Thèse d'exercice : Médecine. Anatomie et cytologie pathologiques : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Le récepteur de basse affinité pour les fragments Fc des immunoglobulines G, FcgammaRIIB, joue un rôle clé dans la régulation négative des réponses immunes. Il est capable d'inhiber les fonctions cellulaires B induites par le BCR, ainsi que à induire un processus de mort cellulaire, encore très peu caractérisée dans la littérature. Récemment, un rôle potentiel de FcgammaRIIB dans la tumorigenèse a été identifié. En particulier, la dérégulation de l'expression de FcgammaRIIB suite à des translocations chromosomiques a été rapportée dans des cas de lymphomes folliculaires. Nous avons, ainsi étudié les conséquences du recrutement des récepteurs FcgammaRIIB dans des lignées de lymphome B. Nous montrons que le co-recrutement de récepteurs FcgammaRII à l'aide d'anticorps anti-FcgammaRII (FLI 8.26) induit la mort cellulaire de cellules de lymphome B, mais n'induit pas la mort des lymphocytes B normaux. Ce processus apoptotique dans les cellules tumorales B est caspase dépendant (libération du cytochrome c, clivage de la caspase-9, activation de la caspase-3) et indépendant (libération d'AIF). Nous montrons que la phosphorylation des récepteurs FcgammaRIIB est un événement précoce dans la voie de signalisation apoptotique. De plus, le traitement par FLI 8.26 a induit l'expression de la protéine HSP27. Nos résultats ont montré pour la première fois les mécanismes de mort cellulaire FcgammaRIIB dépendante dans les lymphomes B humains. Nous suggérons que la mort cellulaire FcgammaRIIB dépendante pourrait ainsi, être mise à profit en thérapeutique.

Ce travail a eu pour objectif de proposer des modèles conjoints d'intensités de processus d'événements récurrents et d'un événement terminal dépendant. Nous montrons que l'analyse séparée de ces événements conduit à des biais d'estimation importants. C'est pourquoi il est nécessaire de prendre en compte les dépendances entre les différents événements d'intérêt. Nous avons choisi de modéliser ces dépendances en introduisant des effets aléatoires (ou fragilités) et de travailler sur la structure de dépendance. Ces effets aléatoires prennent en compte les dépendances entre événements, les dépendances inter-récurrences et l'hétérogénéité non-observée. Nous avons, en premier lieu, développé un modèle conjoint à fragilités pour un type d'événement récurrent et un événement terminal dépendant en introduisant deux effets aléatoires indépendants pour prendre en compte et distinguer la dépendance inter-récurrences et celle entre les risques d'événements récurrents et terminal. Ce modèle a été ajusté pour des données de patients atteints de lymphome folliculaire où les événements d'intérêt sont les rechutes et le décès. Le second modèle développé permet de modéliser conjointement deux types d'événements récurrents et un événement terminal dépendant en introduisant deux effets aléatoires corrélés et deux paramètres de flexibilités. Ce modèle s'avère adapté pour l'analyse des risques de récidives locorégionales, de récidives métastatiques et de décès chez des patientes atteintes de cancer du sein. Nous confirmons ainsi que le décès est lié aux récidives métastatiques mais pas aux récidives locorégionales tandis que les deux types de récidives sont liés. Cependant ces approches font l'hypothèse de proportionnalité des intensités conditionnellement aux fragilités, que nous allons tenter d'assouplir. Dans un troisième travail, nous proposons de modéliser un effet potentiellement dépendant du temps des covariables en utilisant des fonctions B-Splines. / This work aimed to propose joint models for recurrent events and a dependent terminal event. We show how separate analyses of these events could lead to important biases. That is why it seems necessary to take into account the dependencies between events of interest. We choose to model these dependencies through random effects (or frailties) and work on the dependence structure. These random effects account for dependencies between events, inter-dependence recurrences and unobserved heterogeneity. We first have developed a joint frailty model for one type of recurrent events and a dependent terminal event with two independent random effects to take into account and distinguish the inter-recurrence dependence and between recurrent events and terminal event. This model was applied to follicular lymphoma patient’s data where events of interest are relapses and death. The second proposed model is used to model jointly two types of recurrent events and a dependent terminal event by introducing two correlated random effects and two flexible parameters. This model is suitable for analysis of locoregional recurrences, metastatic recurrences and death for breast cancer patients. It confirms that the death is related to metastatic recurrence but not locoregional recurrence while both types of recurrences are related. However, these approaches do the assumption of proportional intensities conditionally on frailties, which we want to relax. In a third study, we propose to model potentially time-dependent regression coefficient using B-splines functions.

Le lymphome folliculaire (LF) représente le 2ème lymphome par ordre de fréquence et reste considéré à l’heure actuelle comme incurable. De nombreuses questions sur le processus de lymphomagénèse sont encore non résolues et il n’existe aucun marqueur génomique ou moléculaire unanimement reconnu permettant de prédire l’évolution des patients. Nos travaux de recherche s’inscrivent dans l’objectif de mieux comprendre l’impact des altérations moléculaires identifiées dans ces tumeurs, grâce à une approche intégrative visant à combiner des données génomiques, transcriptomiques et mutationnelles. Ce travail a permis de construire un score, basé sur l’expression d’un panel de gènes, prédictif du risque de progression de la maladie. Ce score a été confirmé sur une seconde cohorte de patients, validant son utilité potentielle en pratique clinique. Par ailleurs, nos résultats suggèrent que les cellules tumorales peuvent acquérir des propriétés évocatrices d’un profil de cellules souches et associées à un pronostic particulièrement défavorable. Une 2ème partie de notre travail a porté sur les altérations touchant le gène EZH2, muté chez 25% des patients. Nous avons démontré qu’un gain génomique au niveau du locus EZH2 pouvait également avoir des conséquences sur le profil transcriptomique et un impact pronostique, soulignant l’importance de prendre en compte l’ensemble des anomalies touchant ce gène. Enfin, nous rapportons qu’un polymorphisme constitutionnel situé dans ce gène est associé au risque de progression des patients traités par un anticorps anti-CD20. L’ensemble de ces résultats apporte un éclairage nouveau sur la biologie du LF et peut contribuer à améliorer la prise en charge des patients / Follicular Lymphoma (FL) is the 2nd most frequent lymphoma subtype and is usually considered incurable with current strategies. Several questions regarding the lymphomagenesis process are still pending, and no molecular or genomic marker has been unanimously recognized yet to predict outcome. We performed an integrative analysis combining genomic, transcriptomic and mutational data in the view to bringing new highlights in the molecular alterations acting in FL. Based on gene-expression profiling data we developed a model able to predict progression-free survival in FL patients. We confirmed its predictive value in another cohort of patients, thereby allowing its potential use in clinical practice. Furthermore, our results highlight that some tumors show a stem-cell-like gene-expression profile that was associated with highly unfavorable outcome. In the second part of our work, we focused on alterations of the gene EZH2. Although mutations have been reported in 25% of FL patients, we questioned whether genomic gains at EZH2 locus could also contribute to lymphomagenesis. We showed that such gain may impact the transcriptional profile and have a prognostic significance, thus highlighting the crucial interest of determining both kinds of alterations. Finally, we report that a germ-line polyporphism in the EZH2 gene was significantly associated with progression-free survival in patients treated by anti-CD20 therapy. Taken together, these results bring new highlights on FL biology and may help to improve the clinical management of FL patients

Un microenvironnement riche en IL-4 a été mis en évidence dans le lymphome folliculaire (FL). Cette IL-4 impliquée dans la croissance tumorale a été démontrée comme principalement secrétée par les lymphocytes T follicular helper (Tfh). Dans cette étude, nous étudions l’interaction bidirectionnelle entre les cellules fibroblastiques réticulaires (FRC) dont le réseau est augmenté dans le FL et les lymphocytes Tfh par analyse des profils d’expression génique, et co-culture in vitro des lymphocytes Tfh primaires avec des cellules fibroblastiques humaines de type FRC-like. Nous démontrons que les cellules FRC-like augmentent in vitro la croissance des sous-populations de Tfh. De plus, nous avons mis en évidence une augmentation spécifique de la sécrétion d’IL-4 par les précurseurs Tfh (pre-Tfh) co-cultivés avec les cellules FRC-like, augmentation d’IL-4 impliquant les voies Notch et ICAM1/LFA1. Cette observation est particulièrement intéressante dans le contexte du FL car les lymphocytes pre-Tfh de FL comparés à des lymphocytes pre-Tfh d’amygdales non tumorales sont caractérisés par un profil d’expression génique enrichi en gènes des voies Notch et des intégrines en plus d’une surexpression d’IL-4. En conclusion, notre description de l’interaction entre les cellules stromales et les sous-populations Tfh démontrent une modification du profil cytokinique des Tfh au stade précurseur qui pourrait expliquer le profil cytokinique retrouvé dans le microenvironnement du FL, et apporter de nouveaux éléments pour la mise en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. / The enrichment of the microenvironment with tumor-promoting interleukin 4 (IL4) has been implicated in the pathogenesis of follicular lymphoma (FL) and was found to be conferred mainly by T follicular helper (Tfh) cells. In this study, we investigated the bidirectional crosstalk of fibroblastic reticular cells that are expanded in FL and Tfh cells with the analysis of gene expression profiles of the respective, and an in-vitro co-culture model of human induced FRC-like cells. We demonstrated that FRC-like cells enhance the growth of Tfh cell subsets in vitro. Crucially, we uncovered a specific upregulation of IL-4 secretion by precursor Tfh (pre-Tfh) cells co-cultured with FRC-like cells. Additionally, we demonstrated that Notch and ICAM1/LFA1 are two pathways involved in IL-4 secretion following FRClike cell / Tfh cell crosstalk. This observation was particularly interesting in FL context, because FL pre-Tfh cells display an enriched Notch and integrin gene expression profile as well as an overexpression of IL-4, compared to their tonsil counterpart. Altogether, we described new interactions between stromal cells and Tfh subsets and uncovered a specific cytokine profile modification at pre-Tfh stage after contact with FRC-like cells that could explain the high levels of IL-4 in FL and provide a novel target for therapy.

Le lymphome folliculaire (FL) est le lymphome B indolent le plus fréquent. Outre des altérations géniques récurrentes, le micro-environnement tumoral, et notamment les cellules stromales lymphoides,joue un rôle majeur dans le développement de ce cancer. Cependant, la caractérisation in-situ des cellules stromales lymphoïdes chez l'homme tout comme les facteurs menant à la polarisation du stroma en un stroma protumoral ont été peu étudiés. Dans cette thèse, nous avons montré, que les cellules stromales présentes dans les ganglions et la moelle osseuse envahis des patients atteints de FL surexpriment fortement la chimiokine CXCL12. Nous avons ensuite tenté de comprendre les mécanismes responsables de cette induction. Alors que les cellules B tumorales induisent une surexpression de la chimiokine CCL2 dans les cellules stromales de façon dépendante de leur synthèse de TNF, elles ne contribuent pas à l'induction de CXCL12. A l'inverse, le principal compartiment TCD4 impliqué dans la croissance tumorale du FL, les cellules T follicular helper (TFH), augmentent l'expression de CXCL12 dans les cellules stromales. Le taux d'IL-4, la principale cytokine produite par les TFH de FL, est d'ailleurs corrélé à celui de CXCL12 au sein de ma niche tumorale du FL. De plus, à l’aide d'un modèle de différenciation en stroma lymphoide, nous avons démontré que l’IL4 induit l’expression de CXCL12 par les cellules stromale in vitro. Cette production est augmentée quand les cellules stromales sont déjà engagées vers la voie de différentiation lymphoide par un traitement TNF/LT qui favorise l'activation de STAT6 par l'IL-4. Nous avons validé ces résultats dans un modèle de formation d'organe lymphoide ectopique chez la souris. Enfin, CXCL12 induit la migration et l'adhésion au stroma des B de FL via l'activation de cascades de signalisations qui peuvent être abrogées par l'utilisation d'un inhibiteur de Btk utilisé en clinique, l'Ibrutinib. Ces résultats sont en faveur de l'intérêt de considérer la boucle IL-4/CXCL12 pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette pathologie constamment fatale. / Follicular lymphoma (FL) is the most frequent indolent B-cell lymphoma. Beside recurrent genetic alterations, tumor microenvironment, including lymphoid stromal cells, has been shown to play a key role in FL development. However, in situ characterization of lymphoid stromal cells is still lacking in humans and there are very few studies focusing on the factors that could lead to stroma polarization in normal and pathological context. In this thesis, we showed first that in FL, lymph node (LN) and bone marrow (BM) infiltrating stromal cells highly express the chemokine CXCL12. We next focused on the mechanisms underlying this upregulation. Interestingly, whereas malignant FL B cells induced overexpression of CCL2 in stromal cells in a TNF-dependent manner, they did not contribute to CXCL12 induction. Conversely, FL-infiltrating follicular helper T cells (FL-TFH), the key FL-supportive T-cell subset could trigger CXCL12 expression in stromal cells. IL-4 is the main FL-TFH-derived cytokine and showed a positive correlation with CXCL12 expression inside FL cell niches. Moreover, based on our in vitro lymphoid stroma differentiation model, we demonstrated that IL-4 promoted CXCL12 expression in stromal cells, together with a phenotype close to that identified in situ within FL cell niche. Such IL4 dependent CXCL12 regulation is more pronounced in stromal cells already committed towards lymphoid stromal cells by a prestimulation by TNF/LT in association with an increased STAT6 activation. These data were validated in a model of ectopic lymphoid organ formation in mice. Finally, CXCL12 induced FL B-cell migration, and adhesion to stromal cells through the activation of a signaling pathway that could be abrogated by the Btk inhibitor Ibrutinib. These data argue for considering IL-4/CXCL12 axis as a potential therapeutic target to disrupt FL protective cell niche in this still fatal malignancy.

La voie PI3K/AKT est impliquée dans la progression de divers cancers humains, et semble jouer un rôle majeur dans le développement de tumeurs lymphoïdes. Elle pourrait être impliquée dans la pathogénie du lymphome folliculaire (LF) par certains mécanismes non identifiés. Les travaux de thèse portent sur l'étude des anomalies de la voie PI3K/AKT dans le LF, dans le but d'apporter une nouvelle cible thérapeutique. 38 biopsies tissulaires de LF humain ont été étudiées pour une analyse mutationnelle du gène PIK3CA dans les exons 9 et 20 par séquençage. Les mêmes échantillons ont été analysés par western blot et immunohistochimie pour détecter l'expression des protéines AKT, AKT phosphorylée (pAKT), et PTEN. Deux cas de lymphadénite ont été utilisés comme témoins.Les résultats obtenus montrent que l'expression d'AKT était présente dans tous les cas de LF et lymphadénite, et 14/38 (37%) échantillons de LF et 2/2 cas de lymphadénite exprimaient pAKT. 9/38 (24%) échantillons de LF ont montré un niveau élevé d'expression de pAKT, alors que 5/38 (13%) cas de LF, et 2/2 échantillons de lymphadénite montraient un faible niveau d'expression de pAKT. L'expression de PTEN a été observée dans 30/38 (79%) cas de LF et 2/2 cas de lymphadénite, tandis que 8/38 (21%) cas ont montré une perte d'expression de PTEN. En outre, 3 cas qui expriment pAKT montrent une perte d'expression de PTEN. Aucune mutation du gène PIK3CA n'a été détectée dans les échantillons étudiés. Ces données suggèrent que la voie PI3K/AKT peut être activée dans certains cas de LF, soit en raison de la phosphorylation d'AKT, soit en raison d'une perte d'expression de PTEN, en absence de mutations de PIK3CA. / The phosphoinositide 3- kinase (PI3K) pathway is involved in the growth of various human cancers, including lymphoid malignancies. However its role in the pathogenesis of follicular lymphoma (FL) has not been yet described.The PhD work focuses on the study of alterations in the PI3K/AKT pathway in follicular lymphoma, in order to provide a new therapeutic target.To clarify this point, biopsy tissue samples from 38 human FL cases were investigated for PIK3CA somatic mutations in exons 9 and 20 using Sanger sequencing. The same samples were analyzed using western blotting and immunohistochemistry to detect expression of AKT, phosphorylated AKT (pAKT), and PTEN proteins. Two cases of benign lymphadenitis were used as controls. AKT expression was present in all FL and lymphadenitis cases. 14/38 (37%) FL and 2/2 lymphadenitis cases expressed pAKT. 9/38 (24%) FL samples showed high level of pAKT, whereas 5/38 (13%) FL cases and 2/2 benign lymphadenitis samples expressed pAKT at low level. PTEN expression was observed in 30/38 (79%) FL and 2/2 benign lymphadenitis cases, whereas 8/38 (21%) of FL cases showed loss of PTEN expression. In addition, 3 cases with positive pAKT did not express PTEN. PIK3CA mutations were not detected in any sample. These data suggest that the PI3K/AKT signaling pathway could be activated in a subset of FL cases, due to either AKT phosphorylation or PTEN downregulation, in the absence of PIK3CA mutations.

L'étude de la survie nette des patients atteints de cancer en population générale permet d'apprécier l'efficience globale du système de soin d'un pays. La survie nette se définit comme la survie qui serait observée si la seule cause de décès possible était le cancer. Ce concept est fondamental dans les comparaisons entre zones géographiques et/ou périodes de diagnostic dont l'intérêt est d'estimer les variations spécifiques de la mortalité due au cancer. Le concept de survie nette permet de prendre en compte les éventuelles différences de mortalité naturelle entre les groupes comparés. Actuellement, seuls deux outils estiment la survie nette sans biais : l'estimateur non paramétrique de Pohar-Perme et la modélisation paramétrique ajustée sur certaines covariables (essentiellement l'âge). Par ailleurs, les outils paramétriques s'étant perfectionnés, de nouveaux modèles flexibles permettent de modéliser les effets complexes des variables sur la mortalité. Ce travail repose sur la modélisation du taux de mortalité en excès à la suite d'un lymphome malin non hodgkinien, en se basant sur le modèle proposé par Remontet et al. et sur la nécessité de modéliser conjointement les effets complexes des covariables (telles que le temps de suivi, l'année de diagnostic et l'âge) sur la mortalité à l'aide d'une stratégie de modélisation adaptée. L'effet des variables est restitué sur la survie nette mais aussi sur le taux de mortalité en excès ce qui représente un élément nouveau dans les études de survie. Deux applications ont été menées sur des bases de données collaboratives de population : d'une part sur les données françaises du réseau FRANCIM à la suite d'un diagnostic de lymphome folliculaire entre 1995 et 2010 et, d'autre part, sur les données européennes d'EUROCARE-5 après un lymphome folliculaire ou un lymphome B diffus à grandes cellules diagnostiqué entre 1996 et 2004. Les résultats montrent que la dynamique du taux de mortalité en excès au cours du temps de suivi varie en fonction du sous-type de lymphome, de l'âge et de la zone géographique. Les tendances de cette dynamique en fonction de l'année de diagnostic sont également différentes / The net survival of cancer patients in population studies is the most relevant indicator to assess the overall efficiency of the healthcare system of a country. Net survival is defined as the survival that would be observed if the sole cause of death were cancer. This concept is crucial in comparative studies (between geographical areas and/or periods of diagnosis) that estimate specific variations of cancer-related deaths. Net survival takes into account potential differences in mortality patterns between groups. Currently, two methods provide unbiased estimations of net survival: the non-parametric estimator of Pohar-Perme and the parametric model adjusted on specific covariates (mainly, the age at diagnosis). Moreover, new improved parametric tools, such as flexible models, can model the complex covariate effects on mortality. In this work, we modeled the excess mortality rate after a non Hodgkin lymphoma diagnosis, with a model developed by Remontet et al. In addition, we used an appropriate model-building-strategy to model jointly the complex effects of some covariates (such as the time elapsed since diagnosis, the year of diagnosis, and age) on the excess mortality. Finally, this approach allowed for the covariate effects on the net survival and on the excess mortality rate. We applied this method to two different collaborative databases: first on the French database FRANCIM (1995 to 2010) to study the excess mortality after diagnosis of follicular lymphoma, then on the European data of EUROCARE-5 (1996 to 2004) to study the excess mortality after diagnosis of follicular lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma. According to the results, the dynamics of the excess mortality rate varies over the time elapsed since diagnosis according to the lymphoma subtype, the age, and the geographical area. The trends of these dynamics over the years of diagnosis are different too

En France, les hémopathies lymphoïdes, se situant au sixième rang des cancers les plus fréquents, sontun problème majeur de santé publique. Ce travail a pour objectif d’étudier l’impact de la prise en charge thérapeutiquesur la survie et sur la qualité de vie (QdV) des patients atteints de ce type d’hémopathies. Le premierobjectif de ce travail est un état des lieux de l’épidémiologie des hémopathies lymphoïdes avec l’étudede l’évolution de l’incidence et de la survie nette en Côte d’Or entre 1980 et 2009. L’incidence, en nette augmentationdepuis 1980, semble se stabiliser depuis les années 2000 pour certaines entités, notamment pourles lymphomes folliculaires (LF) et les lymphomes B diffus à grandes cellules (LBDGC). Nous observons globalementune amélioration de la survie nette avec, toutefois, un pronostic à court et à long terme qui restedéfavorable pour certaines entités. Les LF et les LBDGC sont les premiers lymphomes à bénéficier de l’introductiondes anticorps monoclonaux dans leur prise en charge thérapeutique. Notre deuxième étude a pourobjectif demesurer l’impact du rituximab sur la survie globale des patients atteints d’un LF ou d’un LBDGC enCôte d’Or en utilisant une méthodologie basée sur le score de propension. Nos résultats confirment le bénéficesignificatif du rituximab sur la survie globale en population générale, sans critère de sélection. En vue de cesrésultats, nous avons étudié la QdV de ces patients pendant et à la suite de la prise en charge thérapeutique. LaQdV évolue différemment au cours du suivi en fonction du type de lymphome. / In France, hematologic malignancies, which are the sixthmost common cancers, are amajor public healthproblem. This work aimed to study the impact of the therapeutic management on survival and healt-relatedquality of life (HRQoL) in patients with these hematologic malignancies. The first objective of this work is topresent an overview of the epidemiology of lymphoid malignancies with a study of changes in the incidenceand net survival in the Côte d’Or department between 1980 and 2009. The incidence, which has increased since1980, seems to have stabilized since the 2000s for some entities, including follicular lymphoma (FL) and diffuselarge B-cell lymphoma (DLBCL). Overall, we observed an improvement in net survival, with, however, a lessfavorable prognosis in the short and long-term for some entities. FL and DLBCL were the first lymphomas tobenefit from the introduction of monoclonal antibodies in their therapeutic management. Our second studyaimed to assess the impact of rituximab on overall survival in patients with FL or DLBCL in the Côte d’Or departmentusing a methodology based on the propensity score. Our results confirmed the significant benefit ofrituximab on overall survival in an unselected population of patients. In view of these results, we studied theHRQoL of these patients during and after treatment. HRQoL evolved differently during follow-up dependingon the type of lymphoma.