Cinco linhagens bacteriocinogênicas foram selecionadas quanto às suas propriedades sensoriais e tecnológicas em leite. Somente Lactococcus lactis ssp. lactis CTC204 apresentou as características (baixa acidificação e proteólise) adequadas para a fabricação de queijo Minas Frescal. Contudo, a baixa atividade da bacteriocina (3x102UA.mL-1) inviabilizou a sua utilização como bioconservante para a produção in situ no queijo. Estudos para obtenção de um bio-ingrediente foram conduzidos. A atividade da bacteriocina foi maior em leite adicionado com extrato de levedura e glicose (1,3x104UAmL-1) comparado com prebioticos (fruto-oligiossacarideo e inulina). A secagem em Spray-drier originou um bio-ingrediente com atividade de 1,3x105UAmL-1. Listeria monocytogenes ATCC7644 (4,0LogUFC.mL-1) foi inoculada nos queijos obtidos por acidificação do leite pasteurizado e microfiltrado. A contagem aumentou 6,2LogUFC.gL-1 e 2LogUFC.gL-1 no 15° e 21º dia de estocagem a 6±1°C, respectivamente, nos queijos sem e com adição de 10% do bio-ingrediente. Portanto, inibição de 4,2 LogUFC.g-1 do patógeno no 15° dia de estocagem. / Among the five bacteriocin-producing lactic bacteria strains tested, only Lactococcus lactis subsp. cremoris CTC 204 presented suitable sensory and technological properties for Minas Frescal cheesemaking process. However, because of the low yield of bacteriocin production in milk (3.0x102 AU.mL-1), its use as biopreservative for in situ production in cheese was impractical. We carried out experiments to obtain a bioingredient. Bacteriocin activity was higher in milk supplemented with glycose and yeast extract (1.3x104 AU.mL-1) compared to probiotics (fructooligosaccharides and inulin). Spray drying fermented milk originated a bioingredient presenting activity of 1.3x105 AU.mL-1. Population count of Listeria monocytogenes ATCC 7644, inoculated (4.0 Log CFU.mL-1) in cheese produced by direct acidification of pasteurized microfiltered milk, reached 6.2 Log CFU.g-1 and 2.0 Log CFU.g-1 at day 15 of storage at 6±1°C, in cheese without and with addition of 10% of bioingredient, respectively, therefore presenting pathogen inhibition of 4.2 Log CFU.g- 1 at day 15 of storage.

Die antimikrobielle Wirkung eines Pflanzenextraktes aus fermentiertem Rooibos (Aspalathus linearis) und eines Extraktes aus Hopfen (Humulus lupulus) auf Milchsäurebildner (Lactobacillus spp., Carnobacterium spp., Leuconostoc carnosum), Verderbniserreger (Bacillus spp., Brochothrix spp., Pseudomonas fluorescens) und pathogene Mikroorganismen (Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidis) wird unter In-vitro-Bedingungen über einen Lagerungszeitraum von 28 Tagen bei Temperaturen von 10 °C und 25 °C untersucht. In den sich anschließenden Challengeversuchen wird evaluiert, ob sich die antimikrobiellen Wirkungen beider Pflanzenextrakte gegen Listeria monocytogenes auf die Lebensmittelmatrix Rotschmierkäse übertragen lassen. Mögliche herstellungsbedingte und sensorische Probleme aufgrund der Anwendung der Pflanzenextrakte im Lebensmittel „Weichkäse“ werden erörtert. Die Ausgangskeimzahl beträgt je Keim 102–103 KbE/ml. Der Rooibosextrakt wird in einer Konzentration von 5 mg/ml zugesetzt und der Hopfenextrakt in einer Konzentration von 30 µg/ml. Unter In-vitro-Bedingungen ist eine statistisch abgesicherte bakteriostatische Wirkung des Rooibosextraktes auf Listeria monocytogenes bei einer Lagerungstemperatur von 10 °C in den ersten 14 Tagen nachweisbar. Die Reduzierung der Verderbniserreger in den ersten 24 Stunden nach Zugabe des Rooibosextraktes bei beiden Lagerungstemperaturen bzw. der Milchsäurebildner bei 25 °C ist statistisch nicht abzusichern und bei den weiteren Probenahmen nicht mehr darstellbar. Der Rooibosextrakt hat keine nachweisbare antibakterielle Wirkung auf Salmonella Enteritidis. Alle grampositiven Testkeime lassen sich durch die Zugabe des Hopfenextaktes statistisch signifikant in ihrem Wachstum beeinflussen. Eine antibakterielle Aktivität des Hopfens zeigt sich bei Listeria monocytogenes in einer verlängerten lag-Phase und anschließendem bakteriostatischen Effekt bei 10 °C. Der Hopfenextrakt hat keinerlei Wirkung auf die gramnegativen Teststämme Pseudomonas fluorescens und Salmonella Enteritidis. Der Extrakt aus Hopfen zeigt auch in der Lebensmittelmatrix Rotschmierekäse eine signifikante Wachstumshemmung auf Listeria monocytogenes. Der Extrakt aus fermentierten Rooibos zeigt keinen antilisteriellen Effekt. Beide Pflanzenextrakte beeinflussen leicht die sensorischen Eigenschaften der Käse, die Käsereifung nicht. Erstmals liegen antibakterielle In-vitro-Studien der getesteten Pflanzenextrakte gegen lebensmittelrelevante Mikroorganismen über 28 Tage vor. Eine Anwendung von Pflanzenextrakten als antimikrobieller Lebensmittelzusatz ist erst nach entsprechender Validierung im jeweiligen Einzelprodukt möglich.

Listeria monocytogenes est une bactérie à Gram positif impliquée dans des infections graves d’origine alimentaire. La plupart des cas de listériose humaine sont causés par la consommation d'aliments réfrigérés prêts à consommer. La capacité de ces bactéries à survivre et à se multiplier dans une large gamme de conditions difficiles fait de ce pathogène une des préoccupations majeures dans les industries agro-alimentaires. Ces propriétés de L. monocytogenes sont renforcées par son aptitude à former des biofilms. Le but de ce projet était d'explorer l'adaptation de ce pathogène à la déshumidification et aux basses températures par deux approches de protéomique. La première approche, basée sur la technique d’imagerie par spectrométrie de masse (IMS) MALDI-TOF, permet de réaliser la cartographie de molécules à partir d'échantillons biologiques. Ce travail a consisté à développer cette approche, en considérant un biofilm bactérien comme un tissu, afin d’accéder à des informations sur la distribution de protéines dans des biofilms de L. monocytogenes soumis à un stress de déshumidification. En outre, une approche LC-MS/MS a été utilisée pour relier les données spectrales d’intérêt obtenues par l'IMS et l'identification des protéines. L’IMS a permis d'examiner la distribution de 47 protéines de bas poids moléculaire dans les biofilms. Cinq protéines ont été identifiées par LC-MS/MS grâce aux données m/z de l’IMS, y compris deux protéines de choc thermique. Les résultats démontrent que l'IMS peut être utilisée pour disséquer le protéome spatial d'un biofilm bactérien. La deuxième approche protéomique a consisté en une comparaison semi-quantitative relative et sans marquage (shotgun proteomic) des protéines exprimées dans différentes conditions de culture. Par cette méthode, nous avons exploré l’expression protéique en fonction du mode de croissance (biofilm vs planctonique) et de la température (10°C, 25°C et 37°C). Parmi les 920 et 931 protéines uniques identifiées, provenant respectivement de cellules sessiles et planctoniques, beaucoup sont liées à des fonctions cellulaires de base, mais certaines sont liées à la thermorégulation. Des changements ont été observés dans le protéome de L. monocytogenes en biofilm par rapport aux cellules planctoniques, ce qui indique des modes de régulation différents selon le mode de croissance. Ces comparaisons de l'expression des protéines dans plusieurs conditions (modes de croissance, températures) enrichiront les bases de données et aideront à modéliser les circuits de régulation qui conduisent à l'adaptation de L. monocytogenes aux environnements. / Listeria monocytogenes is a Gram-positive bacterium implicated in serious food-borne infections. Most cases of human listeriosis are caused by the consumption of refrigerated ready-to-eat foods. The ability of these bacteria to survive and multiply in a wide range of harsh conditions make this pathogen a major concern in agro-food industries. These properties of L. monocytogenes are enhanced by its ability to form biofilms. The aim of this project was to explore the adaptation of this pathogen to dehumidification and low temperatures by two proteomic approaches. The first approach, based on the MALDI-TOF mass spectrometry imaging (IMS), allows the mapping of molecules from biological samples. This work aimed to develop this approach, considering a bacterial biofilm as a tissue, in order to access information on the distribution of proteins in L. monocytogenes biofilms subjected to a dehumidification stress. In addition, an LC-MS/MS approach was used to link spectral data of interest obtained by IMS and protein identification. The IMS allowed to examine the distribution of 47 low molecular weight proteins within the biofilms. Five identified proteins were assigned by LC-MS/MS using IMS m/z data, including two cold-shock proteins. The results demonstrate that imaging can be used to dissect the spatial proteome of a bacterial biofilm. The second proteomic approach consisted on a relative semi-quantitative label-free (shotgun proteomic) comparison of proteins expressed under different culture conditions. With the method, we explored protein expression according to the mode of growth (biofilm vs planktonic) and temperature (10°C, 25°C and 37°C). Throughout the 920 and 931 unique proteins identified, from sessile and planktonic cells, respectively, many are connected to basic cell functions, but some are linked with thermoregulation. A shift was observed in the proteome of L. monocytogenes biofilms compared to planktonic cells indicating different patterns of regulation according to the mode of growth. These comparisons of protein expression throughout several conditions (mode of growth and temperatures) will enrich databases and help to model regulatory circuitry that drives adaptation of L. monocytogenes to environments.

Listeria monocytogenes est un pathogène intracellulaire facultatif responsable d’une infection sévère d’origine alimentaire, la listériose. L’étude du processus d’infection cellulaire de cette bactérie a permis d’élucider divers mécanismes impliqués dans les interactions hôte-pathogène et dans le fonctionnement de la cellule eucaryote. En particulier, L. monocytogenes a été l’un des modèles pionniers dans la découverte du ciblage de la chromatine et de régulateurs nucléaires par des microbes. L’étude d’un facteur de virulence de L. monocytogenes, LntA, a permis l’identification d’un de ces régulateurs : BAHD1. En recrutant des protéines impliquées dans la formation de l’hétérochromatine, telles HDAC1/2 et HP1, BAHD1 stimule la formation d’une chromatine compacte à effet répressif. Lors d’une infection de cellules épithéliales par L. monocytogenes, BAHD1 réprime la réponse immunitaire stimulée par les interférons, une fonction inhibée par LntA. BAHD1 demeurant peu étudiée, mon doctorat a eu pour premier objectif de poursuivre la caractérisation de ce régulateur épigénétique. Par ailleurs, des données préliminaires suggéraient qu’un facteur de virulence de Listeria récemment découvert, InlP, avait la potentialité d’être, comme LntA, une nucléomoduline. Mon deuxième objectif a été d’explorer cette hypothèse.Les résultats de mon premier axe montrent que BAHD1 interagit avec MIER1 et que cette interaction est cruciale pour l’association de BAHD1 aux HDAC1/2. Nous reportons également que BAHD1 modifie la chromatine en changement la méthylation et l’acétylation des histones, ainsi que la méthylation de l’ADN, au niveau d’un gène cible, ESR1. Ces résultats nous permettent de proposer que BAHD1 forme, avec MIER1, un échafaudage assemblant un nouveau complexe de remodelage de la chromatine associé aux HDAC1/2 : le complexe BAHD1. Nous avons ensuite étudié un rôle de BAHD1 dans un organe ciblé par la Listeria, le cerveau. Nos résultats indiquent qu’une déficience totale en BAHD1 altère le transcriptome global de cet organe chez la souris. Les gènes majoritairement surexprimés sont impliqués dans des fonctions du système nerveux, le métabolisme et des troubles neurologiques. Les gènes majoritairement sous-exprimés sont impliqués dans des voies de l’immunité innée, dont des gènes de réponses aux interférons. Par ailleurs, une haplo-déficience en Bahd1 provoque des troubles comportementaux. En comparaison des souris Bahd1+/+, les souris Bahd1+/- souffrent d’une anxiété accrue et d’altérations du réflex de sursaut acoustique. Ces résultats suggèrent qu’une dérégulation de BAHD1, par des stimuli de l’environnement ou par des stimuli infectieux, pourrait avoir des effets neuro-pathologiques.Le second axe de ma thèse concernait l’étude des interactions d’InlP avec des protéines nucléaires de l’hôte, identifiées par un crible double-hybride. Nous montrons d’abord qu’InlP est une internaline atypique, avec des répétitions riches en leucine caractérisées par un motif LPX2. Nous identifions, ensuite, deux protéines nucléaires ciblées par InlP : le facteur d’épissage et suppresseur de tumeur RBM5 et le corépresseur RERE. Quand InlP est produite de façon ectopique dans les cellules humaines, elle se localise dans le noyau, où elle altère la formation de corps nucléaires enrichis en RERE. Dans des cellules sur-exprimant RBM5, InlP inhibe l’effet pro-apoptotique de RBM5 et stimule la formation de corps nucléaires denses associés à RBM5. Ces résultats suggèrent qu’InlP est une nucléomoduline agissant sur la l’assemblage et le désassemblage de compartiments de stockage de protéines cibles impliquées dans la synthèse et l’épissage d’ARNs de l’hôte.Ce travail ouvrent des perspectives dans la compréhension des interactions hôte-pathogène et dans une meilleure connaissance des mécanismes patho-épigénétiques, ainsi qu’en biologie cellulaire, dans la compréhension de la dynamique des organites nucléaires sans membrane. / Listeria monocytogenes is an optional intracellular pathogen responsible for a severe foodborne infection called listeriosis. The study of the cellular infection process of this bacterium has shed light on various mechanisms involved in host-pathogen interactions and in the functioning of the eukaryotic cell. In particular, L. monocytogenes has emerged as one of the pioneering models in the discovery of microbial targeting of chromatin and nuclear regulators. The study of a virulence factor of L. monocytogenes, LntA, allowed the identification of one of these regulators : BAHD1. By recruiting proteins involved in the formation of heterochromatin, such as HDAC1/2 and HP1, BAHD1 stimulates the formation of a compact chromatin with a repressive effect. When epithelial cells are infected with L. monocytogenes, BAHD1 suppresses the immune response stimulated by interferons, a function inhibited by LntA. Since BAHD1 is still under-researched, the first objective for my thesis was to further characterize this epigenetic regulator. In addition, preliminary data suggested that a recently discovered virulence factor of Listeria, InlP, had the potential to be, like LntA, a nucleomodulin. My second objective was to explore this hypothesis.The results of my first axis show that BAHD1 interacts with MIER1 and that this interaction is crucial for the association of BAHD1 with HDAC1/2. We also report that BAHD1 modifies chromatin by changing histone methylation and acetylation, as well as DNA methylation, at a target gene, ESR1. These results allow us to propose that BAHD1 form, with MIER1, a scaffold assembling a new chromatin remodeling complex associated with HDAC1/2 : the BAHD1 complex. We then studied the role of BAHD1 in an organ targeted by Listeria, the brain. Our results indicate that a total deficiency in BAHD1 alters the overall transcriptome of this organ in mice. Most of the overexpressed genes are involved in nervous system functions, metabolism and neurological disorders. The predominantly downregulated genes are involved in innate immunity pathways, including interferon response genes. In addition, a haplodeficiency in Bahd1 causes behavioral problems. Compared to Bahd1+/+ mice, Bahd1+/- mice suffer from increased anxiety and changes in acoustic startle reflex. These results suggest that deregulation of BAHD1, through environmental or infectious stimuli, may have neuro-pathological effects.The second axis of my thesis focused on the study of InlP interactions with host nuclear proteins, identified by a double-hybrid screen. First, we show that InlP is an atypical internalin, with leucine-rich repeats characterized by an LPX2 motif. We then identify two nuclear proteins targeted by InlP: the splicing factor and tumor suppressor RBM5 and the corepressor RERE. When InlP is produced ectopically in human cells, it is localized in the nucleus, where it alters the formation of nuclear bodies enriched in RERE. In RBM5-overexpressing cells, InlP inhibits the pro-apoptotic effect of RBM5 and stimulates the formation of dense nuclear bodies associated with RBM5. These results suggest that InlP is a nucleomodulin acting on the assembly and disassembly of target protein storage compartments involved in the synthesis and splicing of host RNAs.This work opens perspectives in the understanding of host-pathogen interactions and in a better knowledge of patho-epigenetic mechanisms, as well as in cell biology and the understanding of membraneless nuclear organelles dynamics.

Les composés phénoliques pourraient être de bons candidats pour assurer la qualité et la sécurité des produits périssables tels que les aliments prêts-à-consommer. Très répandus dans les plantes et les co-produits agro-industriels, ils peuvent limiter l’oxydation de lipides insaturés d’intérêt nutritionnel (omega-3, dont DHA et EPA) et le développement de bactéries pathogènes alimentaires telles que Listeria monocytogenes.L'objectif de cette thèse est d'évaluer la double activité antioxydante et antimicrobienne de ces composés phénoliques dans des milieux alimentaires complexes et de mieux comprendre les mécanismes d'action associés.L’étude en milieux modèles a tout d’abord permis de mettre en évidence des relations structure-activités et de décrypter certains mécanismes d’action mettant en jeu des paramètres tels que le nombre et l’environnement chimique des groupements phénoliques, le logP, les formes dissociées / non dissociées des acides phénoliques. Les performances de trois composés sélectionnés (eugénol, acide férulique et α-tocophérol) ont ensuite été évaluées dans des milieux alimentaires complexes plus réalistes : des émulsions h/e composées d'huile de poisson, d’une phase aqueuse et de protéines de lactosérum ou Tween 80 en tant qu'émulsifiant. L’acide férulique ne présente aucune activité antioxydante mais peut inhiber le développement de L. monocytogenes. En revanche, l’eugénol et l’α-tocophérol sont de bons antioxydants dans les émulsions à base de protéines de lactosérum alors qu’ils n’y sont pas antimicrobiens. Quelques mécanismes d’action sont proposés pour expliquer ces comportements. / Phenolic compounds appear to be good candidates for ensuring the quality and safety of several perishable products like ready-to-eat food. Widely found in plants and byproducts from agro-industries, they offer a potential solution to limit the oxidation of omega-3 polyunsaturated fatty acids (e.g. DHA and EPA) and the growth of foodborne pathogens such as Listeria monocytogenes.The aim of this PhD is to evaluate dual antioxidant and antimicrobial activity in complex food media and to better understand the associated mechanisms of action.First experiments carried out with a series of phenolic compounds in simple model media confirmed this dual efficiency.Interesting structure/activity relationships were highlighted and some mechanisms of action were decrypted, involving parameters like number and chemical environment of phenolic groups, logP, dissociated/undissociated forms of phenolic acids. The performances of three selected phenolic compounds, i.e. eugenol, ferulic acid and α-tocopherol (added alone or as a mixture), were evaluated in more realistic complex food media: o/w emulsions composed of fish oil, aqueous phase and whey proteins or Tween 80 as emulsifiers. Ferulic acid shows no antioxidant activity but can inhibit the development of L. monocytogenes. In contrast, eugenol and α-tocopherol are good antioxidants but not antimicrobials in emulsions formulated with whey proteins. Mechanisms of action are proposed to explain these behaviors.

Numerous examples of non-linear survival curves, plotted as log surviving cells vs. time, for bacteria exposed to heat have been reported. Factors which may affect the shape of a survival curve and the heat resistance of bacteria include temperature, pH, and NaCl concentration. Many studies have examined the effect of these factors individually, but little information exists on the combined effects. The objective of this study was to mathematically model non-linear survival curves to account for these factors and their interactions simultaneously. Heat resistance of <u>Listeria monocytogenes</u>(L. <u>monocytogenes</u>) was determined in O.lM KH₂P0₄ buffer and in infant formula at three temperatures (50, 55, and 60 C), three pH levels (5, 6, and 7), and three NaCl concentrations (0, 2, 4%). Survival curves were fit using linear regression, non-linear regression with a modified logistic equation, and non-linear regression with a modified Gompertz equation. / Ph. D.

<p>Glavni cilj doktorske disertacije bio je ispitivanje op&scaron;tih odlika industrijski proizvedenih, fermentisanih suvih kobasica u Srbiji i mogućnost dodatnog unapređenja njihove mikrobiolo&scaron;ke bezbednosti. Ispitivani su mikrobiolo&scaron;ki i fizičko-hemiijski pokazatelji u industrijskom proizvodnom lancu sremske kobasice i sudžuka, tipičnih fermentisanih suvih kobasica od svinjskog i goveđeg mesa. U sremskoj kobasici praćeno je prisustvo Salmonella а Escherichia coli O157 u sudžuku. Ispitane su i promene glavnih grupa mikrobiota, pH i aw vrednosti i hemijski sastav proizvoda. Mikrobiolo&scaron;ka kontaminacija u početnim koracima proizvodnje bila je uglavnom visoka. Salmonela je ustanovljena u fazi pripreme nadeva u dva od tri proizvodna pogona, dok je E. coli O157 potvrđena u jednom uzorku usitnjenog mesa i masnog tkiva jednog proizvodnog pogona. Rezultati ispitivanja proizvodnje kobasica slični su rezultatima istraživanja u drugim zemljama. Svi uzorci gotovih sremskih kobasica bili su zadovoljavajućeg nivoa mikrobiolo&scaron;kog kvaliteta, dok većina uzoraka sudžuka nije bila zadovoljavajuća. Početno prisustvo alimentarnih patogena može se smatrati bezbednosnim rizikom.<br />Preživljavanje Salmonella Тyphimurium, Escherichia coli O157 i Listeria monocytogenes tokom proizvodnje i skladi&scaron;tenja inokulisane, sremske kobasice i sudžuka, praćeno je u drugoj fazi istraživanja. Smanjenje brojnosti sva tri patogena u skladu je sa literaturnim podacima i može se zaključiti da postupci uobičajeno primenjeni u industrijskoj proizvodnji sremske kobasice i sudžuka ne osiguravaju uvek, u dovoljnoj meri, mikrobiolo&scaron;ku bezbednost proizvoda. Ispitiana je i mogućnost pasterizacije u cilju redukcije navedenih patogena u kobasicama od svinjskog, odnosno, goveđeg mesa, uz ocenu senzorskog kvaliteta proizvoda. Rezultati su pokazali da Salmonella Typhimurium i E. coli O157 mogu da budu uklonjene pasterizacijom gotovih fermentisanih suvih kobasica а dа senzorske odlike proizvoda i dalje оstanu prihvatljive. L. monoctogenes se pokazala kao patogen koji je značajno otporniji na zagrevanje, u oba tipa kobasica, zbog čega su potrebna dalja istraživanja radi redukcije dо prihvatljivog nivoa.</p> / <p>Glavni cilj doktorske disertacije bio je ispitivanje op&scaron;tih odlika industrijski proizvedenih, fermentisanih suvih kobasica u Srbiji i mogućnost dodatnog unapređenja njihove mikrobiolo&scaron;ke bezbednosti. Ispitivani su mikrobiolo&scaron;ki i fizičko-hemiijski pokazatelji u industrijskom proizvodnom lancu sremske kobasice i sudžuka, tipičnih fermentisanih suvih kobasica od svinjskog i goveđeg mesa. U sremskoj kobasici praćeno je prisustvo Salmonella a Escherichia coli O157 u sudžuku. Ispitane su i promene glavnih grupa mikrobiota, pH i aw vrednosti i hemijski sastav proizvoda. Mikrobiolo&scaron;ka kontaminacija u početnim koracima proizvodnje bila je uglavnom visoka. Salmonela je ustanovljena u fazi pripreme nadeva u dva od tri proizvodna pogona, dok je E. coli O157 potvrđena u jednom uzorku usitnjenog mesa i masnog tkiva jednog proizvodnog pogona. Rezultati ispitivanja proizvodnje kobasica slični su rezultatima istraživanja u drugim zemljama. Svi uzorci gotovih sremskih kobasica bili su zadovoljavajućeg nivoa mikrobiolo&scaron;kog kvaliteta, dok većina uzoraka sudžuka nije bila zadovoljavajuća. Početno prisustvo alimentarnih patogena može se smatrati bezbednosnim rizikom.<br />Preživljavanje Salmonella Typhimurium, Escherichia coli O157 i Listeria monocytogenes tokom proizvodnje i skladi&scaron;tenja inokulisane, sremske kobasice i sudžuka, praćeno je u drugoj fazi istraživanja. Smanjenje brojnosti sva tri patogena u skladu je sa literaturnim podacima i može se zaključiti da postupci uobičajeno primenjeni u industrijskoj proizvodnji sremske kobasice i sudžuka ne osiguravaju uvek, u dovoljnoj meri, mikrobiolo&scaron;ku bezbednost proizvoda. Ispitiana je i mogućnost pasterizacije u cilju redukcije navedenih patogena u kobasicama od svinjskog, odnosno, goveđeg mesa, uz ocenu senzorskog kvaliteta proizvoda. Rezultati su pokazali da Salmonella Typhimurium i E. coli O157 mogu da budu uklonjene pasterizacijom gotovih fermentisanih suvih kobasica a da senzorske odlike proizvoda i dalje ostanu prihvatljive. L. monoctogenes se pokazala kao patogen koji je značajno otporniji na zagrevanje, u oba tipa kobasica, zbog čega su potrebna dalja istraživanja radi redukcije do prihvatljivog nivoa.</p> / <p>The main aim of this doctoral thesis was to investigate the general characteristics of industrially-produced Serbian dry fermented sausages and the possibility of further improving their microbiological safety. Microbiological and physicochemical indicators were studied along the industrial production chains producing Sremska and Sudzuk sausage, typical of dry, fermented sausage prepared from pork or beef, respectively. The occurrences of Salmonella in pork sausages, and of Escherichia coli O157 in beef sausages were determined. Changes in the main groups of microbiota, pH, aw values and the chemical composition of the products were evaluated. Microbiological contamination in the initial stages of production was generally high. Salmonella was confirmed from the batter-preparation phase in two of three production lines, while E. coli O157 was confirmed in one sample of meat and fatty tissue from one production line. The results of this investigation of sausage production were similar to results obtained in other countries. All samples of finished pork sausage were of acceptable microbiological quality, while the majority of beef sausage samples were not microbiologically acceptable. The initial presence of foodborne pathogens can be considered a food safety risk.<br />The survival of Salmonella Тyphimurium, Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes during production and storage of inoculated pork and beef sausages was determined in the second phase of the investigation. All three pathogens declined in numbers in accordance with data from the literature, and it can be concluded that normal measures for pork and beef sausage preparation in industrial production do not always ensure, to a suitable level, the microbiological safety of the products. The possibility of pasteurising finished pork and beef sausages, with the aim of reducing Salmonella Typhimurium and E. coli O157, respectively, was investigated, and at the same time, sensory evaluation of product quality was performed. The results showed that pasteurisation eliminated Salmonella Typhimurium and E. coli O157 from finished dry fermented sausages, while sensory qualities of the products remained acceptable. L. monoctogenes proved to be a significantly more heat-resistant pathogen in both types of sausage, and therefore, further research is required to determine how to reduce numbers of this pathogen to acceptable levels.</p>

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène impliquée dans la toxi-infection alimentaire à l’origine de la listeriose, une maladie peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25 % chez l’homme. Cette bactérie est capable de former un biofilm lui permettant de mieux résister aux stress environnementaux ainsi qu’aux traitements de décontamination. Une nouvelle stratégie d’analyse génomique a été développée et a permis de cibler des systèmes de sécrétion et des protéines potentiellement impliqués dans la formation de biofilm. L’inactivation de la voie SecA2 entraîne la formation d’un biofilm aérien et par conséquent fragile. Ce morphotype est capable de croître de façon sessile à 20°C sur du polystyrène alors que ce n’est pas le cas pour la souche sauvage. De nouvelles protéines sécrétées de façon SecA2 dépendante ont été identifiées par l’étude de l’exoprotéome du mutant ΔsecA2 en comparaison avec celui de la souche sauvage. Le rôle des lipoprotéines dans la formation de biofilm ainsi que leur maturation par les peptidases signal de type II, LspA et LspB, a également été abordé. La combinaison d'une analyse de l’expression des gènes codant les lipoprotéines au cours de la formation de biofilm avec l’analyse génomique basé sur le sécrétome a permis de cibler trois lipoprotéines, dont LpeA qui serait impliquée dans les phases tardives de formation de biofilm. Enfin, l’importance majeure de LspA dans la maturation des lipoprotéines, a été mise en évidence par l’étude de l’exoprotéome des doubles mutant ΔlgtΔlspA et ΔlgtΔlspB en comparaison avec celui de Δlgt. / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogenic bacteria responsible for listeriosis, a rare but high mortality rate disease in humans (25 %). This bacterium can form biofilm allowing a better resistance to environmental stresses as well as decontamination treatments. A new strategy for genomic analysis was developed and allowed to target secretion systems and proteins potentially involved in biofilm formation. Inactivation of the SecA2 pathway leads to the formation of an aerial and fragile biofilm. This morphotype is able to grow in a sessile mode at 20 °C on polystyrene whereas this is not the case for the wild type strain. New proteins secreted in a SecA2 manner were identified by comparing the ΔsecA2 exoproteome to the one of the wild type. The role of lipoproteins in biofilm formation and their maturation by the signal peptidase II, LpsA and LspB, was also tackled. Combining expression analysis of genes encoding lipoproteins during biofilm formation with genomic analysis based on the secretome allowed targeting three lipoproteins, including LpeA, which appeared to be involved in the later stages of biofilm formation. Finally, the importance of LspA in the maturation of lipoproteins,was highlighted by comparing of the double mutant ΔlgtΔlspA and ΔlgtΔlspB exoproteomes to the one of Δlgt.

Les bénéfices attribués aux probiotiques sont nombreux : effets bénéfiques sur le microbiote intestinal, confort digestif, modulation du système immunitaire et prévention des infections intestinales. Ces effets divers et variés sont souches-spécifiques. Actuellement, de nombreuses études visent à mieux caractériser ces effets probiotiques.Ces travaux avaient pour objectif de déterminer et d’analyser les effets probiotiques de trois souches de la collection Danone : la souche de Lactobacillus paracasei CNCM I-3689, la souche de L. rhamnosus CNCM I-3690 ainsi que la souche de Bifidobacterium animalis subps. lactis CNCM I-2494. Dans un premier temps, leurs effets ont été caractérisés dans des modèles in vitro pour des propriétés anti-pathogènes, des propriétés d’immuno-modulation ainsi que pour des propriétés de protection de la barrière épithéliale intestinale. Dans un second temps, leurs effets de la protection de la barrière ont été confirmés dans un modèle murin de faible inflammation.Une analyse des mécanismes sous-jacents à ces effets à la fois chez la souche probiotique et chez l’hôte a été initiée par la construction et l’analyse fonctionnelle de banques génomiques bactériennes ainsi que par l’étude de la modulation des gènes impliqués dans le maintien de la barrière intestinale chez l’hôte. / Health benefits of probiotic bacteria are numerous: beneficial effects on the intestinal microbiota, digestive comfort, modulation of the immune system and prevention of winter infection. These diverse and various effects are strain-specific. Nowadays, numerous studies aim at better characterizing those probiotics effects.This project aimed at identifying and analyzing the probiotic effects of three strains from Danone collection: Lactobacillus paracasei CNCM I-3689, L. rhamnosus CNCM I-3690 and Bifidobacterium animalis subsp. lactis CNCM I-2494. First, their effects were assessed in in vitro models for immunomodulation properties, antipathogens activity and intestinal barrier protection. Secondly, their beneficial effects were confirmed in low-grade inflammation murine model.The analysis of the underlying mechanisms has been initiated both in the bacterial strains by the construction and the functional analysis of genomic libraries and in the host by measuring the modulation of the genes involved in the intestinal barrier maintain.

Certaines pratiques agricoles telles que l’épandage de produits résiduaires organiques (PRO) ou l’irrigation des sols peuvent être à l’origine de l’introduction de bactéries pathogènes de l’Homme dans les sols. Le sol joue alors un rôle central dans la dissémination de ces bactéries pathogènes dans les différents compartiments de l’environnement et peut contaminer les matières premières végétales, les animaux d’élevage mais également les ressources en eau. Le risque sanitaire associé à la dissémination de ces bactéries pathogènes doit être évalué afin de limiter le développement de maladies infectieuses. Dans ce contexte, l’incidence et le potentiel de survie de bactéries pathogènes a été étudié dans un large ensemble de sols provenant du territoire français (Réseau de Mesure de la Qualité des Sols : RMQS). Ce travail a pour objectif général d’identifier les facteurs biotiques et abiotiques des sols qui déterminent l’incidence et la survie de d’un pathogène strict, Listeria monocytogenes, et d’un pathogène opportuniste, Enterococcus faecalis, dans ces matrices environnementales Pour ceci, 2 approches ont été adoptées : la première approche a visé à mettre au point des systèmes de détection de PCR quantitative spécifiques pour ces deux espèces bactériennes afin de détecter et quantifier ces 2 bactéries dans un ensemble de 1200 ADN de sols présentant des paramètres pédoclimatiques contrastés. L. monocytogenes n’est pas détectée dans les ADN de sols avec la méthode moléculaire développée, dont le seuil de détection est d’environ 104 bactéries par gramme de sol. La détection moléculaire d’E. faecalis a été biaisée par un problème de contamination des ADN extraits. Après extraction de nouveaux ADN sur 150 échantillons de sol, E. faecalis a été détecté en faible quantité dans 5 des 150 sols testés (4% des sols) à des concentrations d’environ 102 bactéries par gramme de sol. Dans une deuxième approche, la survie de L. monocytogenes et d’E. faecalis a été suivie dans un ensemble de 100 sols caractérisés par des paramètres pédoclimatiques variables. Des microcosmes de sols ont été inoculés et la survie bactérienne a été évaluée par des méthodes culturales classiques. L. monocytogenes survit à long terme dans un plus grand nombre de sols qu’E. faecalis. Les sols favorables à la survie à long terme sont majoritairement (44%) les mêmes pour les 2 bactéries. Les sols sableux présentant un pH acide sont défavorables à la survie des 2 bactéries. Cependant des différences sont observées quant aux paramètres physico-chimiques des sols qui déterminent la survie de ces 2 bactéries. Ainsi, la survie de L. monocytogenes est corrélée positivement au taux de saturation en cations basiques, à la capacité d’échange cationique et à la concentration en calcium pour le court terme et à la teneur en argile pour le long terme. En revanche, pour E. faecalis, une corrélation négative avec la teneur en calcium total est trouvée pour la survie à court terme alors que la survie à long terme est négativement corrélée à la concentration en phosphore assimilable. Un effet inhibiteur de la microflore des sols a été mis en évidence sur la survie de L. monocytogenes et E. faecalis : il est statistiquement significatif pour les sols présentant un pH supérieur à 7 pour les 2 pathogènes. Les résultats obtenus vont permettre de modéliser la survie de ces pathogènes dans les sols en fonction de paramètres pédo-climatiques et donc à terme de mieux gérer les épandages de PRO en fonction des types de sols pour limiter la persistance de pathogènes dans les sols. / Soil contamination by bacterial pathogens can occur through manure, sewage sludge spreading or irrigation using waste water treatment plants effluents. Agricultural soils may act as reservoirs for these pathogens, play a significant role in their dissemination, leading to the potential contamination of food and water resources. Health risk associated with the occurrence of pathogens in environmental matrices has to be thoroughly evaluated. In this context, the objectives of this work were: i) to determine the prevalence of two pathogenic bacterial species (Listeria monocytogenes and Enterococcus faecalis) in a large collection of French soils originated from a systematic soil survey of the territory, called RMQS (16x16 km grid), ii) to determine major biotic and abiotic parameters driving the survival of bacterial pathogens in soils. Two approaches were used to reach these objectives: i) the prevalence of the two pathogens was monitored in 1200 soils using specific molecular detection tools (real time PCR using TaqMan probe detection system) and ii) the survival of the 2 pathogens, inoculated in soil microcosms, was determined over a 84 days incubation period under laboratory conditions, on a subset of 100 soils from the RMQS survey, using classical microbiological methods. L. monocytogenes was not detected in the set of 1200 soils (with a detection limit estimated to be 104 bacteria per gram of soil) using the molecular detection method, while E. faecalis was detected in approximately 4% of the soils tested (on a smaller set of 150 RMQS soils). The two bacterial pathogens were able to survive in the majority of soil, although L. monocytogenes survived in a greater number of soils. Soils where both pathogens survived represented 44% of soils. The survival of both pathogens is strongly impaired in sandy acidic soils. However, textural and chemical parameters driving survival of the two pathogens differed: L. monocytogenes survival is increased in soils with higher BCSR (basic cation saturation ration) and CEC (cation exchange capacity). L. monocytogenes long-term survival is favored by higher soil clay content. E. faecalis survival is impaired in soils with high total Ca content (calcareous soils). Soil microflora inhibits survival of both pathogens especially in soil with alcaline pH’s. The results of our study will allow implementing survival models for these two pathogens. Such data is invaluable for a better and safer managment of soil manuring using various organic residues.