Le virus de la leucémie bovine (BLV) est un rétrovirus complexe B-lymphotrope, identifié comme l'agent étiologique de la leucose bovine enzootique, une maladie lymphoproliférative qui affecte le bétail. L'infection par le BLV se caractérise par l'absence de virémie due à la latence du virus dans la majorité des cellules infectées. Cette latence résulte de la répression transcriptionnelle de l'expression virale in vivo et favorise très probablement le développement tumoral en permettant aux cellules infectées d'échapper à la réponse immunitaire développée par l'hôte infecté. Dès lors, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régulant la latence du virus BLV ainsi que sa réactivation devrait permettre d'envisager de nouvelles stratégies afin de contrer le processus de transformation cellulaire développé par cet oncovirus.<p><p>Notre laboratoire a précédemment mis en évidence le rôle de l’acétylation des histones dans la régulation transcriptionnelle du BLV. Au cours de ce travail, nous avons poursuivi l’étude du contrôle épigénétique de l’expression génique du BLV en nous focalisant sur une autre modification épigénétique généralement associée à la répression des gènes :la méthylation de l’ADN. Nous avons montré une activation transcriptionnelle du promoteur BLV par différents inhibiteurs de la méthylation de l’ADN. Nous avons également mis en évidence, grâce à la technique du séquençage au bisulfite de sodium, que l’hyperméthylation des régions U3 et R du LTR5’ d’un provirus intégré est associée à un état de latence vraie dans une lignée cellulaire dérivée d’un lymphome (La lignée L267) mais pas à un état de latence dite défective (la lignée YR2). La surexpression des méthyltransférases de l’ADN (DNMTs) DNMT1 et 3A mais pas DNMT3B répriment l’activité du promoteur BLV. Plus encore, les inhibiteurs de DNMTs augmentent de manière synergique l’activation transcriptionnelle du promoteur BLV par la protéine transactivatrice TaxBLV, et ce, de manière dépendante des sites CRE. Au niveau mécanistique, la méthylation des dinucléotides CpG situés aux positions -154 et -129 (situés dans les sites CRE1 et CRE2, respectivement) par rapport au site d’initiation de la transcription (nucléotide +1) abolit in vitro la liaison des facteurs de transcription CREB/CREM/ATF aux sites de liaison CRE1 et CRE2. De manière intéressante, la méthylation spécifique du site CpG -129 est suffisante pour induire une forte répression de l’expression d’un gène rapporteur contrôlé par le promoteur BLV, ce qui suggère que la méthylation d’un site spécifique du promoteur BLV peut réprimer la transcription virale par inhibition directe de la liaison de facteurs de transcription à leur site de reconnaissance et, dès lors, que la méthylation de l’ADN contribue à la latence virale permettant au virus d’échapper au système immunitaire. <p><p>Notre laboratoire a précédemment déterminé la structure chromatinienne du promoteur du BLV et a mis en évidence la présence de deux sites hypersensibles au sein du LTR5’, inductibles par une combinaison de PMA+ionomycine. Au cours de la seconde partie de notre thèse, nous avons étudié la structure chromatinienne de la région située entre les deux LTRs au sein de provirus intégré dans différentes lignées cellulaires chroniquement infectées, grâce à la technique de l’indirect-end-labelling. Nous avons mis en évidence, dans le génome du provirus intégré dans la lignée cellulaire YR2, trois sites hypersensibles situés respectivement en aval du gène env (SH3) et en amont du LTR3’ (SH4 et SH5). La présence de ces sites est probablement due à l’altération locale de la structure nucléosomale dans ces régions. Nous avons observé qu’un remodelage de la structure chromatinienne de la région hypersensible SH3 dans la lignée YR2 se produit durant l’activation de l’expression génique par un inhibiteur d’histone-désacétylases, la TSA. Nous avons également étudié la structure de la région hypersensible SH3 d’un provirus intégré dans une lignée cellulaire productrice de virions, la lignée NBC-13. L’extension de la région SH3 est similaire à celle observée dans les cellules YR2 en conditions induites par la TSA. Ces résultats suggèrent une transition structurale de la chromatine associée à l’activation de l’expression des gènes viraux. Néanmoins, cette région possède les caractéristiques d’un silencer transcriptionnel lorsqu’il est cloné dans un vecteur rapporteur. <p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La régulation transcriptionnelle des gènes constitue une étape clef de la biologie cellulaire. Parmi les mécanismes impliqués dans la répression génique, les modifications épigénétiques jouent un rôle fondamental. Deux machineries épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines du groupe Polycomb, établissent des profils moléculaires qui permettent de distinguer les formes active et inactive de la chromatine. L’établissement et la maintenance de la répression épigénétique des gènes interviennent dans de nombreux processus liés au développement tant biologiques (inactivation du chromosome X chez les mammifères femelles, empreinte génomique ou encore l’expression de gènes tissus-spécifiques) que pathologiques (cancers). <p><p>Au cours de notre thèse de doctorat, nous nous sommes attachés à l’étude des mécanismes par lesquels la méthylation de l’ADN est ciblée en des régions génomiques précises et participe à la répression de l’expression des gènes. La méthylation de l’ADN est catalysée par des enzymes, appelées méthyltransférases de l’ADN (DNMTs), qui transfèrent des résidus méthyls sur les cytosines. Cette modification chimique covalente constitue un niveau de contrôle transcriptionnel important :il existe une corrélation entre méthylation de l’ADN et répression de l’expression génique au niveau de sites génomiques spécifiques. En outre, il semble de plus en plus clair qu’une méthylation aberrante de l’ADN participe au processus de cancérogenèse. A l’heure actuelle, les mécanismes moléculaires par lesquels la méthylation contribue au développement, à la différenciation et à la répression génique restent peu connus. Les données de la littérature suggèrent l’existence d’un lien étroit entre la méthylation de l’ADN et la structure de la chromatine. Celle-ci est notamment régulée par des modifications post-traductionnelles des histones. Il apparaît de plus en plus évident que la méthylation de l’ADN et les modifications des histones prennent part à une «boucle de répression» assurant le maintien et la propagation d’états épigénétiques répressifs. L’étude des mécanismes de la répression médiée par les DNMTs s’avère donc étroitement liée à celle de la structure de la chromatine.<p><p>Dans ce contexte, notre travail de thèse est basé sur l’hypothèse selon laquelle les deux principaux systèmes épigénétiques, la méthylation de l’ADN et les protéines Polycomb, agiraient de concert. Les protéines Polycomb participent au système de mémoire cellulaire, régulent l’expression et la différenciation, agissent sous forme de complexes multimériques associés à la chromatine et interviennent dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Au cours de notre travail, nous nous sommes particulièrement intéressé à la protéine Polycomb EZH2 (Enhancer of Zeste) parce qu’elle possède une activité méthyltransférase d’histone sur les 27 de l’histone H3, impliquée dans la répression transcriptionnelle. <p><p>Dans un premier temps, nous avons mis en évidence un lien mécanistique entre les deux machineries épigénétiques principales, méthylation de l’ADN et protéines du groupe Polycomb. Nous avons montré qu’EZH2 interagit in vivo avec les DNMTs et purifie une activité méthyltransférase de l’ADN in vitro. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine indiquent que les DNMTs fixent les régions promotrices de gènes cibles de EZH2 et que cette liaison est dépendante de la présence d’EZH2. Par ailleurs, l’analyse des promoteurs cibles d’EZH2 par séquençage au bisulfite suggère qu’EZH2 semble également requise pour la méthylation de l’ADN de ces séquences. Nos résultats permettent l’ébauche d’un modèle où EZH2 agit comme une plateforme de recrutement pour les DNMTs (Viré et al. Nature 2006).<p><p>Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons investigué le rôle de MeCP2 dans ce modèle. MeCP2 est une protéine à domaine MBD (methyl-binding domain) qui se fixe sélectivement aux cytosines méthylées. Le recrutement de MeCP2 représente un mécanisme majeur par lequel la méthylation de l’ADN réprime la transcription. Nos données montrent que MeCP2 interagit avec EZH2 in vitro et in vivo et que ces protéines fixent des régions promotrices communes. De plus, le niveau de méthylation des cytosines semble prérequis à la présence d’EZH2. Ce travail suggère que MeCP2 puisse recruter EZH2 à la chromatine et renforcer un état réprimé de la chromatine en agissant comme un pont entre deux modifications épigénétiques essentielles, la méthylation de l’ADN et les proteins Polycomb (Viré et al. soumis). <p>En conclusion, notre travail de doctorat devrait permettre un meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de l’épigénétique et plus particulièrement de cerner comment la méthylation de l’ADN est intimement connectée au remodelage de la chromatine, participe à la répression transcriptionnelle, est spécifiquement ciblée au sein du génome et contribue au développement et à la cancérogenèse.<p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Résumé : Au Canada, un tiers des enfants souffrent d’embonpoint ou sont obèses. Les événements survenant au cours de la vie intra-utérine jouent un rôle important dans la détermination de la susceptibilité des enfants à développer des maladies liées au métabolisme énergétique comme l’obésité et le diabète. L’épigénétique pourrait expliquer en partie ce risque à long terme. Mon projet de maîtrise s’appuie sur les résultats d’une approche à l’échelle du génome qui a pour objectif d’identifier les changements épigénétiques (méthylation de l’ADN), chez les nouveau-nés, associés à une exposition fœtale à l’obésité maternelle ou au diabète gestationnel (DG). Cette stratégie a permis d’identifier le gène PRDM16 qui joue un rôle clé dans le développement du tissu adipeux brun (BAT). Un déficit dans la fonction du BAT résulte en une accumulation de lipides dans le tissu graisseux ce qui est associé au développement de maladies métaboliques. Notre hypothèse est que le profil de méthylation de l’ADN de PRDM16 et d’autres gènes centraux impliqués dans la genèse du BAT est perturbé par une exposition aux débalancements métaboliques associés à l’obésité maternelle et au DG. Cette étude inclut 133 femmes et leur nouveau-né recrutés dans la région du Saguenay-Lac-St-Jean. Les données anthropométriques et métaboliques des femmes ont été récoltées à la fin de chaque trimestre de grossesse. Une hyperglycémie orale provoquée (HGOP, 75g), entre la 24e et la 28e semaine de grossesse, a permis d’établir le diagnostic de DG selon les critères de l’OMS. À la naissance, des biopsies de placenta ont été recueillies ainsi que les données anthropométriques et métaboliques pour chaque enfant. Les niveaux de méthylation de l’ADN des gènes PRDM16, PPARGC1α, BMP7 et CTBP2 dans le placenta fœtal ont été mesurés par pyroséquençage de l’ADN traité au bisulfite de sodium. Les résultats ont montré que le DG était associé à une méthylation de l’ADN du gène BMP7 plus faible dans le placenta des nouveau-nés exposés au DG contrairement à ceux non exposés. Les niveaux de méthylation des gènes BMP7, PPARGC1α et PRDM16 étaient corrélés au statut glycémique maternel au 2e trimestre de grossesse et expliquaient une partie des niveaux de leptine dans le sang de cordon ombilical. Ces résultats suggèrent que la méthylation des gènes associés à la genèse du BAT est affectée par le DG. Ces résultats suggèrent également que le métabolisme énergétique des enfants exposés au DG est altéré ce qui pourrait mener au développement de troubles métaboliques plus tard dans la vie comme l’obésité et le diabète de type 2. // Abstract : In Canada, one third of children are overweight or obese. The events occurring during the intrauterine life play an important role in determining the susceptibility of children to develop diseases related to energy metabolism such as obesity and diabetes. Epigenetic changes can to explain this long-term risk. My project is build on the results of an epigenome-wide aiming to identify epigenetic changes (DNA methylation) in newborns associated with fetal exposure to maternal obesity and gestational diabetes (GD). This strategy has identified the PRDM16 gene which plays a key role in the development of brown adipose tissue (BAT). A deficiency in the function of BAT results in accumulation of lipids in the adipose tissue that is associated with the development of metabolic diseases. Our hypothesis is that the profile of DNA methylation at PRDM16 gene and other genes involved in BAT genesis are disrupted by exposure to metabolic dysregulation associated with maternal obesity and GD. This study included 133 women and their newborn recruited in the Saguenay-Lac-St-Jean region. Anthropometric and metabolic data of the women were collected at the end of each trimester of pregnancy. An oral glucose tolerance test (OGTT, 75g), between the 24th and 28th week of pregnancy, resulted in the diagnosis of GD according to the WHO criteria. At birth, the fetal placenta biopsies were collected and anthropometric and metabolic data for each newborn. DNA methylation levels of PRDM16, PPARGC1α, BMP7 and CTBP2 genes in fetal placenta were measured by pyrosequencing of sodium bisulfite treated DNA. The results showed that GD was associated with lower DNA methylation of BMP7 gene in the placenta of newborns exposed to GD in contrast to those not exposed. DNA methylation levels of BMP7, PPARGC1α and PRDM16 genes were correlated with maternal glycemic status in the 2nd trimester of pregnancy and partially explained leptin level variability in cord blood . These results suggest that DNA methylation of genes associated with BAT genesis is affected by GD. Therefore, energy metabolism of children exposed to GD could be altered and thus leading to the development of metabolic disorders such as obesity and type 2 diabetes later in life .

La maladie cardiovasculaire (MCV) représente encore aujourd’hui l’une des principales causes de décès et d’hospitalisation au Canada. Parmi les facteurs de risque de la MCV, la dyslipidémie est l’un des plus importants. En effet, des concentrations plasmatiques élevées de cholestérol transporté par les lipoprotéines de faibles densités (c-LDL), de triglycérides, ainsi que des concentrations faibles de cholestérol transporté par les lipoprotéines de hautes densités (c-HDL) ont été à maintes reprises identifiées comme des facteurs de risque indépendants de la MCV. Plusieurs facteurs héréditaires et environnementaux ont été associés aux concentrations de lipides plasmatiques. Toutefois, les facteurs héréditaires permettraient d’expliquer la plus grande proportion de la variabilité interindividuelle du bilan lipidique, particulièrement pour le c-HDL. Malgré l’étude de plusieurs millions de modifications génétiques, les principales causes moléculaires responsables de la forte héritabilité des concentrations de c-HDL demeurent pour l’instant encore inconnues. Afin d’expliquer l’héritabilité manquante des concentrations de lipides plasmatiques, plusieurs hypothèses ont été avancées. La présente thèse de doctorat se concentre sur celle suggérant que l’étude de la méthylation de l’ADN, une modification épigénétique considérée comme un facteur héréditaire non traditionnel, permettrait d’identifier de nouveaux fondements moléculaires associés aux dyslipidémies. Dans un premier temps, nous avons analysé la méthylation de l’ADN de plusieurs gènes du métabolisme lipoprotéique chez des sujets atteints d’hypercholestérolémie familiale (HF), un modèle humain de la MCV. Grâce à cette approche, nous avons pu démontrer que la méthylation de l’ADN de plusieurs gènes candidats (ABCA1, ABCG1, CETP, LIPC, LPL et PLTP) était associée à la variabilité du bilan lipidique, ainsi qu’avec les antécédents de maladies coronariennes athérosclérotiques. Dans un deuxième temps, une étude de la méthylation à l’échelle du génome d’un sous-groupe de patients HF nous a permis d’identifier de nouveaux loci associés à la concentration de c-HDL. Nous avons notamment observé que la méthylation de l’ADN du promoteur des gènes TNNT1 et ADRB3 était non seulement associée aux concentrations de c-HDL, mais également avec d’autres facteurs de risque de la MCV. L’ensemble des résultats présentés dans cette thèse démontre que la méthylation de l’ADN contribue à la variabilité du bilan lipidique à jeun de patients atteints d’HF et que l’étude des modifications épigénétiques pourrait aider à expliquer l’héritabilité manquante des concentrations de c-LDL, de c-HDL et de triglycérides plasmatiques.

La lysine méthyltransférase PR-Set7 est responsable de la monométhylation de la lysine 20 de l'histone H4 (H4K20me1). Son expression varie au cours du cycle cellulaire. D'un niveau peu élevé en phase S, l'enzyme atteint un niveau maximum au cours de la mitose. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser les fonctions de PR-Set7 et les raisons de cette régulation au cours du cycle. Présentés sous forme de publication, les résultats de ma thèse montrent que PR-Set7 induit un signal H4K20me1 au niveau des origines de réplication pendant la mitose, ce qui permet le recrutement des complexes de pré-réplication (Pre-RC) contenant les facteurs nécessaires à la formation des fourches de réplication lors la phase S suivante. En effet, la présence de PR-Set7 sur une séquence d'ADN spécifique est suffisante pour induire le co-recrutement des protéines du complexe Pre-RC, tandis que l'inactivation de l'enzyme conduit au contraire à un défaut d'assemblage de ces complexes suivi d'un stress réplicatif. Lors de la phase S, PR-Set7 est dégradée par le complexe Cul4-DDB1, via son interaction avec la protéine PCNA. Cette dégradation permet la disparition du signal H4K20me1 des origines et l'inhibition des complexes Pre-RC, s'assurant ainsi que les origines sont actives une seule fois par cycle cellulaire. La mutation du domaine d'interaction avec PCNA est suffisante pour empêcher la dégradation de PR-Set7, entraînant alors la maintenance du signal H4K20me1 et une activation répétée des origines pendant la phase S (phénotype de sur-réplication). L'ensemble de mes résultats établissent PR-Set7 et le signal H4-K20me1 comme un nouveau mécanisme épigénétique de contrôle des origines de réplication chez les mammifères. / The lysine methyltransferase PR-Set7 is responsible of the monomethylation of lysine 20 of histone H4 (H4K20me1). Its expression is cell-cycle regulated. With weak levels in S phase, this enzyme reach a peak level during mitosis. My PhD project was to characterize the functions of PR-Set7 and the reasons underlying its cell-cycle regulation. Presented as publications, my results show that PR-Set7 induces H4K20me1 on replication origins during mitosis, which allows recruitment of pre-replication complexes (Pre-RC) containing all the factors required to create replication forks during the next S phase. Indeed, the presence of PR-Set7 on a specific DNA sequence is sufficient to induce the co-recruitment of Pre-RC complex proteins, whereas the inactivation of this enzyme leads to defects in the assembly of these complexes followed by a replicative stress. During S phase, PR-Set7 is degraded par the Cul4-DDB1 complex through its association with PCN A. This degradation induces the disappearance of H4K20me1 on origins and inhibition of Pre-RC complexes, ensuring that origins are activated only once per cell cycle. Mutations in the interaction domain with PCNA are sufficient to prevent PR-Set7 degradation, leading to the maintenance of H4K20me1 and a multiple activation of origins during S phase (over-replication phenotype). My results establish PR-Set7 and H4K20me1 as a new epigenetic mechanism to control replication origins in mammals.

L'empreinte génomique est un mécanisme épigénétique qui conduit à l'expression d'un seul des deux allèles parentaux pour une centaine de gènes autosomaux chez les mammifères. La majorité des gènes soumis à l'empreinte est regroupée en clusters et tous ces gènes sont sous le contrôle de séquences discrètes appelées ICR (Imprinting Control Region). Les ICRs sont marquées épigénétiquement par une méthylation d'ADN et des modifications des histones alléliques. La méthylation d'ADN au niveau de ces ICRs est un facteur clé de l'empreinte et va être établie dans les lignées germinales suivant le sexe de l'embryon. Après fécondation, le nouvel embryon portera les empreintes paternelles et maternelles, ces empreintes devront alors être maintenues pendant tout le développement et interprétés dans le but de conduire à l'expression allélique des gènes soumis à l'empreinte. Cependant, la méthylation d'ADN ne peut expliquer à elle seule tous les aspects de l'empreinte génomique. Ainsi, d'autres marques épigénétiques doivent agir dans le maintien et la lecture de ces empreintes. Nous avons mis en évidence dans un premier temps que le contrôle de l'expression allélique dans le cerveau de Grb10 repose sur la résolution d'un domaine bivalent allélique spécifiquement dans le cerveau. Ces résultats mettent en avant pour la première fois un domaine bivalent dans le contrôle de l'expression des gènes soumis à l'empreinte et propose un nouveau mécanisme dans l'expression tissu spécifique de ces gènes. D'autre part, bien que des études en cellules ES aient démontré un rôle de G9a dans le maintien des empreintes au cours du développement embryonnaire, nos données suggèrent que G9a ne serait pas essentielle a ce maintien dans un contexte in vivo. / Genomic imprinting is a developmental mechanism which leads to parent-of-origin-specific expression for about one hundred genes in mammals. Most of imprinted genes are clustered and all are under control of sequence of few kilobases called Imprinting Control Region or ICR. ICRs are epigenetically marked by allelic DNA methylation and histone modifications. DNA methylation on ICRs is a key factor which is established in germ cells according to the sex of the embryo. After fecundation, the new embryo will harbored both paternal and maternal imprints which have to be maintained during the development and read to lead to allelic expression of imprinted genes. However, allelic DNA methylation alone cannot explain every aspect of genomic imprinting. Thus, there should be other epigenetic marks which act in the maintaining and reading of the imprints.Our data first indicate that bivalent chromatin, in combination with neuronal factors, controls the paternal expression of Grb10 in brain, the bivalent domain being resolved upon neural commitment, during the developmental window in which paternal expression is activated. This finding highlights a novel mechanism to control tissue-specific imprinting. On an other hand, although previous studies in ES cells show a role for G9a in the maintaining of imprints during embryonic development, our data suggest that G9a would not be essential in an in vivo model.

La méthylation de l'ADN est fortement reprogrammée pendant le développement chez les mammifères, où elle semble jouer un rôle essentiel dans la répression génique et le maintien de l'identité cellulaire. Néanmoins, les cibles de la méthylation de l'ADN, la cinétique d'acquisition et les mécanismes de ciblage au cours du développement sont mal connus. Le premier objectif de ma thèse a donc été d'identifier les cibles de la méthylation de l'ADN pendant l'embryogenèse chez la souris. Sachant que plusieurs études dans les cellules ES ont mis en évidence un lien entre l'histone méthyltransférase G9a et l'établissement de la méthylation de l'ADN, le deuxième objectif de ma thèse a été de tester le rôle de G9a dans l'établissement de la méthylation de l'ADN au cours de l'embryogenèse. Pour cela, j'ai développé une technique d'analyse de la méthylation à l'échelle génomique à partir d'un petit nombre de cellules. Nous avons observé que la méthylation est essentiellement catalysée par DNMT3B et est mise en place principalement pendant l'implantation de l'embryon entre le blastoscyste et l'épiblaste. Pendant cette période, la méthylation cible préférentiellement les gènes de la lignée germinale et est indispensable à leur répression. La méthylation cible aussi des gènes spécifiques de différentes lignées somatiques telles que la lignée hématopoïétique, et peut être effacée ultérieurement pendant la différentiation. De manière surprenante, nous avons identifié des promoteurs de gènes non soumis à l'empreinte qui semblent résister à la reprogrammation de la méthylation de l'ADN et hériter la méthylation des gamètes parentaux. Enfin, nous avons montré que, contrairement à ce que suggèrent les études dans les cellules ES, G9a ne semble pas être indispensable à l'acquisition et au maintien de la méthylation de l'ADN au niveau des promoteurs pendant le développement in vivo. / DNA methylation is an epigenetic mark extensively reprogrammed during mammalian development. It is believed to play essential functions in gene regulation and the maintenance of cellular identity. However, the target genes of DNA methylation and the mechanisms that recruit DNA methylation during development remain poorly understood. The first aim of my PhD project was to identify the target genes of DNA methylation during early mouse development in vivo. In addition, because several studies show that G9a is required for DNA methylation establishment and maintenance during ES cells differentiation, the second aim was to determine whether G9a is required for the establishment of promoter DNA methylation patterns during early development in vivo.To address these questions, I developped a genomics approach to map DNA methylation starting from very small amount of cells. .We observed a major epigenetic switch during implantation at the transition from the blastocyst to the postimplantation epiblast. During this period, DNA methylation is primarily targeted to repress the germline expression program. DNA methylation in the epiblast is also targeted to promoters of lineage-specific genes such as hematopoietic genes, which are subsequently demethylated during terminal differentiation. De novo methylation during early embryogenesis is catalyzed by Dnmt3b, and absence of DNA methylation leads to ectopic gene activation in the embryo. Surprisingly, we identify nonimprinted genes that escape post-fertilization DNA methylation reprogramming and seem to inherit promoter DNA methylation from parental gametes. Finally we show that, unlike what it was shown in ES cells, the absence of G9a in an in vivo context does not have a drastic effect on the maintenance and the establishment of promoter DNA methylation during early development.

La betterave sucrière est une plante bisannuelle dont le besoin de vernalisation est absolu. Ce processus correspond à l’acquisition de l’aptitude à la montaison et à la floraison et résulte d’une exposition prolongée à de basses températures. La durée de froid requise pour induire la montaison puis la floraison varie suivant les génotypes et reflète leur tolérance à la montaison, qui constitue donc un caractère agronomique essentiel. Cette thèse visait à (i) mettre en évidence un éventuel contrôle épigénétique (méthylation ADN) de l‘induction de la montaison chez des génotypes de betterave sucrière résistants ou sensibles à la montaison, (ii) identifier les séquences ciblées par des remaniements de méthylation de l’ADN et d’expression associés, et (iii) caractériser certaines séquences candidates en vue de leur utilisation comme marqueurs de la montaison. Nos travaux ont montré que l’amplitude et la cinétique des variations de méthylation de l’ADN observées au cours de la vernalisation semblent être des éléments critiques de l’induction et de la tolérance à la montaison. Par une approche ciblée, des séquences dont la méthylation de l’ADN est remaniée ont été identifiées. L’implication dans la transition florale de deux BvRNMT (RNA METHYLTRANSFERASES) et de la méthylation des ARN, tels que l’ARNm de BvFL1, un répresseur floral, a ainsi été mise en évidence chez la betterave sucrière. Enfin, grâce à une approche génomique, un réseau de gènes intégratif incluant la réponse à l’environnement, la signalisation hormonale et l’induction de la floraison a été identifié. La cinétique d’activation de ces gènes définirait le niveau de tolérance à la montaison des différents génotypes de betterave sucrière. / Sugar beet is a biennial plant with an absolute requirement of vernalization, corresponding to the acquisition of the competence to bolt and flower after a prolonged exposure to low temperatures. The cold duration needed to induce bolting and flowering varies depending on the genotypes, reflecting their bolting tolerance, which is an essential agronomic trait. This work aimed at (i) investigating a possible epigenetic control of bolting induction in bolting sensitive and bolting resistant sugar beet genotypes, (ii) identifying sequences targeted by DNA methylation and expression remodeling, and (iii) characterizing candidate sequences which could be used in marked-assisted selection for plant breeding. Our data suggest that the time course and amplitude of DNA methylation variations are critical points for the induction of sugar beet bolting and represent an epigenetic component of the genotypic bolting tolerance. In addition, we identified differentially methylated sequences exhibiting variations of gene-body DNA methylation and expression during cold exposure and/or between genotypes. Among them, two RNA METHYLCYTOSINE TRANSFERASES, in association with RNA methylation such as BvFL1 mRNA, a floral repressor, were shown to play a role in floral transition. Finally, using microarrays we identified an integrative network of genes including response to environment, phytohormone signalling and flowering induction. The activation kinetics of these genes could define the bolting tolerance level of sugar beet genotypes.

Les infections à papillomavirus humains à haut-risque (HPV-HR) sont responsables de 100% des cancers cervico-utérins et de 50% des carcinomes de l'oropharynx. Les infections du col utérin sont généralement transitoires et bénignes. Cependant, en cas d'infection persistante, elles peuvent s'accompagner d'une progression vers des lésions (pré)cancéreuses du col utérin. Les facteurs viraux qui favorisent la persistance ou la clairance virale sont encore mal connus. Dans une première partie, nous avons étudié la méthylation des régions 3'L1 et LCR dans des frottis cervico-utérins HPV16+ / cytologie normale, prélevés chez 37 femmes qui présenteront soit une infection transitoire soit une infection persistante avec progression vers une lésion précancéreuse. Nous avons montré que certains îlots CpG présentaient des taux de méthylation différents en fonction de l'évolution ultérieure de l'infection HPV et pourraient être utilisés comme marqueurs prédictifs.Les cancers de l'oropharynx associés à une infection à HPV-HR présentent un pronostic plus favorable que ceux associés à une intoxication alcoolo-tabagique. Les mécanismes responsables de ce meilleur pronostic sont encore mal compris. Dans une seconde partie, nous avons caractérisé le statut HPV dans 202 cas de cancers de l'oropharynx. Au sein des 32 cancers présentant une infection HPV16 active (avec expression des ARNm E6/E7), nous avons étudié la méthylation des régions 3'L1 et LCR et l'intégration du génome viral. Nous avons montré que les niveaux de méthylation de certains sites CpG, notamment des sites de liaison à la protéine virale E2 (E2BS3 et E2BS4) sont fortement méthylés dans les formes épisomales et mixtes mais sont non méthylés dans les formes intégrées pures.Enfin dans une troisième partie, nous avons étudié des marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) dans des modèles cellulaires et des cancers oropharyngés, en fonction du statut HPV. Une moindre TEM, connue pour être impliquée de façon importante dans les phénomènes d'invasion tumorale, pourrait expliquer le meilleur pronostic associé aux cancers HPV-induits. Nous avons montré que la vimentine, marqueur le plus représentatif de l'acquisition de capacités migratoires et invasives, est plus exprimée dans les cellules tumorales HPV positives que dans les cellules HPV négatives. Le pronostic différentiel observé entre les 2 étiologies des cancers oropharyngés ne serait donc pas corrélé à la TEM.Mots-clés : Cancer, HPV, col utérin, oropharynx, biomarqueurs, méthylation, intégration, TEM. / High-risk human papillomavirus (HR-HPV) infections are responsible for 100% of cervical cancers and 50% of oropharyngeal cancers. Cervical infections are usually transient and benign. Persistent infections may however progress and lead to cervical (pre)cancerous lesions. Viral factors contributing to persistence or clearance are poorly understood. In a fist part, we studied methylation of 3'L1 and LCR regions in HPV16+ / normal cytology cervical smears, taken in 37 women who will present either a transient infection, or a persistent infection with progression to a precancerous lesion. We demonstrated that some CpG sites harbored differential methylation rates in relation with later outcome of HPV infection and may be used as predictive biomarkers.HR-HPV related oropharyngeal cancers present a better prognostic that their alcohol-and-tobacco-induced counterparts. Mechanisms responsible for this better prognostic are mainly unknown. In a second part, we characterized the HPV status in 202 oropharyngeal cancers. In the 32 cases presenting with HPV16 active infections (expressing E6/E7 mRNA), we studied 3'L1 and LCR methylation and integration of viral genome. We showed that methylation rates of some CpG sites, especially in E2 binding sites (E2BS3 & 4), were strongly methylated in episomal and mixed forms but were unmethylated in purely integrated forms.In a third part, we studied epithelial-to-mesenchymal-transition (EMT) markers in cellular models and oropharyngeal cancers, according to HPV status. A lesser EMT, known as an important phenomenon implicated in tumor invasion, could explain the better prognostic associated with HPV-induced cancers. We showed that vimentin, the more representative marker for migration and invasion ability acquisition is more expressed in HPV+ tumor cells than in HPV-negative cells. So the differential prognosis observed between the 2 oropharyngeal cancer etiologies may not be linked to EMT.Key-words: Cancer, HPV, cervical cancer, oropharynx, biomarkers, methylation, integration, EMT.

Le blé tendre ou Triticum aestivum possède un génome hexaploïde (2n=6X=42 chromosomes) de très grande taille (17 Gb) formé de trois génomes diploïdes homéologues. Afin de répondre aux nouvelles contraintes sociétales et environnementales, de nouvelles variétés de blé doivent être créées. L’amélioration des variétés peut se baser sur la variabilité génétique, mais également sur les modifications épigénétiques mises en évidence ces dernières années. La méthylation de l’ADN est l’une de ces modifications, et se retrouve sous forme de 5-méthylcytosine (5mC). Le gène METHYLTRANSFERASE1 (MET1) est bien connu pour son rôle dans le maintien de la méthylation de l’ADN au niveau des 5mC en contexte CpG chez Arabidopsis. Afin d’identifier les orthologues de MET1 chez le blé, la méthode de capture de séquence génomiques sur puce à ADN a été combinée avec des analyses bioinformatiques réalisées sur les récentes données de séquençage du génome du blé. J’ai identifié neufs copies du gène TaMET-1 sur les chromosomes 2, 5 et 7, et ce pour les trois génomes homéologues. Deux évènements de duplications géniques semblent être à l’origine de ces neufs copies. Suite à la seconde duplication, les copies du chromosome groupe 5 (groupe 5) ont évolué plus rapidement pour devenir des pseudogènes, peu ou pas exprimés. L’analyse de données d’expression par RNA-Seq a révélé que les copies des groupes 2 sont 10 à 40 fois plus exprimées que celles du groupe 7. Nous avons montré, pour les régions promotrices des groupes 5 et 7, la relation existant entre un faible niveau d’expression, une forte vitesse évolutive et un enrichissement en CpG, ce dernier étant associé avec une forte méthylation. Plusieurs stratégies ont été envisagées afin de valider les fonctions des gènes TaMET-1 : le crible de population de TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes), la construction de lignées RNAi ciblant MET1 et l’utilisation de lignées délétées pour la partie du chromosome portant la copie TaMET-1 la plus exprimée. Aucun mutant de TILLING n’a été identifié. Une analyse par conversion au bisulfite est actuellement en cours sur les lignées RNAi et lignées de délétion afin de valider un effet possible sur la méthylation. Ce travail permettra de conclure sur l’identification de lignées capables de modifier les profils de méthylation et qui pourraient être le point de départ pour induire de la variabilité épigénétique. / Bread wheat or Triticum aestivum possesses a large hexaploid genome (2n=6X=42 chromosomes, 17 Gb) formed by three homeologous diploid genomes. To better respond to new societal and environmental constraints, new wheat varieties have to be created. Breeding can use genetic variability and epigenetics modifications highlighted in recent years. DNA methylation is one of the epigenetic marks and is found as 5-methylcytosine (5mC). The METHYLTRANSFERASE1 gene (MET1) is known to be involve in maintenance of 5mC DNA methylation in CpG context. To identify MET1 genes in wheat, a method based on genomic sequence capture and bioinformatics analyses on data from wheat genome were combined. I identified nine copies of TaMET-1 gene on chromosomes 2, 5 and 7, for the three homeologous genomes. These nine copies seem to originate from two duplication events. After the second one, copies from chromosome 5 (group 5) evolved faster to become pseudogenes, not expressed or at a low level. Analysis of RNASeq expression data revealed that group 2 copies are expressed from 10 to 40 times more than the ones from group 7. For the promoter regions of group 5 and 7, we have shown a relationship between low expression level, high evolution rate and CpG enrichment, which is associated with high DNA methylation level. Several strategies were chosen to validate MET1 gene function : screen of TILLING population, construction of RNAi lines and use of deleted-chromosome line for the most expressed TaMET-1 gene. No TILLING mutants were found. An analysis based on bisulfite conversion is in progress on RNAi lines and deleted lines to validate a putative effect on DNA methylation. This work will permit to identify lines able to modify DNA methylation pattern which will be the starting point to induce epigenetics variability.