A Leucemia Linfocítica Aguda na infância e adolescência é uma neoplasia de precursores linfóides de natureza heterogênea. Foi a primeira neoplasia disseminada a tornar-se curável pela quimioterapia. No Brasil os estudos cooperativos para o seu tratamento foram iniciados em 1980 com a criação do primeiro protocolo para o tratamento desta leucemia, denominado Grupo Brasileiro para o Tratamento da Leucemia na Infância. Na seqüência destes estudos foram observadas Sobrevidas Livre de Eventos de 50%, 58% e 70% nos protocolos 80, 82 e 85 respectivamente. Durante as décadas de 1980 e 1990, com a divulgação dos excelentes resultados alcançados com os regimes dos protocolos do grupo Berlin Frankfurt Münster, uma série de instituições em nosso País passou a adotá-los. Apesar de termos conhecimento dos dados referentes a evolução dos pacientes protocolados no GBTLI e dos demais estudos divulgados pelas instituições de origem, não tínhamos, porém, uma avaliação epidemiológica nem o conhecimento dos índices de sobrevivência alcançados no estado do Rio Grande do Sul. Neste trabalho foram avaliados 1472 pacientes com LLA, 833 (56,59%) do sexo masculino, 639 (43,41%) do sexo feminino, com idades entre zero e 20 anos, média de 7,40 anos (desvio padrão 5,14) e mediana de 5,70 anos (amplitude 0,06 a 20,76), no período de 1980 a 2008 provenientes deste Estado. Os dados foram colhidos individualmente dos prontuários dos pacientes admitidos nas principais instituições hospitalares que mantém assistência a pacientes pediátricos com neoplasias hematológicas. No presente estudo 487 pacientes (39,40%) foram registrados oficialmente nos protocolos do GBTLI; 678 (54,85%) receberam tratamento baseados nos regimes do grupo BFM e 71 (5,75%) por outros regimes incluindo os tratados segundo o protocolo UKALL. Os casos não foram, no entanto, protocolados e, na grande maioria não foram observados a totalidade dos itens exigidos para os pacientes registrados oficialmente. A sobrevida livre de eventos dos pacientes protocolados foi significativamente superior comparada aos não protocolados, 62,41% ± 2,43% e 53,86% ± 2,04% respectivamente, em cinco anos. De acordo com a faixa etária os pacientes que apresentavam idade de 15 a 19 anos tiveram um índice de SLE de 37,98% ± 4,72% em cinco anos, inferior quando comparado aos de zero a 4 anos e 5 a 9 anos respectivamente: 62,78% ± 2,28% e 62,43% ± 2,84%. Foi observada, na população estudada, uma SG de 63,73% ± 1,49% e SLE de 57,27% ± 1,57%, o que sugere uma discussão para implementar projetos com a finalidade de elevar estes índices de sobrevida. Epidemiologicamente a incidência da LLA com progenitores B seguiu o padrão observado em países desenvolvidos com um pico de freqüência absoluta entre as idades de 2 a 4 anos. Houve diferença significativa entre a população proveniente da região urbana ou rural sendo a SLE em cinco anos de 61,76% ± 1,76% e 49,81% ± 4,28% respectivamente. A SLE e a SG em lactentes e portadores de Síndrome de Down foi inferior aos resultados obtidos em instituições dos países desenvolvidos o que torna aconselhável uma revisão das condições para a assistência destes pacientes. Este estudo teve como finalidade principal retratar a situação passada e a atual do tratamento da LLA na infância e adolescência no Rio Grande do Sul e acumular dados aqui não interpretados e que poderão ser analisados posteriormente / Acute lymphocytic leukemia in childhood and adolescence is a neoplastic disease of lymphoid precursor of heterogeneous nature, being the first disseminated neoplasia to become curable through Chemotherapy. In Brazil, cooperative studies for the treatment of ALL started in 1980 with the creation of the first protocol by the Grupo Brasileiro para o Tratamento da Leucemia na Infância. According to these studies, Event Free Survival of 50%, 58% and 70% in the protocols of 1980, 1982 e 1985 respectively was observed. During the 80s and 90s many Brazilian institutions adopted the protocols motivated by the excellent results achieved by the Berlin Frankfurt Münster group. In spite of the knowledge provided by data related to the evolution of patients protocoled by the GBTLI and other studies published by medical institutions, there was not an epidemiologic evaluation or knowledge of survival indexes achieved in the state of Rio Grande do Sul. In this work, 1472 patients with ALL from the state of Rio Grande do Sul were evaluated. Among the subjects, 833 (56,59%) were male, 639 (43,41%) female, with age range between 0- 20 y average age of 7,40 (standard deviation 5,14) and median 5,70 years old (amplitude 0,06 to 20,76). Data was collected from the medical registers of patients with hematologic neoplasia in medical institutions, which offered pediatric assistance for ALL comprising the period between 1980 until 2008. In the present study, 487 patients (39,40%) were officially registered in the protocols of GBTLI; 678 (54,85%) received treatment based on the regime of the BFM group and 71 (5,75%) were treated according to other regimens (including the UKALL protocol). The cases, however, were not protocoled and, in most cases, the totality of items required for the patients registered officially were not observed. The EFS of the patients protocoled were significantly superior to those who were not protocoled (62,41% ± 2,43% and 53,86% ± 2,04% respectively) in five years. In respect to the age range, the patients which were between 15-20 years had an EFS index of 37,98% ± 4,72% in five years, which is inferior to the index of patients 0-4 years and 5-9 years: 62,78% ± 2,28% e 62,543± 2,84% respectively. An overall survival (OS) of 63,73% ± 1,49% and EFS of 57,27% ± 1,57% was observed in the population studied. These results indicate that a discussion for the implementation of projects, which can increase the indexes of cure, should be carried out. Epidemiologically, the incidence of ALL in B progenitors followed the pattern observed in developed countries with an absolute frequency peak in the age range of 2-4 years. The outcome was superior for patients coming from urban area in comparison to those from rural area. EFS and OS in infant and Down syndrome patients were inferior to the results obtained in developed countries, showing how important it is to review the conditions of the assistance provided to these patients. The objective of this work is to present the development of ALL treatment in childhood and adolescence in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, from its beginning until the current days providing data, which can be analyzed and interpreted posteriorly

Este estudo teve como objetivo avaliar o estado nutricional relativo ao selênio (Se) de pacientes na fase de pós-tratamento da leucemia linfóide aguda (LLA) e sua relação com o estresse oxidativo. Foram selecionados 24 pacientes no pós-tratamento da LLA (9,2 ± 1,9 anos) atendidos no Instituto de Oncologia Pediátrica da Universidade Federal de São Paulo e 60 indivíduos saudáveis (9,5 ± 1,3 anos) da Escola de Aplicação da Universidade de São Paulo. Foram coletados 10 mL de sangue venoso para análise de Se plasmático e eritrocitário, glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), α- tocoferol, malondialdeído (MDA) e 8-oxo-desoxiguanosina (8-oxo-dGuo). A urina de 24 horas foi coletada para análise da excreção de Se, e três recordatórios de consumo alimentar de 24 horas para avaliação do Se ingerido. Os resultados obtidos quanto aos parâmetros bioquímicos de avaliação de Se não apresentaram diferença significativa entre os grupos de pacientes e controles, e foram respectivamente: Se plasmático, 44,4 ± 9,0 µg/L e 48,7 ± 12,0 µg/L (p = 0,122); Se eritrocitário, 49,9 ± 15,9 µg/L e 45,0 ± 15,9 µg/L (p = 0,202); Se urinário, 19,6 ± 14,8 µg Se/g de creatinina e 18,6 ± 9,6 µg Se/g de creatinina (p = 0,820). O consumo médio de Se foi de 27,4 ± 8,7 µg/dia e 28,0 ± 1,5 µg/dia (p = 0,756), respectivamente. Os grupos estudados foram considerados deficientes em Se, considerando os pontos de corte adotados. A atividade da GPx foi significativamente menor nos pacientes do que nos controles (33,3 ± 11,1 U/g Hb e 76,9 ± 25,9 U/g Hb) (p = 0,000), e a atividade da SOD não diferiu entre pacientes e controles (1796,9 ± 257,8 U/g Hb e 1915,9 ± 473,9 U/g Hb) (p = 0,145), assim como as concentrações de MDA (1,7 ± 0,3 µmol/L e 1,8 ± 0,4 µmol/L) (p = 0,053). A concentração de α-tocoferol foi estatisticamente maior nos pacientes que nos controles (17,7 ± 4,7 µmol/L e 10,6 ± 3,2 µmol/L) (p =0,000), bem como a concentração de 8-oxo-dGuo (43,6 ± 28,0 8-oxo/106 dG e 21,3 ± 22,9 8-oxo/106 dG) (p = 0,014). Os resultados apresentados apontam que os participantes deste estudo estão deficientes em Se e, em especial os pacientes no pós-tratamento da LLA estão sujeitos a um aumento do estado de estresse oxidativo, pois apesar das concentrações de MDA serem semelhantes entre os pacientes e os controles, a atividade da GPx dos pacientes foi reduzida e a concentração de 8-oxo-dGuo e α-tocoferol estavam aumentadas em relação aos controles. / This study aimed to evaluate the nutritional status of selenium (Se) in patients in post-treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and its relationship with oxidative stress. We selected 24 patients in post-treatment of ALL (9.2 ± 1.9 years) at the Pediatric Oncology Institute of Federal University of São Paulo and 60 healthy individuals (9.5 ± 1.3 years) of the School of Application at the University of São Paulo. We collected 10 mL of venous blood for analysis of Se in plasma and erythrocytes, glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), α-tocopherol, malondialdehyde (MDA) and 8-oxo-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo). The 24-hour urine was collected for analysis of Se excretion and Se intake was evaluated by using three non-consecutive days of 24- hour recall. The results regarding biochemical evaluation of Se did not differ significantly between patients in post-treatment of ALL and controls, and the results were respectively: Se in plasma, 44.4 ± 9.0 µg/L and 48.7 ± 12.0 µg/L (p = 0.122); Se in erythrocytes, 49.9 ± 15.9 µg/L and 45.0 ± 15.9 µg/L (p = 0.202); Se in urine, 19.6 ± 14.8 µg Se/g creatinine and 18.6 ± 9.6 µg Se/g creatinine (p = 0.820). The average intake of selenium was 27.4 ± 8.7 mg/day and 28.0 ± 1.5 mg/day (p = 0.756), respectively. Both groups were considered deficient in selenium, according to the cut-off points adopted. The GPx activity was significantly lower in patients than in controls (33.3 ± 11.1 U/g Hb and 76.9 ± 25.9 U/g Hb) (p = 0.000), and no difference in SOD activity was observed between groups (1796.9 ± 257.8 U/g Hb and 1915.9 ± 473.9 U/g Hb) (p = 0.145). MDA concentrations were not different between patients and controls (1.7 ± 0.3 µmol/L and 1.8 ± 0.4 µmol/L) (p = 0.053) and α-tocopherol concentration was statistically higher in patients (17.7 ± 4.7 µmol/L and 10.6 ± 3.2 µmol/L) (p = 0.000), as well the concentration of 8-oxo-dGuo (43.6 ± 28.0 8-oxo/106 dG and 21.3 ± 22.9 8-oxo/106 dG) (p = 0.014). These results indicate that the participants in this study are deficient in Se mainly those who are in post-treatment of ALL are exposed to an increased state of oxidative stress, because although the concentrations of MDA were similar between patients and controls, the GPx activity of the patients was reduced and the concentration of 8-oxo-dGuo and α-tocopherol were increased compared to controls.

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 µM respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 µM respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

A crisantaspase é uma enzima do tipo asparaginase (ASNase) produzida pela bactéria Erwinia chrysanthemi e utilizada como biofármaco no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) em casos de hipersensibilidade à ASNase de E. coli. As principais desvantagens deste biofármaco são a curta meia-vida (10 horas) e imunogenicidade. Nesse sentido, sua forma peguilada (PEG-crisantaspase) não só reduziria o efeito imunogênico, como também melhoraria a meia-vida plasmática. Atualmente, somente a ASNase de E. coli está disponível comercialmente na forma peguilada e essa, por ter sido uma das primeiras proteínas a serem peguiladas, é resultado de um processo de peguilação aleatória em resíduos de lisina. Portanto, apresenta alto grau de polidispersão em relação à quantidade de cadeias de PEG ligadas à enzima. Nesse trabalho desenvolvemos um processo de obtenção de crisantaspase peguilada de maneira sítio-específica, no grupamento N-terminal (PEG-crisantaspase). A crisantaspase foi obtida de forma recombinante na cepa E. coli BL21, cultivada em agitador metabólico e biorreator, em meio Luria Bertani. A produtividade volumétrica no biorreator aumentou 37% em comparação com o agitador metabólico (460 e 335 U·L-1·h-1 respectivamente). A crisantaspase foi recuperada por choque osmótico e purificada por cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP FF, 5 mL, eluição em pH 7,5), apresentando atividade específica de 694 U·mg-1, fator de purificação de 31 e rendimento de 69%. A crisantaspase purificada foi peguilada com mPEG-NHS 10 kDa, em tampão fosfato 100 mM, 22 °C, razão molar enzima:PEG 1:50 durante 30 min e sob diferentes valores de pH (6,5-9,0). O melhor rendimento de peguilação N-terminal (50%) foi em pH 7,5 com menor formação de estruturas poli-peguiladas (7%). A PEG-crisantaspase foi isolada por cromatografia de exclusão molecular, retendo 50% da atividade específica (357 U·mg-1) com valor de kM três vezes maior do que o da crisantaspase (150 e 48,5 µM respectivamente). Entretanto, apresentou maior estabilidade em altas temperaturas. Em duas semanas, a crisantaspase perdeu 93% de sua atividade específica enquanto que a PEG-crisantaspase foi estável por 20 dias. Portanto, a enzima PEG-crisantaspase desenvolvida representa uma alternativa promissora para o tratamento da LLA. / Crisantaspase is an asparaginase enzyme (ASNase) produced by Erwinia chrysanthemi bacterium and used as biopharmaceutical in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in case of hypersensivity to E. coli ASNase. The main disadvantages of this biopharmaceutical are the short half-life (10 hours) and immunogenicity. In this sense, its PEGylated form (PEG-crisantaspase) could not only reduce the immunogenic effect but also improve plasma half-life. Currently, only E. coli ASNase is commercially available in its pegylated form. Since ASNase was one of the first proteins to be pegylated, it corresponds to a random PEGylation process on lysine residues and consequently preparations are highly polydisperse. In this work we developed a process to obtain a site-specific N-terminal PEGylated crisantaspase (PEG-crisantaspase). Crisantaspase was recombinantly expressed in E. coli BL21 strain, grown in shaker and bioreactor, in Luria Bertani medium. Volumetric productivity in bioreactor increased 37% compared to shaker conditions (460 and 335 U·L-1·h-1 respectively). Crisantaspase was extracted by osmotic shock and purified by cation exchange chromatography (HiTrap SP FF column, 5 mL, elution at pH 7.5), presenting specific activity of 694 U·mg-1,31 purification fold and an yield of 69%. Purified crisantaspase was PEGylated with 10 kDa mPEG-NHS in 100mM phosphate buffer, 22°C, enzyme:PEG molar ratio of 1:50 for 30 min, and at different pH values (6.5-9.0). The highest N-terminal pegylation yield (50%) was at pH 7.5 with less poly-PEGylated forms (7%). PEG-crisantaspase was purified by size-exclusion chromatography, retaining 50% of specific activity (357 U·mg-1) with a kM value 3 times higher than crisantaspase (150 and 48,5 µM respectively). Nonetheless, PEG-crisantaspase was found to be more stable at high temperatures and over the time. In two weeks, crisantaspase lost 93% of its specific activity, while PEG-crisantaspase was stable for 20 days. Therefore, the novel PEG-crisantaspase enzyme developed represents a promising alternative for the treatment of ALL.

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.

Leung Kam Tong. / Thesis submitted in: September 2006. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (leaves 79-95). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / Abstract (Chinese) --- p.iii / Acknowledgements --- p.v / Table of contents --- p.vi / List of figures --- p.ix / List of abbreviations --- p.xii / Chapter Chapter 1 --- General Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Acute lymphoblastic leukemia --- p.1 / Chapter 1.2 --- T-cell acute lymphoblastic leukemia --- p.2 / Chapter 1.2.1 --- Chemotherapy --- p.2 / Chapter 1.2.1.1 --- Induction therapy --- p.2 / Chapter 1.2.1.2 --- Intensification therapy --- p.3 / Chapter 1.2.1.3 --- Maintenance therapy --- p.3 / Chapter 1.2.2 --- Chemoresistance in T-ALL --- p.3 / Chapter 1.3 --- Apoptosis and chemoresistance --- p.5 / Chapter 1.3.1 --- "Initiation, execution and regulation of apoptosis" --- p.5 / Chapter 1.3.1.1 --- Initiation of apoptosis --- p.5 / Chapter 1.3.1.2 --- Execution of apoptosis --- p.7 / Chapter 1.3.1.3 --- Regulation of apoptosis --- p.7 / Chapter 1.3.2 --- Mechanisms of resistance to apoptosis --- p.9 / Chapter 1.3.2.1 --- Overexpression of pro-survival proteins --- p.9 / Chapter 1.3.2.2 --- Downregulation and mutation of pro-apoptotic proteins --- p.11 / Chapter 1.3.2.3 --- Other mechanisms --- p.13 / Chapter 1.4 --- Bcl-2 interating mediator of cell death --- p.14 / Chapter 1.4.1 --- Role of Bim in apoptosis --- p.16 / Chapter 1.4.2 --- Regulation of Bim --- p.17 / Chapter 1.4.2.1 --- Transcriptional regulation of Bim --- p.18 / Chapter 1.4.2.2 --- Post-transcriptional regulation of Bim --- p.18 / Chapter 1.5 --- c-Jun N-terminal kinase --- p.20 / Chapter 1.5.1 --- Pro-apoptotic role of JNK --- p.21 / Chapter 1.5.2 --- Anti-apoptotic role of JNK --- p.21 / Chapter 1.6 --- Hypotheses --- p.22 / Chapter Chapter 2 --- Materials and Methods --- p.23 / Chapter 2.1 --- Cell culture --- p.23 / Chapter 2.2 --- Induction of quantification of apoptosis --- p.24 / Chapter 2.3 --- Determination of caspase activities --- p.24 / Chapter 2.4 --- Western blotting --- p.25 / Chapter 2.4.1 --- Protein extraction and determination of protein concentration --- p.25 / Chapter 2.4.2 --- SDS-PAGE and immunodetection --- p.26 / Chapter 2.5 --- Cell-free apoptosis reactions --- p.27 / Chapter 2.6 --- Analysis of mitochondrial membrane potential --- p.27 / Chapter 2.7 --- Transient transfection of Sup-Tl cells --- p.28 / Chapter 2.8 --- Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) --- p.28 / Chapter 2.8.1 --- RNA isolation --- p.28 / Chapter 2.8.2 --- Synthesis of first-strand cDNA --- p.29 / Chapter 2.8.3 --- Polymerase chain reaction --- p.29 / Chapter 2.9 --- Alkaline phosphatase digestion of Bim --- p.30 / Chapter Chapter 3 --- Results --- p.31 / Chapter 3.1 --- The T-ALL cell line Sup-Tl is resistant to etoposide-induced apoptosis --- p.31 / Chapter 3.2 --- Sup-Tl cells are resistant to etoposide-induced caspase activation --- p.40 / Chapter 3.3 --- Sup-Tl cells are insusceptible to etoposide-induced mitochondrial alterations --- p.46 / Chapter 3.4 --- BimEL is required for etoposide-induced apoptosis in Sup-Tl cells --- p.51 / Chapter 3.5 --- The reduced level of BimEL in Sup-Tl cells is owing to the presence of constitutively active JNK --- p.58 / Chapter Chapter 4 --- Discussion --- p.67 / References --- p.79

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:38:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EdianaROG_DISSERT.pdf: 2182777 bytes, checksum: a6c802e96d340606dfb3cbb335b79787 (MD5) Previous issue date: 2011-04-01 / The present work investigated the cognitive operation of children diagnosed with acute lymphoblastic leukaemia (ALL), accompanied at pediatric oncologic institutions at the city of Natal/RN. Had participated in this study twenty children, of both sexes, between six and twelve years old, with the ALL diagnostic, who were in treatment (n=10) and out of treatment for at least one year (n=10) and were submitted exclusively to chemotherapy as CNS prophylaxis. The utilized protocol of neuropsychological evaluation covered the following cognitive abilities: intellective capability, attentional and memory systems, and executive functions. Data was analyzed through descriptive and inferential measures, with the support of the Mann-Whitney U Test and T-test, considering the influence of the variables sex, age at diagnostic and the past time since the beginning of the treatment over children s performance. The intellective capability evaluation showed low score to the out-of-treatment groups, female and children under five years old to the diagnostic. In concern of attentional systems, groups showed the expected performance. In a relevant way, in the evaluation of executive functions, were found reduced scores within all groups, especially inside the in-treatment group. Memory evaluation pointed to reduced performance in items concerning to learning evolution and spontaneous evocation after interference to the several groups. It can be concluded, reffer to the occurrence of transitory and permanent impact associated to the intrusion of chemotherapic components during the maturational course of the CNS. It s expected that the present investigation and the development of similar studies enable major comprehension about the mode, extension and repercussion of these damages subsidizing the development of strategies which may minimize them and provide better xxiii life quality to this clinical subgroup / O presente trabalho investigou o funcionamento cognitivo de crian?as diagnosticadas com Leucemia Linf?ide Aguda (LLA) acompanhadas por institui??es oncol?gicas pedi?tricas no munic?pio de Natal/RN. Participaram deste estudo 20 crian?as diagnosticadas com LLA, de ambos os sexos, com idades entre seis e doze anos, que estavam em tratamento (n=10) e fora de tratamento h? pelo menos 1 ano (n=10), submetidas exclusivamente ? quimioterapia como profilaxia do SNC. O protocolo de avalia??o neuropsicol?gica utilizado contemplou as seguintes habilidades cognitivas: capacidade intelectiva, sistemas atencionais e de mem?ria e fun??es executivas. Os dados foram analisados atrav?s de medidas descritivas e inferenciais com o aux?lio do Teste U de Mann-Whitney e do Teste t, considerando-se a influ?ncia das vari?veis sexo, idade ao diagn?stico e tempo decorrido desde o in?cio do tratamento sobre o desempenho das crian?as. A avalia??o da capacidade intelectiva revelou baixas pontua??es para os grupos fora de tratamento, sexo feminino e crian?as menores de cinco anos ao diagn?stico. Quanto aos sistemas atencionais os grupos apresentaram desempenho dentro do esperado. De forma relevante, na avalia??o das fun??es executivas foram encontradas pontua??es reduzidas em todos os grupos, com destaque para o grupo em tratamento. A avalia??o da mem?ria indicou desempenho rebaixado em itens concernentes ? evolu??o da aprendizagem e evoca??o espont?nea ap?s interfer?ncia para os diversos grupos. Conclui-se que estas informa??es aludem ? ocorr?ncia de impactos transit?rios e permanentes associados ? intrus?o de componentes quimioter?picos no curso maturacional do SNC. Espera-se que a presente investiga??o e o desenvolvimento de estudos semelhantes possibilitem maior compreens?o acerca da modalidade, extens?o e repercuss?o de tais preju?zos, subsidiando o desenvolvimento de xxi estrat?gias que possam minimiz?-los e proporcionar maior qualidade de vida para este subgrupo cl?nico

O acometimento do câncer na infância é relativamente raro, com taxas relevantes de incidência de alguns tumores, como a leucemia linfoblástica aguda (LLA) e o tumor de Wilms (TW). Embora o câncer seja uma das dez primeiras causas de óbito de crianças e adolescentes e a primeira por doença a partir dos cinco anos, nas últimas décadas o progresso da terapêutica tem possibilitado um declínio nas taxas de mortalidade e expansão dos prazos de sobrevida. Desta forma, o acompanhamento efetivo no enfrentamento da doença passou a buscar análises mais amplas dos efeitos orgânicos tardios da doença e da terapêutica, incluindo as condições psicossociais do sobrevivente, como nas avaliações da qualidade de vida relacionada à saúde (QVRS). No sentido de ampliar o conhecimento e alternativas para o acompanhamento ambulatorial e periódico da condição de sobrevivência, este estudo buscou comparar o impacto na QVRS do sobrevivente adulto, dada a diferença na terapêutica de escolha para a remissão da LLA (quimioterapia) e do TW (cirurgia e quimioterapia), utilizando uma avaliação a distância da QVRS (SF-36, via telefone).Objetivos: Analisar e comparar a QVRS de sobreviventes adultos de LLA e TW, entre si e em relação a participantes sadios, acompanhados no Ambulatório Fora de Terapia do ITACI-HC-FMUSP, através da aplicação alternativa (via telefone) do SF-36.Casuística e Método: 90 participantes, acima de 18 anos. Grupo controle(CTRL) (30 sujeitos, fisicamente saudáveis, com ausência de diagnóstico prévio de câncer, recém-ingressos em curso superior) e Grupos experimentais (60 sobreviventes - Ambulatório Fora de Terapia - ITACI - HCFMUSP): grupo LLA (GLLA) - 30 sobreviventes LLA e grupo TW (GTW) 30 sobreviventes TW. A avaliação foi realizada através da aplicação, via telefone, do SF- 36. Após compilação dos domínios do SF-36, os resultados foram analisados através do teste de qui-quadrado, teste t-independente e teste de ANOVA. Resultados: Os participantes não apresentaram diferença significativa quanto a idade, a maioria eram solteiros, sem filhos e provenientes de São Paulo. O nível mais elevado de escolaridade do CTRL decorreu do critério de inclusão, mas com relevante proporção de sobreviventes no nível superior. Nos sobreviventes não houve diferença significativa de idade de diagnóstico e tempo de fora de terapia. Quanto a QVRS, houve melhores resultados dos sobreviventes masculinos em relação às sobreviventes e participantes CTRL. Especificamente, GLLA e GTW para Vitalidade e GLLA para Aspectos sociais, Saúde mental e Aspectos emocionais, no último aspecto detectada diferença também para as sobreviventes GTW. Nos sobreviventes com diagnóstico tardio (acima 53 meses) o GLLA apresentou melhores resultados na Capacidade funcional. Na percepção da própria saúde, houve diferença para todos os domínios, exceto nos Aspectos sociais e emocionais, estando as diferenças circunscritas a percepções positivas (boa, muito boa e excelente) da própria saúde pelos sobreviventes e controles. Conclusão: Particularmente no período do estudo, para a amostra selecionada e os aspectos analisados pelo SF-36 pode-se inferir que, apesar de algumas diferenças encontradas, os sobreviventes não apresentaram evidências de comprometimento de QVRS. O SF-36 (via telefone) pode ser um recurso de acesso e avaliação de QVRS de sobreviventes sob acompanhamento ambulatorial / The involvement of childhood cancer is relatively rare, with relevant incidence rates of some cancers such as Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and Wilms Tumor (WT). Although cancer is one of the top ten causes of death in children and adolescents and the first disease from the age of five, in recent decades the therapeutic progress has made possible a decline in mortality rates and expansion of the survival periods. In this way, the effective monitoring in the confrontation of the disease passed to seek broader analyses of later organic effects from disease and therapy, including the psychosocial conditions of survivor, as in evaluations of healthrelated quality of life (HRQoL). In order to increase knowledge and alternatives for monitoring outpatient and periodic survival condition, this study sought to compare the impact on HRQoL of adult survivor, given the difference in the choice therapy for the remission of ALL (chemotherapy) and WT (surgery) using a remote assessment of HRQoL (SF -36 via telephone call). Objectives: Analyze and compare the HRQoL of adult survivors of ALL and WT between themselves and in relation to healthy participants, followed at the Ambulatory outside ITACI - HC - USP therapy , by alternative application ( by phone calls) of the SF - 36 . Methods: 90 participants , above 18 years. Control group (CTRL): (30 subjects, physically healthy, no history of oncological diagnosis, newly joined in higher education) and experimental groups (60 survivors - Outpatient Therapy - ITACI - HCFMUSP ): ALL group ( GALL ) - 30 ALL survivors and WT group ( GWT ) 30 WT survivors. The evaluation was performed by applying SF-36, via telephone calls. After compilation of the SF -36 domains, the results were analyzed through chi - square test, independent t test and ANOVA test. Results: Participants showed no significant difference regarding age, most were single, childless and from Sao Paulo. CTRL highest level of schooling resulted from inclusion criterion but with relevant proportion of survivors at the top level. In survivors there was no significant difference in age of diagnosis and time outside therapy. As for HRQoL there have been better results of male survivors in relation to female survivors and CTRL participants. Specifically GALL and GWT for vitality domain and GALL for social aspects, mental health and emotional aspects. In the last domain, it was detected also difference female survivors GWT. In survivors with late diagnosis (above 53 months) the GALL presented better results in functional capacity. In the perception of their own health, there were differences for all domains except in social and emotional aspects, with differences confined to positive perceptions (good, very good and excellent ) of own health by survivors and controls. Conclusion: Particularly during the study period, for the selected sample and the analyzed aspects by SF -36 can be inferred that, despite some differences, survivors did not show evidence of impairment of HRQoL . The SF -36 (via telephone calls) can be a resource of access HRQoL evaluation of survivors under ambulatory followup

A Leucemia Linfocítica Aguda na infância e adolescência é uma neoplasia de precursores linfóides de natureza heterogênea. Foi a primeira neoplasia disseminada a tornar-se curável pela quimioterapia. No Brasil os estudos cooperativos para o seu tratamento foram iniciados em 1980 com a criação do primeiro protocolo para o tratamento desta leucemia, denominado Grupo Brasileiro para o Tratamento da Leucemia na Infância. Na seqüência destes estudos foram observadas Sobrevidas Livre de Eventos de 50%, 58% e 70% nos protocolos 80, 82 e 85 respectivamente. Durante as décadas de 1980 e 1990, com a divulgação dos excelentes resultados alcançados com os regimes dos protocolos do grupo Berlin Frankfurt Münster, uma série de instituições em nosso País passou a adotá-los. Apesar de termos conhecimento dos dados referentes a evolução dos pacientes protocolados no GBTLI e dos demais estudos divulgados pelas instituições de origem, não tínhamos, porém, uma avaliação epidemiológica nem o conhecimento dos índices de sobrevivência alcançados no estado do Rio Grande do Sul. Neste trabalho foram avaliados 1472 pacientes com LLA, 833 (56,59%) do sexo masculino, 639 (43,41%) do sexo feminino, com idades entre zero e 20 anos, média de 7,40 anos (desvio padrão 5,14) e mediana de 5,70 anos (amplitude 0,06 a 20,76), no período de 1980 a 2008 provenientes deste Estado. Os dados foram colhidos individualmente dos prontuários dos pacientes admitidos nas principais instituições hospitalares que mantém assistência a pacientes pediátricos com neoplasias hematológicas. No presente estudo 487 pacientes (39,40%) foram registrados oficialmente nos protocolos do GBTLI; 678 (54,85%) receberam tratamento baseados nos regimes do grupo BFM e 71 (5,75%) por outros regimes incluindo os tratados segundo o protocolo UKALL. Os casos não foram, no entanto, protocolados e, na grande maioria não foram observados a totalidade dos itens exigidos para os pacientes registrados oficialmente. A sobrevida livre de eventos dos pacientes protocolados foi significativamente superior comparada aos não protocolados, 62,41% ± 2,43% e 53,86% ± 2,04% respectivamente, em cinco anos. De acordo com a faixa etária os pacientes que apresentavam idade de 15 a 19 anos tiveram um índice de SLE de 37,98% ± 4,72% em cinco anos, inferior quando comparado aos de zero a 4 anos e 5 a 9 anos respectivamente: 62,78% ± 2,28% e 62,43% ± 2,84%. Foi observada, na população estudada, uma SG de 63,73% ± 1,49% e SLE de 57,27% ± 1,57%, o que sugere uma discussão para implementar projetos com a finalidade de elevar estes índices de sobrevida. Epidemiologicamente a incidência da LLA com progenitores B seguiu o padrão observado em países desenvolvidos com um pico de freqüência absoluta entre as idades de 2 a 4 anos. Houve diferença significativa entre a população proveniente da região urbana ou rural sendo a SLE em cinco anos de 61,76% ± 1,76% e 49,81% ± 4,28% respectivamente. A SLE e a SG em lactentes e portadores de Síndrome de Down foi inferior aos resultados obtidos em instituições dos países desenvolvidos o que torna aconselhável uma revisão das condições para a assistência destes pacientes. Este estudo teve como finalidade principal retratar a situação passada e a atual do tratamento da LLA na infância e adolescência no Rio Grande do Sul e acumular dados aqui não interpretados e que poderão ser analisados posteriormente / Acute lymphocytic leukemia in childhood and adolescence is a neoplastic disease of lymphoid precursor of heterogeneous nature, being the first disseminated neoplasia to become curable through Chemotherapy. In Brazil, cooperative studies for the treatment of ALL started in 1980 with the creation of the first protocol by the Grupo Brasileiro para o Tratamento da Leucemia na Infância. According to these studies, Event Free Survival of 50%, 58% and 70% in the protocols of 1980, 1982 e 1985 respectively was observed. During the 80s and 90s many Brazilian institutions adopted the protocols motivated by the excellent results achieved by the Berlin Frankfurt Münster group. In spite of the knowledge provided by data related to the evolution of patients protocoled by the GBTLI and other studies published by medical institutions, there was not an epidemiologic evaluation or knowledge of survival indexes achieved in the state of Rio Grande do Sul. In this work, 1472 patients with ALL from the state of Rio Grande do Sul were evaluated. Among the subjects, 833 (56,59%) were male, 639 (43,41%) female, with age range between 0- 20 y average age of 7,40 (standard deviation 5,14) and median 5,70 years old (amplitude 0,06 to 20,76). Data was collected from the medical registers of patients with hematologic neoplasia in medical institutions, which offered pediatric assistance for ALL comprising the period between 1980 until 2008. In the present study, 487 patients (39,40%) were officially registered in the protocols of GBTLI; 678 (54,85%) received treatment based on the regime of the BFM group and 71 (5,75%) were treated according to other regimens (including the UKALL protocol). The cases, however, were not protocoled and, in most cases, the totality of items required for the patients registered officially were not observed. The EFS of the patients protocoled were significantly superior to those who were not protocoled (62,41% ± 2,43% and 53,86% ± 2,04% respectively) in five years. In respect to the age range, the patients which were between 15-20 years had an EFS index of 37,98% ± 4,72% in five years, which is inferior to the index of patients 0-4 years and 5-9 years: 62,78% ± 2,28% e 62,543± 2,84% respectively. An overall survival (OS) of 63,73% ± 1,49% and EFS of 57,27% ± 1,57% was observed in the population studied. These results indicate that a discussion for the implementation of projects, which can increase the indexes of cure, should be carried out. Epidemiologically, the incidence of ALL in B progenitors followed the pattern observed in developed countries with an absolute frequency peak in the age range of 2-4 years. The outcome was superior for patients coming from urban area in comparison to those from rural area. EFS and OS in infant and Down syndrome patients were inferior to the results obtained in developed countries, showing how important it is to review the conditions of the assistance provided to these patients. The objective of this work is to present the development of ALL treatment in childhood and adolescence in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, from its beginning until the current days providing data, which can be analyzed and interpreted posteriorly

O tratamento para a Leucemia Linfoblástica Aguda LLA utiliza, entre outros fármacos, a enzima L-asparaginase (ASNase) proveniente da bactéria Escherichia coli. Reações imunológicas estão entre os problemas do tratamento com ASNase, e a formação de anticorpos contra essa proteína pode impedir o sucesso no tratamento. Duas cisteíno proteases lisossomais estão relacionadas com a degradação de ASNase nos seres humanos, a Catepsina B (CTSB) e Asparagina Endopeptidase (AEP). Em estudos prévios do nosso grupo obteve-se mutantes de ASNase resistentes a degradação por CTSB e/ou AEP in vitro. Nesse trabalho avaliamos essas mutantes quanto a sua citotoxicidade em linhagens celulares de leucemia e conduzimos estudos in vivo, aplicando as proteoformas de ASNases em camundongos Balb C para avaliar a atividade asparaginase sérica das enzimas ao longo do tempo, bem como obter informações sobre a formação de anticorpos contra essas proteoformas. Nos ensaios de citotoxicidade, duas das proteoformas testadas tiveram efeito citotóxico semelhante a forma selvagem, enquanto uma outra proteoforma tem a citotoxicidade sensivelmente reduzida. Já nos ensaios in vivo, uma proteoforma demonstrou meia vida sérica maior da atividade asparaginásica, e duas proteoformas causaram reduzida formação de anticorpos. Juntos, esses resultados colaboram para a obtenção de uma nova geração de ASNases com melhor biodisponibilidade, e efeitos adversos reduzidos, gerando a possibilidade de menores doses e frequência de aplicações. / The Treatment for Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) includes the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli. Immunological reactions are among the problems of treatment using ASNase, and the antibodies formation protein may prevent success in treatment. Lysosomal cysteine proteases are related to ASNase degradation, Cathepsin B (CTSB) and Asparagine Endopeptidase (AEP). In previous studies, ASNase mutants resistant to CTSB and / or AEP degradation in vitro were obtained. In this work, mutants were evaluated in cytotoxicity in ALL cell lines and, in vivo studies, applying doses of the wild and mutant ASNases in Balb C mice to evaluate serum asparaginase activity of the enzymes over time, as well as to obtain information on the formation of antibodies against these proteoforms. Regarding to the cytotoxicity, two proteoforms among the tested had similar cytotoxicity than the wild-type. While another proteoform had the cytotoxicity severely reduced. One proteoform have demonstrated greater serum half-life of asparaginase activity, while two other mutants caused reduced antibody formation. Together, these results collaborate to obtain a new generation of ASNases with increased bioavailability and reduced side effects, generating the possibility of lower doses and frequency of applications.