Pour pallier aux problèmes d'infertilité masculine, de plus en plus de cliniques de fertilité font appel à l'injection intracytoplasmique d'un spermatozoïde (ICSI) directement dans un ovule. Le gamète mâle peut alors être isolé du testicule, de l'épididyme, ou obtenu après éjaculation. Les risques associés à l'ICSI font l'objet de nombreux débats en ce qui concerne les modifications -en particulier épigénétiques- que cette technique peut induire sur les gamètes et la santé de la progéniture. L'objectif de ma thèse était de cartographier le profil de méthylation d'ADN spermatique dans les différents segments du tractus mâle, de comprendre les mécanismes impliqués dans ces changements, et ultimement évaluer les conséquences que ces marques épigénétiques pourraient avoir sur le développement embryonnaire. Dans le cadre de mon projet, les spermatozoïdes testiculaires et épididymaires ont été purifiés à partir du modèle de souris transgénique (CAG/su9-DsRed2, Acr3- EGFP) dans lequel les gamètes mâles présentent une fluorescence endogène et peuvent être isolés par cytométrie en flux. L'analyse par séquençage bisulfite d'une représentation réduite (RRBS) du méthylome de l'ADN spermatique a mis en évidence un profil de méthylation d'ADN variable au niveau post-testiculaire, les spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme présentant des marques de méthylation d'ADN les plus distinctes des autres régions anatomiques. L'analyse in silico de ces changements de méthylation d'ADN nous a permis de définir que la plupart des gènes ciblés par ces modifications sont associés à des fonctions importantes pour le développement embryonnaire. Afin d'étudier les mécanismes potentiellement impliqués dans ces changements, l'activité des ADN (dé)méthyltransférases a été évaluée dans l'épididyme. Bien que ces enzymes soient détectées au niveau testiculaire et post-testiculaire, leur activité est réduite dans cet organe, mettant ainsi en évidence une cause alternative à ces changements. Grâce à nos analyses de cytométrie en flux, nous avons identifié l'existence de deux populations spermatiques présentant des niveaux de fluorescence CAG-DsRed distincts dans la région proximale de l'épididyme. Ces deux populations ont des profils de méthylation d'ADN significativement différents pour trois gènes d'intérêt et sont sensibles au traitement DNAse. Ceci suggère que l'association d'ADN extracellulaire avec une sous-population spermatique serait responsable du changement du profile de méthylation d'ADN observé dans la région proximale de l'épididyme. La réalisation de ce projet nous a permis 1) de définir l'hétérogénéité du méthylome de l'ADN spermatique au cours de la maturation post-testiculaire à l'aide d'outils de pointe, et 2) d'identifier les sources potentielles de ces changements. En plus de contribuer à l'avancement des connaissances, notre recherche réalisée sur un modèle murin pourrait avoir des implications directes en santé humaine. En effet, l'évaluation du degré de conservation de cette hétérogénéité épigénétique chez l'homme pourrait ultimement améliorer les critères de sélection des spermatozoïdes de la région proximale de l'épididyme utilisés pour l'ICSI et diminuer les risques associés. / The technique, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), is applied more and more frequently in infertility clinics to overcome male infertility issues. In that context, spermatozoa can be collected from the testis, epididymis, or from the ejaculate, and directly injected into an egg. However, the risks associated with ICSI are the subject of much debate with regard to the modifications -particularly epigenetic that this technique can induce on the gametes and the health of the offspring. Therefore, the main objective of my thesis was to map-out the sperm DNA methylation profile in different segments of the male tract to understand the mechanisms involved in these changes, and ultimately to assess the consequences that these epigenetic marks could have on embryonic development. As part of my project, testicular and epididymal spermatozoa were purified from the transgenic mouse model (CAG/su9-DsRed2, Acr3-EGFP) in which male gametes exhibit endogenous fluorescence and can be isolated by flow cytometry. Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) of the sperm DNA methylome showed a variable DNA methylation profile at the post-testicular level, with sperm from the epididymal proximal region exhibiting DNA methylation marks most distinct from other anatomical regions. The in silico analysis of these DNA methylation changes allowed us to define that most of the genes targeted by these modifications are associated with important functions for embryonic development. In order to study the mechanisms potentially involved in these changes, the expression and activity of (de)methyltransferases were assessed in the epididymis. Although these enzymes were detected at the testicular and post-testicular levels, their activity was reduced in this organ, thus highlighting an alternative cause for these changes. Through our flow cytometry analyses, we identified the existence of two sperm populations with distinct CAG-DsRed fluorescence levels in the proximal region of the epididymis. These two populations displayed significantly different DNA methylation profiles for three genes of interest and were sensitive to DNAse treatment. This suggests that the association of extracellular DNA with a sperm subpopulation would be responsible for the change in the DNA methylation profile observed in the proximal region of the epididymis. The achievement of this project allowed us to 1) define sperm DNA methylome heterogeneity during post-testicular maturation using state-of-the-art tools, and 2) identify potential sources of these changes. In addition to contributing to the advancement of knowledge, our research carried out on a mouse model could have direct implications for human health. Indeed, evaluating the degree of conservation of this epigenetic heterogeneity in humans could ultimately improve the selection criteria for spermatozoa from the proximal region of the epididymis used for ICSI and reduce the associated risks.

Chez les mammifères, le passage d’une génération à une autre nécessite la reprogrammation du génome. Cette reprogrammation nécessite la déméthylation de l’ADN parternel et maternel ainsi que celle des lysines des histones suite à la fécondation. Des familles d’enzymes ont récemment été associées à ces processus : les déaminases, notamment Aicda (activation-induced cytosine deaminase), et les Tet (Ten-eleven translocation) désoxygénase, Tet1, Tet2 et Tet3. Plusieurs déméthylases des lysines des histones (KDM) ont été identifiées au cours des dernières années mais très peu d’informations sont disponibles à leur sujet, particulièrement en ce qui a trait à l’embryon bovin. Notre étude s’est attardée à dresser un profil d’expression spatiotemporel de ces familles d’enzymes lors des différents stades embryonnaires précoces chez la vache. Nous suggérons que Tet3 participe activement à la déméthylation de l’ADN, possiblement assisté par Tet2, mais sans Tet1 ni Aicda. Nous montrons également que KDM3A, KDM4A, KDM4C et KDM5B sont présents à des stades et à des endroits précis de l’embryon suggérant ainsi un rôle dans certains processus clés du développement embryonnaire. Ces informations ouvrent la voie à de nouvelles recherches afin de comprendre les modifications de l’épigénome et de réduire les anomalies épigénétiques rencontrées chez les animaux issus de certains protocoles de reproduction assistée. / In mammals, the transition from one generation to the next requires genomic reprogramming. Such epigenetic change is mediated by paternal and maternal DNA demethylation as well as histone lysines demethylation after fertilization, which is a poorly understood process. Some family of enzymes have recently been associated to those process: the deaminases, like Aicda (activation-induced cytosine deaminase), and Tet (Ten-eleven translocation) dioxygenases, Tet1, Tet2 and Tet3. Many lysine specific histone demethylases (KDM) have been identified in the past few years but little is known about their roles in mammalian embryo. The objective of this study was to develop of a spatiotemporal expression profile of those proteins at different preimplantation stage of bovine embryo. We suggest an active participation of Tet3 in DNA methylation, possibly supported by Tet2 but without Tet1 or Aicda. We also demonstrate the presence and specific localization of KDM3A, KDM4A, KDM4C and KDM5B which may suggest a role during the different embryonic stages. This information opens up the possibilities for further research in order to reduce epigenetic abnormalities associated to assisted reproduction technologies.

Chez l'homme, l'épissage alternatif (EA) affecte presque tous les gènes permettant de générer de vastes répertoires d'ARN et de protéines. L'épissage est un processus hautement régulé qui s'effectue principalement lorsque l'ARN est en cours de synthèse sur la chromatine. Beaucoup d'études suggèrent que la chromatine et ses marques épigénétiques influencent les décisions d'épissage au locus correspondant. A l'inverse, d'autres données laissent penser que l'épissage peut moduler les marques épigénétiques. Au cours de ma thèse, j'ai étudié différentes voies de couplage entre l'épissage et la chromatine. D'une part, j'ai exploré l'impact de la méthylation de l'ADN sur la régulation de l'épissage. J'ai montré que les enzymes qui méthylent l'ADN ont un effet global sur l'épissage d'exons enrichis en méthylation. Mes données suggèrent que les protéines qui lient la méthylation de l'ADN sont impliquées dans cette régulation. D'autre part, j'ai exploré les conséquences de l'EA sur la régulation de la chromatine en étudiant son impact de deux histones-methyltransferases (HMTase) : G9A et SUV39H2 dont les gènes génèrent des transcrits alternatifs. Tous les transcrits variants codent pour des protéines. La conservation des variants d'épissage de G9A dans des espèces et l'absence de différences dans leur activité HMTase, nous amènent à proposer que l'EA est associé à une fonction non liée aux histones. A l'inverse, les isoformes de SUV39H2 exhibent des activités HMTases différentes et régulent l'expression de gènes cibles différents. Ensemble, nos résultats apportent de nouvelles connexions dans le couplage épissage-chromatine et supporte un modèle où ces derniers s'auto-influencent. / In humans, alternative splicing affects almost all genes in the genome and generates extensive repertoires of RNAs and proteins. Splicing is a highly regulated process which occurs primarily when the RNA is being synthesized on chromatin. Many studies suggest that chromatin and epigenetic marks influence splicing choices to the corresponding locus. Conversely, other data suggest that splicing can modulate epigenetic marks. During my thesis, I studied different ways of crosstalk between splicing and chromatin. First, I investigated the effect of DNA methylation on splicing regulation. I have shown that the enzymes that methylate DNA have an overall effect on the splicing of exons with enriched methylation. My data suggest that proteins which bind to methylated DNA are involved in this regulation. On the other hand, I explored the impact of alternative splicing on chromatin regulation studying its impact on the expression and activity of both histone methyltransferases (HMTase): SUV39H2 and G9A. G9A and SUV39H2 generate variants transcripts whose expression is regulated according to tissues. All variants transcripts encode proteins. Conservation of G9A splice variants in species and no differences in their HMTase activity, lead us to propose that G9A alternative splicing is associated with a non-histone function. Conversely, SUV39H2 isoforms exhibit different HMTases activities, and regulate the expression of different target genes. All our results provide new connections in chromatin - splicing coupling and support a model in which they harbor self-influence.

Les streptomycètes, des bactéries au développement morphologique complexe, sont étudiés depuis des décennies en raison de leurs caractéristiques particulières incluant leur capacité à produire une grande diversité d'enzymes hydrolytiques et de molécules complexes telle que des centaines d'antibiotiques. Streptomyces coelicolor est l'organisme modèle pour l'étude des streptomycètes et le séquençage de son génome a ouvert la voie à l'étude de centaines de gènes dont la fonction est jusqu'à présent inconnue. La protéine TerD du Serratia marcescens joue un rôle dans la résistance au tellurite chez cet organisme. Plusieurs orthologues de cette protéine ont été identifiés chez le S. coelicolor. Sur la base de la similarité de leurs séquences avec la protéine TerD, ces protéines du S. coelicolor ont été désignées comme des protéines de résistance au tellurite. Ces mêmes protéines ont été identifiées comme étant induites ou réprimées dans de nombreuses conditions exemptes de tellurite, laissant croire qu'elles participent à d'autres voies métaboliques. Au cours de ce travail de doctorat, des souches mutantes du S. coelicolor ont été produites pour les gènes SCO2367, SCO2368 et SC04277, trois gènes homologues à ter D, afin d'évaluer les répercussions de la perte de ces gènes chez la bactérie.Les souches ont été caractérisées morphologiquement et nous avons démontré que la délétion de ces gènes nuit sérieusement au développement de la bactérie, à la production de spores et à la vitesse de croissance. Parallèlement, une approche protéomique a été utilisée afin de caractériser les effets de la délétion ou de la surexpression du gène SCO2368 sur la biosynthèse des protéines intracellulaires et extracellulaires de la bactérie. Ceci a permis de démontrer qu'une grande quantité de protéines reliées au stress sont induites chez les deux souches mutantes, laissant présumer qu'un déséquilibre dans le taux de cette protéine induit un stress physiologique important. Par ailleurs, différentes isoformes de la protéine SCO2368 ont été identifiées tant au niveau intracellulaire que dans le milieu extracellulaire. Par l'analyse des modifications post-traductionnelles de ces isoformes, nous avons prouvé que celles-ci étaient méthylées sur plusieurs acides aminés. De plus, nous avons démontré que la transcription du gène SCO2368 n'est pas induite par la présence de tellurite. Ces résultats démontrent que les gènes homologues à ter D ont une autre fonction que la résistance au tellurite et qu'ils jouent vraisemblablement un rôle dans la morphogénèse.

Dans le noyau cellulaire, l’ADN est compacté autour de petites protéines appelées histones formant ainsi le nucléosome, unité de base de la chromatine. Les nucléosomes contrôlent la liaison des facteurs de transcription à l’ADN et sont ainsi responsables de la régulation des processus cellulaires tels que la transcription. Afin de permettre l’expression des gènes, la chromatine est remodelée, c’est-à-dire que les nucléosomes sont repositionnés de manière à ce que la machinerie générale de la transcription puisse atteindre l’ADN afin de produire l’ARN messager. La moindre petite modification dans la fonction des facteurs de transcription ou des enzymes responsables du remodelage de la chromatine entraine des variations d’expression des gènes, et donc des maladies telles que les cancers. Le cancer du sein est le cancer le plus couramment développé chez les femmes. Cette maladie est principalement causée par l’activité du récepteur des œstrogènes ERα et de ses co-régulateurs ayant, pour la plupart, un rôle direct sur le remodelage de la chromatine. Afin de mieux comprendre le développement et la progression du cancer du sein, nous avons décidé d’étudier le rôle de deux co-régulateurs de ERα, TLE3 et KDM5A, impliqués dans le remodelage de la chromatine et dont la fonction dans le cancer du sein est indéterminée. Nous avons démontré que TLE3 est un partenaire d’interaction du facteur pionnier FoxA1, facteur nécessaire à la liaison de ERα sur l’ADN pour la transcription des gènes cibles de ce récepteur. L’interaction de TLE3 avec FoxA1 inhibe la liaison de ERα à l’ADN en absence d’œstrogènes, via le recrutement de HDAC2 qui déacétyle la chromatine, empêchant alors l’activation fortuite de la transcription en absence de signal. Quant à KDM5A, malgré sa réputation de répresseur de la transcription, dans le cancer du sein, cette déméthylase de H3K4me2/3 est un coactivateur de ERα, dû à son rôle direct sur l’expression du récepteur.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La tomate (Solanum lycopsersicum), qui forme un clade monophylétique restreint au sein de la large famille des Solanacées, est utilisée comme modèle pour l’analyse du génome, et le développement du fruit. A ce jour, de nombreux efforts ont été consacrés à l'analyse de la diversité génétique des espèces de tomate. Cependant peu de travaux ont porté sur l'analyse de la diversité épigénétique, alors qu’il est aujourd’hui admis que les processus épigénétiques jouent un rôle essentiel dans la diversité phénotypique. Dans un premier temps, le niveau de méthylation de l'ADN a été comparé dans les feuilles et les fruits de différentes variétés de tomates sauvages et cultivées. Puis la famille des gènes Enhancer of zeste (E (z)) a été analysée. Chez la tomate, cette famille comprend deux gènes fonctionnels ainsi qu’un pseudogène. Finalement la stabilité épigénétique reste un facteur majeur pouvant avoir un impact essentiel sur les stratégies de sélection végétales. En outre nous avons fait une caractérisation fine des différents aspects du développement du fruit et de la maturation. / Tomato (Solanum lycopsersicum) which forms a small monophyletic clade within the large Solanaceae family has been chosen as a model system for studying the Solanaceae genome, fruit development and ripening. At that time, many efforts have been devoted to the analysis of the genetic diversity of tomato species, little work has focused on the analysis epigenetic diversity in this clade, although there is a general agreement that epigenetic processes play essential role in the phenotypic diversity in animal and plant system. As first step, DNA methylation level was analyzed in leaves and fruits of various wild and cultivated tomato species.Additionally, the Enhancer of zest (E(z)) gene family has been analyzed. In tomato, the E(z) family consists in two functional genes (SlEZ1, SlEZ2) and in a pseudogene (SlEZ3). In addition, the epigenetic stability is an important consideration that could have a significant on strategies for crop breading. Finally, we made a fine characterization of the different aspects of fruit development and ripening. / All’interno della grande famiglia delle Solanacee è stato scelto il pomodoro (Solanum lycopsersicum) come sistema modello per studio dello sviluppo e maturazione del frutto. Molti sforzi sono stati fatti per analizzare la diversità genetica delle specie di pomodoro, pochi lavori invece riguardano l’analisi della diversità epigenetica, sebbene ci sia accordo sul fatto che processi epigenetici giochino un ruolo essenziale nella diversità fenotipica dei sistemi animali e vegetali. Inizialmente è stato analizzato il livello di metilazione del DNA in foglie e frutti delle diverse specie di pomodoro selvatico e coltivato. Inoltre, è stata analizzata la famiglia genica Enhancer of Zeste (E (z)). In pomodoro la famiglia E(z) consiste di 2 geni funzionali SlEZ1, SlEZ2 e di uno pseudogene SlEZ3. Inoltre la stabilità epigenetica è importante in quanto può avere un impatto sulle strategie di miglioramento genetico delle specie coltivate. Infine è stata condotta una attenta caratterizzazione dei meccanismi cellulari dello sviluppo del frutto e della sua maturazione.

Pendant la méiose, la division cellulaire qui forme les cellules haploïdes, les chromosomes homologues hérités de chacun des deux parents sont appariés et échangent des segments réciproques appelés crossing-overs (CO). Les CO ne sont pas distribués au hasard dans le génome et leur taux varie le long des chromosomes. Certains des mécanismes responsable ont été décrits chez les mammifères et la levure mais ne sont pas conservés chez les plantes. Les CO sont fortement inhibés dans l'hétérochromatine qui est riche en éléments répétés. Le degré élevé de méthylation d l'ADN qui caractérise les séquences répétées pourrait être un inhibiteur des CO. Cela a été clairement démontré chez le champignon Ascobolus immersus et des études récentes ont montré que la perte de méthylation modifiait la distribution des CO chez Arabidopsis thaliana. Le but de ma thèse a été de décrire plus précisément le rôle de la méthylation de l'ADN dans le contrôle des CO en l'absence de polymorphisme de séquence qui affecte aussi la recombinaison.Pour cela, j'ai mesuré la recombinaison dans différentes plantes dans lesquelles la méthylation de l'ADN a été partiellement ou totalement enlevée grâce à la mutation du gène ddm1. Pour tester l'effet opposé d'un gain de méthylation, j'ai aussi essayé de cibler la methylation de l'ADN à un point chaud de recombinaison connu. Mes résultats montrent que la parte de la méthylation de l'ADN entraîne une augmentation globale de la recombinaison. Paradoxalement, l'heterochromatine qui est normalement très méthylée est moins affectée par la perte de méthylation que le reste du chromosome, probablement car la méthylation de l'ADN a des effets à distance. L'augmentation de CO est accentuée dans les générations successives du mutant ddm1. Cependant, l'effet le plus important est observé dans les hétérozygotes où la moitié du génome seulement est hypométhylée, ce qui suggère un rôle complexe de la méthylation. Finalement, j'ai pu montrer que le polymorphisme affecte la recombinaison surtout dans l'hétérochromatine mais pas dans le sens attendu puisque les plantes homozygotes recombinent moins que les plantes hétérozygotes. / During meiosis, the cellular division that gives rise to haploid cells, homologous chromosomes inherited from each parent are paired and are subjected to reciprocal exchanges of chromosome segments called crossing-overs (COs). COs are not randomly distributed in the genome. Some of the involved mechanisms have recently been described in mammals and yeast bu they are not conserved in plants. Repeat-rich heterochromatin is suppressed for COs. The high level of DNA methylation associated with repeats could be an inhibitor of COs. This was clearly demonstrated in the fungus Ascobolus immersus and recent studies have shown that the loss of DNA methylation also affects COs in Arabidopsis thaliana. The aim of my thesis was to describe more precisely the role of DNA methylation in the control of CO distribution in the absence of any DNA sequence polymorphism which are known to affect recombination. For this purpose, I measured recombination in different plants where DNA methylation has been partially or completely removed thanks to the mutation of the DDM1 gene. To test the opposed effect of a gain of DNA methylation,.I also tried to target DNA methylation at a known recombination hotspot. My results show that the loss of DNA methylation induces a global increase of recombination. Paradoxically, the normally highly methylated heterochromatin is less affected by this loss than the rest of the chromosome, probably because DNA methylation has distal effects. The increased recombination is exacerbated in successive generations of the hypomethylated ddm1 mutants. However, the strongest effect is seen in the heterozygotes where only half of the genome is hypomethylated, suggesting a complex role in the control of CO distribution. Finally, I show that DNA sequence polymorphism affects mainly recombination in the heterochromatin but not in the expected sense, since homozygous plants recombine less than heterozygous.