Au cours de la cicatrisation cutanée, la production et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) sont des étapes importantes modulées par les communications entre les cellules. Les microvésicules (MV) produites par les myofibroblastes humains de plaie cutanée contiennent des molécules potentiellement impliquées dans la cicatrisation pouvant être transmises à d'autres cellules. Mon hypothèse est que les MV stimulent la production/remodelage de la MEC par les fibroblastes. Le but de cette étude est d'évaluer l'effet potentiel des MV sur les différents paramètres liés à la MEC et de déterminer les molécules signalétiques responsables de ces effets. Nous avons d'abord évalué les contacts possibles entre les fibroblastes et les MV. Des fibroblastes ont été traités avec des MV fluorescentes et la quantification de la fluorescence des fibroblastes a ensuite été réalisée par cytométrie en flux. Le dosage de 45 cytokines par ELISA multiplex sur des échantillons de MV a été réalisé. Des fibroblastes de peau ont été cultivés en présence de MV et de cytokines purifiées. Après les traitements, les paramètres liés à la MEC ont été étudiés: croissance cellulaire par comptage cellulaire, sécrétion de procollagène I dosée par ELISA, activité des métalloprotéinases sécrétées déterminée par un test enzymatique et expression de l'α-smooth muscle actine (α-SMA) évaluée par cytométrie en flux. Enfin, les fibroblastes ont été traités avec des MV prétraitées avec des anticorps neutralisant une cytokine afin de valider l'action de celle-ci sur le mécanisme étudié. L'incubation de fibroblastes avec des MV fluorescentes a augmenté la fluorescence des cellules, suggérant une absorption des MV par les fibroblastes. Le PLGF-1 (Facteur de croissance placentaire 1) est la cytokine détectée dans les MV en plus grande quantité. Le traitement des fibroblastes avec des MV ou avec le PLGF-1 stimule faiblement leur croissance sans modifier le taux d'α-SMA ou de métalloprotéinases. Par contre, il stimule significativement la migration cellulaire et la sécrétion de procollagène. La neutralisation du PLGF-1 au niveau des MV inhibe cette sécrétion de procollagène. Nos résultats suggèrent que les MV peuvent participer à la régulation de la MEC en stimulant les fibroblastes à produire du collagène. Ces résultats représentent une opportunité de mieux comprendre comment les MV et les myofibroblastes de plaie peuvent contribuer à la cicatrisation des plaies. / During normal wound healing, production and remodeling of the extracellular matrix (ECM) are important steps modulated by cell-to-cell communications. Microvesicles (MVs) produced by human skin wound myofibroblasts (Wmyos) contain molecules involved in healing that can be transmitted to other cells. My hypothesis is that MVs stimulate the production/remodeling of ECM by fibroblasts. The purpose of this study is to evaluate the potential effect of MVs on various parameters related to the ECM and to determine the signalling molecules responsible for these effects.We first evaluated the possible contacts between fibroblasts and MVs. The fibroblasts were treated with fluorescent MVs and quantification of cell fluorescence was then performed by flow cytometry. A multiplex ELISA assay of 45 cytokines was performed on MV samples. The fibroblasts were cultured in the presence of MVsand purified cytokines. After the treatments, parameters related to the ECM were studied: cell growth assessed by cell count, secretion of procollagen I determined by ELISA, activity of the secreted metalloproteinases determined by an enzymatic test and expression of the α-smooth muscle actin (α-SMA) evaluated using flow cytometry. Finally, the fibroblasts were stimulated with MVs pretreated with antibodies neutralizing cytokines to verify their action on the studied mechanism.Incubation of fibroblasts with fluorescent MVs increased cell fluorescence suggesting an uptake of MV by the fibroblasts. The cytokine detected at the highest level in MVs was PLGF-1. Treatment of fibroblasts with MVs or with PLGF-1(Placental growth factor 1) weakly stimulated cell growth without altering the level of α-SMA or metalloproteinases. On the other hand, these treatments significantly stimulated cell migration and procollagen secretion. The neutralization of PLGF-1 on MVs inhibited this secretion.Our results suggest that MVs can participate in the regulation of ECM by stimulating fibroblasts to produce collagen.These results represent a promising opportunity to better understand how MVs and myofibroblasts of normal wounds can contribute to wound healing.

Dès les premières heures suivant une lésion à l’épithélium cornéen, d’importantes quantités de fibronectine (FN) sont sécrétées dans la membrane basale, tandis que l’expression des laminines (LMs) et des collagènes (principalement le type IV) diminue temporairement pour réapparaitre une fois la lésion recouverte. L’intégrine α5β1 joue un rôle majeur dans la cicatrisation cornéenne en favorisant l’adhésion et la migration des cellules épithéliales de cornées (CEC) sur la matrice temporaire de FN. Notre laboratoire étudie la modulation d’expression du gène codant pour la sous-unité α5 par les composantes de la matrice extracellulaire (MEC) durant la cicatrisation de l’épithélium cornéen. Des travaux antérieurs réalisés dans notre laboratoire ont permis de démontrer que la FN exerce une influence positive sur l’activité transcriptionnelle du promoteur du gène α5, tandis que la LM exerce une influence négative dans des CEC de lapins. Toutefois, l’étude des influences individuelles des collagènes ou des effets combinés des matrices complexes n’avait jamais été entreprise à ce jour. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de démontrer que les matrices extracellulaires complexes, composées de FN et de différents types de collagènes, exercent une influence positive sur l’expression du gène α5 dans des CEC humaines. Ces influences de la MEC résultent de modifications dans l’expression et les activités de liaison à l’ADN des facteurs de transcription NFI, Sp1, AP-1 et Pax-6. À l’inverse, les matrices simples de collagènes exercent une influence négative sur l’expression du gène α5 dans les CECs ce qui suggère qu’une des multiples actions des collagènes pourrait être de ralentir la migration et la prolifération des cellules épithéliales afin de permettre leur différenciation dans les couches supérieures de l’épithélium cornéen. Nous avons également démontré la présence d’une région distale conservée de 300 nucléotides située en amont des gènes codant pour les sous-unités d’intégrines α3, α5, α9 et αv. Cette région conservée porte plusieurs éléments de régulation (positifs et négatifs) qui contribuent à la modulation fine de l’expression du gène α5. Outre les gènes pour certaines intégrines, la MEC modifie profondément l’expression de plusieurs gènes codant, entre-autre, pour des métalloprotéinases matricielles (MMPs) et diverses composantes de la MEC. / Upon corneal injury, it is the massive secretion of fibronectin (FN) that characterizes the very first changes occurring in the basement membrane (BM) while in the meantime laminin (LM) and collagens (mostly type IV) temporarily disappear and then sequentially reappear once the denuded corneal area is completely covered. The FN binding integrin α5β1 plays a major role in corneal wound healing by promoting epithelial cell adhesion and migration over the temporary FN matrix. Over the past few years, our laboratory investigated the mechanisms by which the extracellular matrix (ECM) components may alter the expression of the α5 integrin subunit gene during corneal wound healing. While FN was found to positively regulate the expression of the α5 gene promoter, LM surprisingly repressed its transcription in rabbit corneal epithelial cells. However, the individual influences of collagens, or the combinatorial influence of a more complex tissue-engineered ECM had yet to be determined. In this thesis, we demonstrated that the reconstructed ECM, which is enriched in several types of collagens and FN, exerts a positive influence on the expression of the α5 gene in human corneal epithelial cells as a result of alterations in the expression and DNA binding of the transcription factors NFI, Sp1, AP-1 and Pax-6. On the other hand, collagens most usually acted negatively on the expression of the α5 integrin gene in corneal epithelial cells (CECs). One can then speculate that a particularly important function of the corneal BM collagens would consist to inform CECs that cell migration is no longer required, allowing them to differentiate vertically into suprabasal epithelial cells. We also demonstrated that a 300 bp conserved 5’-distal region present in the α3, α5, α9 and αv integrin subunit gene promoter sequences contains several target sites for positive and negative transcription factors that may prove important for fine-tuned regulation of α5 gene transcription. In addition, the ECM components also cause important changes in the expression of other genes, such as those encoding matrix metalloproteinases (MMPs) and various ECM components.

Seulement 30% des cas d'infertilité masculine peuvent être diagnostiqués grâce à un spermogramme. Comme l'épididyme joue un rôle important dans la maturation posttesticulaire spermatique, le dysfonctionnement de cet organe peut être à l'origine de cas d'infertilité non expliquée. Ainsi, puisque la communication intercellulaire au niveau du tractus reproducteur mâle est différente lorsqu’il y a un problème de fertilité, nous avons émis l’hypothèse qu’une signature moléculaire précise pourrait aider à mieux comprendre et diagnostiquer une plus large population. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle murin génétiquement modifié ayant une délétion conditionnelle (cKO) pour une enzyme impliquée dans la biogenèse des microARNs (miARNs) au niveau proximal de l’épididyme. Nous avons comparé le profil d’expression des miARNs et des gènes au sein de l’épididyme avec un modèle de souris témoin. Cent cinquante-quatre miARNs ont illustrés une forte diminution d’expression chez la souris génétiquement modifiée, dont miR-210, miR-672, miR-191 and miR-204. Notons également la variation d’expression des protéines AZGP1 (Zn-alpha 2-glycoprotein) et PATE4 (Prostate And Testis Expressed 4 protein) qui ont particulièrement attiré notre attention, car elles sont directement impliquées dans le pouvoir fécondant masculin. Deuxièmement, comme ces molécules se sont avérées être relarguées dans le milieu extracellulaire, nous avons décidé d’investiguer leur mode de sécrétion dans le liquide épididymaire afin d’évaluer leur potentiel en tant que biomarqueurs pour un certain type d’infertilité masculine. En nous référant aux critères de l’Organisation Mondial de la santé (OMS), j’ai créé une biobanque contenant 43 échantillons humains. J’ai pu mettre également en pratique une méthode plus actuelle d’isolement de vésicules membranaire à partir de fluide séminal. Finalement, j’ai validé l’association de 4 molécules (miR-672, miR- 191 and miR-204 et AZGP1) avec les exosomes. Tous ces résultats suggèrent donc qu’il existe un profil moléculaire associé au phénotype de fertilité et que ces nouvelles molécules extracellulaires pourraient aider à représenter des sous-types d’infertilité masculine. / Only 30% cases of male infertility can be diagnosed with a spermogram. As the epididymis plays an important role in spermatic post-testicular maturation, the dysfunction of this organ may be at the origin of unexplained infertility. Thus, since intercellular communication in the male reproductive tract is different when there is a fertility problem, we hypothesized that a precise molecular signature could help to better understand and diagnose a larger population. To do this, we used a genetically modified murine model with a conditional kockout (cKO) for an enzyme involved in the biogenesis of microRNAs (miRNAs) at the proximal level of the epididymis. We compared the epididymal miRNAs and genes expression pattern between a control and cKO mouse model. One hundred and fifty-four miRNAs showed a strong expression decrease in the genetically modified mice, including miR-210, miR-672, miR-191 and miR-204. Note also the variation in expression of the proteins AZGP1 (Zn-alpha 2-glycoprotein) and PATE4 (Prostate And Testis Expressed 4 protein) which have particularly attracted our attention, because they are directly involved in the male fertility. Secondly, since these molecules were found to be released into the extracellular environment, we decided to investigate their secretion pattern in the epididymal fluid in order to evaluate their potential as biomarkers for a certain type of male infertility. Referring to the criteria of the World Health Organization (WHO), I was able to create a biobank containing 43 human samples. I was also able to practice a more current method of isolating membrane vesicles from seminal fluid. Finally, I validated the association of 4 molecules (miR-672, miR-191 and miR-204 and AZGP1) with exosomes. All these results therefore suggest that there is a molecular profile associated with the fertility phenotype and that these new extracellular molecules might help to represent subtypes of male infertility.

Les gliomes sont les tumeurs primitives les plus fréquentes du système nerveux central. Cette dernière décennie, l’apport de la biologie moléculaire a permis de mieux appréhender leurs comportements et de mieux préciser leur origine. Nous avons montré que le profil moléculaire des glioblastomes (grade IV dans la classification de l’OMS) et celui des astrocytomes pilocytiques (grade I dans la classification de l’OMS) différait notamment par l’expression d’un gène nommé KIAA 0510. La caractérisation de sa séquence nous a mené à nous intéresser à la Ténascine R, une glycoprotéine de la matrice extracellulaire impliquée dans les processus de migration et de différenciation cellulaire. Par ailleurs, l’expression de la Ténascine R pendant le développement, suggère son implication au cours de la corticogenèse.Dans le but de mieux comprendre l’origine des astrocytomes pilocytiques, notamment ceux de la région des voies optiques, nous avons mis en évidence au niveau du chiasma optique en développement des cellules de la glie radiaire à partir desquelles les astrocytomes pilocytiques des voies optiques pourraient dériver. / Gliomas are the most frequently occurring primary tumors in the central nervous system. These last years, molecular biology technics allowed a better understanding of the gliomagenesis as well as behaviour of these tumors. We have previously shown that molecular profiling of glioblastomes (WHO grade IV) and pilocytic astrocytomas (WHO grade I) differed for KIAA 0510 gene expression. This sequence was fully characterized and shown to be part of the tenascin R gene encoding for an extracellular matrix glycoprotein involved in migration and cell differentiation. In addition, during development, Tenascin-R may be involved in corticogenesis.In parallel, in the developing optic chiasm, we evidenced cells with radial glial characteristics from which the hypothalamo-chiasmatic pilocytic astrocytomas could derive.

Nous étudions la migration et la protéolyse de la matrice extracellulaire dans le cancer du sein. Pour cela, nous avons mis en place deux systèmes modèles. Le premier, se base sur une lame basale reconstituée et permet d'évaluer le potentiel invasif de lignées cellulaires tumorales. Nous montrons que les cellules cancéreuses migrent différemment à travers un gel pour former des amas de taille variable directement corrélé à leur pouvoir invasif. Dans notre système, seule la migration de type mésenchymateuse est utilisée par les cellules. Ce type de mouvement est directement dépendant de protéases sécrétées par les cellules. Nous avons, donc mesurée la synthèse au niveau transcriptionnel de la classe d'enzyme majoritairement impliquée dans la dissémination tumorale, les matrice métalloprotéases (MMPs). Nous avons ainsi pu montrer que l'expression de 3 MMPs est corrélée aux capacités migratoires des cellules donc à leur potentiel invasif. Le processus physique par lequel les enzymes dégradent les matrices est très peu étudié au niveau expérimental. Le second système que nous utilisons se base sur un modèle de matrice conjonctive majoritairement composer de collagène de type I. Nous utilisons la gélatine, pour étudier la protéolyse de gels protéiques par différentes classes de protéases. A partirdes études sur la solubilisation enzymatique des gels par l'-chymotrypsine, la protéinase K et la papaïne, nous montrons qu'il existe des mécanismes de dégradation distincts. Le premier est un mécanisme anormal dont la cinétique est limitée par la diffusion de l'enzyme, le second est brownien et la cinétique est limitée par la réaction. Ce second mécanisme dépend directement d'interactions eléctrostatiques entre l'enzyme et le gel. Nous observons pour deux des enzymes que l'évolution des temps de dégradation mais également la cinétique dépendent de la concentration en protéine dans les gels. / We study the migration and proteolysis of the extracellular matrix in breast cancer. For this, we set up two model systems. The first is based on a reconstituted basement membrane and allows the evaluation of invasive potential tumor cell lines. We show that cancer cells migrate differently across the gel to form clusters of variable size directly correlates with their invasiveness. In our system, only the migration of mesenchymal type is used by the cells. This type of movement is directly dependent proteases secreted by the cells. We therefore measured the synthesis at the transcriptional level of the enzyme class mainly involved in tumor dissemination, the matrix metalloproteases (MMPs). We were able to show that the expression of 3 MMPs is correlated with migratory capacity of cells, therefore their invasive potential. The physical process by which enzymes degrade the matrix is very little studied at the experimental level. The second system we use is based on a model of connective matrix mainly composed of collagen type I. We use gelatin for the study of protein gels proteolysis by different classes of proteases. Based on the study of gels enzymatic solubilization by a- chymotrypsin, proteinase K and papain, we show that there are distinct mechanisms of degradation. The first mechanism is abnormal whose kinetic is limited by enzyme diffusion, and the second is Brownian and the kinetic is reaction limited. The second mechanism depends directly on electrostatic interactions between enzyme and gel. We observe for two enzymes that the evolution of degradation time but also the degradation kinetics depend on the concentration of protein in gels.

La leishmaniose est causée par un parasite protozoaire du genre Leishmania. Cette maladie infecte environ 12 millions de personnes dans le monde et en menace 350 millions dans 98 pays. Il existe trois formes majeures de leishmaniose : cutanée, mucocutanée et viscérale. L'infection se produit par le dépôt des parasites sous forme de promastigotes dans la peau de l'hôte mammifère via la piqûre d’un phlébotome. Les parasites peuvent migrer au sein de la matrice extracellulaire avant d’infecter les macrophages. Bien que la plupart des études réalisées jusqu’ici aient été consacrées aux interactions des parasites Leishmania avec leurs cellules cibles, quelques interactants extracellulaires ont déjà été identifiés. Dans cette étude, nous avons étudié pour la première fois le répertoire d’interactions de 24 souches de promastigotes intacts, vivants (6 espèces aux différents tropismes) avec environ ~70 biomolécules de la matrice extracellulaire de l’hôte à l’échelle moléculaire en utilisant des puces à protéines et à glycosaminoglycanes et la résonance plasmonique de surface en mode imagerie. Nous avons identifié 27 nouveaux partenaires (23 protéines et 4 glycosaminoglycanes) des promastigotes de Leishmania. Les souches partagent des partenaires communs tels que le plasminogène, TEM-8 et la tropoélastine, qui est dégradée in vitro par la majorité des souches. Les Leishmania se lient à plusieurs régulateurs de l’angiogenèse et à des glycosaminoglycanes. Dans une seconde partie, nous avons cloné deux protéines de L. major, l’énolase et la superoxyde dismutase, toutes deux identifiées dans le sécrétome de Leishmania, afin d’étudier leur répertoire d’interactions. L’énolase possède un répertoire d’interactions (13 partenaires) supérieur à celui de la superoxyde dismutase (6 partenaires) mais toutes deux interagissent également avec le plasminogène, l’ectodomaine de TEM-8, l’endostatine et l’héparine. Enfin, dans une troisième partie, nous avons créé une base de données, LeishMatrixDB, qui recense toutes les interactions des parasites Leishmania, ou leurs molécules, avec les composants de la matrice extracellulaire de l’hôte décrites dans la littérature / Leishmaniasis is a vector-borne disease caused by parasitic protozoa of the genus Leishmania. 12 million people are presently infected worldwide and the disease threatens 350 million people in 98 countries around the world. There are three main types of the disease: cutaneous, mucocutaneous and visceral. Infection occurs by the deposition of promastigote form into the mammalian skin via the bite of phlebotomine sandflies within the extracellular matrix proteins prior infecting macrophages. Most studies have focused on the interaction of Leishmania promastigotes with their cellular targets, some extracellular partners have been identified. In this study, we investigated for the first time the interplay between 24 strains of intact, live, parasites (6 species of different tropisms) and ~70 biomolecules of the host extracellular matrix at the molecular level using protein and glycosaminoglycan arrays probed by surface plasmon resonance imaging. We have identified 27 new partners (23 proteins and 4 glycosaminoglycans) of Leishmania promastigotes. All strains tested shared 3 common partners such as plasminogen, TEM-8 and tropoelastin, which is degraded in vitro by most Leishmania tested. Leishmania bound to several regulators of angiogenesis and to glycosaminoglycans. In a second part, we cloned two L. major proteins, enolase and superoxyde dismutase, both identified in Leishmania secretome in order to study their interaction repertoire. Enolase had a larger interaction repertoire (13 partners) than superoxide dismutase (6 partners) but both bound to plasminogen, ectodomain of TEM-8, endostatin and heparin. In a third part, we have created a database, LeishMatrixDB, which lists all the interactions of Leishmania, or their molecules, with host extracellular components from the literature

Les protéoglycanes (PGs) sont des protéines présentes au niveau de la matrice extracellulaire et à la surface des cellules. Ils sont constitués d’une protéine sur laquelle sont attachées des chaînes de glycosaminoglycanes. Ils jouent un rôle essentiel dans plusieurs processus biologiques. Des mutations au niveau des gènes codant pour la protéine porteuse ou les enzymes impliquées dans la biosynthèse des GAGs sont associées à plusieurs syndromes et pathologies chez l’homme. L’initiation de la synthèse des GAGs est catalysée par la xylosyltransférase I (XT-I). La XT-I joue un rôle clé dans la régulation de la synthèse des PGs au niveau du cartilage et il a été montré récemment que les mutations hypomorphiques de la XT-I sont associées au syndrome du Desbuquois de type II (DBQD2) caractérisé par des anomalies squelettiques (ostéochondrodysplasie). Afin d’élucider le rôle de la XT-I dans le développement ostéoarticulaire, nous avons généré une souris transgénique conditionnelle Col2α1-CreERTM ;XylT1flox/flox permettant l’invalidation de la XT-I au niveau du cartilage. De façon intéressante, l’invalidation de la XT-I induit des anomalies du développement ostéoarticulaire caractérisées par un nanisme important et des défauts des éléments squelettiques. Des études histologiques et la microscopie SHG (génération de seconde harmonique) de la plaque de croissance ont permis de montrer l’importante de la XT-I dans la formation de la matrice extracellulaire (MEC), la fibrillation du collagène II, la maturation des chondrocytes et leur organisation en colonne dans la plaque de croissance. L’analyse des mécanismes moléculaires impliqués indique la perturbation de la voie de signalisation du TGF-β dans la plaque de croissance. D’autre part, des études histomorphométriques et histologiques des os ont révélé que la déficience en XT-I entraîne une accélération du processus d’ossification avec une stimulation de l’activité des ostéoclastes au niveau de l’os spongieux conduisant à une résorption osseuse importante et à une ossification accrue de l’os cortical. Ces travaux ont permis de révéler le rôle de la XT-I dans le développement ostéoarticulaire et dans le maintien de l’homéostasie du cartilage et du tissu osseux et ont mis en évidence le rôle de la voie du TGF-β dans les anomalies du développement. Ces travaux ouvrent également la voie pour le développement de thérapeutiques potentielles pour le traitement des patients atteints du syndrome de Desbuquois type II / Proteoglycans (PGs) are proteins present in the extracellular matrix and on the surface of cells. They consist of a protein to which chains of glycosaminoglycans (GAGs) are attached. PGs play an essential role in many biological processes and in the homeostasis of different tissues including cartilage, bone and skin. Mutations in the genes encoding PG core proteins or the enzymes involved in GAG biosynthesis are associated with several syndromes and pathologies in human. Initiation of GAG synthesis is catalyzed by xylosyltransferase I (XT-I). XT-I plays a key role in the regulation of the synthesis of PGs in cartilage and it has been shown recently that hypomorphic mutations of XT-I are associated with the Desbuquois syndrome type II (DBQD2), characterized by skeletal abnormalities (osteochondrodysplasia). To elucidate the role of XT-I in skeletal development, we generated a conditional transgenic mouse, Col2α1-CreERTM; XylT1flox/flox allowing the invalidation of XT-I gene in the cartilage. Interestingly, the invalidation of XT-I induces skeletal developmental abnormalities characterized by significant dwarfism, and defects in many skeletal elements. Histological studies and SHG microscopy (second harmonic generation) of the growth plate showed the importance of XT-I in extracellular matrix formation, fibrillation of collagen type II, maturation of chondrocytes and their organization in column in the growth plate. The analysis of the molecular mechanisms involved indicates the disruption of the TGF-β signaling pathway in the growth plate. On the other hand, histomorphometric and histological studies of the bones revealed that the XT-I deficiency causes an acceleration of the ossification process with a stimulation of the osteoclasts activity in spongy bone leading to bone resorption, and increased ossification of the cortical bone. This work revealed the role of XT-I in skeletal development and in the maintenance of cartilage and bone homeostasis and highlighted the role of the TGF-β pathway in developmental abnormalities. This work also paves the way for the development of potential therapeutics for the treatment of patients with Desbuquois syndrome type II

Les cellules sont organisées en tissus dont les propriétés physiques comme la rigidité et l'élasticité sont variables. La matrice extracellulaire (MEC) est produite et remodelée par les cellules qui s'adaptent en retour aux conditions physico-chimiques de cet environnement extracellulaire. Cela nécessite une communication bidirectionnelle entre la cellule et la matrice. Les intégrines sont des protéines transmembranaires impliquées dans l'adhérence, liant la MEC au cytosquelette d'actine via une plateforme protéique appelée adhérence focale, lieu d'une double signalisation (inside-out et outside-in). Des variations de tension intracellulaire imposées par l'environnement modifient la distribution et la taille de ces adhérences. Leur dynamique est aussi contrôlée par certaines protéines cytoplasmiques comme la protéine ICAP-1, partenaire de l'intégrine b1. En cherchant à comprendre le lien entre la tension interne et l'activation des intégrines, j'ai montré qu'ICAP-1 contrôle l'étalement, la contractilité interne et la migration cellulaire en présence comme en absence de l'intégrine b1, révélant un rôle ICAP-1 indépendant de son interaction avec l'intégrine b1. Ce contrôle semble passer par l'interaction ICAP-1/ROCK et a révélé un contrôle de l'intégrine b3 par l'intégrine b1. / The physical properties of cell tissues are variable and cells adapt their behaviour to the physical and chemical extracellular environment such as rigidity and composition of the extracellular matrix (ECM) which is produced and remodelled by cells. This implicates a bidirectionnal signalling between cells and the ECM. Integrins are transmembrane proteins involved in cell adhesion, linking the ECM to the actin cytoskeleton through adaptor proteins forming adhesion site called focal adhesion (FA) where take place an inside-out and an outside-in signallings. Intracellular tension can be controlled by extracellular cues, modifying the size and distribution of FA. FA dynamics is also regulated by cytoplasmic proteins such as ICAP-1 that interacts with b1 integrin. Looking for a better comprehension of the link between cell tension and integrin activation, I show that ICAP-1 controls cell spreading, cell contractility and cell migration both in presence or absence of b1 integrins meaning that ICAP-1 has an action without its interaction b1 integrin. This action seems to implicate the interaction between ICAP-1 and ROCK and revealed a control of b1 integrin on b3 integrin.

Lorsque des vaisseaux autologues ne sont pas disponibles pour faire un pontage, des greffons synthétiques sont utilisés mais avec des taux d’échec élevés. En effet, malgré leurs bonnes propriétés mécaniques, la surface synthétique de ces greffons entraîne de la thrombose et de l’hyperplasie intimale ayant pour conséquence une mauvaise perméabilité du substitut à long terme pour de nombreuses applications. Par ingénierie tissulaire, des greffons vasculaires entièrement biologiques et humains ont déjà été produits par roulage de feuillets de matrice extracellulaire synthétisée par des fibroblastes dermiques humains in vitro. Grâce à une nouvelle méthode d’assemblage basée sur une approche textile, des greffons ont été produits trois fois plus rapidement. Pour ce faire, le feuillet a été découpé en fils afin de permettre la construction d’un substitut vasculaire par tissage. Cette thèse comporte trois articles. Le premier visait à montrer la composition riche de la matrice, décrire l’organisation de son réseau complexe de collagènes et démontrer que la dévitalisation par séchage de la matrice n’a pas affecté significativement cette organisation. Le deuxième avait pour but de décrire les propriétés mécaniques des fils en fonction du torsadage et/ou de l’âge de la matrice ainsi que l’effet sur la force de différents traitements nécessaires au processus de fabrication. Les différentes applications de l’approche textile dans la construction de structures complexes ainsi que les propriétés mécaniques des substituts tissés ont également été évaluées. Le troisième article a montré la faible réponse inflammatoire ainsi que le potentiel d’intégration et de remodelage de la matrice in vivo. Par ailleurs, la décellularisation n’a pas montré de résultats supérieurs à la dévitalisation, permettant ainsi de s’affranchir d’une étape de fabrication supplémentaire et potentiellement délétère à l’organisation biologique de cette matrice. En conclusion, cette thèse constitue la première démonstration de la fabrication de textiles humains mécaniquement très forts mais sans utilisation de matériel exogène. La dévitalisation couplée à l’approche textile ont permis de créer un modèle allogénique plus simple, plus rapide et moins coûteux mais avec un potentiel d’intégration in vivo intact. Ce modèle sera très prochainement étudié par implantation à long terme dans la circulation sanguine. / When autologous blood vessels are not available for bypass surgery, synthetic grafts are used but display high failure rates. Indeed, despite their good mechanical properties, their synthetic surface lead to thrombosis and intimal hyperplasia, which cause poor long-term patency in many applications. Using tissue engineering, completely biological and human vascular grafts have been produced by rolling sheets of extracellular matrix synthesized by dermal human fibroblasts in vitro. Using a new assembly technique based on a textile approach, grafts were produced three-time faster. To do so, sheets were cut into yarns to construct vascular substitute by weaving. This manuscript includes three articles. The first one aimed at showing the rich composition of the matrix, describing the organization of its complex network of collagens and demonstrating that the devitalization by drying the matrix did not significantly affect this organization. The second one described the mechanical properties of the yarns depending on the twisting, matrix age or different treatments useful for the manufacturing process. It also demonstrated some of the assembly techniques possible with this human yarn, as well as its possible use as a suture or to build a vascular graft. The third article showed the survival of the yarns subcutaneously implanted for 6 month in nude rats. The implants created little inflammatory response, were mildly remodeled and kept a significant mechanical strength. Decellularization did not show results improvement compared to the simple devitalization, demonstrating that the remaining cellular fragments were not a meaningful activator of the innate immune system. To conclude, this thesis is the first demonstration of the production of human textiles, without using any exogenous material and that are mechanically very strong. Both the devitalization and the textile approach have allowed to create a simpler allogeneic model, faster and cheaper but with an intact potential of integration in vivo, that will be studied very soon with a long-term implantation of the textile in the bloodstream.

La dysplasie géléophysique (DG) est une maladie rare qui appartient à la famille des dysplasies acroméliques. Cette pathologie est caractérisée par un retard statural, une brachydactylie, une raideur articulaire, une dysmorphie faciale, une peau épaisse, une atteinte bronchopulmonaire et une surcharge valvulaire cardiaque conduisant le plus souvent à une mort précoce dans les premières années de la vie. Deux modes de transmissions ont été identifiés. Le premier autosomique récessif est dû à des mutations dans le gène ADAMTSL2. Le second, autosomique dominant est dû à un hot-spot de mutations dans les exons 41 et 42 qui codent pour le domaine Transforming Growth Factor (TGF) β-binding protein-like domain 5 (TB5) du gène FBN1. FBN1 et ADAMTSL2 codent pour des protéines sécrétées de la matrice extracellulaire (MEC). FBN1 code pour la fibrilline-1, une composante des microfibrilles qui jouent un rôle dans la biodisponibilité du TGFβ. La protéine ADAMTSL2 fait partie de la famille des ADAMTS mais n’a pas d’activité enzymatique dû à l’absence de domaine catalytique. Sa fonction est encore inconnue. Cependant des partenaires d’ADAMTSL2 ont été identifiés par notre équipe : latent-transforming growth factor beta-binding protein 1 (LTBP1) et FBN1 qui sont directement impliqués dans le stockage de TGFβ. Récemment une autre protéine, FBN2, a aussi été découverte comme partenaire d’ADAMTSL2 (Hubmacher D et. al.). L’objectif de ma thèse était de comprendre le mécanisme physiopathologique de la DG, grâce à l’analyse de modèles murins. Un premier modèle murin pour la forme récessive de la DG appelé CreCMV; Adamtsl2f/f (ou KO) a été généré. L’analyse phénotypique de ces souris a montré un retard statural, des os longs courts, des extrémités courtes. Dans les plaques de croissance des os longs des souris mutantes, nous avons observé une désorganisation des colonnes chondrocytaires associée à une diminution de l’expression du collagène de type 10, marqueur de la différentiation des chondrocytes. L’analyse de la matrice extracellulaire des plaques de croissance a révélé une désorganisation structurale importante. Une diminution de la fibrilline-1 et de LTBP-1 a été observée ainsi qu’une augmentation de l’activation de la voie de signalisation TGFβ au niveau de la plaque de croissance des souris mutantes. Nous avons observé une désorganisation du réseau microfibrillaire sur des cultures de chondrocytes de souris mutantes. Ces résultats nous ont permis de suggérer que la protéine ADAMTSL2 est impliquée dans la structure du réseau microfibrillaire, lieu de stockage du TGFβ et de démontrer un rôle majeur d’ADAMTSL2 dans la régulation de la chondrogenèse. Afin d’étudier la forme dominante de la DG, le modèle FBN1TB5+/- a été généré. Il est issu d’un système knock-in avec une mutation dans l’exon 42 du gène fbn1 qui correspond au domaine TB5 de la fibrilline-1. Nos résultats ont montré une réduction de la taille des souris hétérozygotes et homozygotes en comparaison aux souris sauvages au stade P1 et P30. Au stade P1, nous avons observé des chondrocytes plus larges et une dérégulation des marqueurs de la chondrogenèse au niveau de la plaque de croissance des fémurs des souris hétérozygotes, ainsi que chez les souris homozygotes. De plus, nous avons observé une très forte mortalité des souris homozygotes vers l’âge de 2 ou 3 mois. Nous en avons conclu que des mutations domaine TB5 de la fibrilline étaient liées à un retard statural et donc que FBN1 avait un rôle majeur dans la chondrogenèse. / Geleophysic dysplasia (GD) is a rare disease, which belong to acromelic group. This pathology is characterized by short stature, brachydactyly, joint stiffness, thick skin, facial dimorphism, broncho-pulmonary insufficiency and cardiac disease which lead to an early death in the first years of life. Two mode of inheritance have been identified. The first one, autosomal recessive, is due to mutations in ADAMTSL2 gene. The second, autosomal dominant, is due to hot-spot mutations in exon 41-42 of FBN1 gene, which encode the Transforming Growth Factor (TGF) β-binding protein-like domain 5 (TB5) of the protein. FBN1 and ADAMTSL2 encode secreted proteins of the extracellular matrix (ECM). FBN1 encodes fibrilline-1, component of microfibrillar network, playing a role in the bioavailability of TGF- β. ADAMTSL2 protein belongs to ADAMTS family, but does not have enzymatic activity due to lack of catalytic domain. Its function remains unknown. However, ADAMTSL2 partners have been identified by our team: latent-transforming growth factor beta-binding protein 1 (LTBP1) and FBN1, which are directly implied in storage of TGF-β. Recently, another protein, FBN2, have been identified as an ADAMTSL2 partner (Hubmacher D et. al.). The aim of my study was to understand the physiopathological mechanism of Geleophysic dysplasia by analysing murine models. A first murine model for the GD recessive form, CreCMV; Adamtsl2f/f (KO), have been generated. Phenotypic analysis of these mice showed short stature and shorter long bones and extremities. In long bone growth plate of mutant mice, we observed disorganization of chondrocyte columns, associated with decrease of collagen 10 expression, marker of chondrocyte differentiation. Analysis of ECM in growth plate revealed strong structural disorganization. Decrease of FBN1 and LTBP1 and were observed with an overactivation of TGF-β pathway in growth plate of mutant mice. We observed disorganization of microfibrillar network in chondrocyte cultures of mutant mice. These results suggest that ADAMTSL2 protein is implied in structure of microfibrillar network, where is stored TGF-β, and demonstrate major role of ADAMTSL2 in chondrogenesis. In order to study dominant form of GD, mouse model FBN1TB5+/-, have been generated. The mice were obtained by knock-in system, with mutation in exon 42 of FBN1 gene. Our results showed short stature of heterozygous (HT) and homozygous (Ho) mice compared to wild)type mice, at stage P1 and P30. At stage P1, we observed larger chondrocytes and deregulation of chondrogenesis markers in growth plate of HT and Ho mice. Furthermore, we observed high mortality of Ho mice at 2-3 months. We concluded that mutations in TB5 domain of FBN1 were linked to short stature and thus FBN1 have major role in chondrogenesis.