Le micro-environnement tumoral joue un rôle dans la croissance, l'invasion tumorale et la résistance aux traitements. Il est essentiel de comprendre les mécanismes qui régulent la communication entre les cellules tumorales et ce micro-environnement pour développer des thérapies efficaces. Dans ce contexte, les protéases extracellulaires de la famille des Adamalysines sont des acteurs importants dans la progression tumorale en agissant sur le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) et la biodisponibilité des médiateurs de communication cellulaire tels que les cytokines, les chimiokines et les facteurs de croissance. Mes travaux ont mis en évidence une nouvelle interaction entre ADAM12, un marqueur mésenchymateux induit au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) dépendante du TGF-β et ZO-1, une protéine d’échafaudage exprimée dans des jonctions serrées de cellules épithéliales. Ces deux protéines sont redistribuées, dans des structures de type invadopodes pour promouvoir la dégradation de la MEC. Nous avons par ailleurs réalisé un criblage in silico qui nous a permis d’identifier un cluster d’adamalysines dont les gènes sont co-exprimés chez des patients atteints d’un carcinome hépatocellulaire. Parmi ces adamalysines, nous avons mis en évidence la protéine ADAMTS12, qui joue un rôle clé dans le développement de la fibrose hépatique en lien avec une réponse inflammatoire aigüe ou chronique. / Tumor microenvironment plays a major role in tumor growth, invasion and resistance to treatments. Understanding the mechanisms that regulate communication between tumor cells and their microenvironment is essential to develop effective therapies. In this context, Adamalysin extracellular proteases play major role in tumor progression, by modulating the extracellular matrix (ECM) remodeling and the bioavailability of cell communication mediators such as cytokines, chemokines and growth factors. My work revealed a new interaction between ADAM12, a mesenchymal marker induced during the epithelial-mesenchymal transition (EMT) dependent on TGF-β and ZO-1, a scaffolding protein expressed in tight junctions of epithelial cells. Both proteins are redistributed in invadopodia-like structures to promote ECM degradation. In a second study, we carried out an in silico screening that allowed us to identify a cluster of Adamalysin genes co-expressed in patients with hepatocellular carcinoma. Among these Adamalysins we have studied the protein ADAMTS12 in more details, and shown that this protein plays a key role in the development of liver fibrosis involving an acute or chronic inflammatory response.

La sclérose systémique est une maladie autoimmune dont l’une des complications majeures est la fibrose. La DNA topoisomérase I (topo) est l’un des principaux autoantigènes associés à cette maladie. Toutefois, aucun lien n’a encore pu être établi entre la présence des anti-topo et le développement de la fibrose. Les travaux antérieurs du laboratoire d’accueil ont montré une interaction directe de la topo avec la surface des fibroblastes et la matrice extracellulaire. Nous avons voulu caractériser ces interactions du point de vue moléculaire. La topo a donc été exprimée sous forme de 5 fragments, déterminés à partir de ses principaux domaines structuraux et de ses épitopes majeurs, chez E. coli. Les fragments purifiés ont été analysés pour leur interaction avec l’héparine, représentant les héparane sulfates de la surface des fibroblastes, et avec des protéines purifiées de la matrice extracellulaire. Nous avons montré que le fragment topo-N est le principal responsable de l’interaction avec l’héparine, ce qui suggère donc l’implication potentielle de ce domaine dans l’interaction de la topo avec la surface des fibroblastes. Le fragment topo-DIDII est responsable de l’interaction avec la plupart des protéines de la matrice extracellulaire étudiées, alors que le fragment topo-H15 n’interagit qu’avec la vitronectine. Aucune interaction des fragments topo-DIII et topo-C n’a été décelée. Ces résultats pourront maintenant servir à mieux comprendre le rôle potentiel de la topo et des autoanticorps circulants anti-topo dans la fibrose présente chez les personnes atteintes de sclérose systémique en contribuant à l’identification de la cible de la topo sur les fibroblastes. / Systemic sclerosis is an autoimmune disease in which one of the major complications is fibrosis. DNA topoisomerase I (topo) is a major autoantigen associated with this disease. However, no link has yet been established between the presence of anti-topo and the development of fibrosis. Previous work of the host laboratory showed a direct interaction of the topo with the surface of fibroblasts and extracellular matrix. We wanted to characterize these interactions at the molecular level. Topo was expressed in 5 fragments, determined from its main structural domains and its major epitopes, in E. coli. The purified fragments were analyzed for their interaction with heparin, representing heparan sulfates on the surface of fibroblasts, and with purified proteins of the extracellular matrix. We have shown that the topo-N fragment is responsible for interaction with heparin, suggesting hence, potential involvement of this domain in the interaction of topo with the surface of fibroblasts. The topo-DIDII fragment is responsible for the interaction with most proteins of the extracellular matrix studied, whereas the topo-H15 fragment only binds to vitronectin. No interaction of fragments topo-DIII and topo-C was found. These results can now be used to better understand the potential role of topo and circulating anti-topo autoantibodies in the fibrosis present in patients with systemic sclerosis in helping to identify the target of topo on fibroblasts.

L’apoptose endothéliale initie le processus menant au remodelage vasculaire et au développement de la néointima dans la vasculopathie du greffon. La formation de néointima résulte de l’accumulation de leucocytes, de matrice extracellulaire et de cellules positives pour l’actine musculaire lisse alpha (αSMA+) dans l’intima des artères, artérioles et capillaires du greffon. Les cellules αSMA+ dans la néointima sont des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) dérivées du donneur ainsi que des cellules souches dérivées du receveur, dont des cellules souches mésenchymateuses (CSM). L’acquisition d’un phénotype anti-apoptotique chez ces cellules est déterminante pour le développement de la néointima. Le laboratoire de Dre Hébert a démontré que les cellules endothéliales (CE) apoptotiques libèrent des médiateurs induisant une résistance à l’apoptose chez les CMLV et les fibroblastes. Notamment, les CE apoptotiques relâchent la cathepsine L qui clive le perlécan et ainsi libère un fragment C-terminal correspondant au troisième motif laminine G du domaine V du perlécan (LG3). Le LG3 est anti-apoptotique pour les fibroblastes. Nous avons donc émis l’hypothèse que le LG3 est un des médiateurs clés libéré par les CE apoptotiques favorisant le développement de la néointima via l’induction d’un phénotype anti-apoptotique chez les cellules néointimales αSMA+. Nous avons démontré que les médiateurs libérés par les CE apoptotiques induisent un phénotype anti-apoptotique chez les CSM dépendant de l’activation de la voie ERK1/2. De plus, le LG3 active la voie ERK1/2 via son interaction avec les intégrines beta 1 et induit une réponse anti-apoptotique chez ces cellules. Cependant l’activation de ERK1/2 par le LG3 est plus faible en comparaison de son activation par le milieu conditionné par des CE apoptotiques. Nos résultats suggèrent que les CE apoptotiques libèrent aussi de l’EGF qui agit de façon paracrine sur les CSM en coopération avec le LG3 pour induire un phénotype anti-apoptotique chez les CSM. Nous avons poursuivi l’étude de l’effet du LG3 in vivo sur le remodelage vasculaire en transplantation. Nous avons pour cela développé un modèle murin de rejet vasculaire qui consiste en une transplantation aortique entre des souris alloincompatibles. Nous avons ensuite injecté du LG3 chez les souris receveuses en post-transplantation. Nous avons observé dans ce modèle que des niveaux augmentés de LG3 sérique augmentent la formation de néointima, favorisent l’accumulation de cellules néointimales αSMA+ et diminuent le nombre de cellules CD31+ au niveau du greffon aortique. Parallèlement nous avons vérifié que le LG3 induit aussi un phénotype anti-apoptotique chez les CMLV et nous avons démontré un nouvel effet du LG3, soit une activité pro-migratoire, qui dépend de l’activation de la voie ERK1/2 chez les CMLV. Nous avons complété cette étude par l’analyse des niveaux de LG3 sérique dans une cohorte de patients receveurs d’allogreffe rénale. Nous avons observé chez ces patients, une association entre des niveaux élevés de LG3 sérique et un rejet vasculaire. Le LG3 contribue à la formation de néointima par son activité pro-migratoire et pro-survie chez les cellules néointimales et aussi de par son activité angiostatique. Nos résultats suggèrent que le LG3 est un nouveau médiateur important dans le remodelage vasculaire en transplantation / In allogeneic transplanted organs, endothelial apoptosis is associated with vascular remodeling and neointima formation which in turn leads to allograft vasculopathy, a maladaptive form of vascular repair. In allograft vasculopathy, neointima results from the accumulation of leukocytes, extracellular matrix and alpha-smooth muscle actin positive (αSMA+) cells in the intima of allogeneic arteries, arterioles and capillaries. Neointimal αSMA+ cells comprise vascular smooth muscle cells (VSMC) derived from the donor and stem cells derived from the recipient, including mesenchymal stem cells (MSC). Acquisition of an anti-apoptotic phenotype of neointimal cells is central to the development of vascular obliterative changes. Dr Hébert’s team demonstrated that apoptotic endothelial cells release mediators which in turn induce a state of resistance to apoptosis of VMSC and fibroblasts. Apoptotic endothelial cells release cathepsin-L which cleaves perlecan therefore releasing a C-terminal fragment harbouring a laminin G motif and referred to as LG3. LG3 is anti-apoptotic for fibroblasts. We hypothesized that LG3 is a key mediator produced by endothelial apoptosis of importance in favoring neointima formation via the induction of an anti-apoptotic phenotype in αSMA+ neointimal cells We demonstrated that mediators released by endothelial apoptosis induce an ERK1/2-dependent anti-apoptotic phenotype in MSC. We identified LG3 as one of the mediators implicated in the induction of this anti-apoptotic response. Interactions between LG3 and beta 1 integrins expressed on MSC trigger ERK1/2 activation albeit to a lesser degree than medium conditioned by apoptotic endothelial cells. We showed that apoptotic endothelial cells also release EGF which cooperates with LG3 to induce an anti-apoptotic phenotype on MSC through cross-talk between EGF receptor and integrin-dependent pathways. Next, we characterized the impact of LG3 on allogeneic vascular remodeling in vivo. We developed a murine model of vascular rejection based on orthotopic transplantation of an aortic segment between two fully MHC-incompatible mice in absence of immunosuppression. Recombinant LG3 was injected intravenously post-transplantation in recipients resulting in higher circulating levels of LG3. In LG3-injected mice, accumulation of αSMA+ neointimal cells was enhanced resulting in significantly increased intima/media ratios in the allogeneic aortic graft. Aortic grafts of LG3-injected allografts also showed decreased CD31+ cells. We also demonstrated, using cell-based approaches, that LG3 exerts a pro-migratory activity on VSMC through beta 1-integrin and ERK1/2 -dependent pathways. In line with these observations we also reported augmented serum LG3 in human renal transplant patients in association with acute vascular rejection episodes. Collectively these results suggest that the pro-migratory, pro-survival and angiostatic activities of LG3 contribute to neointima formation. Our results suggest that LG3 is a novel mediator of importance in the development of obliterative vascular remodeling associated with rejection of allogeneic organs.

Les réseaux vasculaires et nerveux présentent des similitudes frappantes (points de branchements, superposition, voies afférentes/efférentes, …) et tous deux interagissent lors du développement ou dans le cadre de pathologies.Dans un premier projet, nous avons voulu déterminer si un facteur pro-angiogénique, c'est-à-dire induisant la formation de nouveaux vaisseaux, peut avoir un effet direct sur le réseau neuronal. Des études menées in vitro ou in vivo chez l’adulte, ont montré une implication directe du Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sur le système nerveux (survie, prolifération neuronale, croissance axonale, …). Nous avons cherché à savoir si ce facteur a un effet sur le développement ou l’activité des réseaux neuronaux lors de la vie embryonnaire alors que les systèmes vasculaires et nerveux se mettent progressivement en place. Avec une approche électrophysiologique, nous avons focalisé notre attention sur les motoneurones de la moelle épinière de souris entre les stades E13,5 et P0. Nos résultats montrent que le VEGF augmente de façon significative la fréquence des activités synaptiques liées à la libération de GABA et de Glycine pendant une fenêtre temporelle correspondant à la mise en place de ces mêmes activités (E13,5 et E15,5). Cet effet modulateur met en évidence un nouveau rôle du VEGF dans la maturation fonctionnelle des réseaux neuronaux et ouvre de nouvelles perspectives dans l’étude des neurodégénérescences précoces. Dans un second projet, nous nous sommes intéressés au glioblastome, cancer cérébral très invasif. Nous montrons que l’inhibition d’IRE1 (Inositol Requiring-Enzyme 1, senseur du stress du réticulum endoplasmique) dans un modèle d’implantation orthotopique chez la souris induit la formation de tumeurs plus petites, moins vascularisées et plus dispersées avec un meilleur pronostic de survie. Nous observons aussi des altérations du microenvironnement tumoral (matrice extracellulaire, réaction astrocytaire) avec des modifications de l’expression de nombreux facteurs de croissance dont le TGFß. / The nervous and the vascular systems share similarities (branching points, afferent/efferent parts …) and are closely connected during development and pathology.In the first part of this project, we questioned whether the pro-angiogenic key factor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), which promotes new blood vessels formation, can directly interact with neural networks while nervous and vascular systems are developing. In the present study, using an electrophysiological approach, we focused on the effect of VEGF on embryonic spinal lumbar motoneurons (MNs). Our results demonstrate that VEGF increases the frequency of the GABA/glycinergic events at early developmental stages (E13.5 and E15.5) but not at the perinatal stage E17.5. Our data highlight a new role for VEGF which can control both the maturation of the vascular and neuronal networks and may likely be involved in early MNs degeneration.In the second part, we focused on glioblastoma, the most agressive form of brain cancer. Our results show that inhibition of IRE1 (Inositol Requiring-Enzyme 1, stress sensor of endoplasmic reticulum) leads to formation of smaller, less vascularized, more invasive tumors with a better prognosis. We also observe that tumoral microenvironnement is altered (reactive astrogliosis, extracellular matrix) and expression of several growth factors like TGFß is modified.

L'empreinte génomique parentale est un mécanisme de régulation épigénétique conduisant à la répression d'un allèle d'un gène en fonction de son origine parentale. Ce mécanisme affecte un nombre restreint de gènes chez les mammifères métathériens et euthériens. Ces gènes, dits gènes soumis à empreinte (GSE), ont des fonctions moléculaires variées et sans lien apparent. Cependant, deux thèmes reviennent de manière récurrente dans leurs fonctions: le contrôle de la croissance embryonnaire et la tumorigenèse. Ma thèse a consisté à démontrer l'existence d'un lien fonctionnel entre les GSE. Nous montrons que les GSE s'inscrivent dans un même réseau de co-expression transcriptionnelle et qu'ils sont co-régulés dans différentes situations biologiques lors des transitions entre les différents états cellulaires. En effet, une induction coordonnée de la plupart des GSE a lieu lors des sorties du cycle cellulaire, réversibles (quiescence) ou non (différenciation). Les perturbations individuelles de l'expression de plusieurs GSE dans le modèle des pré-adipocytes 3T3-L1 confirment un rôle du réseau des GSE dans le contrôle des transitions entre prolifération, quiescence et différenciation. De plus, l'analyse des gènes bi-alléliques inclus dans le même réseau de co-régulation que les GSE montre un enrichissement en gènes de la matrice extracellulaire. La fonction associée à ce réseau serait donc le contrôle des transitions entre les différents états cellulaires, via le remodelage de la matrice extracellulaire. Pour conclure, outre l'identification d'une fonction commune aux GSE, nos résultats suggèrent un scénario pour le ciblage de ces gènes par l'empreinte génomique parentale au cours de l'évolution des mammifères. / Genomic imprinting is an epigenetic mechanism leading to the repression of one allele of a gene, depending on its parental origin. This mechanism affects a small number of genes in metatherian and eutherian mammals. These genes, named imprinted genes (IGs), display various molecular functions and thus seem unrelated. However, their alterations are frequently associated with the control of embryonic growth and tumorigenesis. My PhD project has consisted in demonstrating a functional link between IGs. We show that IGs are frequently co-expressed and belong to a common gene network. They are co-regulated in biological situations corresponding to the transitions between different cellular states. Coordinated induction of most IGs takes place at the outputs of the cell cycle. Loss and gain of function experiments of several IGs in the 3T3-L1 pre-adipocyte model demonstrate a role of the IG network in controlling transitions between cellular states (proliferation, quiescence and differentiation). In addition to IGs, this network also includes bi-allelic genes, with many extracellular matrix genes. Therefore, the function associated with the IG network could be the fine control of transitions between cellular states through a remodeling of the extracellular matrix.To conclude, in addition to the identification of a common cellular function for IGs, our results suggest a possible scenario for the targeting of these genes by parental genomic imprinting during mammalian evolution.

La jonction myotendineuse (JMT) est une interface spécialisée dans la transmission des forces entre le muscle et le tendon. Le collagène XXII (COLXXII) est un nouveau composant de cette jonction (Koch et al., 2004). COLXXII fait partie de la sous-famille des FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) qui se caractérisent par leur capacité à s’associer aux collagènes fibrillaires pour former des réseaux protéiques. La fonction de ce nouveau composant de la JMT n’est pas connue. C’est pourquoi nous avons décidé de réaliser une perte de fonction chez le poisson zèbre en utilisant la stratégie anti-sens morpholinos et d’en étudier le phénotype par différentes techniques. Chez l’embryon, le COLXXII est exprimé aux extrémités des fibres musculaires au niveau de leur ancrage sur le myosepte (structure équivalente au tendon des mammifères) pour être déposé à la JMT. Son expression est régulée par des membres de la famille des FGF, probablement FGF8. L’absence de COLXXII conduit à une perte des capacités contractiles du muscle et au détachement et à la rétractation progressive des fibres musculaires, causés par une rupture de la JMT qui s’opère entre la lame basale des fibres musculaires et la matrice tendineuse. Le morphotype induit par l’injection de morpholino COLXXII phénocopie les mutants sapje (mutant dystrophine) et candyfloss (mutation de la chaîne α2 des laminines) indiquant que COLXXII permet un lien structural entre le muscle et le tendon. Nos résultats montrent que COLXXII joue un rôle crucial dans le développement et la fonction de la JMT et représente un nouveau gène candidat pour les dystrophies musculaires. / The myotendinous junction (MTJ) is a specialized structure that transmits muscle contractile forces to tendon. Collagen XXII (COLXXII) is a novel component of MTJ (Koch et al., 2004). It belongs to the FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) subset of the collagen superfamily that is characterized by their capacity to mediate protein-protein interactions. The in vivo role of COLXXII has not been elucidated. Therefore, we decided to analyze its function in developing zebrafish using the morpholino-based knock-down strategy. We showed that its transcripts are exclusively expressed at the extremities of muscle fibers close to myoseptal tendons and the protein is deposited at the MTJ. The onset of COLXXII expression depends on FGF signaling, probably FGF8. Using different methods, we showed that loss of COLXXII induces morphofunctional alterations of muscle/tendon development and muscle weakness. Progressive muscle fiber detachment and retraction are observed in morphants that result from MTJ failure occuring at the muscle basement membrane/myosepta extracellular matrix side. The morphotype of the MO22-injected embryos is reminiscent to the sapje (dystrophin mutant) and candyfloss (laminin α2 chain mutation) mutant phenotypes indicating that COLXXII provides a molecular link between muscle and tendons. Our results suggest that COLXXII plays a crucial role in MTJ development and function and represents a novel candidate gene for muscular dystrophies.

La maturation des collagènes fibrillaires est régulée par la libération protéolytique des propeptides qui conduit à la formation spontanée de fibres, à partir des molécules de collagène mature. Les fibres de collagène ainsi formées confèrent résistance et solidité aux tissus. Les métalloprotéases Tolloïdes sont les principales enzymes responsables de la maturation C-terminale des procollagènes. Ces protéases possèdent de nombreux autres substrats et se distinguent par un mode de régulation original, l’utilisation de régulateurs « substrats-spécifiques », qui leur permet de moduler leur activité vis-à-vis de ces différents substrats. Parmi ces régulateurs, les Procollagen C-Proteinase Enhancers (PCPE-1 et 2) semblent jouer un rôle important car ils augmentent l’activité de clivage du C-propeptide des procollagènes jusqu’à 20 fois. Même si PCPE-1 a été découvert en 1985, son mode d’action n’est toujours pas compris. Le principal objectif de cette thèse était donc de mieux comprendre le mécanisme de l’activation. Nous avons commencé par identifier la région minimale de PCPE-1 capable d’activer les Tolloïdes et démontré une très forte coopérativité entre les domaines de cette région. Par ailleurs, nous avons mis en évidence, pour la première fois, un nouveau rôle physiologique pour le domaine C-terminal de PCPE-1 (NTR). Concernant les autres partenaires du complexe de maturation, nous avons observé une interaction d’affinité modérée entre PCPE-1 et la protéase Tolloïde appelée BMP-1 et montré que PCPE-1 se fixe uniquement sur la partie C-terminale du procollagène. Enfin, nous avons mis en évidence que d’autres métalloprotéases, les Méprines, pourraient également jouer un rôle dans la maturation de collagènes fibrillaires en étant régulées négativement par les PCPEs. L’ensemble de ces résultats nous a permis de proposer un nouveau schéma d’interaction pour les PCPEs et de faire de nouvelles hypothèses concernant leur mécanisme d’action / The maturation of fibrillar collagens is a tightly regulated process controlled by two proteolytic cleavages that remove the propeptide regions from procollagen precursors leading to spontaneous assembly of mature collagen molecules into fibrils. These fibrils provide tensile strength and toughness to connective tissues and consequently to the organism itself. The group of extracellular metalloproteinases mostly responsible for procollagen processing are the tolloids. As these enzymes have several functions other than procollagen processing, their activities on different substrates are controlled by a growing number of substrate-specific regulators. The most prominent of these regulators are the procollagen C-proteinase enhancers (PCPEs), of which PCPE-1 is a 55 kDa glycoprotein composed of two CUB and a C-terminal NTR domain, which is capable of enhancing the proteolytic activity of tolloids up to 20-fold. Even though PCPE-1 has been known since 1985 the molecular mechanism of enhancement is still unclear. The aim of this thesis was to understand and characterize this mechanism with the aid of biochemical and biophysical methods. We have identified the minimal unit responsible for enhancing activity. In addition, we propose a mechanism for how the subdomains responsible for enhancement cooperatively bind to procollagen substrates. Furthermore, we have for the first time been able to identify a possible physiological function of the NTR domain. Also, we have identified meprins as new players involved in procollagen processing and this has given valuable insights in the mechanism of action of PCPEs. Finally, we have been able to demonstrate that the interaction of PCPE-1 with procollagen is mostly limited to the C-propeptide region. Based on these findings we propose a new hypothetical interaction mechanism for PCPE-1

L’endostatine est le fragment C-terminal du collagène XVIII libéré dans la matrice extracellulaire par clivage enzymatique. C'est un inhibiteur endogène de l’angiogenèse et de la croissance tumorale. L'endostatine inhibe la prolifération et la migration des cellules endothéliales induite par le Fibroblast Growth Factor-2 ou le Vascular Endothelial Growth Factor et elle inhibe la croissance de 65 types de cellules tumorales. L’endostatine fait actuellement l’objet d’essais cliniques pour le traitement de différents cancers son mécanisme d’action est encore mal connu. Nous avons caractérisé par résonance plasmonique de surface (SPR) les interactions établies par l'endostatine avec les intégrines αvβ3 et α5β1 qui sont surexprimées à la surface des cellules endothéliales activée. Nous avons identifié le site de fixation l'endostatine sur les intégrines, proposé un modèle de structure du complexe formé par l'endostatine et l'intégrine αvβ3 et montré que l'endostatine ne peut pas se lier simultanément aux intégrines et aux chaînes d'héparane sulfate présentes à la surface cellulaire. Pour identifier des partenaires supplémentaires de l'endostatine, nous avons développé des puces à protéines et à glycosaminoglycanes basées sur la SPR et capables de suivre jusqu'à 400 interactions simultanément. Nous avons identifié neuf partenaires de l'endostatine (le dermatane sulfate, la transglutaminase-2, les collagènes I, IV et VI, le peptide amyloïde β1-42, et des protéines matricellulaires dont SPARC et thrombospondine-1). Nous avons montré que l’endostatine se fixe avec une forte affinité (KD ~ 6 nM) sur la transglutaminase-2 et que cette interaction nécessite la présence de calcium mais que l'endostatine n'est pas un substrat donneur d'acyle de l'enzyme. Nous avons montré que le réseau d'interactions de l'endostatine est enrichi en protéines contenant des modules EGF (Epidermal Growth Factor). Cela offre de nouvelles perspectives pour l'identification d'autres partenaires et donc de nouvelles fonctions de l'endostatine. Des protéines contenant des modules EGF comme la fibrilline-1, composant des fibres élastiques, et des protéines de l'immunité innée par exemple sont des partenaires potentiels de l'endostatine / Endostatin is the carboxyl-terminal fragment of collagen XVIII released in the extracellular matrix by proteolytic cleavage. It inhibits angiogenesis and tumor growth. Endostatin inhibits the proliferation and migration of endothelial cells induced by Fibroblast Growth Factor-2 and Vascular Endothelial Growth Factor and it inhibits 65 different tumor types. Endostatin is currently under clinical trials for several tumors. We have used surface plasmon resonance (SPR) binding assays to characterize interactions between endostatin and α5β1 or αvβ3 integrins which are over-expressed at cell surface of actived endothelial cell. We have identified the binding site of endostatin on those integrins, and we have built a molecular modeling of the endostatin/integrin αvβ3 complex. We have shown that endostatin can not bind simultaneously to integrins and to heparan sulfate. In order to identify new partners of endostatin we have developed glycosaminoglycan and protein arrays based on SPR detection. We have found nine new partners of endostatin include glycosaminoglycans (chondroitin and dermatan sulfate), matricellular proteins (thrombospondin-1 and SPARC), collagens (I, IV and VI), the amyloid peptide Aβ(1-42), and transglutaminase-2 (TG-2). We have shown that endostatin binds to transglutaminase-2 with an high affinity (KD ~ 6 nM) in a calcium-dependent manner. Enzymatic assays indicated that, in contrast to other extracellular matrix proteins, endostatin is not a glutaminyl substrate of TG-2, but would rather be an acyl acceptor. The endostatin network comprises a number of extracellular proteins containing EGF domains (Epidermal Growth Factor), and able to bind calcium. Depending on the trigger event, and on the availability of its members in a given tissue at a given time, the endostatin network might be involved either in the control of angiogenesis, and tumor growth, or in neurogenesis and neurodegenerative diseases

La matrice extracellulaire est constituée d'un réseau tridimensionnel de protéines et de polysaccharides complexes, les glycosaminoglycanes. Elle apporte un support structural aux tissus et aux cellules dont elle est capable de moduler la prolifération, la migration et la différenciation. Nous avons créé une base de données d'interactions extracellulaires protéine-protéine et protéine-glycosaminoglycane, MatrixDB, qui est disponible sur le Web (http://matrixdb.ibcp.fr). Nous avons intégré des données expérimentales, des données issues de l’analyse de la littérature et des données issues de bases de données d'interactions publiquement disponibles. Nous avons respecté les standards de curation et d’échange de données du consortium IMEx dont fait partie MatrixDB. MatrixDB permet la construction et la visualisation de l'interactome extracellulaire entier et de plusieurs types de réseaux d'interactions, spécifiques d'une molécule, d'un tissu, d'une pathologie ou d'un processus biologique. Nous avons ainsi caractérisé le réseau d’interactions extracellulaire associé au vieillissement et mis en évidence le rôle important des glycosaminoglycanes et du calcium dans ce réseau. Nous avons construit le réseau d'interactions d'une matricryptine anti-angiogénique et anti-tumorale, l'endostatine, qui est issue du collagène XVIII. Les analyses structurales et fonctionnelles de ce réseau ont montré que les partenaires de l’endostatine sont majoritairement impliqués dans l’adhésion cellulaire et que les domaines EGF (Epidermal Growth Factor) sont surreprésentés. Cette propriété nous a permis d'identifier expérimentalement d'autres partenaires de l'endostatine possédant un ou plusieurs domaines EGF et de nouvelles fonctions de l’endostatine. Nous avons modélisé les complexes formés par l'endostatine avec deux de ses partenaires pour identifier les sites d'interactions. Ces prédictions, associées aux données expérimentales, ont permis de déterminer des interactions susceptibles d'être établies simultanément par l'endostatine. L'intégration de ces données et des paramètres cinétiques et d'affinité dans le réseau d'interactions de l'endostatine sera utilisée pour proposer un modèle de son mécanisme d'action qui reste mal connu / The extracellular matrix is composed of a tridimensional network of proteins and complex polysaccharides called glycosaminoglycans. It provides a structural support to tissues and modulates cell proliferation, migration and differenciation. We have created a database of protein-protein and proteinglycosaminoglycan extracellular interactions, MatrixDB (http://matrixdb.ibcp.fr). We have integrated experimental data, data issued of the literature curation and data from interaction databases publicly available. We have respected the curation and exchange standards of the IMEx consortium that includes MatrixDB. MatrixDB allows the construction and the visualization of the entire extracellular network and other types of interaction networks specific of a molecule, a tissue, a disease or a biological process. We have characterized the aging-related extracellular interaction network and underlined the important role of glycosaminoglycans and calcium in this network. We have constructed the interaction network of an antitumoral and anti-angiogenic matricryptin, endostatin, issued from collagen XVIII. Functional and structural analysis of their network showed that partners of endostatin are mostly involved in cell adhesion and that EGF domains are overrepresented. This has allowed us to to identify experimentally other partners of endostatin possessing one or more EGF domains and to propose new functions of endostatin. We have modelled complexes formed by endostatin with two of its partners to identify the binding sites.These predictions, associated with experimental data, allowed us to determine interactions able to be established simultaneously by endostatin. Integration of these data and of kinetics and affinity parameters in the interaction network of endostatin will be used to build a model of its mechanism of action that is not fully elucidated

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