L'adhérence à la matrice extracellulaire dépendante des intégrines est un processus dynamique et hautement régulé assurant la motilité cellulaire. La protéine ICAP-1alpha interagit avec le domaine cytoplasmique de l'intégrine beta1 et désorganise les adhérences focales in vitro. Comme ICAP-1alpha est absent des adhérences, cette protéine pourrait avoir une action transitoire et finement régulée au niveau de beta1. Dans un premier temps, j'ai pu montrer que ICAP-1alpha ralentit la phase d'assemblage des adhérences en maintenant l'intégrine beta1 en état de faible affinité pour son ligand. De façon surprenante, la régulation négative de l'affinité de l'intégrine beta1 par ICAP-1alpha assure la perception des faibles densités de matrice extracellulaire et l'adaptation de la réponse cellulaire adhésive à cet environnement. ICAP-1alpha agit comme un capteur mécanique qui limite l'assemblage des sites d'adhérence et ralentit la migration et l'étalement des cellules sur des matrices peu denses. Dans un second temps, la voie de signalisation contrôlant l'activité de ICAP-1alpha sur la fonction de l'intégrine beta1 a été caractérisée. ICAP-1alpha possède des sites consensus de phosphorylation dont un reconnu par la protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline de type II, la CaMKII. Plusieurs évidences révèlent que la CaMKII régule la fonction d'ICAP-1alpha. La phosphorylation d'ICAP-1alpha sur le site reconnu par la CaMKII stimule la liaison de cette protéine sur beta maintient cette intégrine en état de faible affinité pour son ligand et réduit la formation des adhérences focales.

L'obésité maternelle, dont la prévalence ne cesse d'augmenter, est associée à de nombreux troubles de l'accouchement, tels que des dépassements de terme à l'origine d'une augmentation du taux de césariennes. Ces troubles pourraient, en partie, s'expliquer par une concentration plasmatique de leptine plus élevée chez les femmes enceintes obèses ainsi que par les effets inhibiteurs, démontrés in vitro, de cette adipokine sur la contractilité myométriale. Au moment de l'accouchement, la transition phénotypique du myomètre d'un état de quiescence utérine à un état contractile est une étape clé indispensable à la mise en route du travail. Elle est associée à une activation de l'apoptose des cellules myométriales ainsi qu'à un remodelage de la matrice extracellulaire utérine. Le but de notre travail était d'étudier la capacité de la leptine à moduler l'apoptose et le remodelage myométriaux induits par le lipopolysaccharide (LPS).Les échantillons de myomètre ont été prélevés lors de césariennes réalisées avant la mise en route du travail, à la maternité du CHU de Dijon. Les effets de la leptine ont été évalués après incubation des explants myométriaux pendant 48 heures avec du LPS (10 µg/ml) avec ou sans leptine (de 10-10 à 10-8 M).Nos résultats ont démontré la capacité de la leptine à inhiber, de façon concentration-dépendante, l'apoptose induite par le LPS en diminuant l'expression des protéines pro-apoptotiques (caspase-3 clivée, BAX) et en augmentant celle du médiateur anti-apoptotique BCL2. Cet effet anti-apoptotique de la leptine dans le myomètre gestant était associé à l'activation de la voie de signalisation ERK1/2. De plus, nos résultats ont montré que la leptine était également capable de s'opposer, de façon concentration-dépendante, à la dégradation du collagène de la matrice extracellulaire myométriale induite par le LPS. Cet effet était associé à l'inhibition de l'activation et de la surexpression des métalloprotéinases MMP2 et MMP9 induites par le LPS.Ce travail a permis d'approfondir les connaissances sur le rôle de la leptine dans la régulation de l'activité du myomètre. Nos résultats suggèrent que les troubles de l'accouchement observés chez les femmes obèses résulteraient de l'inhibition de l'apoptose et du remodelage myométriaux par la leptine, en plus de l'inhibition de la contractilité utérine déjà décrite.

La jonction myotendineuse (JMT) est une interface spécialisée dans la transmission des forces entre le muscle et le tendon. Le collagène XXII (COLXXII) est un nouveau composant de cette jonction (Koch et al., 2004). COLXXII fait partie de la sous-famille des FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) qui se caractérisent par leur capacité à s'associer aux collagènes fibrillaires pour former des réseaux protéiques. La fonction de ce nouveau composant de la JMT n'est pas connue. C'est pourquoi nous avons décidé de réaliser une perte de fonction chez le poisson zèbre en utilisant la stratégie anti-sens morpholinos et d'en étudier le phénotype par différentes techniques. Chez l'embryon, le COLXXII est exprimé aux extrémités des fibres musculaires au niveau de leur ancrage sur le myosepte (structure équivalente au tendon des mammifères) pour être déposé à la JMT. Son expression est régulée par des membres de la famille des FGF, probablement FGF8. L'absence de COLXXII conduit à une perte des capacités contractiles du muscle et au détachement et à la rétractation progressive des fibres musculaires, causés par une rupture de la JMT qui s'opère entre la lame basale des fibres musculaires et la matrice tendineuse. Le morphotype induit par l'injection de morpholino COLXXII phénocopie les mutants sapje (mutant dystrophine) et candyfloss (mutation de la chaîne α2 des laminines) indiquant que COLXXII permet un lien structural entre le muscle et le tendon. Nos résultats montrent que COLXXII joue un rôle crucial dans le développement et la fonction de la JMT et représente un nouveau gène candidat pour les dystrophies musculaires.

Le cancer de l'ovaire représente la première cause de décès par cancer gynécologique. La survie globale des patientes à 5 ans est inférieure à 30%. Ce sombre pronostic s'explique à la fois par la découverte tardive de la maladie et par le développement d'une chimiorésistance. L'ascite est un fluide exsudatif qui est fréquemment accumulé dans la cavité péritonéale au cours de la progression des cancers de l'ovaire. Ce " microenvironnement tumoral " particulier contribue à la dissémination des cellules cancéreuses et à leurs implantations péritonéales.L'objectif global du travail de thèse a été, d'une part d'évaluer l'influence de l'ascite sur le comportement des cellules cancéreuses ovariennes et d'autre part, d'étudier les mécanismes de résistance à la perte d'ancrage des cellules cancéreuses ovariennes.Nous avons ainsi démontré que l'ascite induit une transition épithélio-mésenchymateuse partielle et que les modifications des comportements cellulaires observées sont dépendantes des intégrines alpha-v.Deux ligands de ces intégrines, la vitronectine et la fibronectine, ont été purifiés selon un protocole original permettant la caractérisation des deux protéines à partir d'une même ascite. Ces protéines ascitiques ont des propriétés différentes selon leur origine, donc selon les patientes dont elles sont issues, et influencent le comportement adhésif des cellules avec un degré variable. L'importance de la signalisation dépendante des intégrines alpha-v et des voies MAP Kinases a également été démontrée dans l'établissement d'une résistance des sphéroïdes tumoraux à l'anoïkis.En perspective, approfondir les connaissances des processus cellulaires et moléculaires conduisant à la dissémination intrapéritonéale et à l'émergence de chimiorésistance ainsi que déterminer le rôle potentiel de protéines ascitiques dans ces processus pourraient permettre la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques.

Le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer à plusieurs reprises après blessure grâce à sa population de cellules souches résidentes: les cellules satellites. Cependant, les mécanismes impliquant les cellules satellite dans la recouvrement de l'homéostasie et de l'intégrité musculaire ne sont toujours pas clairs. Chez l'adulte, les cellules satellites sont quiescentes et localisées dans une niche entre la lame basale et la fibre musculaire. Après blessure, elles prolifèrent, se différencient et fusent afin de restaurer les fibres endommagées. Lorsque la niche des cellules satellite est altérée elles expriment rapidement le marqueur d'activation Myod puis prolifèrent. La lame basale des cellules souches est riche en collagène, glycoprotéines et de protéoglycan. Cependant, le mécanisme de fonction de ces protéines de la matrice extracellulaire (MEC) dans le maintien de la cellule satellite dans sa niche est toujours inconnu. De plus, l'interaction entre la MEC et des voies de signalisation cellulaire essentielles au maintien des cellules souches quiescentes sont toujours un mystère. Nous avons identifiés la voie Notch comme effecteur indispensable à la quiescence des cellules satellites. Un ChIP screening dans des cellules musculaires nous a permit d'identifier des microRNAs et collagènes spécifiques comme des gènes cibles de la voie Notch. L'utilisation d'outils génétiques permettant de moduler l'activité de la voie Notch démontrent que ces microRNAs et collagènes sont régulés transcriptionnellement par la voie Notch in vitro et in vivo. Nous proposons que le Collagène de type V et miR-708, induits par Notch, peuvent autoréguler la niche des cellules souches. / Adult skeletal muscles can regenerate after repeated trauma, yet our understanding of how adult muscle satellite (stem) cells (MuSCs) restore muscle integrity and homeostasis after regeneration is limited. In the adult mouse, MuSCs are quiescent and located between the basal lamina and the myofibre. After injury, they re-enter the cell cycle, proliferate, differentiate and fuse to restore the damaged fibre. A subpopulation of myogenic cells then self-renews and replenishes the stem cell pool for future repair. When MuSCs are removed from their niche, they rapidly express the commitment marker Myod and proliferate. The basal lamina that ensheaths MuSCs is rich in collagens, non-collagenous glycoproteins and proteoglycans. Whether these and other extracellular matrix (ECM) proteins constitute functional components of MuSCs niche remains unclear. Moreover, although signalling pathways that maintain MuSCs quiescence have been identified, how these regulate stem cell properties and niche composition remains largely unknown. Sustained, high activity of the Notch signalling pathway is critical for the maintenance of MuSCs in a quiescence state. Of interest, whole-genome ChIP for direct Notch/Rbpj transcriptional targets identified specific micro-RNAs and collagen genes in satellite cells. Using genetic tools to conditionally activate or abrogate Notch signalling, we demonstrate that the expression of these target genes is controlled by the Notch pathway in vitro and in vivo. Further, we propose that Collagen V and miR708 can contribute cell-autonomously to the generation of the MuSCs niche via a Notch signalling-regulated mechanism.

Les microglies sont des cellules hématogène mais prennent place dans le système nerveux central (SNC) au cours du développement embryonnaire pour constituer la population résidente des cellules immunitaires. Elles sont les médiateurs crucials du bon développement et de l'entretien des réseaux de neurones dans le SNC. De nombreux aspects de la physiologie microgliale et les mécanismes qui sous-tendent leurs fonctions au cours du développement embryonnaire du cerveau sont encore largement méconnues. Cette thèse de doctorat porte sur la migration des cellules microgliales au cours du développement embryonnaire du cortex et elle débouche sur trois grandes conclusions. (1) Les cellules microgliales embryonnaires in situ sont très dynamiques et adaptent leur phénotype à leur environnement local. (2) La vitesse de migration des microglies ex vivo dépend des intégrines beta1 qui exercent des fonctions à la fois inhibitrices et promotrices sur la migration selon l'âge embryonnaire. (3) Les microglies jouent probablement un rôle dans l'étiologie des troubles du développement neurologique, mais il faudrait que les futures recherches se concentrent sur le dysfonctionnement des microglies plutôt que sur leur activation immunitaire classique. / Microglia are blood-borne cells but take up residence in the central nervous system (CNS) during embryonic development to constitute the resident pool of immune cells. They are crucial mediators of the healthy development and maintenance of neural networks in the CNS. Many aspects of the physiology of microglia and the mechanisms underpinning their tasks during embryonic brain development are still unresolved. This doctoral dissertation focuses on migration of microglial cells during embryonic cortical development. All together, this dissertation brings forwards three major conclusions. (1) In situ embryonic microglia are highly dynamic cells that adapt their phenotype to their local environment. (2) Microglial migration speed ex vivo is dependent on β1 integrins that exert both migration promoting and inhibiting functions which are age-specifically regulated. (3) Microglia likely play a role in the etiology of neurodevelopmental disorders, but further research should focus on microglia dysfunction rather than classical microglial immune activation.

L’épithélium intestinal est composé d’une monocouche de cellules épithéliales qui recouvrent à la fois les villi qui projettent dans le lumen et les cryptes invaginées dans le tissu conjonctif sous-jacent. Les cellules souches intestinales prolifèrent dans les cryptes et se différencient en 5 types de cellules différenciées incluant les entérocytes, les cellules de Paneth, les cellules caliciformes, les cellules entéroendocrines et les cellules Tuft. La plupart de ces cellules différenciées migrent vers le pôle apical du villus où elles meurent par apoptose exception faite des cellules de Paneth qui sont présentes uniquement dans les cryptes. Les cellules épithéliales adhèrent à la membrane basale qui sépare l’épithélium du stroma principalement constitué de collagène I et de fibroblastes. L’épithélium intestinal est renouvelé chaque semaine. Plusieurs voies de signalisation biochimiques qui gouvernent l’homéostasie intestinale ont été isolées en utilisant des modèles murins. En complément des études menées in vivo, des systèmes in vitro ont été développés de répondre à des questions difficiles à étudier in vivo, on peut notamment citer les organoides. Malgré leur indiscutable intérêt, les organoides ne reproduisent pas certaines caractéristiques majeures de l’intestin, à savoir que le nombre de total de cellules ne reste pas constant, qu’ils ne forment pas spontanément des villi et que le stroma est absent de ces modèles. Présentement, uniquement deux microsystèmes ont tenté de pallier l’absence de villi de ces modèles en reproduisant des caractéristiques dynamique (i.e le mouvement péristaltique) ou architecturale (i.e la topographie des villi) de l’intestin dans le but d’induire la formation des villi. Cependant, dans ces deux systèmes, les cellules ne reposent pas sur un substrat physiologique et sont directement ensemencées sur un support élastomérique. Quand bien même la surface de ces substrats est traitée avec des molécules constitutives de la matrice extracellulaire (ECM), ils ne reproduisent pas la micro-architecture (e.g sa structure microfibrillaire et la possibilité d’être remodelée par les cellules ensemencées) et les propriétés mécaniques spécifiques de l’ECM intestinale. Il est ainsi fort probable que ces systèmes induisent des phénotypes différents de ceux comprenant un substrat physiologique. Pour éviter ces phénomènes, nous avons développé un système innovant qui reproduit à la fois la composition et la topographie de la matrice intestinale. Le collagène I, en tant que principal composant des matrices extracellulaires, des mammifères a naturellement été choisi comme substrat cellulaire. La composition ainsi que les propriétés rhéologiques du collagène commercial ont été comparées au collagène extrait de queue de rat dans le laboratoire. Les techniques de lithographies ont été adaptées pour microstructurer les hydrogels en collagène en une sinusoïde tridimensionnelle de 400µm de période et 400µm d’amplitude en accord avec les dimensions anatomiques des intestins de souris. Les cellules épithéliales de lignées Caco2 qui sont considérées comme un modèle de cellules intestinales ont été ensemencées à la surface de la structure et ont colonisé les micro-structures en formant une monocouche cellulaire. L’utilisation du collagène I permet l’inclusion de fibroblastes primaires dans la matrice où ils évoluent in vivo. Les forces de tension développées par la monocouche épithéliale à la surface de la matrice mais également par les fibroblastes dans l’hydrogel affaissent les structures. Plus la concentration en collagène des gels est importante moins les structures sont déformées. Cependant, pour des concentrations supérieures à 6mg/mL, les fibroblastes présentent des difficultés pour s’étaler et proliférer dans la matrice probablement dues à une diffusion réduite des nutriments dans de telles matrices mais également à une réduction de la taille du maillage fibrillaire qui empêche l’étalement des cellules. / The epithelium of the small intestine is composed of a single layer of epithelial cells lining the villi that project into the lumen of the gut, and the crypts that descend into the underlying connective tissue. Dividing stem cells are contained within the crypts and give rise to five types of specialized epithelial cells including enterocytes, Goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and Tuft cells. Most of those cells travel upwards from the crypt towards the villus tip where they shed into the lumen except for Paneth cells that remain confined into the crypt. The basement membrane underlines the basal surface of epithelium and separates it from the stroma mostly composed of collagen I and fibroblasts. The whole intestinal epithelium is renewed every week. Many biochemical pathways that control intestinal homeostasis are discovered using mouse models. In contrast, in vitro models systems, such as organoids, provide a mean to investigate questions hard to be addressed in vivo. Despite their obvious interest, organoids do not fully recapitulate intestinal features: the total number of cells does not remain constant, villi-like structures are missing as well as cells and matrix constitutive of the stroma. Only two microfabricated devices have been developed to overcome this absence of villi by replicating dynamic (i.e the peristaltic motion) or structural feature (i.e the topography of the villus) of the intestine in order to induce the formation of villi. However they both do not provide the cells a physiological substrate as cells are directly seeded on an elastomeric synthetic scaffold. Even though those substrates are coated with ECM molecules, as they miss the micro-architecture specific of ECM (e.g. fibrillar structure and capacity to be remodeled by cells) as well as their mechanical properties; they might induce a different phenotype to the cells than if they were seeded on/in an ECM-like hydrogel. To address this lack, we developed an innovative device that recapitulates both the composition and topography of the intestinal lining. We chose collagen I as the constituent of our substrate since collagen I is the most abundant protein in mammals and the main constituent of all ECM in the body. We first characterized the composition and the rheological properties of commercial rat tail collagen I hydrogel and compared it to the one we extracted from rat tails. To reproduce the 3D structure of the intestine, we microstructured collagen I scaffolds as 3D sinusoids with 400µm period and 400µm height that respect the anatomic dimensions of mice intestine by adapting methods from soft lithography field. Epithelial cells from Caco2 cell line which are considered as an intestinal model were first seeded on the surface of the scaffold and successfully colonized the structure as a monolayer. Primary fibroblasts were embedded in collagen scaffolds were they actually belong in vivo. The force exterted by the epithelial monolayer at the surface of the scaffold but also by the fibroblasts inside the gels flattened the structures. The higher the concentration of collagen was the less the structures were deformed. However, for collagen concentrations higher than 6mg/mL, the fibroblasts experienced difficulties to spread and proliferate in the matrix probably related to a reduced diffusion of nutrients in such matrix or to the reduced mesh size of the fibrillar network that prevent cell spreading. Two main approaches were investigated to stiffen the collagen scaffold while maintaining a porosity suitable for fibroblasts spreading and proliferation. One consisted in the addition of a stiffer biocompatible polymer to generate a hybrid semi-interpenetrating network hydrogel with improved mechanical properties. The other resided in the addition of a cross-linker that covalently bonded the fibrils constitutive of the collagen network.

Le muscle squelettique est le réservoir principal d’acides aminés libres de l’organisme. Ainsi, l’atrophie musculaire induite par l’immobilisation peut entraîner un affaiblissement et un allongement des périodes de récupération générant des coûts de santé publique élevés. Une aggravation de l’atrophie caractérise de façon surprenante le muscle tibialis anterior (TA) après le déplâtrage, retardant la récupération. Mon objectif a été de comprendre les mécanismes à l’origine de l’aggravation de l’atrophie du TA pendant les phases précoces de récupération en étudiant i) la structure et le phénotype des muscles, ii) la composition de la matrice extracellulaire (MEC), iii) la protéolyse et l’apoptose, et iv) les processus de signalisation via les intégrines. Des rats ont été soumis à une immobilisation par plâtrage pendant 8 jours d’une des deux pattes arrière, l’autre servant de témoin, et placés en récupération pendant 10 jours. L’aggravation de l’atrophie du TA apparaît dès déplâtrage, corrélée avec i) une baisse de l’aire des fibres associée à leur déformation, ii) une redistribution des isoformes des chaines lourdes de myosines, iii) une augmentation de l’apoptose localisée dans le tissu conjonctif, iv) un épaississement de l’endomysium pendant la remobilisation, v) des adaptations au niveau des processus de remodelage des collagènes, et vi) une activation prononcée et persistante du système protéolytique ubiquitine-protéasome (UPS) et de l’apoptosome. Nous montrons également une élévation des niveaux ARNm dans le TA remobilisé vii) de la ténascine-C et de Sparc dès le déplâtrage, et viii) de marqueurs de l’autophagie à partir du moment où l’atrophie se stabilise. Enfin, nous montrons également une élévation des ARNm dans le TA immobilisé ix) des facteurs myogéniques, et x) des intégrines membranaires et de leurs partenaires pendant l’immobilisation et après le déplâtrage. En conclusion, mon travail de thèse a permis de montrer que l'aggravation de l’atrophie du TA est précoce, associée à un remodelage important de la structure et de la composition de la MEC et du phénotype des fibres musculaires, et pourrait résulter de l’augmentation persistante et prononcée de la voie UPS et de l’apoptose. Ce travail suggère que des modifications au niveau des molécules matricielles pendant la remobilisation pourraient influencer la signalisation dépendante des intégrines et la régénération musculaire. / Skeletal muscle is the main reservoir of body amino acids. Thus, muscle atrophy induced by immobilization can lead to a weakening and to a lengthening of recovery periods, leading to elevated healthcare costs. Surprisingly, a worsening of tibialis anterior (TA) muscle atrophy prevailed after cast removal and thus delayed recovery. The aim of my Ph.D was to understand mechanisms underlying the worsening of TA atrophy during early recovery by studying i) the muscle structure and phenotype, ii) the composition of the extracellular matrix (ECM), iii) proteolysis and apoptosis, and iv) the signaling pathways via integrins. Rats were subjected to hindlimb casting for 8 days of one hindllimb, the other leg served as control, and then were allowed to recover for 10 days. The worsening of TA atrophy appeared immediately after cast removal and correlated with i) a decrease in fiber crosssection area associated to fiber deformation, ii) a redistribution of myosin heavy chain isoforms, iii) an increase in apoptosis localized in the connective tissue, iv) a thickening of the endomysium during remobilization, v) some adaptations in collagen remodeling processes, and vi) a pronounced and sustained activation of the ubiquitin-proteasome proteolytic system (UPS) and of the apoptosome. We also showed an increase in the remobilized TA of mRNA levels vii) of tenascin-C and Sparc immediately after cast removal, and viii) of some autophagy markers, when atrophy stabilized. Finally, we showed an elevation of mRNA levels encoding ix) myogenic factors, and x) transmembrane integrins and their partners during TA immobilization and after cast removal. In conclusion, my Ph.D project showed that the worsening of the TA atrophy occurred early after cast removal, was associated with a significant remodeling of the structure and composition of the ECM and of the phenotype of muscle fibers, and may result from pronounced and sustained increase in the UPS and apoptosis. This work suggests that changes in the matricellular matrix molecules during remobilization could influence integrin-dependent signaling and muscle regeneration.

La cicatrisation cornéenne représente un processus de réparation complexe qui vise à restaurer l'intégrité, la structure et la transparence de la cornée. Cependant, dans un certain nombre de cas, ce processus peut évoluer de façon anormale et se stabiliser en entraînant la formation d'une opacité cornéenne installée. Les mécanismes impliqués dans la formation de ces cicatrices persistantes ne sont pas encore complètement élucidés, mais il est établi que la composition et l'organisation de la matrice extracellulaire du stroma jouent un rôle majeur dans la restauration de la transparence de la cornée. Ce projet s’est concentré sur la métalloprotéase extracellulaire BMP-1 (Bone Morphogenetic Protein 1), déjà connue pour son rôle dans l'assemblage de la matrice extracellulaire et l'activation du TGF-bêta. Afin d’identifier les processus contrôlés par BMP-1 dans la cornée, nous avons d’abord effectué une comparaison systématique des inhibiteurs de BMP-1 connus ou potentiels, de différentes origines, pour caractériser leurs propriétés à la fois in vitro et dans des cultures cellulaires. Ensuite, nous avons mené une étude approfondie du sécrétome des cellules stromales de la cornée humaine (kératocytes), et des conséquences de la différenciation de ces cellules en myofibroblastes. Enfin, nous avons analysé les événements protéolytiques médiés par BMP-1 dans le sécrétome des kératocytes en utilisant principalement une approche de protéomique quantitative basée sur le marquage iTRAQ des protéines entières (technique TAILS). La comparaison des inhibiteurs disponibles de BMP-1 a permis de mettre en évidence différents profils d’efficacité, de spécificité et de toxicité et a conduit à l’identification d’un inhibiteur hydroxamate et d’un inhibiteur protéique efficaces, peu toxiques et très spécifiques de BMP-1. Le sécrétome des kératocytes s’est avéré être un modèle adéquat pour l’étude des activités de BMP-1 dans le contexte cornéen. Plus de 2022 protéines ont été identifiées, dont la métalloprotéase BMP-1 et 16 de ses 33 substrats connus jusqu’à présent. Enfin, 76 protéines modifiées par l’activité de BMP-1 ont été identifiées dans le sécrétome des kératocytes. Ces résultats confirment les liens forts entre BMP-1, l'assemblage de la matrice extracellulaire et le TGF-bêta, mais suggèrent également de nouveaux rôles pour la protéase dans l'inflammation. Certains des substrats nouvellement identifiés (TGFBI, HSP47 et collagène VI) sont très pertinents dans le contexte de la cicatrisation de la cornée et ont été validés d’un point de vue biochimique. En conclusion, BMP-1 est confirmée comme une cible potentielle intéressante pour traiter ou prévenir la formation des opacités cornéennes et la caractérisation des inhibiteurs disponibles ouvre des perspectives importantes pour des études précliniques chez l’animal / When the cornea is injured, a complex multi-step healing process is triggered which aims at restoring corneal integrity, structure and transparency. However, in some cases, corneal healing results in the formation of a stable scar associated with a prolonged loss of corneal transparency and with functional blindness. The mechanisms involved in the formation of these persistent scars are still not fully understood but it is known that the composition and organization of the extracellular matrix significantly contributes to the maintenance of corneal transparency. This work focused on the extracellular metalloproteinase called BMP-1 (Bone Morphogenetic Protein 1), a major player in the control of extracellular matrix assembly and TGF-beta activation, which was previously shown to be up-regulated in corneal healing and scarring. In order to further probe BMP-1 functions in corneal healing, we first performed a systematic comparison of known or potential BMP-1 inhibitors from different origins to characterize their properties both in vitro and in cell cultures. We then carried out an in-depth study of the secretome of human corneal stromal cells (keratocytes) and of the consequences of the differentiation of these cells into myofibroblasts. Finally, we analyzed BMP-1-mediated proteolytic events in keratocyte secretomes, mainly using a quantitative proteomic approach based on iTRAQ labeling of proteins (TAILS technique). The comparison of BMP-1 available inhibitors revealed different profiles of efficacy, specificity and toxicity and led to the identification of one hydroxamate inhibitor and one protein inhibitor, which were very efficient, non-toxic and very specific of BMP-1. The keratocyte secretome was shown to be a suitable model for the study of BMP-1 activities in the corneal context. More than 2022 proteins were identified, including the BMP-1 metalloprotease and 16 of its 33 already known substrates. Finally, 76 proteins modified by BMP-1 activity were identified in the keratocyte secretome. These results confirm the strong links between BMP-1, extracellular matrix assembly and TGF-beta, but also suggest new roles for this protease in cell proliferation and inflammation. Some of the newly identified substrates (TGFBI, HSP47 and collagen VI) are highly relevant in the context of corneal healing and were validated at the biochemical standpoint. In conclusion, BMP-1 is confirmed as a potential target to treat or prevent the formation of corneal opacities and the characterization of available inhibitors opens up important perspectives for preclinical studies in animals

Une expression élevée de la protéine de la matrice extracellulaire ténascine-C (TNC) favorise la progression du cancer et est corrélée à une réduction de la survie des patients. Dans cette thèse, j’ai étudié comment la TNC affecte l'angiogenèse tumorale. J’ai montré que la TNC altère les protrusions angiogéniques, la tubulogenèse, la migration et la prolifération des cellules endothéliales. J’ai lié ces effets à la perturbation du cytosquelette d'actine et la réduction de la signalisation YAP par la TNC. Chez les cellules tumorales et les fibroblastes associés au cancer, la TNC favorise la sécrétion de facteurs angio-modulateurs qui stimulent la survie et la tubulogenèse des cellules endothéliales de façon paracrine. Cet effet implique la régulation de l’expression de SDF1 (CXCL12) et de deux membres de la famille des lipocalines. Ainsi, la TNC favorise l’angiogenèse en activant chez les cellules tumorales un sécrétome pro-angiogénique, et inhibe la tubulogenèse en altérant la survie des cellules endothéliales. Ces effets opposés pourraient expliquer pourquoi nous avons observé dans un modèle de tumeur spontanée chez la souris que la TNC favorise le switch angiogénique résultant en la formation d’une forte vascularisation tumorale, mais qui reste peu fonctionnelle associée à la formation de plus de métastases. Ce travail fournit pour la première fois la possibilité de contrer l’action de la TNC dans l'angiogenèse tumorale. / A high expression of the extracellular matrix molecule tenascin-C (TNC) enhances multiple steps in cancer progression and correlates with worsened survival prognosis. In this thesis I studied how TNC affects tumor angiogenesis. I showed that TNC impairs endothelial sprouting, tubulogenesis, migration and proliferation. I linked this effect to disruption of the actin cytoskeleton and reduced YAP signaling activity by TNC. In tumor cells and cancer associated fibroblasts, TNC regulated secretion of angio-modulatory factors that promoted endothelial cell survival and tubulogenesis in a paracrine manner involving regulation of SDF1 (CXCL12) and two lipocalin family members. Altogether, TNC promotes endothelial tubulogenesis through a pro-angiogenic secretome from tumor cells, and inhibits by direct contact tubulogenesis by impairing endothelial cell survival. These opposing effects could explain why we observed that TNC promotes the tumor angiogenic switch resulting in more but poorly functional blood vessels associated with more metastasis in a spontaneous tumor mouse model. This knowledge provides for the first time opportunities to counteract TNC activities in tumor angiogenesis.