal(α1→3)Gal containing N-linked glycan on a mAb variable heavy chain has potential clinical interest, as it has been implicated in allergic responses in patients receiving therapeutic antibodies. The second focus of my thesis research is the lipid A moiety of LPS, which is involved in septic shock. Though the lipid A epitope appears to be cryptic during infection with Gram-negative bacteria, there have been several reported instances of lipid A specific antibodies isolated from human sera. While these antibodies are strictly selective for lipid A, there are reports of polyspecificity of some anti-lipid A antibodies for single stranded DNA. In such cases, the breakdown of negative selection through polyspecificity has been reported to result in the unfortunate consequences of autoimmune disease. This thesis reports the first crystal structures of antibodies in complex with lipid A and single stranded nucleic acids, elucidating their mechanism for polyspecificity. Perhaps more importantly, the structures may yield clues to the genesis of autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus, thyroiditis, and rheumatic autoimmune diseases. / Graduate / 2020-04-18 / 0487 / 0982

Nous nous sommes intéressés à la compréhension des mécanismes régissant la symbiose Rhizobium-Acacia dans les conditions de stress salin. Les lipopolysaccharides jouent un rôle important dans les étapes de cette symbiose. Le but était de mettre en évidence les modifications pariétales de la bactérie en réponse au stress salin par l’étude de la structure des lipopolysaccharides des souches isolées du désert marocain tolérant NaCl 7%. Ainsi, une nouvelle méthode d’hydrolyse des lipopolysaccharides sensible, non destructive et compatible avec la spectrométrie de masse a été développée. En présence de stress salin, nous avons montré que la membrane externe devenait plus hydrophobe en augmentant l’acylation de la région lipidique ainsi qu’en réduisant la présence des molécules de LPSs à longues chaînes de sucres.Des essais d’évaluation de l’efficience et de l’infectivité des Rhizobia étudiés ont été mis en œuvre pour déterminer l’impact de ces modifications des LPSs sur la symbiose sous stress salin. / We were interested in the understanding of the mechanisms governing Rhizobium-Acacia symbiosis in salt stress conditions. Lipopolysaccharides play an important role in the stages of this symbiosis. The aim of this work was to highlight the changes occurring in the bacterial membrane in response to salt stress by studying the structure of the lipopolysaccharides isolated from Moroccan desert strains tolerating 7% NaCl. Thus, a new method of hydrolysis of the lipopolysaccharide - sensitive, non-destructive and compatible with mass spectrometry- was developed. We studied the LPSs strains grown with or without salt stress and we showed that in salt stress conditions, the outer membrane becomes more hydrophobic by increasing acylation of the lipid region and reducing the number of long sugar chains in LPSs. Tests for evaluating the efficiency and infectivity of the studied rhizobia were carried out to determine the impact of these LPS modifications on symbiosis under salt stress.

A própolis é uma substância resinosa, cujas atividades antibacteriana, antiinflamatória, antiviral, fungicida, imuno estimulante, cicatrizante e de anestésico local tem sido valorizadas no uso clínico. O lipopolissacarídeo (LPS) é reconhecidamente uma endotoxina e pode induzir processos inflamatórios. Os objetivos deste trabalho foram: a) analisar in vitro as seguintes propriedades do extrato de própolis verde: 1) perfil físico químico 2) Concentração Inibitória Mínima (CIM) frente à endotoxina da bactéria gram negativa Escherichia coli; e 3) sua atividade imunorregulatória sobre leucócitos de baço de ratos; b) analisar &Prime;in vivo&Prime; a ação do Extrato Etanólico de Própolis (EEP) 10% e 90% e do Extrato de Própolis Puro (EPP), em alvéolos dentais contaminados ou não com lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano. Para o estudo in vivo 35 ratos foram submetidos às exodontias dos primeiros molares superiores direito e esquerdo, os quais, imediatamente tiveram o alvéolo dental direito contaminado com 0,1µL de lipopolissacarídeo (LPS) (100µg/kg) e o esquerdo sem tal contaminação. Os grupos com (n=7) para cada tratamento, após 2 semanas: GI- Controle Negativo (CN) - sem tratamento; GII- Tratados com Extrato de Própolis puro (EPP) GIII- Tratados com pasta de própolis a 90% (P90); GIV- Tratados com pasta de própolis a 10% (P10); e, GV- Tratado com veículo das pastas (SB) foram analisados. Os alvéolos foram removidos, desmineralizados, processados pela técnica histológica de rotina, submetidos a secções sistematizadas a 6 µm de espessura e corados em H.E. O volume de osso formado, foi avaliado por contagem de pontos, usando um Sistema Teste sobreposto as imagens capturadas com auxílio de uma câmera acoplada a um microscópio. Observada a normalidade dos dados, procedeu-se o teste ANOVA fatorial e Tukey-Kramer test (p<0,05). In vitro determinou-se a propriedade da própolis, sua CIM e atividade imunorregulatória. In vivo os alvéolos dentais contaminados com lipopolissacarídeo bacteriano e tratados com a própolis verde apresentou maior área de osso neoformado, quando comparado aos demais grupos experimentais. O alvéolo não contaminado e tratado com própolis pura mostrou maior área de fibras colágenas. / Propolis is a resinous substance, whose antibacterial, antiinflammatory, antiviral, antifungal, immune stimulant, and local anesthetic wound healing properties has been considered for clinical practice. The lipopolysaccharide (LPS) is recognized as an endotoxin and can induce inflammatory processes. Our objectives were: a) to analyze in vitro the following properties of green propolis extract: 1) physicochemical profile of green propolis sample, 2) Minimum Inhibitory Concentration (MIC) against endotoxin from gram negative Escherichia coli and 3) its immunoregulatory activity using leukocytes from the spleen of mice,. b) analyze in vivo, the action of propolis ethanol extract (EEP) 10% and 90% and Pure Propolis Extract (EPP) in dental alveoli or not contaminated with lipopolysaccharide (LPS) bacterial. For in vivo study, 35 rats were subjected to extractions of maxillary first molars, right and left, which immediately had the right dental socket contaminated with 0.1 µL of lipopolysaccharide (LPS) (100µg/kg) and left without such contamination. They were divided into groups (n = 7) for each sample after 2 weeks, according to the treatment in the right and left alveoli: GI-Negative Control (NC) - no treatment, GII-Treated Pure Propolis Extract (EPP) GIII-Treated folder with propolis 90% (P90), GIV-Treated folder with propolis 10% (P10) and GV-Treated folder with vehicle (SB). The alveoli were removed, demineralized, processed by routine histologic technique, submitted to systematic sections (6 microns) of thick and stained with HE for histological analysis to assess the new bone tissue volume by point counting method, using a Test system on images captured with the aid of a digital camera attached to a microscope. Observed data normality, we proceeded to ANOVA and Tukey-Kramer tests (p <0.05). In vitro, it was determined the propolis properties, CIM and immunoregulatory activity. In vivo, the alveoli contamined with bacterian lipopolysaccharide and treated with green propolis induced higher bone formation when compared to other groups. The non contamined alveoli and treated with pure propolis showed more quantity of collagen fibers.

Lesão pulmonar aguda é caracterizada por infiltrado de neutrófilos no pulmão, edema, lesão alveolar difusa e alteração da reatividade das vias aéreas. Evidências clínicas e experimentais sugerem que os hormônios sexuais femininos (HSF) modulam a inflamação. Nesse estudo camundongos fêmeas C57BL/6 foram ovariectomizados (OVx) ou falsamente operados, com ovários mantidos (Sham). Após 7 dias foi realizada instilação nasal de LPS (ou salina como controle). Após 4 ou 24 h os experimentos foram conduzidos. Os resultados obtidos 24 h após o LPS mostram aumento de neutrófilos, IL-1b e de óxido nítrico (NO) e redução de IL-10 no pulmão dos animais OVx em relação aos Sham. Também foi observada redução da reatividade traqueal e da resistência e elastância pulmonar dos animais OVx. O tratamento dos animais OVx com 17b-estradiol ou progesterona antes do LPS reverteram esses efeitos. Os dados mostram que 4 h após o LPS a OVx não altera a inflamação e a reatividade das vias aéreas. Pode-se concluir nesse modelo experimental que os HSF exerçam papel de proteção ao organismo. / Acute lung injury is characterized by lung neutrophil infiltration, edema, diffuse alveolar damage and changes in airway reactivity. Clinical and experimental evidences suggest that the female sex hormones (FSH) modulate the inflammation. In this study, female mice C57BL/6 were ovariectomized (OVx) or not (Sham). After 7 days, LPS or saline (as control) were intranasally instillated. After 4 or 24 h the experiments were carried. We observed, 24 h after LPS, increase in neutrophil, IL-1b and nitric oxide (NO) and reduction of IL-10 in the lungs of OVx compared to Sham. We also noted reduced tracheal reactivity and lung resistance and elastance in OVx animals. Treatment of OVx with 17b-estradiol or progesterone before LPS reversed these effects. The data show that 4 h after LPS, the OVx does not promote inflammation and airway reactivity. We can conclude that in our experimental model, FSH exert protective role.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / INTRODUÃÃO: O papel do LPS na defesa da mucosa gÃstrica ainda nÃo està estabelecido. OBJETIVOS: 1-Verificar o efeito protetor do LPS na lesÃo gÃstrica (LG), na infiltraÃÃo de neutrÃfilos (IN), no aumento da adesÃo leucocitÃria, na diminuiÃÃo dos nÃveis de GSH induzidos por indometacina (INDO) em ratos; 2-Investigar o papel da COX-2, NOSi e dos canais de K sensÃveis ao ATP (KATP) na gastroproteÃÃo do LPS na gastropatia por INDO. MÃTODOS: Os ratos foram tratados com LPS da E. coli (30, 100 ou 300 &#61549;g/Kg, e.v.). ApÃs 6 hs, foi administrado INDO (20mg/Kg, p.o.). Decorridas 3 hs, o sangue foi colhido para determinaÃÃo do leucograma. Posteriormente, os ratos foram sacrificados e a LG foi aferida. Fragmentos do estÃmago foram retirados para avaliaÃÃo da atividade de mieloperoxidase (MPO) e determinaÃÃo dos nÃveis de glutationa (GSH). A adesÃo e o rolling dos leucÃcitos foram avaliados por microscopia intravital. Diferentes grupos foram tratados com rofecoxib, L-NAME, aminoguanidina, dexametasona, glibenclamida, diazÃxido ou glibenclamida + diazÃxido. ApÃs 3 horas da administraÃÃo de INDO (20mg/Kg, p.o.), foram avaliadas a LG, a MPO e GSH. RESULTADOS: LPS reduziu a LG e o aumentou a MPO induzidas por INDO de forma dose-dependente, com o efeito mÃximo na dose de 300 &#61549;g/Kg e no tempo de 6 hs. O prÃ-tratamento com LPS induziu uma neutrofilia na gastropatia induzida pela INDO. LPS reverteu à queda dos nÃveis de GSH no estÃmago com INDO. O tratamento com LPS diminui a adesÃo e aumentou o rolling dos leucÃcitos quando comparado com o tratado com INDO. Rofecoxib, L-NAME, aminoguanidina ou dexametasona nÃo reverteram o efeito protetor do LPS. Glibenclamida, mas nÃo diazÃxido, reverteu o efeito protetor do LPS na gastropatia induzida por INDO, aumentando de forma significativa a LG, MPO e diminuindo a GSH. A associaÃÃo de glibenclamida com diazÃxido nÃo reverteu o efeito protetor do LPS. CONCLUSÃES: LPS protege contra a LG por INDO, atravÃs da inibiÃÃo da IN por uma diminuiÃÃo da adesÃo de leucÃcitos ao endotÃlio e por um aumento dos nÃveis de GSH no estÃmago. Este evento dependente da abertura de KATP. Nossos dados tambÃm sugerem que a atividade de COX-2 e NOSi nÃo estÃo envolvidos no efeito protetor do LPS. / INTRODUCTION: The role of the LPS in the defense of the gastric mucosa is still not established. AIMS: To verify the protective effect of the LPS in the gastric damage (GD), in the neutrophil infiltration (NI), in the increase of the leukocyte of adhesion, in the reduction of the induced glutathione levels for indomethacin (INDO) in rats and to investigate the role of the COX-2, NOSi and of ATP-sensitive k channels (KATP) in the protective effect of LPS administration on INDO- induced gastropathy. METHODS: The rats were treated with LPS of E. coli (30, 100 or 300 mg/Kg, e.v.). After 6 hs, INDO was administrated (20mg/Kg, p.o.). 3 hs later, the blood was harvested for determination the total and differential number of white blood cell counts. Later, the rats had been sacrificed and the GD was surveyed. Piece of the stomach had been removed for evaluation of the MPOactivity and determination of the GSH levels. The adhesion and rolling of the leukocytes had been evaluated by intravital microscopy. Different groups were treated with rofecoxib, L-NAME, aminoguanidine, dexamethasone, glibenclamide, diazoxide or glibenclamide + diazoxide. After 3 hs of the administration of INDO (20mg/Kg, p.o.), had been evaluated the GD, MPO and GSH. RESULTS: LPS reduced dose- dependently INDO- induced GD and increase in MPO, with the maximal effect at the dose of 300 &#61549;g/kg and in the time of 6 hs. The LPS treatment neutrophilia induced in INDO induced gastropathy. LPS reverted to the fall of the GSH levels in the stomach with INDO. The LPS treatment decreased the adhesion and increased rolling of the leukocytes when compared with the INDO treated. Rofecoxib, L-NAME, aminoguanidine or dexamethasona had not reverted the protective effect of the LPS. Glibenclamide, but not diazoxide, reverted the protective effect of the LPS in the induced gastropathy for INDO, increasing of significant form the GD, MPO and decreasing the GSH. The diazoxide + glibenclamide association of with did not revert the protective effect of the LPS. CONCLUSIONS: LPS protects against INDO induced GD, through the inhibition of the NI for a reduction of the adhesion of leukocytes to the endothelin and for an increase of the GSH levels in the stomach. This dependent event of the KATP opening. Our data also suggest that the activity of COX-2 and NOSi are not involved in the protective effect of the LPS.