Le carcinome hépatocellulaire (CHC) présente des mutations génétiques qui altèrent les principales voies de signalisation, notamment la voie Wnt/β-caténine. En absence de mutation génétique, certains CHC peuvent montrer une activité Wnt exacerbée suite à une inactivation épigénétique d’inhibiteurs ou à une surexpression de ligands Wnts ou de ses récepteurs. De plus, le remodelage de la matrice extracellulaire favorise la progression du CHC. Nous avons montré une association entre l’activation du signal Wnt et le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) dans les cirrhoses et le CHC. Puis modélisé in vitro, les effets des stimuli Wnt extracellulaires sur le phénotype de cellules hépatiques, en absence de mutation de la β-caténine. En effet, les cellules HepaRG ne présentent pas de mutations de la β-caténine, de l’axine et de p53. Ainsi, la stimulation Wnt3a des cellules HepaRG induisait la formation de palissades de cellules fusiformes. De plus, les cellules traitées exprimaient des taux élevés de αSMA, COLIV, c-MYC, CK19 et LGR5 suggérant un phénotype myofibroblastique, en accord avec l’expression des marqueurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), SNAIL et TWIST. Ces données sont en faveur du rôle déterminant du microenvironnement Wnt activé dans la progression du CHC entrainant les cellules vers un phénotype progéniteur plus agressif via une TEM. En outre, l'analyse in silico de la signature transcriptomique de l'activation non mutationnelle de la voie Wnt a révélé un réseau de gènes impliqués dans le remodelage de la MEC, la TEM et la différenciation cellulaire. Les résultats suggèrent le rôle de HAPLN1 qui affecterait la migration cellulaire et l'expression des gènes de la MEC. De plus, LGR5 semble favoriser la dédifférenciation des hépatocytes. Au total, 8 gènes marqueurs obtenus in vitro ont été validés in vivo dans une série de 81 CHC humains, par qPCR et immunohistochimie en utilisant des tissus micro-array (78 CHC et 5 foies contrôles). Au total, l'ensemble des données suggère que HAPLN1 a une valeur pronostique sur la récidive et la survie globale du CHC. HAPLN1semble être indépendant du statut mutationnel la β-caténine et des variables cliniques. De plus, sa valeur pronostique est additive avec celle de CK19 + EpCAM et il semble agir en synergie avec NOG. / Hepatocellular carcinoma (HCC) displays signaling pathway disorders, including Wnt/β-catenin. Up-regulation of extracellular Wnt pathway agonists and down-regulation of extracellular Wnt pathway inhibitors result in non-mutational activation of Wnt signaling. In addition, increased extracellular matrix remodeling fosters HCC progression. Thus, we showed that enhanced Wnt signaling is associated with extracellular matrix remodeling in human cirrhosis and cancer. To further investigate non-mutational Wnt pathway activation, we established a model of Wnt activation in HepaRG human HCC progenitor cells carrying wild-type β-catenin, axin and p53. HepaRG progenitor cells treated with Wnt3a became fusiform and grew in palisades with enhanced expression of αSMA, COLIV, CK19, c-MYC, LGR5, SNAIL and TWIST, suggesting that enhanced extracellular Wnt signaling may drive HCC cells toward a more aggressive progenitor and epithelial mesenchymal transition (EMT) phenotype. Moreover, in silico analysis of the transcriptomic signature of non-mutational Wnt activation revealed a gene network involved in ECM remodeling, EMT and cell fate. Results suggest a role of HAPLN1, affecting extracellular matrix gene expression and cell migration and of LGR5 in hepatocyte dedifferentiation. Eight genes among the HepaRG gene expression dataset were validated in vivo in a collection of 81 human HCC samples and controls by qPCR and immunohistochemistry using tissue micro-arrays (78 HCC samples and 5 normal livers) in the light of β-catenin activation and mutational status. In conclusion, data suggest that HAPLN1 has a prognostic value on overall survival and recurrence of HCC. HAPLN1 appears to be independent of clinical features and β-catenin mutationnal status. Moreover, HAPLN1 appears to have an additive prognostic value with CK19 + EpCAM and act synergistically with NOG.

Les pathologies valvulaires aortiques sont des pathologies plurifactorielles, comportant un déterminisme génétique indiscutable mais peu caractérisé. Ma thèse a pour but d’étudier le rôle du facteur de transcription Krox20 au cours du développement et de la maturation valvulaire à travers l’analyse de modèles murins. Nous avons montré que ce gène est nécessaire au développement et à la maturation de la valve aortique. L’invalidation de Krox20 chez la souris conduit à une hypertrophie des feuillets aortiques dès les stades fœtaux et à des insuffisances aortiques chez l’adulte. Ces anomalies sont associées à des défauts d’organisation de la matrice extracellulaire en partie liée à une régulation directe de l’expression des collagènes de type I et III. 25% des souris déficientes pour Krox20 présentent une bicuspidie de la valve aortique. Nous avons observé une diminution de l’expression de eNos chez ces mutants et pu mettre en évidence une interaction génétique entre Krox20 et eNos. De plus, nous avons identifié une sous population de cellules des crêtes neurales cardiaques impliquées dans l’apparition de la bicuspidie chez les mutants Krox20. Afin d’explorer le rôle de Krox20 dans la calcification de la valve aortique, nous avons étudié les conséquences de la surexpression de ce gène dans un modèle et montré que lcela induisait une activation de gènes pro-fibrotiques et pro-ostéogénique sans conduire à des dépôts calciques. Krox20 est donc un facteur de transcription important pour la valvulogenèse et à l’homéostasie valvulaire chez l’adulte. Mes travaux ont contribué à l’identification de Krox20 comme gène candidat potentiel aux valvulopathies rencontrées chez l’homme. / Long seen as a consequence of aging and mechanical wear of aortic cusps, aortic valve diseases are currently considered multifactorial diseases, with an indisputable genetic determinism but not well characterized. My thesis aims to study the role of the transcription factor Krox20 during development and maturation of the valve through the analysis of mouse models. We have shown that this gene is necessary for the development and maturation of the aortic valve. Indeed, the deletion of Krox20 in the mouse leads to thickened aortic leaflets from the fetal stage and the onset of aortic valve disease in adults. These anomalies are associated with defects in the organization of the extracellular matrix and more particularly to direct regulsation of collagen type I and type III expression. Our analysis showed that 25% Krox20-/- mice have a bicuspid aortic valve. The analysis of this model has allowed us to identify a population of cardiac neural crest cells involved in the occurrence of this phenotype. In addition, we were able to observe a down regulation of eNos in Krox20-/- embryos and show a genetic interaction between Krox20 and eNos. To address the role of Krox20 in the process of calcification of the aortic valve, we have studied the effects of its overexpression. Our preliminary results indicate that this overexpression leads to activation of pro-fibrotic and pro-osteogenic genes, however, this is not sufficient to induce calcification of aortic valve leaflets.Therefore Krox20 is important for valvulogenesis but also for valvular homeostasis in the adult. My work has contributed to the identification of a potential candidate gene involved in human valve diseases.

La neurogenèse adulte permet la formation de nouveaux neurones dans les bulbes olfactifs de la souris. Les propriétés des cellules souches neurales situées dans la zone sous-ventriculaire (ZSV) et des précurseurs sont régulées par la niche contenant des cellules de support et une matrice extracellulaire (MEC). Des facteurs contenus dans le liquide cérébrospinal (LCS), produits par les plexus choroïdes (PC), contrôlent aussi la niche. L'homéoprotéine Otx2 est secrétée dans le LCS par les PC, et internalisée spécifiquement par certaines cellules du parenchyme cérébral. Otx2 est impliquée dans différentes étapes du développement du cerveau, dont celui des PC, et peut agir de manière non-cellulaire-autonome. Ma thèse vise à comprendre comment Otx2 régule les fonctions des PC et participe à la neurogenèse adulte. Grâce à des études génomiques d'un modèle murin knockdown (KD) d'Otx2 dans les PC adultes, nous avons montré que (i) les PC de différents ventricules présentent des profils d'expression différents (ii) le KD d'Otx2 modifie l'expression de gènes impliqués dans des fonctions importantes des PC (iii) la dérégulation de certains gènes après KD est spécifique d'un type de PC. Une étude protéomique suggère (iv) qu'Otx2 pourrait être impliquée à d'autres niveaux que la régulation transcriptionnelle. L'étude de la neurogenèse adulte dans des modèles murins KD d'Otx2 nous a permis de montrer que (i) l'expression d'Otx2 dans les PC régule la neurogenèse adulte (ii) Otx2 transfère dans les astrocytes de la ZSV (iii) le transfert d'Otx2 est suffisant pour réguler la neurogenèse (iv) le KD d'Otx2 dans les PC modifie l'expression de protéines de la MEC secrétées par les astrocytes. / Adult neurogenesis in mice involves neural stem cells in the subventricular zone (SVZ) whose progenitors integrate into the olfactory bulbs. The neurogenic niche, which contains supporting cells and extracellular matrix (ECM), regulates the properties (proliferation, migration and differentiation) of progenitor cells. This niche is influenced by factors from cerebrospinal fluid (CSF), which is produced by the choroid plexus (CP) in the brain ventricles. The Otx2 homeoprotein transcription factor is secreted into CSF by CP, and taken up by a specific subset of cells within the brain parenchyma. Otx2 is involved in various stages of brain development, including CP development, and has non-cell autonomous functions. The aim of my thesis is to understand how Otx2 regulates adult CP function and participates in adult SVZ neurogenesis. Through genomic studies, we investigated the consequence of Otx2 knockdown (KD) in adult CP and found: (i) adult CP from different ventricles exhibit different expression profiles; (ii) Otx2 KD alters the expression of genes with important CP functions; and (iii) deregulation of certain genes after Otx2 KD can be CP specific. Through proteomics studies, we found that (iv) adult Otx2 could be involved in functions beyond transcriptional regulation, such as RNA processing.To evaluate the role of Otx2 in SVZ neurogenesis, we also used Otx2 KD mouse models. We found that: (i) the expression of Otx2 in CP regulates adult neurogenesis; (ii) Otx2 transfers to astrocytes of the SVZ; (iii) Otx2 transfer is sufficient to regulate adult neurogenesis; and (iv) Otx2 KD in CP alters the expression of ECM proteins secreted by astrocytes in the neurogenic niche.

L’angiogenèses par bourgeonnement est associée à une réorganisation majeure de la matrice extracellulaire (MEC). Nous avons déjà démontré que la lysyl oxydase-like 2 (LOXL2), une enzyme responsable du crosslinking de la MEC, régule la formation de vaisseaux intersomitiques dans les embryons de poisson zèbre et de capillaires en hydrogels 3D. Dans ce manuscrit, nous avons examiné les mécanismes impliqués dans cette régulation. Nous avons constaté l’association intracellulaire de LOXL2 avec la fibronectine et le collagène IV, avant d’être incorporée dans des structures fibrillaires dès l’exocytose. De plus, l’inhibition de l’expression de LOXL2 entraine des défauts de déposition de la MEC et diminue sa rigidité, inhibant secondairement la maturation des structures d'adhésion cellulaire. Alors que LOXL2 n‘est pas nécessaire pour la formation de capillaires dans un modèle 2D sur MEC de fibroblastes, les défauts de déposition de MEC sont corrélés à l'inhibition de formation des capillaires en hydrogel 3D. Ni l’addition de LOXL2 exogène, ni l’augmentation de la rigidité des hydrogels ne compense la perte d’expression de LOXL2. Enfin, nous avons pu montrer que ni l'activité catalytique ni le domaine catalytique de LOXL2 ne sont essentiels pour la formation de capillaire dans le poisson zèbre et dans les hydrogels et pour l’assemblage du collagène IV par des cellules endothéliales. L’ensemble de ces données suggère donc que les domaines SRCR de LOXL2 exprimés par des cellules endothéliales régulent l’échafaudage de fibronectine et de collagène IV dans la MEC qui est nécessaire à la formation de capillaires. / Sprouting angiogenesis is associated with major extracellular matrix (ECM) remodelling, consisting in both degradation of the microenvironment and generation of a new basement membrane. We have previously reported that lysyl oxidase-like 2 (LOXL2), an enzyme responsible for ECM crosslinking, regulates formation of intersomitic vessels (ISV) of zebrafish embryos and of capillaries in 3D hydrogels. In this manuscript we investigated the mechanisms involved. We found that LOXL2 associates with fibronectin and collagen IV intracellulary before direct incorporation in fibrillar structures of the ECM upon exocytosis. In addition, silencing LOXL2 demonstrated its involvement in ECM deposition as both composition and stiffness of the ECM were affected, which subsequently altered maturation of cell adhesion structures. Whereas LOXL2 is not required for formation of capillaries on top of a fibroblast monolayer, in a 2D assay, ECM defaults were associated with altered formation of capillaries in 3D hydrogels.Neither addition of exogenous LOXL2, nor increasing the stiffness of hydrogels could restore capillary formation. Moreover, we could show that neither the catalytic activity nor the catalytic domain were required for capillary formation in vivo and in 3D hydrogels, and for collagen IV deposition by endothelial cells. Altogether, these data suggest that the SRCR domains of LOXL2 expressed by endothelial cells regulate 3D capillary morphogenesis through scaffolding of fibronectin and collagen IV in the ECM.

Le système musculo-squelettique permet la mobilité. Le développement des muscles, du tissu conjonctif (TC) et des os est coordonné de manière très précise. Osr1 encode pour un facteur de transcription qui est exprimé au niveau du TC musculaire au cours du développement. Le but de cette thèse est d'élucider la fonction d’Osr1 dans la régulation cellulaire non-autonome de la formation des muscles au niveau des membres dans le modèle murin. Le traçage génétique a révélé que les cellules Osr1+ sont à l’origine de plusieurs TC, y compris musculaire, cutané et pulmonaire, mais aussi à l’origine du muscle lisse et des adipocytes bruns. L’analyse phénotypique des embryons de souris Osr1GCE/GCE à E13.5 a révélé des défauts dans l’organisation des muscles. L’analyse transcriptomique montre deux caractéristiques moléculaires causées par le manque d'activité d’Osr1. Tout d'abord, Osr1 réprime l'expression de gènes associés au développement du cartilage et du tendon, ce qui suggère qu’Osr1 confère une identité «tissu conjonctif musculaire». Ensuite, Osr1 régule positivement l'expression des composants de la matrice extracellulaire (MEC). De plus, l’expression de nombreuses molécules de signalisation est diminuée dans les cellules déficientes pour Osr1. Ces résultats montrent l’importance des cellules Osr1+ du TC dans la formation des muscles des membres. Ces résultats montrent également qu’Osr1 régule la transcription des composants de la MEC au niveau du tissu conjonctif musculaire. Enfin, ils suggèrent qu’Osr1 exerce sa fonction par l'intermédiaire de facteurs sécrétés pour assurer le bon développement musculaire. / The musculoskeletal system allows body motion. Despite the distinct mesodermal origins of its components, the development of muscle, connective tissue (CT) and bone is highly coordinated. Osr1 encodes a zinc-finger transcription factor expressed in muscle CT in limbs. The aim of the PhD was to elucidate Osr1 function in the non-cell autonomous regulation of mouse limb muscle formation. Genetic lineage tracing revealed that Osr1+ cells are progenitors for several CTs, including muscle, dermal and lung CTs, but also for smooth muscle and brown adipocytes. Comprehensive phenotypic analysis of skeletal muscles in E13.5 Osr1GCE/GCE mouse embryos revealed impaired muscle formation. Transcriptomic analysis highlighted two major molecular characteristics caused by the lack of Osr1 activity. First, Osr1 actively repressed the expression of genes associated with cartilage and tendon development, suggesting that Osr1 confers a muscle connective tissue identity. Second, Osr1 positively regulated the expression of components of the extracellular matrix (ECM). In addition to the decrease of ECM components, numerous signaling molecules were significantly down-regulated in Osr1-deficient cells of mutant embryos. This highlights the function of Osr1+ resident connective tissue cells in limb muscle formation. It also establishes that Osr1 regulates the transcription of ECM components in limb muscle CT. Lastly, it suggests that Osr1 exerts its function via chemokines and secreted factors to ensure proper muscle development.

La matrice extracellulaire (MEC) constitue une source de balises moléculaires qui guident les axones moteurs en direction de leur cible musculaire. Le collagène XV (COLXV) est un collagène associé aux lames basales qui est codé par deux paralogues chez le poisson zèbre, col15a1a et col15a1b. Au cours de ma thèse, nous avons déterminé le patron d’expression du second paralogue col15a1b et caractérisé sa fonction in vivo au cours du développement du poisson zèbre. Dans le tronc, col15a1b est spécifiquement exprimé par les précurseurs du muscle lent qui sont la source d’un grand nombre de molécules de la MEC constituant le chemin des axones moteurs en croissance. Grâce à des anticorps spécifiquement dirigés contre COLXV-B nouvellement générés, nous avons montré que COLXV-B balise la trajectoire des axones moteurs. Des expériences de perte et de gain de fonction ont montré que l’expression et l’organisation extracellulaire de col15a1b dépend des voies de signalisation Hedgehog et unplugged/MuSK respectivement. L’inhibition de l’expression de col15a1b provoque principalement un arrêt de croissance ou des erreurs de trajectoire des axones des motoneurones primaires et secondaires au niveau du point de sélection des trajectoires. Ce défaut d’innervation s’accompagne d’une atrophie musculaire et d’un comportement de nage anormal des embryons en réponse à une stimulation. La conservation de la synthénie, la similarité du patron d’expression de col15a1b et COL15A1 pourrait avoir une fonction identique chez l’humain et représenter un gène candidat pour les maladies neuromusculaires / The extracellular matrix (ECM) provides positional information to guide motoneuron axons toward their muscle target. Collagen XV is a basement membrane component encoded by two paralogs in zebrafish, col15a1a and col15a1b. My PhD project consisted in the characterization of the expression pattern of the col15a1b paralog during development and in the analysis of the in vivo function of this paralog in developing zebrafish embryos. Interestingly, we showed that col15a1b paralog is expressed by slow muscle precursors that represent an important source of the ECM path. Using newly generated antibodies to collagen XV-B (COLXV-B), we found that COLXV-B paves the trajectory of motor axons. Loss and gain of function experiments showed that col15a1b expression and extracellular organization depends respectively on Hedgehog and unplugged/MuSK signaling. Col15a1b knockdown weakly affected slow muscle differentiation but provoked primary and secondary motoneuron axons truncation or pathfinding errors at the choice point where pathway selection takes place. This resulted in muscle atrophy and compromised swimming behavior. Our data identified an unexpected role for COLXV-B as an unplugged/MuSK-dependent cue that paves the axonal motor path to guide the decision of axons at the choice point. The conserved syntheny, the broad expression pattern of col15a1b similar to COL15A1 ortholog and the conservation of the primary sequence of COLXV-B with the mammalian counterparts suggested that the human protein COLXV could display similar function and represent a gene candidate for neuromuscular disorders

Les muscles sont des structures très organisées qui nous permettent d’effectuer un grand nombre de fonctions. Ils sont constitués de cellules musculaires mais aussi de tissus conjonctifs qui comprennent à la fois des cellules et la matrice extracellulaire. Les interactions entre les cellules musculaires et le tissu conjonctif sont cruciales pour la physiologie du muscle. Le collagène VI (COLVI) est une molécule hétérotrimérique ubiquitaire située dans les tissus conjonctifs, qui est impliquée dans un grand nombre de processus biologiques. Les trimères de COLVI sont composés de 2 chaines dites “courtes” et d’une chaine “longue”. Chez les mammifères, il existe à ce jour, 6 chaines COLVI (deux courtes (α1-2(VI) et 4 chaines longues (α3-6(VI)). Peu de choses sont encore connues à propos de l’assemblage des chaines les plus récemment décrites α4-6(VI) avec les chaines courtes ainsi qu’une la potentielle compensation entre les différentes chaines longues. De plus, chez l’homme, un déficit en α1-3(VI) du fait de mutations dans les gènes correspondants COL6A1-3 conduit à un spectre de maladies neuromusculaires appelées myopathies liées au COLVI. Pendant ma thèse, je me suis intéressée au COLVI durant le développement du poisson-zèbre, un modèle pertinent pour l’étude de maladies neuromusculaires. Dans la première partie de mon travail, j’ai identifié 2 orthologues des chaines α4-6(VI) chez le poisson-zèbre grâce à des études bio-informatiques. Du fait de leur plus grande homologie avec la chaine α4(VI) murine, nous les avons nommés col6a4a et col6a4b. Pour mieux comprendre les rôles des protéines correspondantes, j’ai créé des embryons de poissons-zèbres déficients en COLVI en utilisant l’approche transitoire par oligo morpholino antisens (MOs). Nous avons dessiné des MOs ciblant des sites d’épissage des pré-messagers col6a2, col6a4a et col6a4b, provoquant un saut d’exon et conduisant à un stop prématuré (PTC). J’ai observé une forte diminution des transcrits ciblés. Tous les embryons injectés (morphants) ont présenté des phénotypes morphologiques macroscopiques qui ont conduit à des défauts fonctionnels. Ces phénotypes ont été confirmés au niveau ultra-structural par microscopie électronique. Toutefois, l’analyse de la croissance des motoneurones a permis de mettre en évidence des différences entre ces morphants. Par la suite, j’ai voulu créer deux types de lignées transgéniques, pour pouvoir à la fois étudier le déficit en COLVI à plus long terme (grâce à l’utilisation de Zinc Finger Nucleases) et tester des approches de cribles pharmacologiques (lignée transgénique col6a2 contenant un PTC, fusionné à la GFP). J’ai effectué les clonages nécessaires à l’obtention des différentes constructions, et ces dernières ont été testées in vitro pour validation, lorsque cela était possible. Malheureusement, du fait des forts taux de mortalité in vivo dans les deux cas, nous avons dû nous résoudre à arrêter ces projets. En parallèle, ma connaissance du modèle poisson-zèbre m’a donné l’opportunité, dans le cadre d’une collaboration avec l’équipe de Denis Furling, d’aborder une autre problématique. Ce groupe, qui travaille sur la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1), s’est intéressé à la réexpression d’une isoforme fœtale de la dystrophine retrouvée chez les patients DM1 et à sa possible implication dans la pathologie. L’isoforme fœtale diffère de la forme adulte notamment par l’exclusion de l’exon 78, conduisant à un changement de cadre de lecture et un changement dans la partie 3’ de l’ARN de la dystrophine. Nous avons montré que le maintien de l’isoforme fœtale de la dystrophine était délétère pendant le développement du poisson-zèbre, puisque ces embryons ont présenté un phénotype macroscopique dépendant de la dose de MO injectée ainsi que des troubles de la mobilité. / Muscles are highly organized structures that allow us to perform many functions. They are made from muscular cells but also surrounding tissues that comprise both cells and extracellular matrix. The interactions between them are crucial for the muscle physiology. Collagen VI (COLVI) is a heterotrimeric protein, ubiquitously expressed in connective tissues. It plays multiple biological roles in the maintenance of structural integrity, cellular adhesion, migration and survival. COLVI trimers are formed by the assembly of 2 “short” chains and 1 “long” chain. To date, six COLVI chains are recognized in mammalians with 2 short (α1-2(VI)) and 3 long (α3-6(VI)) chains. Little is known regarding the possible assembly of the newly characterized α4-6(VI) polypeptides with the short chains, and a putative functional compensation between the different long chains. Furthermore, in humans, deficiency in α1-3(VI) due to mutations in the COL6A1-3 genes causes a heterogeneous group of neuromuscular disorders collectively termed COLVI-myopathies. During my Ph.D, I got interested in COLVI during the development of zebrafish, a relevant model of neuromuscular disorders. In the first part of my work, I identified 2 orthologs of the α4-6(VI) chains in zebrafish thanks to bio-informatics studies. In light of their stronger homology with the mammalian α4(VI) chain, we named the genes encoding the novel chains col6a4a and col6a4b. To further unveil the roles of the corresponding proteins, we created COLVI deficient zebrafish embryos using a morpholino antisense oligonucleotides approach (MO) . We chose to design MOs that block splicing of col6a2, col6a4a and col6a4b, thereby creating premature termination codons. As expected, the targeted transcripts levels were drastically reduced, likely due to degradation by the nonsense mediated RNA decay. All morphant embryos presented macroscopic and morphologic phenotypes that overall resulted in functional muscle defects: altered muscle structure detected by birefringence analysis and impaired motility upon touch-evoked escape test. These alterations were confirmed at the ultra-structural level by electron microscopy. Nevertheless, some phenotypical specificities were uncovered between the different col6a2, col6a4a and col6a4b morphants, with the discovery of axon outgrowth defects. In a second part, we wanted to create stable zebrafish lines to study COLVI deficiency at later stages using Zinc Finger Nucleases (ZFN) and to be able to carry out pharmacological screenings with a transgenic line containing col6a2 with a premature codon (PTC) fused to the GFP. I performed clonings to obtain the different constructs. When possible, constructs were tested in vitro. Unfortunately, due to high mortality in vivo in both cases, we had to interrupt these projects. In parallel, my knowledge of the zebrafish model gave me the opportunity to be part of another project, in collaboration with the team of Denis Furling...

L’obésité maternelle, dont la prévalence ne cesse d’augmenter, est associée à de nombreux troubles de l’accouchement, tels que des dépassements de terme à l’origine d’une augmentation du taux de césariennes. Ces troubles pourraient, en partie, s’expliquer par une concentration plasmatique de leptine plus élevée chez les femmes enceintes obèses ainsi que par les effets inhibiteurs, démontrés in vitro, de cette adipokine sur la contractilité myométriale. Au moment de l’accouchement, la transition phénotypique du myomètre d’un état de quiescence utérine à un état contractile est une étape clé indispensable à la mise en route du travail. Elle est associée à une activation de l’apoptose des cellules myométriales ainsi qu’à un remodelage de la matrice extracellulaire utérine. Le but de notre travail était d’étudier la capacité de la leptine à moduler l’apoptose et le remodelage myométriaux induits par le lipopolysaccharide (LPS).Les échantillons de myomètre ont été prélevés lors de césariennes réalisées avant la mise en route du travail, à la maternité du CHU de Dijon. Les effets de la leptine ont été évalués après incubation des explants myométriaux pendant 48 heures avec du LPS (10 µg/ml) avec ou sans leptine (de 10-10 à 10-8 M).Nos résultats ont démontré la capacité de la leptine à inhiber, de façon concentration-dépendante, l’apoptose induite par le LPS en diminuant l’expression des protéines pro-apoptotiques (caspase-3 clivée, BAX) et en augmentant celle du médiateur anti-apoptotique BCL2. Cet effet anti-apoptotique de la leptine dans le myomètre gestant était associé à l’activation de la voie de signalisation ERK1/2. De plus, nos résultats ont montré que la leptine était également capable de s’opposer, de façon concentration-dépendante, à la dégradation du collagène de la matrice extracellulaire myométriale induite par le LPS. Cet effet était associé à l’inhibition de l’activation et de la surexpression des métalloprotéinases MMP2 et MMP9 induites par le LPS.Ce travail a permis d’approfondir les connaissances sur le rôle de la leptine dans la régulation de l'activité du myomètre. Nos résultats suggèrent que les troubles de l’accouchement observés chez les femmes obèses résulteraient de l’inhibition de l’apoptose et du remodelage myométriaux par la leptine, en plus de l’inhibition de la contractilité utérine déjà décrite. / Maternal obesity is associated with a wide spectrum of delivery disorders, such as delayed or post-term delivery, that might be explained partly by the increase in plasma leptin levels in obese women, as leptin inhibits in vitro myometrial contractility. Delivery involves uterine apoptosis and remodelling of the extracellular matrix, via the activation of matrix metalloproteinases (MMP). This study was aimed to assess the role of leptin on human myometrium, by studying the interaction of leptin with lipopolysaccharide (LPS)-induced apoptosis and degradation of myometrial collagen.Myometrial biopsies were obtained from women undergoing caesarean delivery before labour onset. The effects of leptin on myometrial apoptosis and remodelling were assessed by incubating the strips for 48h with LPS (10 µg/ml) alone or with leptin (from 10-10 to 10-8 M).Leptin prevented LPS-induced apoptosis, in a concentration-dependent manner, by down-regulating cleaved caspase-3, BAX and up-regulating BCL2 expression. This effect was specifically mediated through leptin receptors stimulation followed by ERK1/2 signalling pathway activation. Leptin prevented, in a concentration-dependent manner, an LPS-induced decrease in myometrial collagen content, and this effect was associated with a decrease in MMP2 and MMP9 activity and overexpression. These effects of leptin were abolished by pre-treatment with a selective leptin receptor antagonist. These results suggest new potential pathways involved in delivery disorders of obese women and propose a role for leptin-induced inhibition of myometrial apoptosis and extracellular matrix remodelling in the development of such disorders.

La perception de la viande bovine par le consommateur est un enjeu crucial pour l’industrie de la viande. La tendreté reste l’une des qualités organoleptiques essentielle aux yeux du consommateur, avec la jutosité et la flaveur. L’objectif de ma thèse a été d’étudier les propriétés structurales et biochimiques du tissu conjonctif intramusculaire responsables de la dureté de base et de faire le lien avec la tendreté et plus largement avec les qualités organoleptiques de la viande. Le développement et la mise au point d’une méthode d’analyse d’images a permis d’étudier objectivement les caractéristiques des composantes périmysiale et endomysiale du tissu conjonctif intramusculaire et de montrer que la surface occupée par ces deux structures influençait la tendreté de la viande. Préalablement à l’étude biochimique et moléculaire du tissu conjonctif intramusculaire le dosage des protéoglycanes totaux a été développé et mis en place au laboratoire. Les résultats de cette deuxième partie ont permis de mettre en avant la complémentarité entre protéoglycanes, collagène total et liaisons de réticulation au sein du muscle et leur rôle sur la jutosité. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence le rôle positif des protéoglycanes de haut poids moléculaire sur la jutosité, alors que les protéoglycanes de faible poids moléculaire, telle que la décorine,joueraient plutôt un rôle sur la dureté de la viande. L’ensemble des résultats obtenus confirme nos hypothèses, à savoir que la composante structurale ainsi que les molécules minoritairement présentes dans le tissu conjonctif peuvent influencer les qualités organoleptiques de la viande bovine. / The perception of beef by consumers is a crucial issue for the meat industry. Tenderness remains one of the sensory qualities essential to the consumer, with the juiciness and flavour. The aim of my thesis was to study the structural and biochemical properties of intramuscular connective tissue responsible for the background toughness and study relationships with tenderness and more widely with the sensory qualities of beef. The development of a method of image analysis was used to study objectively the characteristics of the perimysial and endomysial component of the intramuscular connective tissue. The results showed that the area occupied by these two structures influenced the beef tenderness. An assay for total proteoglycan measurement has been developed previously to the study of biochemical and molecular characteristics intramuscular connective tissue. The results obtained in this second part have highlighted the complementarities between proteoglycans, total collagen and cross-links within the muscle and their role on the juiciness. Furthermore, we were able to highlight the positive role of high molecular weight proteoglycans on juiciness, while low molecular weight proteoglycans, such as decorin, rather played a role in beef toughness. The overall results confirm our hypothesis that the structural components of the connective tissue and the small quantity of extracellular matrix molecules could influence the sensory qualities of beef.

Les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire (MEC) sont cruciales pour entretenir la cohésion tissulaire. Ces deux types d'adhésions sont fonctionnellement interconnectés par un dialogue permanent qui met en jeu des voies de signalisation convergentes régulant notamment l'architecture et la contractilité du cytosquelette d'acto-myosine sous-jacent. Ce dialogue permet d'établir un équilibre de forces intracellulaires en réponse à la tension appliquée par le milieu extérieur. L'endothélium des vaisseaux sanguins est un tissu soumis à des conditions mécaniques particulières. En plus des compressions intercellulaires subies par tout épithélium, les cellules endothéliales (CEs) doivent également subir et résister aux forces hémodynamiques du flux sanguin et à la rigidité de la lame basale – deux signaux mécaniques agissant de part et d'autre de l'endothélium. Les Cerebral Cavernous Maformations (CCM) ou encore angiomes caverneux sont des lésions vasculaires hémorragiques d'origine génétique qui se développent au niveau des capillaires du système nerveux central et qui se caractérisent par des défauts dans l'environnement proche des CEs. La perte des jonctions intercellulaires et du recouvrement par les cellules murales, l'organisation aberrante de la membrane basale aussi que la stagnation du flux sanguin sont les caractéristiques des CCM. C'est pourquoi nous avons choisi cette pathologie comme modèle intéressant de mécanotransduction mettant en jeu le dialogue entre les intégrines et les cadhérines. En effet, les trois gènes indifféremment mutés dans cette pathologie codent pour des protéines, CCM1-3, qui s'associent en un complexe ternaire et qui sont reconnues comme des acteurs importants de la régulation des jonctions adhérentes. Des études moléculaires et protéomiques montrant que le complexe CCM interagit avec la protéine ICAP-1, un régulateur négatif de l'intégrine β1, nous ont conduit à formuler l'hypothèse selon laquelle ce complexe jouerait un rôle pivot dans la signalisation croisée entre ces intégrines et cadhérines. Les études effectuées pendant ma thèse ont démontré que les protéines CCM régulent l'homéostasie tensionnelle médiée par les structures d'adhérence intercellulaires et à la MEC par leur action inhibitrice sur l'intégrine β1 et en controlant une balance d'activité entre les deux isoformes de ROCK, ROCK1 et ROCK2. Nous avons montré que, suite à la perte des protéines CCMs, la suractivation de l'intégrine β1 augmente la sensibilité des CEs aux signaux mécaniques comme la rigidité de la MEC ou les forces hémodynamiques du flux sanguin. Il en résulte une suractivation de la contractilité cellulaire dépendante de ROCK1 déclenchant une boucle de rétrocontrôle mécanique conduisant à l'amplification des tensions intra- et extracellulaire et brisant ainsi l'homéostasie tensionnelle pour favoriser le phénotype malin. / Cell-cell or cell-matrix interactions have crucial roles in the maintenance of the physical cohesion of any tissue. In addition, growing body of evidence indicates that these two adhesion systems do not act independently, but rather are functionally interconnected by a permanent crosstalk. This dialog usually operates via common molecules that trigger convergent signaling as well as by actomyosin network which, by providing physical link, contributes to establishment of intracellular force counterbalancing tension applied by extracellular surrounding. Blood vessels endothelium is a particular tissue in term of mechanical conditions. Apart from intracellular compression, endothelial lining needs to resist hemodynamic forces as well as rigidity of the basal membrane - two mechanical inputs acting from opposite sides of the endothelial layer. Cerebral Cavernous Malformation (CCM) is a sporadically acquired or inherited disease of venous capillaries within neuro-vascular unit characterized by defects in all aspects of local microenvironment. Loss of intra-endothelial junctions and mural cell coverage, aberrant organization of basal lamina as well as stagnant blood flow are features of CCM lesions. Thereby, CCM became for us an interesting model to study mechanotrasduction process and in this context, the cross-talk between integrin and cadherin mediated adhesion structures. Indeed, CCM proteins are well recognized players involved in a control of VE-cadherin mediated intracellular junctions. In addition, CCM1 was found to interact with ICAP-1, a negative regulator of β1 integrin, raising the possibility that this complex most likely acts as molecular node regulating β1 integrin/ VE-cadherin convergent signaling pathways.Studies performed during this thesis have demonstrated that CCM complex coordinates cadherin- and integrin-mediated tensional homeostasis by repressing β1 integrin activation and maintaining a balance of activity between the two isoforms of RhoA-associated kinases ROCK1 and ROCK2. We have found that β1 integrin sustained over-activation upon CCM proteins loss contributes to increased ECs sensitivity to mechanical cues, such as ECM physical reorganization or hemodynamic force that in turn activates ROCK1-dependent contractility. This establishes a positive feedback mechanical loop that breaks tensional homeostasis and switches on the malignant phenotype.