La métagénomique vise à étudier le contenu génétique et génomique d'un échantillon provenant d'un environnement naturel. Cette discipline récente s'attache à étudier les génomes de différents organismes provenant d'un même milieu. La métagénomique pose de nouvelles questions, tant d'un point de vue biologique qu'informatique. Les masses de données générées par les études métagénomiques et la complexité des milieux étudiés nécessitent de développer de nouvelles structures de données et de nouveaux algorithmes dédiés. Parmi les différentes approches existantes en métagénomique, la métagénomique comparative consiste à comparer plusieurs métagénomes afin d'en connaitre les divers degrés de similarité. Lorsque cette comparaison se base uniquement sur le contenu brut des échantillons, sans faire appel à des connaissances externes, on parle de métagénomique comparative de novo. L'objectif des travaux que nous proposons est de développer une méthode permettant d'extraire les séquences similaires entre deux jeux de données métagénomiques, où chaque jeu peut être composé de centaines de millions de courtes séquences d'adn. La comparaison proposée consiste à identifier les séquences d'un premier jeu similaires à au moins une séquence d'un second jeu. Afin d'être rapide et économe en mémoire, l'implémentation de notre méthode a nécessité la conception d'une nouvelle structure d'indexation, basée sur le filtre de bloom. Le logiciel final, nommé Compareads, a une consommation mémoire faible (de l'ordre de quelques go) et peut calculer l'intersection de deux échantillons de 100 millions de séquences chacun en une dizaine d'heures. Notre méthode est une heuristique qui génère un faible taux de faux positifs. Le logiciel Compareads est dédié à l'analyse de grands jeux de données métagénomiques. À l'heure actuelle, il est le seul outil capable de comparer de tels jeux. Compareads a été appliqué sur plusieurs projets métagénomiques. Notre outil produit des résultats robustes, biologiquement exploitables et en accord avec diverses méthodes fondamentalement différentes. Il est actuellement utilisé de manière intensive sur les échantillons provenant de l'expédition tara oceans. Sur ce projet, notre méthode a permis de mettre en évidence que les grands systèmes océaniques influent sur la répartition globale des microorganismes marins.

Le séquençage ADN d'échantillons complexes contenant plusieurs espèces est une technique de choix pour étudier le paysage viral d'un milieu donné. Or les génomes viraux sont difficiles à identifier, de par leur extrême variabilité et la relation étroite qu'ils entretiennent avec leurs hôtes. Nous proposons de nouvelles pistes de recherche pour apporter une solution spécifique aux séquences virales afin de répondre au besoin d'identification pour lequel les solutions génériques existantes n'apportent pas de réponse satisfaisante. / DNA sequencing of complex samples containing various living species is a choice approach to study the viral landscape of a given environment. Viral genomes are hard to identify due to their extreme variability and the tight relationship they have with their hosts. We hereby provide new leads for the development of a virusesspecific solution to the need for accurate identification that hasn't found a satisfactory solution in the existing universal software so far.

La phytoremédiation, la technique de bioremédiation qui utilise les plantes, est considérée comme une technologie « verte » et efficace pour décontaminer des sols pollués aux hydrocarbures. Les plantes agissent essentiellement à travers la stimulation des microorganismes de la rhizosphère, où l’exsudation racinaire semble être le moteur majeur de l’activité microbienne qui s’y déroule. Beaucoup de gènes responsables de l’adaptation bactérienne, dans le sol contaminé ou dans la rhizosphère, semblent être portés par les plasmides conjugatifs et transférés entre les bactéries. Une meilleure compréhension de ce phénomène pourrait améliorer le développement de techniques de manipulation du microbiome rhizosphérique afin d’accélérer la bioremédiation. Le but de cette recherche est d’étudier le plasmidome, soit le contenu total en plasmides, de la rhizosphère de saules provenant d’un sol contaminé aux hydrocarbures. Des analyses métagénomiques, de données obtenues à partir d’un séquençage Illumina, ont été utilisées pour étudier les fonctions portées par les plasmides. Nos résultats ont indiqué un fort effet de la contamination aux hydrocarbures sur la composition des plasmides. De plus, les plasmides contenaient des gènes impliqués dans de nombreuses voies métaboliques, telles que la biodégradation d’hydrocarbures, la production d’énergie, la transduction du signal, le chimiotactisme, et les métabolismes des sucres, acides aminés et métabolites secondaires. À ce jour, c’est la première étude de métagénomique comparative documentant la diversité des plasmides dans un contexte de phytoremédiation. Ces résultats fournissent de nouvelles connaissances sur le rôle du transfert latéral de gènes dans l’adaptation bactérienne dans la rhizosphère et dans le sol contaminé aux hydrocarbures. / Phytoremediation, a bioremediation technique that uses plants, is considered to be an effective and affordable “green technology” to clean up hydrocarbon contaminated soils. Plants essentially act indirectly through the stimulation of rhizosphere microorganisms. Root exudation is thought to be one of the predominant drivers of microbial communities in the rhizosphere and is therefore a potential key factor behind enhanced hydrocarbon biodegradation. Many of the genes responsible for bacterial adaptation in contaminated soil and the plant rhizosphere are thought to be carried by conjugative plasmids and transferred among bacteria. A better understanding of these phenomena could thus inform the development of techniques to manipulate the rhizospheric microbiome in ways that improve hydrocarbon bioremediation. This research aims to study the plasmidome (the overall plasmid content) in the rhizosphere of willow growing in hydrocarbon contaminated and non-contaminated soils, as compared with unplanted soil. Metagenomic analyses based on Illumina sequencing were used to highlight functions carried by plasmids. Our results indicate a strong effect of hydrocarbon contamination on plasmid composition. Furthermore, plasmids harbored genes involved in several metabolic pathways, such as hydrocarbon biodegradation, energy production, signal transduction, chemotaxis, metabolisms of carbohydrates, amino acids and secondary metabolites. To date, this is the first comparative soil metagenomics documenting the plasmidome diversity in a phytoremediation system. The results provide new knowledge on the role of lateral gene transfer in the bacterial adaptation in rhizosphere and in hydrocarbon contaminated soil.

Ce travail de thèse a pour but de modéliser la capacité de dégradation des polysaccharides non digestibles par le microbiote intestinal humain. Nous exploitons pour cela des données métagénomiques. Il s'agit de données d'abondances de séquences de nucléotides dans 1408 échantillons dont les fonctions métaboliques sont assignées par annotation contre une base de données. Les séquences sont annotées par des marqueurs fonctionnels. Après une étape de sélection manuelle de 86 marqueurs fonctionnels pertinents à l'activité de métabolisation des polysaccharides, nous étudions leurs variations d'abondances parmi les échantillons métagénomiques.Nous proposons une approche de modélisation écologique du microbiote intestinal humain et considérons principalement la sélection fonctionnelle intense de cet écosystème pour faire l'hypothèse que des regroupements identiques de fonctions métaboliques sont présents en proportions différentes dans tous les microbiotes intestinaux humains. Nous proposons le terme d'assemblage fonctionnel qui rend compte de la co-occurrence spatiale et temporelle d'un groupement de fonctions. Ces assemblages sont en pratiques déterminés par leur composition en marqueurs fonctionnels, et peuvent s'interpréter comme une combinaison de traits fonctionnels agrégés au niveau des microorganismes composant l'assemblage.Les assemblages fonctionnels sont inférés par le biais d'une factorisation en matrice positive aussi nommée NMF de l'anglais Non-Negative Matrix Factorisation. Cette méthode permet de déterminer les assemblages fonctionnels, à la fois concernant leur composition et à la fois concernant leur abondance dans chacun des 1408 échantillons. Nous exploitons par ailleurs une information métabolique provenant de 190 génomes microbiens et de la bibliographie qui permet de préciser la composition de ces assemblages fonctionnels. Cette information se traduit sous forme d'une contrainte.Nous trouvons 4 assemblages en considérant un consensus entre différents critères. L'utilisation de l'information métabolique nous permet d'interpréter biologiquement ces assemblages. Les métadonnées associées aux 1408 échantillons nous permettent d'observer un comportement différent pour les échantillons provenant d'individus atteints de la maladie de Crohn. Nous validons cette observation sur des données extérieures.Nous avons proposé une approche réductionniste permettant de représenter un processus métabolique important à l'échelle du microbiote. Nous trouvons un nombre réduit de 4 assemblages fonctionnels qui sont biologiquement vraisemblables et permettent de bien approcher les 1408 échantillons métagénomiques. / The purpose of this work of thesis is to model the capacity of degradation of non-digestible polysaccharides by the human intestinal microbiote. To this end we exploit metagenomic data. We use abundances of nucleotide sequences in 1408 samples whose metabolic function are assigned by annotation against a database. The sequences are annotated with functional markers. Upon manual selection of 86 functional markers relevant to the activity of metabolisation of polysaccharides, we their abundances variation among the metagenomic samples are studied.We propose an ecological approach in modeling the human intestinal microbiote. We consider the intense functional selection of this ecosystem and assume that identical cluster of metabolic functions can be found in different proportions in every human gut microbiota. We propose the term of functional assembly as to account for spacial and temporal co-occurence of functional cluster. In practice, theses assemblies are determined by their composition and can be interpreted as combinations of functional traits aggregated at the levels of the cluster of microorganisms composing each assembly. Functional assemblies are inferred by the means of Non-Negative Matrix Factorization (NMF). This method allows to determine the composition of functional assemblies and their abundance in each of the 1408 metagenomic sample.Furthermore, we exploit metabolic information from bibliographic resources and 190 microbial genomes in order to specify the composition of these functional assemblies. This information is translated in the form of a constraint.We find 4 assemblies by considering a consensus between various criteria. The use of metabolic information allow to interpret theses assemblies biologically. By exploiting the metadata of the 1408 samples, we observe a different behaviour for the samples coming from individuals suffering from Crohn disease. We validate this observation on external data.We proposed a reductionistic approach allowing to represent an important metabolic process at the level of the microbiota. We find a small number of 4 functional assemblies which are biologically likely and approach well the 1408 metagenomic samples.

Le choléra est une infection diarrhéique aiguë qui représente encore aujourd’hui un grave problème de santé publique dans les pays où l’accès à l’eau potable et un système d’assainissement adéquat ne peut pas être garanti. Vibrio cholerae, le pathogène bactérien responsable de cette maladie, peut provoquer toute une série de symptômes chez les individus infectés, allant d’une diarrhée intense conduisant à une déshydratation sévère, au portage asymptomatique de la bactérie. Bien que notre compréhension du choléra à une échelle macro-épidémiologique a considérablement été améliorée par le développement des techniques de séquençage à haut débit et par les avancées dans le domaine de la génomique bactérienne, aucune étude n’a encore été menée pour caractériser son évolution à l’échelle des individus infectés. De plus, le rôle des porteurs asymptomatiques au sein d’une épidémie et la raison derrière l’absence de symptômes chez ces individus infectés sont encore méconnus. L’objectif principal de cette thèse est donc de (1) caractériser la diversité génomique de V. cholerae au niveau des individus et des cercles familiaux, mais aussi (2) d’évaluer le rôle potentiel du microbiome intestinal dans la susceptibilité de contracter cette maladie entérique aiguë et de présenter des symptômes sévères. Dans un premier temps, nous caractérisons la diversité génomique de colonies isolées à partir de patients symptomatiques. Le séquençage de génomes entiers de souches provenant de patients du Bangladesh et d’Haïti révèle que cette diversité sous la forme de mutations ponctuelles reste limitée, mais détectable au sein des hôtes. Une grande partie de la variation du contenu génétique semble être surtout due au gain et à la perte de phages et de plasmides au sein de la population de V. cholerae, avec des échanges occasionnels entre le pathogène et d’autres membres commensaux du microbiote intestinal. Cela contredit l’hypothèse couramment acceptée que les infections par V. cholerae sont majoritairement clonales, et confirme que le transfert horizontal de gènes est un facteur important dans l’évolution de V. cholerae. De plus, nos résultats montrent que certains de ces variants peuvent avoir un effet phénotypique, impactant par exemple la formation de biofilms, et peuvent être sélectionnés au sein des individus infectés. Par la suite, nous appliquons une association de méthodes de séquençage de génomes entiers et de méthodes métagénomiques afin d’améliorer la détection des variants intra-hôte, à la fois chez des patients symptomatiques, mais aussi chez des porteurs asymptomatiques. Notre étude montre que l’approche métagénomique offre une meilleure résolution dans la détection de la diversité dans la population microbienne, mais reste difficile à appliquer chez des patients asymptomatiques, en raison du faible nombre de cellules de V. cholerae chez ces patients. Dans l’ensemble, nous constatons que le niveau de diversité au sein de la population bactérienne intra-hôte est similaire entre les patients symptomatiques et asymptomatiques. Nous détectons aussi la présence de souches hypermutantes chez certains patients. De plus, alors que les mutations chez les patients porteurs de phénotypes d’hypermutations ne semblent pas sous l’effet de la sélection, des signes d'évolution parallèle sont détectés chez les patients présentant un plus faible nombre de mutations, suggérant des mécanismes d’adaptation au sein de l’hôte. Nos résultats soulignent la puissance de la métagénomique combinée au séquençage de génomes entiers pour caractériser la diversité intra-hôte dans le cas d’une infection aiguë du choléra, mais aussi dans le cas de portage asymptomatique, tout en identifiant pour la première fois le phénotype d’hypermutation chez des patients infectés. Finalement, nous nous intéressons aux facteurs liés à la susceptibilité à la maladie et à la sévérité des symptômes. Basée sur une étude récente utilisant le séquençage 16S pour montrer le lien potentiel entre le microbiome intestinal et la susceptibilité à l’infection par V. cholerae, nos analyses utilisent les méthodes de séquençage métagénomique sur les mêmes échantillons de cette précédente étude afin de caractériser les profils taxonomiques et fonctionnels du microbiome intestinal de contacts familiaux exposés à V. cholerae. Les échantillons sont prélevés avant l’infection de ces contacts familiaux et l’apparition ou non de symptômes, et sont analysés pour identifier des prédicteurs à la maladie symptomatique. Grâce à un algorithme d’apprentissage machine, nous pouvons identifier des espèces, des familles de gènes et des voies métaboliques du microbiome au moment de l'exposition à V. cholerae pour détecter des biomarqueurs potentiels corrélés avec les risques d'infection et la gravité des symptômes. Nos résultats montrent que l’utilisation du séquençage métagénomique améliore la précision et l’exactitude des prévisions par rapport au séquençage 16S. Nos analyses permettent aussi de prédire la gravité de la maladie, bien qu’avec une plus grande incertitude que la prédiction de l’infection. Des taxons bactériens des genres Prevotella et Bifidobacterium ont été identifiées comme des marqueurs potentiels de protection contre l’infection, tout comme gènes impliqués dans le métabolisme du fer. Nos résultats soulignent le pouvoir de la métagénomique pour prédire l’évolution des maladies et identifient des espèces et des gènes spécifiques pouvant être impliqués dans des tests expérimentaux afin d’étudier les mécanismes liés au microbiome intestinal expliquant la potentielle protection contre le choléra. / Cholera is an acute diarrhoeal disease that remains a global threat to public health in countries where access to safe water and adequate sanitation cannot be guaranteed. Vibrio cholerae, the bacterial pathogen responsible for this disease, can cause a range of symptoms in infected individuals, from intense diarrhea leading to severe dehydration, to asymptomatic carriage of the bacteria. Although our understanding of cholera on a macro-epidemiological scale has been considerably improved by the development of high-throughput sequencing techniques and by advances in bacterial genomics, no studies have yet been conducted to characterize its evolution at the scale of infected individuals. Furthermore, the role of asymptomatic carriers in an epidemic and the reason behind the absence of symptoms in these infected individuals remains unknown. The main objective of this thesis is therefore to characterize the genomic diversity of V. cholerae at the level of individuals and households, but also to evaluate the potential role of the gut microbiome in the susceptibility to contract this acute enteric disease and to present severe symptoms. First, we characterize the genomic diversity of colonies isolated from symptomatic patients. The whole genome sequencing of strains from patients in Bangladesh and Haiti reveals that this diversity is detectable in the form of point mutations within hosts, but remains limited. Much of the variation detected within patients appears to be due to the gain and loss of phages and plasmids within the V. cholerae population, with occasional exchanges between the pathogen and other commensal members of the gut microbiota. These results challenge the commonly accepted assumption that V. cholerae infections are predominantly clonal, and confirm that horizontal gene transfer is an important factor in the evolution of V. cholerae. In addition, our results show that some of these variants may also have a phenotypic effect, for example by impacting biofilm formation, and can be selected within infected individuals. Next, we apply a combination of whole genome sequencing and metagenomic approaches to improve the detection of intra-host variants, both in symptomatic patients and in asymptomatic carriers. Our study shows that the metagenomic approach offers a better resolution in the detection of the diversity in the microbial population, but remains difficult to apply in asymptomatic patients, due to the low number of V. cholerae cells in these individuals. Overall, we find that the level of diversity within the intra-host bacterial population is similar between symptomatic and asymptomatic patients. We also detect the presence of hypermutator strains in some patients. In addition, while mutations in patients with hypermutator phenotypes did not appear to be driven by selection, signs of parallel evolution are detected in patients with fewer mutations, suggesting adaptive mechanisms within the host. Our results underline the power of metagenomics combined with whole genome sequencing to characterize intra-host diversity in acute cholera infection, but also in asymptomatic carriers, while identifying for the first time an hypermutator phenotype in infected patients. Finally, we are interested in factors related to susceptibility to the disease and related to the severity of symptoms. Based on a recent study using 16S rRNA amplicon sequencing to show the potential link between the intestinal microbiome and susceptibility to V. cholerae infection, our study uses metagenomic sequencing methods on the same samples from this previous study to characterize the taxonomic and functional profiles of the gut microbiome of household contacts exposed to V. cholerae. Samples are collected prior to infection of these household contacts, and used to identify predictors of symptomatic disease. Using a machine learning algorithm, we can identify species, gene families and metabolic pathways in the microbiome at the time of exposure to V. cholerae to detect potential biomarkers correlated with risk of infection and symptom severity. Our results show that the use of metagenomic sequencing improves the precision and accuracy of predictions compared to 16S rRNA amplicon sequencing. Our analyses also predict disease severity, although with greater uncertainty than the prediction of infection. Bacterial taxa from the genera Prevotella and Bifidobacterium have been identified as potential markers of protection against infection, as well as genes involved in iron metabolism. Our results highlight the power of metagenomics to predict disease progression and identify specific species and genes that could be involved in experimental tests to study the mechanisms related to the microbiome explaining potential protection against cholera.

La prise en compte du microbiote intestinal porcin est une approche de plus en plus considérée dans la qualification des mesures de contrôle des pathogènes alimentaires issus de cette filière de production. Toutefois, ces études, en conditions protégées, sont généralement réalisées in vivo, nécessitent des installations spécialisées, coûteuses en fonctionnement. Une alternative possible à l’utilisation des animaux serait la disponibilité d’un système in vitro mimant le microbiote intestinal cultivé en bioréacteur. Ce projet de recherche vise la mise au point d’un système de culture en bioréacteur pour la production d’un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin, puis la mesure de l’effet de deux huiles essentielles sur le microbiote. Un système, original par son alimentation continue par un digestat d’aliment conventionnel porcin, a été utilisé dans le cadre de ce projet. En effet, ce système est composé de huit réacteurs, dont un réacteur mère permettant la croissance du microbiote qui a été distribué dans les sept réacteurs fils afin de disposer de conditions reproductibles. Les résultats obtenus par séquençage métagénomique 16S par Illumina MiSeq des échantillons démontrent une grande évolution de la composition des échantillons à 48 h par rapport au contenu intestinal utilisé pour l’inoculation. Toutefois, cette variation a diminué considérablement entre 48h et 72h, pour offrir une fenêtre d’analyse de microbiotes complexes d’origine intestinale porcine pour l’évaluation d’additifs alimentaires. Dans le cadre de cette étude, l’introduction de deux huiles essentielles, le Thymol et le Carvacrol, a été testée dans le système à 48h, pour deux concentrations (200 ou 1000 ppm). Les résultats de PCR quantitative ont démontré une augmentation significative des populations de Lactobacilles dans les réacteurs contenant du Thymol à 1000 ppm en 24h (entre l’ajout à 48h et la fin de l’expérience, à 72 h) ou par comparaison avec le réacteur contrôle sans huile à la fin de l’essai, mais aucune différence significative n’a été observée pour le Carvacrol. Toutefois, aucune différence significative n’a été observée au niveau de la composition du microbiote entre les réacteurs comportant des additifs différents. Cette étude a permis le développement d’un système de bioréacteur permettant de maintenir un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin sur 72h, ainsi que sa mise en oeuvre pour mesurer l’effet de l’addition d’une huile essentielle dans un réacteur. / Pig intestinal microbiota is an approach more considered in the foodborne pathogen control qualification in the pig production. However, these studies are commonly conducted in vivo needing specific installation and significant costs. A possible alternative to the use of animals would be the used of an in vitro system to mimic the intestinal microbiota, in a bioreactor. This research project aims to setup a bioreactor system to produce a microbiota derived from the pig intestinal microbiota, and to assess the effect of two essentials oils on this microbiota. The system used in this project is unique by its design, continuously supplied using digested piglet feed as a culture media. This system is composed of eight reactors, including a mother reactor for the growth of the microbiota that was divided between seven daughter reactors to obtain reproducible conditions. Results obtained by 16S metagenomic sequencing using Illumina MiSeq of the samples showed an evolution of the sample composition at 48h compared to intestinal content used for inoculation. However, this variation decreases between 48h and 72h, offering a window for the analysis of food additives effect on the microbiota from piglet origin. In this study, two essentials’ oils, Thymol and Carvacrol, were added to the system at 48h, at a concentration of 200 and 1000 ppm, respectively. Quantitative PCR showed a significant increase of Lactobacilli in reactors containing Thymol at 1000 ppm in 24h (between the addition at 48h and the end of the experiment at 72h) or when comparing with the control reactor without oils at the end of the experiment, but no significative difference was observed for the Carvacrol. However, no significative difference was observed in microbiota composition between the reactors containing the different additives. This study enabled the development of a bioreactor system to maintain a microbiota derived from the pig intestinal microbiota over 72h, and the possibility to assess the effect of essential oils addition in a reactor.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le domaine médical a évolué drastiquement au cours des derniers siècles et la découverte du premier antibiotique, c'est-à-dire une substance qui est capable de détruire ou d'inactiver certains microorganismes, y a grandement contribué. Cette découverte a mené à une diminution du taux de mortalité causé par certaines bactéries pathogènes. Cependant, la commercialisation des antibiotiques a mené à une diversification des mécanismes de résistance par les bactéries. L'utilisation à large échelle des antibiotiques a favorisé l'émergence et le transfert de gènes de résistance aux antibiotiques (antibiotic resistance genes, ARGs) chez les bactéries. Cette résistance représente l'un des principaux enjeux de santé publique à l'échelle mondiale, en raison d'une recrudescence de maladies bactériennes qui ne répondent plus à ce traitement de première ligne. Cependant, on en sait très peu sur la dispersion des ARGs dans l'environnement et encore moins lorsqu'il s'agit de la distribution de ces gènes dans le Haut-Arctique, où les pressions climatiques risquent d'apporter plusieurs changements. L'objectif principal de ce projet est de caractériser, à l'aide d'approches métagénomiques, les ARGs des communautés microbiennes dans différents réservoirs environnementaux faisant partie d'un gradient d'influence anthropique en Arctique canadien, sur l'île de Cornwallis. Les objectifs spécifiques sont de caractériser les ARGs le long d'un continuum d'environnements influencés par l'humain (incluant un site impacté par des eaux usées) et de comparer leur distribution le long de ce gradient d'influence. Nous avons identifié des ARGs dans les tapis microbiens, l'eau du lac et les aérosols dans l'ensemble du bassin versant de Resolute Bay. Nous avons également constaté que les tapis microbiens de la région contaminée présentaient la plus grande diversité d'ARGs par rapport aux sites non contaminés. Bien que nous ayons identifiés les ARGs principalement dans les génomes bactériens, nos données suggèrent, pour la première fois, que certains virus géants sont capables d'héberger des ARGs. / The medical field has evolved dramatically over the last few centuries, and the discovery of the first antibiotic, a substance that can destroy or inactivate certain microorganisms, in 1928 was a major contributor. This discovery led to a decrease in the mortality rate caused by certain pathogenic bacteria. However, the commercialization of antibiotics has led to a diversification of various resistance mechanisms by bacteria. The widespread use of antibiotics has favored the emergence and transfer of antibiotic resistance genes (ARGs) in bacteria. Antibiotic resistance now represents one of the major global health crises due to an upsurge in bacterial-based diseases that no longer respond to this firstline treatment. However, very little is known about the dispersal of antibiotic resistance genes across different environments, and even less when it comes to the distribution of these genes in the High Arctic, where climate pressures are likely to increase the average temperature and disrupt existing microbial communities. The main objective of this project was to characterize, using metagenomic approaches, the ARGs of microbial communities in different environmental reservoirs along a gradient of anthropogenic influence in the Canadian Arctic on Cornwallis Island. The specific objectives were to characterize ARGs along a continuum of human-influenced environments (including sites impacted by sewage) and to compare their distribution along this gradient of anthropogenic influence. We identified ARGs in microbial mats, lake water and aerosols throughout the Resolute Bay watershed. We also found that microbial mats in the contaminated region had the highest diversity of ARGs relative to uncontaminated sites, and that this may be a remnant signal of the introduction of waste water. Although we identified ARGs predominantly in the genomes of bacteria, our data suggests, for the first time, that some giant viruses are capable of harbouring ARGs.

Les écosystèmes marins côtiers sont constament soumis à des pollutions, notamment aux hydrocarbures, du fait de leur localisation et de leurs caractéristiques environnementales. Le rôle clé des microorganismes dans la dégradation de ces polluants est aujourd’hui très bien décrit. Toutefois, les conditions d’oxygénation fluctuantes dans ces environnements côtiers, dues aux marées et aux activités de bioturbation de la macrofaune, influencent les communautés microbiennes.Ainsi, ce travail de thèse a eu pour objectif de caractériser, l’assemblage de communautés microbiennes hydrocarbonoclastes de sédiments marins côtiers soumises à des oscillations oxie/anoxie en présence de pétrole lors d’une expérience en bioréacteurs. L’adaptation des bactéries marines hydrocarbonoclastes notamment des genres Alcanivorax et Cycloclasticus vis-à-vis de ces variations d’oxygène a pu être investiguée par oligotypage. Des écotypes ont été identifiés en fonction des conditions d’oxygénation démontrant ainsi les capacités d’adaptation aux conditions oscillantes d’oxygène de ces deux genres. La structure des communautés archéennes (séquençage des transcrits du gène de l’ARNr 16S) n’a pas montré de modification évidente liée aux conditions d’oxygénation démontrant ainsi des capacités d’adaptation et/ou de résistance plus importantes chez ces microorganismes comparées aux communautés bactériennes. Enfin, les analyses métagénomiques ont mis en évidence une réponse fonctionnelle spécifique aux oscillations oxie/anoxie. Ainsi, ces travaux de thèse apportent de nouvelles connaissances sur l’influence des variations d’oxygénation sur les communautés microbiennes et par conséquent sur la dégradation des hydrocarbures au sein des écosystèmes marins côtiers. / Coastal marine ecosystems are constantly subject to pollution, particularly hydrocarbons, because of their location and their environmental characteristics. The key role of microorganisms in the degradation of these pollutants is now well described. However, fluctuating oxygenation conditions in these coastal environments, due to tides and macrofauna bioturbation activities influence microbial communities.Thus, this thesis work aimed to characterize the assembly of microbial hydrocarbonoclastic communities of coastal marine sediments subjected to oxic/anoxic oscillations in the presence of oil during a bioreactor experiment. The adaptation of MOHCB, particularly of Alcanivorax and Cycloclasticus genera, to these oxygen variations has been investigated by oligotyping. Ecotypes were identified according to the oxygenation conditions demonstrating adaptation capacities of these two genera to the oscillating oxygen conditions. The structure of archaeal communities (16S rRNA transcript sequencing) did not show any modification related to the oxygenation conditions thus demonstrating greater adaptation and/or resistance capacities in these microorganisms compared to the bacterial communities. Finally, metagenomics analyses revealed a specific functional response to oxic/anoxic oscillations. Thus, this thesis provides new insights into the influence of oxygenation variations on microbial communities and consequently on the degradation of hydrocarbons in coastal marine ecosystems.

La recherche en bactériologie et virologie est à la fois de nature cognitive et appliquée. Elle consiste à fédérer et mettre en place une capacité de recherche multidisciplinaire et pouvoir l'intégrer sur un champ très vaste de microorganismes et de maladies. Les nouvelles avancées conceptuelles et technologiques dans le domaine de la génomique, notamment les avancées dans les techniques à haut débit (séquençage, PCR...) permettent actuellement d’avoir rapidement des génomes bactériens et viraux entiers, ou seulement sur quelques gènes d’une grande population. Les progrès dans ce domaine permettent l’accès à ces informations en évitant une combinaison de plusieurs méthodologies, et à moindre coûts. Dans notre travail de thèse, nous avons été porté à analyser et traiter les données de deux études genomiques et métagenomiques, mettant en évidence avantages, limites et attentes liés à ces techniques. La première étude porte sur l'analyse génomique de nouveaux virus géants et chlamydia infectant Vermamoeba vermiformis. La deuxième étude concerne le pyroséquençage 16S de microbiote intestinal de nouveau-nés atteint de l'entérocolite nécrosante. Pour le premier projet du travail de thèse, nous avons analysé les génomes de trois nouvelles espèces de Chlamydiae et onze virus giants (premiers membres de deux probables nouvelles familles) qui se multiplient naturellement dans Vermamoeba vermiformis. L'objectif étant de mettre en évidence les caractéristiques génétiques spécifiques à ces micro-organismes. La deuxième partie a été consacrée à l'analyse des données de pyroséquençage 16S des selles de nouveau-nés atteints de l'entérocolite nécrosante. / Research in bacteriology and virology is both cognitive and applied. It involves federating and developing a multidisciplinary research capacity and being able to integrate it into a very broad field of microorganisms and diseases. New genomic and conceptual advances in genomics, including advances in high-throughput techniques, now permit rapid bacterial and viral genomes, or only a few genes of a large population. Progress in this area allows access to this information by avoiding a combination of several methodologies and at lower costs. In our thesis work, we were led to analyze and process the data of two genomic and metagenomic studies, highlighting advantages, limitations and expectations related to these techniques. The first study focuses on the genomic analysis of new giant viruses and chlamydia infecting Vermamoeba vermiformis. The second study concerns the 16S pyrosequencing of intestinal microbiota of neonates with necrotizing enterocolitis. The first project of the thesis work analyzed the genomes of three new species of Chlamydiae and eleven giant viruses (first members of two probable new families) which naturally multiply in Vermamoeba vermiformis. The objective is to highlight the genetic characteristics specific to these microorganisms. The second part was devoted to the analysis of 16S pyrosequencing data from neonatal enterocolitis neonatal stools. The goal was to identify an agent responsible for this disease.

Grâce au développement des technologies de métagénomique au cours des dix dernières années, il a été constaté que les micro-organismes représentent la plus grande ressource de diversité métabolique et génétique sur Terre. En effet, un gramme de sol contient 109 cellules bactériennes et 103-104 différentes espèces bactériennes. Certaines sont en mesure de réaliser des réactions enzymatiques conduisant à la dégradation complète de certains polluants toxiques pour l’environnement comme les composés organiques tels que la quinoléine. Cependant, l'immense réservoir de molécules et enzymes microbiennes n'a pas encore été exploité, car plus de 99% d'entre elles ne sont, pour l’instant, pas cultivables in vitro. Mon travail s’inscrit dans le cadre d’une collaboration entre l’Université SJTU (Shanghai Jiao Tong Université en Chine) et le groupe de G. M.E (Génomique Microbienne Environmentale) du laboratoire Ampère à l’Ecole Centrale de Lyon. Nos partenaires à l’Université SJTU ont construit un réacteur de dénitrification à l'échelle du laboratoire capable de dégrader la quinoléine en retirant la demande chimique en oxygène. Un nouvel outil appelé "Genefish" a été developpé dans notre laboratoire comme une méthode alternative de la métagénomique pour aider à la découverte de nouveaux gènes d’intérêt industriel ou environnemental. A la suite des premiers travaux réalisés dans notre laboratoire, ma thèse présentée ici comporte deux parties.Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié le potentiel de dégradation de la quinoléine présente dans les bactéries d’un sol de référence largement étudié au laboratoire. Pour cela nous avons mis en place des expériences de microcosme qui visent à révéler la diversité potentielle des bactéries responsables de la dégradation de la quinoléine. Des analyses comparatives des profils RISA (Ribosomal Intergenic Spacer analysis) nous ont permis de mettre en évidence des changements dans la structure de la communauté des bactéries du sol incubé en conditions aérobie et anaérobie en présence de quinoléine. La dégradation de la quinoléine a été confirmée par technique de GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Les travaux futurs seront de vérifier la communauté de bactéries responsables de la dégradation de quinoléine en utilisant la technique de NGS (Next Generation Sequencing).Le deuxième objectif de ma thèse a été d'utiliser Genefish dont la finalité est de capturer des gènes ciblés (le gène bcr qui serait responsable de la degradation de quinoléine dans le réacteur de nos partenaires) dans l'ADN métagénomique extrait du sol. Genefish consiste à élaborer une souche d’E.coli incluant un plasmide de capture permettant de pêcher les gènes recherchés dans un échantillon d’ADN metagénomique par recombinaison homologue. Le plasmide de capture comprend une cassette de deux gènes toxiques pour la souche qui activés par induction chimique vont permettre la sélection positive directe des clones recombinants, et deux sites multiples de clonage dans lesquels sont insérées les zones de recombinaison qui vont jouer le rôle d’hameçons. Nous avons testé la capacité de Genefish à capturer des produits PCR du gène bcr, l'efficacité de recombinaison reste faible à cause de la persistance de plusieurs copies du plasmide suicide dans la cellule après l’ évenement de recombinaison. Par conséquent, trois stratégies ont été essayées pour améliorer l’efficacité: la co-électroporation, la ségrégation de plasmide et la construction de plasmide suicide en mono-copie. Finalement, la stratégie de la ségrégation plasmidique fonctionne mais l'efficacité de recombinaison est encore trop faible peut-être due à l’incertitude des modèles de recombinaison homologue. Les travaux futurs se concentreront sur l'amélioration des fréquences de recombinaison par transfert de fragments du plasmide de capture dans le chromosome de la souche Genefish. / As the development of metagenomic technologies in the past ten years, it is unquestionned that microorganisms encompass the largest resource of metabolic and genetic diversity in the world. Actually, one gramme of soil contains more than 109 bacteria and 103-104 species. Some of their members are able to carry out enzymatic reactions leading to the complete degradation of pollutants (such as quinoline). So, the biodegradation of some highly toxic or organic compounds by microorganisms will be a general trend for pollutant treatment. However, the huge reservoir of molecules and enzymes from microorganisms still need to be explored because more than 99% of microorganisms cannot be cultivated in vitro.My work was based on collaboration between the University SJTU and Ecole Centrale de Lyon. Our partners at the University SJTU have built a laboratory scale denitrification reactor which was capable of degrading quinoline by removing the chemical oxygen demand. A new tool called "Genefish" has been developed in our laboratory as an alternative method for metagenomics which aims to discover novel industrial or environmental genes of interest. Following the early work in our laboratory, my thesis is presented here in two parts.In the first part, we set up a quinoline microcosm experiment both under aerobic and anaerobic condition using reference soil extensively studied in the laboratory at Ecole Centrale de LYON. This work aimed to reveal the potential bacterial diversity and even genes responsible for quinoline degradation. We used RISA(Ribosomal intergenic Spacer analysis) to analyze the bacteria community structure changes and GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) was also used to detect the quinoline degradation and reveal potential quinoline metabolic pathways under aerobic and anaerobic condition. Results showed great bacteria community structure changes and high quinoline degradation activity after the quinoline addition under aerobic condition. The future work is to investigate the bacteria community which may be responsible for quinoline degradation using the technique of NGS (Next Generation Sequencing).The second object of my thesis was to use the Genefish tool to capture targeted genes (the bcr gene responsible for the quinoline degradation in the wastewater treatment bioreactor) from the soil metagenome. The aim was to construct an E.coli strain containing a capture plasmid and Red system for capturing targeted genes from metagenomic DNA by homologous recombination. The capture plasmid includes a toxic cassette consisting of two suicide genes which can be activated by chemical induction, finally support the positive recombinants selection. It also contains two multiply cloning sites in which highly conserved sequences were inserted and works as the bait during recombination. We have tested the capacity of Genefish to capture the PCR products of bcr gene; the efficiency was low because of the persistence of several copies of the capture plasmid into the Genefish strain after recombination events. So, three strategies were tried to improve the recombination efficiency: co-electroporation, plasmid segregation and mono-copy capture plasmid construction. Finally, the strategy of plasmid segregation works but the recombination efficiency was still low maybe caused by the uncertain model of homologous recombination. The further research will focus on the transfer of the toxic cassette and homologous arms into the host strain chromosome, this new strategy will exclude the bad effect of low copy number capture plasmid, uncertain model of λ Red induced homologous recombination and the homologous arms site in the capture plasmid which are the most important factors influencing the homologous recombination efficiency in Genefish.