A leucemia linfóide aguda (LLA) é caracterizada pelo acúmulo de células imaturas da linhagem linfóide, na medula óssea, sangue periférico e órgãos linfóides, sendo seu pico de incidência por volta dos cinco anos de idade. O prognóstico da LLA é determinado pela idade, imunofenótipo e alterações moleculares sendo que estas últimas são de fundamental importância para a estratificação em grupos de risco. Nesse estudo, realizamos uma análise retrospectiva das características imunofenotípicas e moleculares, de 35 casos de LLA pediátrica, tratados em duas grandes Instituições da cidade de Porto Alegre. Os pacientes foram classificados de acordo com critérios morfológicos, citoquímicos e imunofenotípicos. Em relação ao imunofenótipo, 8,8% dos pacientes foram classificados como LLA pró-B, 67,6% LLAB (B-comum e pré-B) e 23,5% LLA-T. O imunofenótipo Pré-B CD10+ foi o mais comum. A freqüência dos principais genes de fusão de significância prognóstica, realizada por RT-PCR foi de 15% para a t(12;21)/TEL-AML1 (19% entre as LLA de linhagem B); 4% t(4;11)/MLL-AF4, 4% t(1;19)/E2A-PBX1 e 4% t(9;22)/BCR-ABL. Nossos resultados mostram a importância do estudo molecular e sugerem que crianças com LLA tratadas nas Instituições referidas, apresentam as mesmas características biológicas de outras regiões do Brasil e de países desenvolvidos, suportando o uso de protocolos de regimes terapêuticos similares. Assim, o aumento do número de pacientes de alto risco com LLA na infância, parece não estar relacionado a um excesso de anormalidades genéticas desfavoráveis, e sim uma consequência do diagnóstico tardio, como sugerido pelo excesso de casos de hiperleucocitose. Embora a LLA pediátrica apresente um elevado índice de cura, o desafio atual é a busca de melhores testes diagnósticos e novas estratégias terapêuticas, através do conhecimento de genes alvos, permitindo o tratamento individualizado e uma maior sobrevida para o paciente. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is characterized by the accumulation of immature cells of lymphoid lineage in the bone marrow, in the peripheral blood and lymphoid organs, with peak incidence around the age of five. The prognosis of ALL is determined by age, immunophenotype and molecular changes of which the latter have fundamental importance for determining the stratification in risk groups. In this study, we have conducted a retrospective analysis of immunophenotypic and molecular characteristics of 35 cases of pediatric ALL, treated at two major institutions of Porto Alegre city. Patients were classified according to morphological, cytochemical and immunophenotypical. Regarding the immunophenotype, 8.8% of patients were classified as pro-B ALL, 67.6% B-ALL (common B-and pre-B) and 23.5% T-ALL. The Pre-B immunophenotype CD10 + was the most common. The frequency of major fusion genes of prognostic significance performed by RT-PCR was 15% for a t(12;21)/TEL-AML1 (19% between the B-lineage ALL), 4% t (4;11)/MLL-AF4, 4% t(1;19)/E2A-PBX1 and 4% t(9;22)/ BCR-ABL. Our results show the importance of the molecular study and suggest that children with ALL that have been treated in those institutions have the same biological characteristics of the ones from other regions of Brazil and developed countries, what supports the use of similar therapeutic protocols. Thus, the increased number of high-risk patients with childhood ALL appears to be related to an excess of adverse genetic abnormalities, but as consequence of late diagnosis, as suggested by the excess of cases of hyperleucocytosis. Although pediatric ALL has a high cure rate, the current challenge is the search for better diagnostic tests and new therapeutic strategies through the knowledge of target genes enabling the individualized treatment and increased chances for patients to survive.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é caracterizada pelo acúmulo de células imaturas da linhagem linfóide, na medula óssea, sangue periférico e órgãos linfóides, sendo seu pico de incidência por volta dos cinco anos de idade. O prognóstico da LLA é determinado pela idade, imunofenótipo e alterações moleculares sendo que estas últimas são de fundamental importância para a estratificação em grupos de risco. Nesse estudo, realizamos uma análise retrospectiva das características imunofenotípicas e moleculares, de 35 casos de LLA pediátrica, tratados em duas grandes Instituições da cidade de Porto Alegre. Os pacientes foram classificados de acordo com critérios morfológicos, citoquímicos e imunofenotípicos. Em relação ao imunofenótipo, 8,8% dos pacientes foram classificados como LLA pró-B, 67,6% LLAB (B-comum e pré-B) e 23,5% LLA-T. O imunofenótipo Pré-B CD10+ foi o mais comum. A freqüência dos principais genes de fusão de significância prognóstica, realizada por RT-PCR foi de 15% para a t(12;21)/TEL-AML1 (19% entre as LLA de linhagem B); 4% t(4;11)/MLL-AF4, 4% t(1;19)/E2A-PBX1 e 4% t(9;22)/BCR-ABL. Nossos resultados mostram a importância do estudo molecular e sugerem que crianças com LLA tratadas nas Instituições referidas, apresentam as mesmas características biológicas de outras regiões do Brasil e de países desenvolvidos, suportando o uso de protocolos de regimes terapêuticos similares. Assim, o aumento do número de pacientes de alto risco com LLA na infância, parece não estar relacionado a um excesso de anormalidades genéticas desfavoráveis, e sim uma consequência do diagnóstico tardio, como sugerido pelo excesso de casos de hiperleucocitose. Embora a LLA pediátrica apresente um elevado índice de cura, o desafio atual é a busca de melhores testes diagnósticos e novas estratégias terapêuticas, através do conhecimento de genes alvos, permitindo o tratamento individualizado e uma maior sobrevida para o paciente. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is characterized by the accumulation of immature cells of lymphoid lineage in the bone marrow, in the peripheral blood and lymphoid organs, with peak incidence around the age of five. The prognosis of ALL is determined by age, immunophenotype and molecular changes of which the latter have fundamental importance for determining the stratification in risk groups. In this study, we have conducted a retrospective analysis of immunophenotypic and molecular characteristics of 35 cases of pediatric ALL, treated at two major institutions of Porto Alegre city. Patients were classified according to morphological, cytochemical and immunophenotypical. Regarding the immunophenotype, 8.8% of patients were classified as pro-B ALL, 67.6% B-ALL (common B-and pre-B) and 23.5% T-ALL. The Pre-B immunophenotype CD10 + was the most common. The frequency of major fusion genes of prognostic significance performed by RT-PCR was 15% for a t(12;21)/TEL-AML1 (19% between the B-lineage ALL), 4% t (4;11)/MLL-AF4, 4% t(1;19)/E2A-PBX1 and 4% t(9;22)/ BCR-ABL. Our results show the importance of the molecular study and suggest that children with ALL that have been treated in those institutions have the same biological characteristics of the ones from other regions of Brazil and developed countries, what supports the use of similar therapeutic protocols. Thus, the increased number of high-risk patients with childhood ALL appears to be related to an excess of adverse genetic abnormalities, but as consequence of late diagnosis, as suggested by the excess of cases of hyperleucocytosis. Although pediatric ALL has a high cure rate, the current challenge is the search for better diagnostic tests and new therapeutic strategies through the knowledge of target genes enabling the individualized treatment and increased chances for patients to survive.

The NTPDase1 (E.C. 3.6.1.5, apyrase, CD39, ecto-ATP-diphosphohydrolase) enzymatic activity, which is responsible for hydrolyzing ATP and ADP nucleotides, was verified in lymphocytes from 56 patients under treatment for acute lymphoblastic leukemia (ALL) and from 33 healthy subjects. Patients were divided into 3 groups: remission induction (RI), remission maintenance (RM) and out-oftreatment (OT). It had been verified, in each group, the influence of the recurrence risk (high or low) on the enzymatic activity. The RM group was then subdivided by the amount of time they had been in remission maintenance (0-30, 31-60 and 61-84 weeks). Results demonstrated that the ATP hydrolysis from lymphocyte NTPDase1 is altered in the groups studied (F (3,84)=100.34; p<0.01) in relation to the controls, and that it is reduced in both RI and RM groups, while enhanced in OT group. The recurrence risk did not influence ATP hydrolysis in none of the groups. Furthermore, it has been found a significant variation at the NTPDase1 activity to ATP hydrolysis during RM phase (F (2,17)=11.22; p=0.01), being higher in the first 30 weeks, and subsequently reduced. ADP hydrolysis by NTPDase1 activity was also significantly reduced in both the RI and RM groups, but similar to the controls in OT (F (3,69)=59.05; p<0.01). It has not been verified any influence of the recurrence risk on ADP hydrolysis. Furhermore, NTPDase1 using ADP as substrate has shown to be constant during RM phase (F (2,13)=2.40; p=0.130). The alteration on ATP and ADP hydrolysis on lymphocytes of ALL patients is in agreement to the characteristics found in this pathology. Thus, our results corroborate the role of adenine nucleotides, ATP in special, in the immune system, as signaling molecules, and the importance of the NTPDase1 to maintain constant the extracellular levels of these nucleotides. However, more studies are necessary to better understand the role of adenine nucleotides and NTPDase1 in the immunodeficiency and citotoxicity observed in treated ALL patients. / A atividade da enzima NTPDase1 (E.C. 3.6.1.5, CD39, apirase, ecto-ATPdifosfoidrolase), a qual hidrolisa os nucleotídeos ATP e ADP, foi verificada em linfócitos de 56 pacientes em tratamento para leucemia linfocítica aguda (LLA) e em 33 indivíduos controle. Os pacientes foram divididos em 3 grupos de acordo com a fase do tratamento: indução da remissão (IR), manutenção da remissão (MR) e fora-de-tratamento (FT), sendo que para cada grupo foi também verificada a influência do risco de recaída da doença (alto ou baixo) na atividade da enzima. O grupo MR foi ainda subdividido em três, de acordo com o período nesta fase: 0-30, 31-60 e 61-84 semanas em tratamento. Os resultados demonstraram que a hidrólise do ATP pela NTPDase1 está alterada nos 3 grupos estudados (F (3, 84)=100.34; p<0.01) em relação ao grupo controle, sendo que houve uma redução nas fases IR e MR, enquanto houve um aumento da hidrólise na fase FT. Não houve influência do prognóstico (grau de risco) na alteração da atividade da enzima em nenhum dos grupos estudados. Encontrou-se ainda uma variação na hidrólise do ATP pela enzima NTPDase1 durante a fase MR (F (2, 17)=11.22; p=001), sendo maior durante o período de 0-30 semanas de tratamento, e reduzida após. A atividade da NTPDase1 na hidrólise do ADP também se encontrou significativamente reduzida nas fases IR e MR, porém semelhante aos controles na fase FT (F (3, 69)=59.05; p<0.01). Também não foi verificada correlação entre a atividade da enzima, tendo ADP como substrato, e o prognóstico da LLA. Além disso, a atividade da NTPDase1 para o ADP se manteve constante durante a fase MR (F (2, 13)=2.40; p=0.130). A alteração na hidrólise do ATP e ADP em linfócitos de pacientes com LLA, como nossos resultados indicam, está de acordo com algumas das características encontradas durante o tratamento dessa patologia. Dessa forma, nossos resultados corroboram o papel dos nucleotídeos da adenina, em especial o ATP, no sistema imune como moléculas sinalizadoras, bem como a importância da enzima NTPDase1 para a manutenção dos níveis extracelulares desses nucleotídeos. Entretanto, mais estudos são necessários para melhor compreender o papel dos nucleotídeos da adenina e da NTPDase1 na imunodeficiência e citotoxicidade induzidos pelo tratamento da LLA.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common cancer found in the pediatric population and is characterized by uncontrolled proliferation and maturation arrest of lymphoid progenitor cells (lymphoblasts) in the bone marrow. In ALL occurs an increase in the production of reactive species and studies show the involvement of oxidative stress in ALL pathogenesis. Moreover acetylcholinesterase (AChE) present in blood and plasma and also in lymphocytes is well established as having non-cholinergic functions including development of cancer and its contribution to the regulation of immune function. Considering such statements, it was investigated the oxidative profile and ACHE activity in ALL patients. Eighty two ALL patients and 50 healthy subjects participated in this study. Patients were divided into 4 groups: newly diagnosed (ND) remission induction (RI), remission maintenance (RM) and out-of-treatment (OT). For evaluation of the oxidative profile, we determined the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities in blood, thiols non protein (NPSH) in plasma and erythrocytes, as well as, vitamin E, TBARS and protein carbonyl content from serum samples. Damage markers in lipids and proteins, represented by MDA levels and protein carbonylation content respectively, showed increased levels in patients when compared with the control group. In relation to enzymatic defense, represented by the enzymes SOD and CAT, it was observed a decrease in the activities in ALL patients in groups RD, RI and RM, coming back to the normal in OT group. Non enzymatic defense (NPSH in plasma and vitamin E) analyzed also revealed decrease in ALL patients in relation to the controls. No significant difference in NPSH levels was observed between RD group and control group. In relation to AChE activity, in both total blood and lymphocytes, was observed an increase in the RD group in relation to the other groups. On the other hand, in RI and RM the enzyme activity was diminished in relation to control group. No significant difference was observed in AChE activity between FT group and the control group. The results suggest that in ALL an excessive accumulation of reactive species contributes to an antioxidant depletion and dysfunction. The results had also disclosed that the AChE activity is modified in ALL, what can suggest the involvement of this enzyme in the modulation of immune function and in cancer development. The ALL results in a systemic disorder that induces changes, which can be detected by mesuring the peripheral markers of oxidative stress and AChE activity in whole blood and lymphocytes. / A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o câncer mais comum na infância e é caracterizado por uma proliferação descontrolada de células linfóides imaturas (linfoblastos) na medula óssea. Na LLA há uma produção elevada de espécies reativas e estudos relatam que o estresse oxidativo está envolvido na patogenia desta doença. Além disso, a enzima acetilcolinesterase (AChE) presente no sangue e no plasma, inclusive nos linfócitos, desempenha funções não colinérgicas e parece estar envolvida na regulação da função imune e no desenvolvimento do câncer. Levando em consideração tais afirmativas, este trabalho investigou o perfil oxidativo e a atividade da enzima AChE em pacientes com LLA. Participaram do estudo 82 pacientes com LLA e 50 indivíduos controles. Os pacientes foram divididos em 4 grupos: recém diagnosticado (RD), indução da remissão (IR), manutenção da remissão (MR) e fora de tratamento (FT). Para avaliação do perfil oxidativo, determinou-se a atividade da catalase (CAT) e da superóxido dismutase (SOD) em sangue total, os níveis de tióis não protéicos (NPSH) em plasma e eritrócitos, bem como, a concentração de vitamina E, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e o conteúdo de proteína carbonil em amostras de soro da população estudada. Os marcadores de danos oxidativos em lipídeos e proteínas, representados pelos níveis de MDA e conteúdo de proteína carbonil mostraram-se elevados nos pacientes quando comparados ao grupo controle. Em relação aos antioxidantes enzimáticos, representados pelas enzimas SOD e CAT, observou-se uma diminuição nas atividades das mesmas nos pacientes com LLA nos grupos RD, IR E MR voltando ao normal no grupo FT. Os antioxidantes não enzimáticos analisados (NPSH em plasma e vitamina E) também se mostraram diminuídos nos pacientes em relação aos controles. Nenhuma diferença nos níveis de NPSH em eritrócitos foi encontrada entre o grupo RD e o grupo controle. Em relação à atividade da AChE, observou-se um aumento nos pacientes do grupo RD em relação aos demais grupos tanto em sangue total quanto em linfócitos. Já, nos grupos IR e MR a atividade da enzima encontrou-se diminuída em relação ao grupo controle. Não houve diferença significativa na atividade da AChE entre o grupo FT e o grupo controle. Os resultados sugerem que na LLA, ocorre acumulação excessiva de espécies reativas levando a depleção ou disfunção das defesas antioxidantes tanto enzimáticas quanto não enzimáticas. Os resultados também revelaram que a atividade da AChE está modificada na LLA, o que pode sugerir o envolvimento desta enzima na modulação da função imune e no desenvolvimento do câncer. Conclui-se então que na LLA ocorrem mudanças sistêmicas, as quais podem ser detectadas pela medida de marcadores periféricos do estresse oxidativo e pela atividade da AChE em linfócitos e sangue total.

Introdução. A etiologia da leucemia linfocítica aguda (LLA), câncer mais comum na infância, não é completamente conhecida. Objetivo. Examinar a associação de infecções na infância e características maternas com a LLA em crianças residentes no Estado de São Paulo. Métodos. Estudo caso-controle com 241 casos recrutados em oito hospitais do Estado de São Paulo e diagnosticados com LLA de janeiro de 2003 a fevereiro de 2009. Os 598 controles foram selecionados na base de Declarações de Nascidos Vivos da Fundação Sistema Estadual de Análise de Dados. Entrevistas com a mãe ou responsável pela criança foram realizadas no hospital para os casos e no domicílio para os controles utilizando-se questionário semelhante. A análise dos dados foi conduzida com três grupos distintos: Grupo 1 - todos os subtipos de LLA, entrevistas com as mães ou outros responsáveis pelas crianças; Grupo 2 - todos os subtipos de LLA, entrevistas com as mães; Grupo 3 - LLA de precursores B, entrevistas com as mães. Para estimar o risco de LLA associado com as variáveis relacionadas a infecções e características maternas odds ratios (OR) e intervalos com 95 por cento de confiança (IC 95 por cento ) foram calculados por meio de análise de regressão logística multivariada não condicional. Três modelos de regressão logística foram conduzidos: a) com ajuste por sexo e idade da criança; b) com ajuste por sexo, idade da criança e escolaridade materna; c) com ajuste por todas potenciais variáveis de confusão via stepwise forward selection. Resultados. Os resultados correspondentes ao Grupo 3 e Modelo 3 de análise revelaram proteção para LLA em crianças com histórico de episódios de gripe (categoria frequentemente versus não OR = 0,27; IC 95 por cento 0,15-0,48), episódios de dor no ouvido (categoria raramente versus não OR = 0,48; IC 95 por cento 0,25-0,90), frequência à creche (categoria mais de 24 meses versus nunca OR = 0,37; IC 95 por cento 0,17-0,77), e contato com cães no primeiro ano de vida (categoria sim versus não OR = 0,76; IC 95 por cento 0,45-1,27). Foi observado tênue aumento do risco de LLA em crianças com mães que referiram consumo de álcool no passado (OR = 1,29; IC 95 por cento 0,62-2,68) e ainda bebe (OR = 1,53; IC 95 por cento 0,97-2,41) em comparação àquelas cujas mães referiram nunca ter consumido álcool. Baixo nível educacional das mães foi associado com aumento do risco de LLA em crianças (categoria 0 a 4 anos versus 12 e mais OR = 2,71; IC 95 por cento 1,26-5,81). Conclusões. Os resultados mostraram que exposição a infecções na infância, frequência à creche e contato com cães no primeiro ano de vida exercem papel protetor para LLA, por outro lado, o consumo de álcool e o baixo nível educacional das mães aumentaram o risco de LLA em crianças / Introduction. The etiology of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common cancer in childhood, is not completely known. Objective. To examine the association of childhood infections and mother characteristics with ALL in children living in São Paulo. Methods. Case-control study with 241 cases recruited in eight hospitals in the state of São Paulo and diagnosed with ALL from January 2003 to February 2009. The 598 controls were selected from the São Paulo Birth Registry. Interviews with the mother or guardian were conducted in the hospital for cases and at home for controls through a similar questionnaire. Data analysis was performed in three distinct groups: Group 1 - all subtypes of ALL, interviews conducted with the mother or other childs guardian; Group 2 - all subtypes of ALL, interviews conducted with the mother; Group 3 - precursor B ALL, interviews conducted with the mother. In order to estimate the risk of ALL associated with variables related to infections and mother characteristics odds ratios (OR) and 95 per cent confidence interval (95 per cent CI) were calculated by unconditional multivariate logistic regression. Three logistic regression models were conducted: a) with adjustment for sex and age of child; b) with adjustment for sex, age of child and maternal education; c) adjusted for all potential confounders through stepwise forward selection. Results. The results corresponding to Group 3 and Model 3 revealed protection for ALL in children with episodes of influenza (category often versus no OR = 0.27; 95 per cent CI 0.15-0.48), episodes of earache (category rarely versus no OR = 0.48; 95 per cent CI 0.25-0.90), daycare attendance (category over 24 months versus never OR = 0.37; 95 per cent CI 0.17-0.77), and contact with dogs in the first year of life (category yes versus no OR = 0.76; 95 per cent CI 0,45-1.27). Slight increase was observed in the risk of ALL in children with mothers who reported alcohol consumption in the past (OR = 1.29; 95 per cent CI 0.62-2.68) and still drink (OR = 1.53; 95 per cent CI 0.97-2.41) compared to those whose mothers reported never having consumed alcohol. Low educational level of the mothers was associated with increased risk of ALL in children (category 0-4 years versus 12 and over OR = 2.71; 95 per cent CI 1.26-5.81). Conclusions. The results provided evidences that exposure to infections in the childhood, daycare attendance and contact with dogs in the first year of life have a protective role in ALL, on the other hand, alcohol consumption and low education level of mothers increase the risk of ALL in children

Orientador: Jose Andres Yunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T02:57:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ganazza_MonicaAparecida_M.pdf: 2462267 bytes, checksum: 471302ae0756c283d944a7545a0ff930 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é o câncer mais comum da infância. Os atuais protocolos de tratamento da LLA levam à cura em 70% dos casos e parte do sucesso se deve à aplicação de diferentes tratamentos para os pacientes estratificados em diferentes grupos de risco, segundo fatores prognóstico pré-tratamento (contagem leucocitária e idade ao diagnóstico). Contudo, pacientes considerados em remissão podem apresentar conteúdo substancial de células neoplásicas, chamada doença residual mínima (DRM), cuja proliferação está associada com a recaída da doença e que podem estar em níveis indetectáveis pelas técnicas convencionais de análise morfológica. Vários trabalhos têm mostrado que é possível prever a evolução clínica dos pacientes com base na DRM, porém, no protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia Infantil (GBTLI), a DRM não é utilizada como critério de realocação dos pacientes nos grupos de risco. Desta forma, o presente estudo objetivou (1) obter dados prospectivos de DRM com o uso de reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de rearranjos de genes de imunoglobulina (Ig) e receptores de células T (TCR); (2) comparar resultados de DRM com fatores prognósticos ao diagnóstico e de resposta utilizados nos protocolos do GBTLI e (3) avaliar o valor preditivo da DRM em pacientes tratados pelo protocolo GBTLI-99. No total, foram estudadas 91 amostras de LLA pediátrica classificadas e tratadas pelo protocolo GBTLI-99. Duas metodologias foram empregadas, metodologia do grupo brasileiro (91 casos) e metodologia Biomed-1 (78 casos), as quais são baseadas em PCR com primers consenso para as regiões VDJ das imunoglobulinas e TCR seguido por análise de formação de homo/heteroduplex. Ambos métodos mostraram-se tecnicamente factíveis, reprodutíveis e capazes de detectar marcadores moleculares para a análise da DRM na maioria dos casos, a saber, 2 ou mais marcadores de DRM em 85,7 e 76,9% do total das amostras analisadas, respectivamente. As mesmas metodologias foram aplicadas para a análise da DRM nos dias 14 e 28 da terapia de indução e demonstraram concordância de 96% na detecção da DRM. Gênero masculino, idade <1 e _ 9 anos, imunofenótipo LLA-T, classificação em alto risco, ausência de CD10, presença de blastos no dia 14, presença de mais de 5% de blastos leucêmicos na medula óssea (MO) do D14 e resposta ao tratamento associaram-se com DRM positiva no D14. Já DRM positiva no D28 mostrou estar associada com imunofenótipo LLA-T, ausência de calla (CD10), presença de mais de 5% de blastos leucêmicos na MO no D28 e resposta ao tratamento. O valor preditivo da DRM, nas condições testadas, mostrou-se pouco útil para casos classificados como sendo de risco baixo pelo GBTLI/99. Para casos de alto risco, entretanto, a ausência de DRM no D14 caracteriza um grupo de pacientes com sobrevida similar a pacientes de risco básico. Novos protocolos para análise da DRM foram propostos baseados nas metodologias aplicadas no presente estudo visando otimizar o tempo e minimizar os custos / Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric cancer. The recent ALL treatment protocols can achieve the complete remission in 70% of cases and this success is due to different treatments for patients stratified into different risk groups , according to pre-treatment prognostic factors (white count cells and diagnosis age). Therefore, patients considered in remission may have substantial contents of neoplasic cells, the minimal residual disease (MRD). The proliferation of such neoplasic cells is associated with disease relapse and they can be undeteced by conventional methods. It has been demonstrated that the clinical evolution of patients based on MRD can be forecasted. Therefore, in the Brazilian Group for Childhood Leukemia Treatment (GBTLI), MRD is not used as a reallocation criterion of patients in risk groups. The present study aimed to (1) obtain MRD data through the use of polymerase chain reaction (PCR) for the detection of immunoglobulin (Ig) and T cell receptor genes rearrangements (TCR); (2) compare the results of MRD with prognostic factors at diagnosis and response factors used in the GBTLI protocols and (3) estimate the predictive value of MRD in patients treated by the GBTLI-99 protocol. In total, 91 samples of pediatric ALL classified and treated with the GBTLI-99 protocol were studied using two methodologies: Brazilian group methodology (91 cases) and Biomed-1 methodology (78 cases), both using the consensus PCR primers for the immunoglobulin and TCR VDJ regions followed by homo/heteroduplex formation. These methods were feasible, reproducible and able to detect molecular markers for MRD analysis in most cases, since they provided the detection of two or more markers in 85,7% and 76,9% of the samples analyzed, respectively. The same methodologies were applied in the MRD analysis on days 14 and 28 of induction therapy and the results are in agreement in 96% of the MRD detection. Male, age (<1 e _ 9 years), immunophenotyping (T-ALL), high risk classification, calla (CD10) absence, presence of blasts in peripheral blood on day 14, presence of more than 5% of leukemic blasts in the bone marrow (BM) on day 14 of treatment response were associated with positive MRD on D14. Already, positive MRD on day 28 of treatment were associated with immunophenotyping (T-ALL), CD10 absence, presence of more than 5% of leukemic blasts in the BM on D28 and treatment response. MRD predictive value on the conditions tested proved to be useful for the patients classified by GBTLI/99 as basic risk. However, for high risk cases, the absence of MRD on D14 defines a new group of patients with similar survival to basic risk patients. New protocols to the MRD analysis were proposed based on methodologies applied in this study to optimize the time and minimize the costs / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Este estudo randomizado, duplo-cego e controlado com placebo avaliou a eficácia do laser de baixa intensidade, infravermelho, na prevenção e tratamento da mucosite em pacientes pediátricos portadores de leucemia linfoblástica aguda (LLA) em uso do agente quimioterápico metotrexato em altas doses (MTX >1g/m2). Os pacientes foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: o grupo teste em que os pacientes receberam aplicação de laser profilático e o grupo controle com laser placebo. Os dois grupos receberam aplicação de laser nos dias D1, D2, D3. Realizada esta fase, os pacientes que desenvolveram mucosite oral tiveram acesso ao tratamento e aqueles que apresentaram mucosa normal foram orientados a retornar à consulta no 8º dia. Concomitante, foi solicitado exame hematológico prévio ao tratamento e no dia D8. Foi também mensurado o nível sérico do MTX 42 horas após a infusão da quimioterapia. Os resultados hematológicos prévios se mostraram satisfatórios e alguns apresentaram alterações no dia D8. No nosso estudo não foi possível comprovar se o nível sérico do MTX tem relação com toxicidade oral. A mucosite foi avaliada segundo a escala WHO e a avaliação da dor pré e pós-tratamento pelas escalas VAS, de faces e comportamental. Mucosite foi observada em 6 pacientes, 4 tratados com laser placebo e 2 tratados com laser profilático. Esta diferença não foi estatisticamente significante (P > 0.5). Os 6 pacientes desenvolveram grau 2 de mucosite oral. Média de laserterapia foi de 5.8 dias. Com relação à sintomatologia dolorosa 2 pacientes não apresentaram dor, 1 paciente apresentou dor moderada, nos outros a sintomatologia foi leve. Os resultados deste estudo demonstraram que o laser 780nm não foi eficaz na prevenção da mucosite oral mas constatamos o potencial efeito do laser terapêutico no controle da mucosite oral e da dor em pacientes pediátricos portadores LLA. / This randomized, double-blind, placebo-controlled study evaluated the efficacy of low intensity laser in the prevention and treatment of oral mucositis in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia undergoing chemotherapy with highdose methotrexate (MTX>1g/m2). The patients were divided into two groups: the test group, the patients who received prophylactic low-intensity laser, and the control group who received laser without radiation (sham laser). Nor the clinician neither the patients knew which type of laser was being used until the end of the trial. The patients of each group received laser application in the days D1, D2, D3. After that, the patients who developed oral mucositis were treated with low-intensity laser and those without oral mucositis were instructed to return on day 8 for clinical reevaluation. Concomitantly, patients were screening for previous hematological examination and in the day D8. The plasma level of MTX was measured at 42 hours starting the infusion. Hematological analyses revealed no abnormality and other with alterations. In this present study, there was no correlation between the plasma level MTX and oral toxicity. Mucositis was evaluated by the WHO scale and pain was measured by VAS, face scales and behavioral. Six patients developed oral mucositis and had grade 2 by WHO scale. There was no significant difference between laser group and the control group (P > 0.5). Average time of therapeutic laser was 5.8 days. Laser applications reduced oral pain. Low-intensity laser 780 nm wavelength showed no efficient method in the prevention of oral mucositis but produced some benefits in the control of the oral mucositis and pain in pediatric patients of LLA after chemotherapy.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / HematogÃnias sÃo cÃlulas jovens normais da medula Ãssea responsÃveis pela produÃÃo das cÃlulas de linhagem B do sistema imunolÃgico. A leucemia linfoblÃstica aguda de cÃlulas precursoras B representa um dos tipos de transformaÃÃo neoplÃsica das hematogÃnias. Devido a alta similaridade do ponto de vista citolÃgico dos dois tipos celulares, à possÃvel haver erros de interpretaÃÃo na anÃlise citolÃgica, fazendo-se necessÃrio em algumas circunstÃncias o uso de tÃcnicas complementares diagnÃsticas para diferenciar as cÃlulas benignas das malignas. O uso de marcadores imunolÃgicos atravÃs de anticorpos monoclonais marcados com fluorescÃncia tem grande aplicabilidade nos laboratÃrios especializados como rotina no estudo das leucemias. Os antÃgenos CD10 e CD19 estÃo expressos em ambos os tipos celulares de forma que se faz necessÃria uma extensÃo no uso de outros marcadores para caracterizaÃÃo da natureza benigna ou maligna das cÃlulas. Testou-se possÃveis diferenÃas nas curvas de expressÃo de CD10 e CD19 dos dois tipos celulares. Foram colhidas 36 amostras de medula Ãssea de pacientes pediÃtricos nÃo neoplÃsicos como grupo controle. A idade variou de 24 dias de vida a 15 anos com uma mÃdia de 5 anos. Foram colhidas tambÃm 39 amostras de pacientes portadores de LLA de linhagem B por ocasiÃo do diagnÃstico. A idade variou de 4 meses a 14 anos com uma mÃdia de 6,6 anos. Analisou-se as diferenÃas nas distribuiÃÃes quanto a intensidade de fluorescÃncia pelas mÃdias, desvios-padrÃo, coeficientes de variaÃÃo, coeficientes de inclinaÃÃo e coeficiente de curtose para os dois marcadores CD10 e CD19 nos dois grupos. Os valores individuais de cada amostra foram comparados com os intervalos gerados pelos valores do grupo controle com os seguintes respectivos resultados de sensibilidade e especificidade: 89,7% e 75% para um cut-off de mÃdia+2DP; 79,5% e 100% para mÃdia+2,5DP; e 71,8% e 100% para mÃdia+3DP. ConclusÃo: A expressÃo de CD10 e CD19 em blastos e hematogÃnias à diferente podendo ser de utilidade prÃtica na distinÃÃo entre os dois tipos celulares. / Hematogones are normal immature cells from bone marrow that are responsible for the production of the immune systemâs B cell lineage. The acute lymphoblastic leukemia (ALL) of precursors B cells represents one type of neoplastic transformation of hematogones. Due to their high similarity there are risks of erroneous interpretation consequently making it necessary use to complementary diagnostic techniques. The CD10 and CD19 antigens are expressed on both types of cells so, it is necessary use other monoclonal antibodies to identify malign or benign nature. In attempt to avoid the use of different antibodies we investigate possible differences in the expression of CD10 and CD19 in both cell types. We collected 36 samples of bone marrow from non-neoplastic patients as a control group. The age raged from 0 to 15 years with an average of 5 years. It was also collected 39 samples from patients with ALL of B cells. The age ranged from 0 to 14 years with an average of 6.6 years. We analyzed the differences between the fluorescence intensity concerning average, standard deviation, variation, inclination and kurtosis coefficients for the two markers. The individual values of each sample were compared with the intervals generated by the values of the control group: MEÂ2SD; MEÂ2.5SD and MEÂ3SD. It was possible to distinguish the groups with 89.7% and 75%; 79.5% and 100% and 71.8% e 100% of sensibility and specificity, respectively for the intervals. In conclusion, the expression of CD10 and CD19 antigens on blasts and hematogones is significantly different and may be useful in the differentiation of both cell types

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao raphael nunes leles.pdf: 1578040 bytes, checksum: 8952ece9da3998627179afb8493faa03 (MD5) Previous issue date: 2008-09-29 / Methotrexate (MTX) is a drug with high toxicity, used in high doses for the treatment of neoplasic diseases. Therapeutic concentrations preserve the effectiveness, but higher values increases the toxicity risks. The aim of this article was to develop and validate an analytical method on HPLC-PDA to measure methotrexate plasma levels on children affected by LLA. The analytical method was performed with a mobile phase composed by acetic acid 0,1%:methanol:acetonitrile in concentration gradients during the analysis. The validation parameters were: specificity, relative recovery, lowest (LLQ) and higher limits of quantification, precision (Intra-assay standard deviation), accuracy, log time stability, calibration curve and co-validation. Biological samples were collected from 7 patients hospitalized on Araújo Jorge Hospital totaling 42 blood samples used to estimate the pharmacokinetic parameters. As results we obtained a method with a flow-rate of 1.5 mL/min, the methotrexate and teophyllin detection were observed in 304 and 271 nm respectively, in 13 minutes of carryover. The relative recovery was about 71%, LLQ about 0,1 &#956;g/Ml. Intra-assay standard deviation was 11% for LLQ and no more than 14,88% for other concentrations; the accuracy was 97,63% and the long time stability was confirmed in human blood with a -20º C freezing. As pharmacokinetic parameters, we estimate the total clearance (3,03 L/h), constant of elimination (0,2586 h-1), a distribution volume of 12,57 L, half-life time as 2,73 h and median AUCT (for area under the time vs concentratrion curve) of 626,493 &#956;gh/mL. As conclusion, the analytical method proved to be high efficient to detect and to quantify the drug on human blood, and we observed the high variability of the pharmacokinetic parameters, showing the importance of realize the therapeutic drug monitoring. / O metotrexato (MTX) é um fármaco de elevada toxicidade utilizado em doses geralmente elevadas, no tratamento de neoplasias. Concentrações terapêuticas preservam a eficácia, porém valores acima elevam o risco de intoxicação. Assim o presente trabalho objetivou desenvolver e validar uma técnica analítica em HPLCPDA para dosagem do metotrexato em plasma, e monitorar seus níveis plasmáticos em crianças com LLA. A técnica analítica foi desenvolvida apresentando fase móvel contendo ácido acético 0,1%:acetonitrila:metanol em diferentes proporções durante a corrida. Utilizamos como parâmetros de validação a especificidade, recuperação, limites inferior (LIQ) e superior (LSQ) de quantificação, precisão, exatidão, estabilidade de longa duração, curva de calibração e co-validação. O material utilizado na realização desse trabalho foi coletado de pacientes Internados no Hospital Araújo Jorge (ACCG), totalizando 42 amostras de plasma, provenientes de 7 pacientes, para estabelecimento de parâmetros farmacocinéticos. Como resultados obtivemos como condições de análise um fluxo de 1,5 mL/min, com detecção do metotrexato e da teofilina em 304 e 271 nm respectivamente, em 13 minutos de corrida. A técnica analítica apresentou recuperação média de 71%, um LIQ de 0,1 &#956;g/mL, como precisão um coeficiente de variação médio de 11% para o LIQ, e máximo de 14,88% para os demais pontos, valor de exatidão médio de 97,63%, demonstramos a estabilidade do fármaco em plasma humano quando congelado a -20°C, não obtendo variação maior do que 15% na co-validação. Como parâmetros farmacocinéticos obtivemos clearance total médio de 3,03 L/h, constante de eliminação média de 0,2586 h1, volume de distribuição médio de 12,57 L, tempo médio de meia vida de 2,73 horas, área sob a curva média equivalendo a 626,493 &#956;gh/mL. Como conclusão, a técnica analítica mostrou-se bastante eficaz para a detecção e quantificação do fármaco, e observamos uma grande variabilidade dos parâmetros farmacocinéticos, o que comprova a necessidade de se realizar a monitoração terapêutica.

Orientadores: José Andrés Yunes, Ana Carolina de Mattos Zeri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T13:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Canevarolo_RafaelRenatino_M.pdf: 3376497 bytes, checksum: f3e8edf217e0d57089ffcffbe4a8097a (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O uso intensivo e combinado de diferentes quimioterápicos tem permitido a cura de 70-80% das leucemias linfóides agudas (LLA) da infância, sendo que a recaída da doença decorre em grande parte da resistência intrínseca das células leucêmicas à quimioterapia. Alguns dos quimioterápicos utilizados na LLA são inibidores metabólicos, como o metotrexato (MTX), antagonista do ácido fólico, que impede a divisão celular ao inibir a síntese de nucleotídeos. Em uma abordagem metabolômica, foi investigada a associação entre linhagens leucêmicas resistentes ou sensíveis ao MTX e metabólitos biondicadores de cada um destes fenótipos. Seis linhagens celulares B-derivadas e oito T-derivadas foram classificadas como sendo resistentes ou sensíveis ao MTX pelo método do 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) após 48h de co-cultura com diferentes concentrações da droga. Cinco linhagens foram classificadas como resistentes e nove como sensíveis ao MTX. Após 24h de cultura na presença ou ausência de MTX (ambos em triplicata), os metabólitos intracelulares das linhagens foram acessados por ressonância magnética nuclear (RMN) numa abordagem metabolômica. Ao total, oitenta e quatro metabólitos foram quantificados, dos quais 72 foram também identificados. A análise de componentes principais (PCA) não conseguiu segregar as amostras de acordo com sua resistência, ao passo que a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foi efetiva nesta separação. Os metabólitos mais relevantes para a construção dos modelos de classificação quanto à resistência ao MTX, tanto para amostras tratadas quanto controles foram: ATP, dimetilglicina, fosfocolina e sarcosina (associados à resistência); carnitina, CB-09 (composto não identificado), colato, fumarato, glicocolato, lactato, malato e succinato (associados à sensibilidade ao MTX). A capacidade de classificar corretamente as amostras em sensíveis ou resistentes foi obtida com a construção de curvas da característica operativa do receptor (ROC) para os metabólitos individualmente. Os metabólitos com desempenho bom ou excelente na análise ROC (AUC>0,8) foram selecionados para comporem "testes diagnósticos" de classificação de amostras. De todas as combinações possíveis dentre os metabólitos selecionados, o teste que considerou a combinação de carnitina, sarcosina e succinato em amostras não tratadas com MTX apresentou sensibilidade de 100% (identificou todas as 15 amostras resistentes) e especificidade de 92,3% ao classificar corretamente 24 de 26 amostras sensíveis. O melhor teste diagnóstico para amostras tratadas com MTX considerou as concentrações de CB-MTX, glicocolato, sarcosina e succinato; apresentou sensibilidade de 100% (identificou as 15 amostras resistentes) e especificidade de 85,2%, equivocando-se na classificação de 4 dentre 27 amostras sensíveis. As concentrações metabólicas diferenciais apontaram para uma superativação dos metabolismos energético e de lipídeos em linhagens sensíveis ao MTX, ao passo que linhagens resistentes teriam superativado o metabolismo da glicina. As análises metabolômicas e de integração bioquímica dos metabólitos revelaram interações gênicas, enzimáticas e metabólicas que podem estar alteradas em linhagens sensíveis ou resistentes ao MTX, bem como permitiram a especulação sobre possíveis alvos moleculares que poderiam tornar sensíveis células resistentes ao quimioterápico / Abstract: The intensive use of different and combined chemotherapics has allowed curing 70-80% of pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL), and the relapse of the disease stems largely from the intrinsic resistance of leukemic cells to chemotherapy. Some of the chemotherapics used in ALL are metabolic inhibitors such as methotrexate (MTX), a folic acid antagonist, which prevents cell division by inhibiting the synthesis of nucleotides. The association between leukemic strains resistant or sensitive to MTX and the metabolites associated with each of these phenotypes were investigated. Six B- and eight T-derived cell lines were classified as resistant or sensitive to MTX by the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, after 48h in co-culture with different concentrations of the drug. Five lineages were classified as resistant, and nine as sensitive to MTX. After 24 hours of culture in the presence or absence of MTX (both in triplicates), the intracellular metabolites of the lineages were assessed by nuclear magnetic resonance (NMR), in a metabolomic approach. In total, 84 metabolites were quantified, 72 of which were also identified. The principal component analysis (PCA) did not segregate the samples according to their resistance, whereas the supervised partial least square discriminate analysis (PLS-DA) was effective in this separation. ATP, dimethylglycine, sarcosine and phosphocholine were associated with MTX resistance in both models constructed for treated and untreated samples, whereas carnitine, CB-MTX (unidentified compound), cholate, fumarate, glycocholate, lactate, malate and succinate were associated with sensitivity to MTX. The ability to correctly classify the samples into sensitive or resistant groups was checked with the construction of the receiver operating characteristic (ROC) curves for metabolites individually. Metabolites with good or excellent performance in ROC analysis (AUC> 0.8) were selected to compose "diagnostic tests" for classifying samples. Of all the possible combinations among the selected metabolites, the test composed by the comination of carnitine, sarcosine and succinate in untreated samples exhibited sensitivity of 100% (identified all 15 resistant samples) and specificity of 92.3% in classifying correctly 24 of 26 sensitive samples. The best diagnostic test for samples treated with MTX took into consideration concentrations of CB-MTX, glycocholate, sarcosina, succinato. It had a sensitivity of 100% (identified 15 resistant samples) and specificity of 85.2%, classifying incorrectly 4 out of 27 sensitive samples. Differential metabolic concentrations pointed to an over activation of energy and lipids metabolism in MTX-sensitive strains, whereas resistant strains seemed to have overactive the glycine metabolism. Metabolomic and biochemical integration analysis revealed genetic, enzymatic and metabolic interactions that might be altered in strains sensitive or resistant to MTX, as well as allowed speculations about possible molecular targets on which intervention could make resistant cells susceptible to chemotherapy / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas