La cicatrisation de ligaments est un processus complexe qui consiste en la prolifération et la migration cellulaire, ainsi que la synthèse de la matrice extracellulaire. Ce phénomène est influencé par des facteurs biochimiques et/ou environnementaux. Les propriétés spécifiques des cellules ligamentaires permettrent de répondre aux facteurs de croissance et aux contraintes mécaniques. Le but de nos travaux a été de définir les conditions de reconstruction in vitro d’un tissu ligamentaire. Nous avons tenu compte d’une part des paramètres biochimiques, d’autre part des paramètres mécaniques afin d’étudier l’ensemble des facteurs agissant sur la synthèse d’un nouveau tissu. Dans un premier temps, nous avons montré l’influence des facteurs de croissance, tels que le PDGF-AB et le TGF-b1 sur la prolifération et sur la synthèse de composants de la matrice extracellulaire (collagènes des types I et III). Il semble que ces deux facteurs de croissance aient une action, mais il n’agissent pas sur le même mode du point de vue temporel et mécanistique. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet de la contrainte mécanique spécifique du ligament, l’étirement. Nous avons montré que l’action des contraintes mécaniques est essentielle pour la différentiation des cellules cibles et leur évolution en cellules ligamentaires, en promouvant la synthèse de molécules spécifiques, telles que la ténascine, et les collagènes. Cependant, bien que ces résultats, restent insuffisants pour la reconstruction d’un bio tissu, ils nous ont néanmoins permis de définir les protocoles à suivre pour la suite de ces projets d’ingénierie tissulaire / The process of ligament healing is complex, which consists of the proliferation and the cellular migration, as well as the synthesis of the extra cellular matrix. This process is influenced by the biochemical and/or environmental factors. The specific properties of the ligament cell permit their responses to growth factors and to mechanical stress. The aim of our work was to define the conditions of in vitro reconstruction of ligament tissue. We take into account the biochemical, as well as the mechanical parameters in order to study the factors acting on the synthesis of a new tissue. Firstly, we investigated the influence of the growth factors such as PDGF-AB and TGF-b1 on the cell proliferation and the matrix synthesis (collagens types I and III) respectively. It seems that these two growth factors act on the different mode on the temporal and mechanistic aspects. Secondly, we studied the effect of the specific mechanical stress the stretching on the ligament. It was showed that the action of the mechanical stretching was essential for the differentiation of the target cells and their evolution in the ligament cell, by promoting the synthesis of the specific molecules, such as tenascin, and collagens. Although these results remain insufficient for the reconstruction of neotissue, they allowed us to define the protocols to be followed for the projects of tissue engineering

Les pathologies musculo-squelettiques affectant les os et les articulations demeurent un défi pour la médecine régénératrice. Les difficultés retrouvées sont liées aux besoins d’une vascularisation tissulaire optimale pour les substituts osseux et à l’obtention d’un cartilage de qualité pour les substituts articulaires. Les objectifs de ces travaux de thèse étaient de parvenir à différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) ombilicales humaines – outil de choix en médecine régénérative - vers un phénotype vasculaire et un phénotype chondrogénique articulaire pour répondre aux besoins de l’ingénierie tissulaire musculo-squelettique. La différenciation de CSM ombilicales en cellules musculaires lisses vasculaires a été montrée après 12 jours de stimulation par des facteurs solubles comme le transforming growth factor (TGF)-beta1 et l’acide ascorbique. Face aux limites des supports de culture en deux dimensions in vitro, un modèle de culture tridimensionnel a été mis en place à l’aide de CSM cultivées en “pellets” en présence ou non d’une solution matrice extracellulaire (MEC) ombilicale pour les expériences suivantes. Les facteurs solubles disposant d’une efficacité limitée et étant souvent onéreux, une transduction des “pellets” de CSM-GW a été réalisée à l’aide de virus adéno-associés recombinants (rAAV) permettant une synthèse de facteurs par les cellules à plus long terme. Ici, les pellets ont été transduits à l’aide de rAAV contenant le gène du facteur de transcription Sox9 afin d’induire une différenciation chondrogénique articulaire. Ces travaux démontrent l’intérêt d’associer la MEC et les CSM ombilicales humaines dans un modèle de culture en trois dimensions, ainsi que les outils de thérapie génique comme les rAAV pour constituer des implants utilisables pour régénérer les tissus musculo-squelettiques / Musculoskeletal conditions affecting bones and joints remain a challenge for regenerative medicine. The difficulties found are related to the needs of an optimal tissue vascularization for bone substitutes and to obtain a cartilage of quality for articular substitutes. The objectives of this PhD work were to differentiate human umbilical mesenchymal stem cells (MSC) - a tool of choice in regenerative medicine - towards a vascular phenotype and a joint chondrogenic phenotype to meet the needs of musculoskeletal tissue engineering. The differentiation of umbilical MSC into vascular smooth muscle cells was shown after 12 days of stimulation by soluble factors such as transforming growth factor (TGF)-beta1 and ascorbic acid. Facing the limits of two-dimensional culture supports in vitro, a three-dimensional culture model was set up using MSC cultured in pellets with or whitout an umbilical extracellular matrix (ECM) solution for the following experiences. Soluble factors have a limited efficacy and are often expensive, a transduction of MSC pellets was performed using recombinant adeno-associated viruses (rAAV) allowing a long term synthesis of factors by the cells. Here, the pellets were transduced using rAAV containing the Sox9 transcription factor gene to induce articular chondrogenic differentiation. This work demonstrates the interest of associating ECM and human umbilical MSC in a three-dimensional culture model, as well as gene therapy tools such as rAAVs to provide grafts that can be used to regenerate musculoskeletal tissues / Muskel- und Skeletterkrankungen an Knochen und Gelenken bleiben eine Herausforderung für die regenerative Medizin. Die Schwierigkeiten stehen im Zusammenhang mit den Ansprüchen einer optimalen Gewebevaskularisierung der Knochenersatzstoffe und damit, einen qualitativ hochwertigen Knorpel für den Gelenkersatz zu erhalten. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, humane mesenchymale Stammzellen (MSZ) aus der Nabelschnur, die das Werkzeug der Wahl in der regenerativen Medizin sind, in einen vaskulären und in einen chondrogenen Phänotyp zu differenzieren, um den Anforderungen des muskuloskeletalen Tissue Engineerings zu entsprechen. Die Differenzierung von Nabelschnur-MSZ in vaskuläre glatte Muskelzellen konnte durch Stimulation mit löslichen Faktoren wie dem Transforming Growth Factor (TGF)-beta1 und Ascorbinsäure nach 12 Tagen gezeigt werden. Angesichts der Grenzen einer zweidimensionalen Zellkultur in vitro, wurde ein dreidimensionales Kulturmodell, in dem MSZ in Pellets mit oder ohne extrazelluläre Matrix der Nabelschnur (EZM) kultiviert wurden, für die weiteren Versuche erstellt. Lösliche Faktoren haben eine limitierte Wirksamkeit und sind häufig teuer. Deshalb wurden die MSZ-Pellets mit rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (rAAV) transduziert, was eine Synthese der Faktoren durch die Zellen über einen längeren Zeitraum ermöglicht. In unserem Fall wurden die Pellets mit rAAV, die das Transkriptionsgen Sox9 enthalten, tranzduziert, um eine artikuläre chondrogene Differenzierung zu induzieren. Diese Arbeit zeigt, dass es von Interesse ist EZMs und humane Nabelschnur-MSZ in einem dreidimensionalen Kulturmodell zu vereinen. Auch wird gezeigt, dass Werkzeuge der Gentherapie wie rAAVs, die den Transplantaten zugeführt werden, helfen können muskuloskeletales Gewebe zu regenerieren

La matrice extracellulaire (MEC) est impliquée dans les mécanismes de prolifération, migration, différenciation et d’adhésion cellulaire. La membrane basale (MB), MEC entourant le muscle, sert de soutien aux fibres musculaires durant la contraction donnant ainsi une élasticité aux fibres musculaires. La MB est composée de collagènes dont majoritairement le collagène IV, de laminines, de nidogène (entactine), de perlecan (heparan sulphate proteoglycan), et de protéoglycans. Au cours de la myogenèse, la modulation de la MEC est indispensable au bon déroulement des processus de délamination, migration et fusion des cellules musculaires. Le collagène XXV est un collagène de la famille MACIT (Membrane Associated Collagens with Interrupted Triple Helices). Cette famille de collagènes transmembranaires contient 3 autres membres : le collagène XIII, le collagène XVII et le collagène XXIII. Le collagène XIII est impliqué dans les processus de migration cellulaire, le collagène XXIII dans ceux d’adhésion cellulaire. Le collagène XXV est impliqué dans la maladie d’Alzheimer, par sa fixation aux agrégats de peptides Aβ. D’autre part, il a été montré qu’il est nécessaire à la mise en place de la jonction neuromusculaire dans le muscle du diaphragme. La souris col25a1-/- présente une aplasie et une atrophie du diaphragme à E18.5 probablement dues au défaut d’innervation. L’expression du collagène est précoce dans la myogenèse, puisqu’il est fortement exprimé dans le bourgeon de membre d’embryons de souris dès E12.5, bien avant l’innervation des muscles des membres. Le rôle du collagène XXV dans la myogenèse précoce n’est pas connu. Le but de mon travail est de démontrer le rôle du collagène XXV durant la myogenèse. Pour ce faire, des études in vivo et in vitro ont été menées. In vitro, nous montrons l’implication du collagène XXV dans la différenciation myogénique. In vivo, la souris col25a1-/- présente des défauts de formation de fibres plurinucléées dans les bourgeons de membre d'embryons prélevés à E12.5 et E14.5, ce qui démontre le rôle de ce collagène dans les processus de fusion des myoblastes en myotubes au cours de la myogenèse primaire. Nous démontrons aussi la régulation de l’ARNm de ce collagène par deux microARN : miR-208b et miR-499, sans effet additionnel ou synergique de ces deux miRs. Nos résultats complémentaires suggèrent que l'expression de col25a1 est probablement régulée par le facteur de transcription NFATc2. En effet, chez les embryons de souris nfatc2-/- prélevés à E12.5, nous observons une diminution de l’expression de col25a1, ce qui pourrait expliquer l’atrophie musculaire observée chez la souris nfatc2-/-. Il serait intéressant de restaurer ce défaut musculaire chez la souris nfatc2-/- en surexprimant ce collagène XXV chez cette souris. / Extracellular matrix is involved in cellular proliferation, migration, differentiation and adhesion. Muscle extracellular matrix, called the basement membrane, serves as support for muscle fibers during contraction, thus giving elasticity to the muscle fibers. Basement membrane is composed by collagen mainly collagen IV, laminin, nidogen, perlecan (heparan sulphate proteoglycan) and proteoglycan. During myogenesis, the modulation of extracellular matrix is very important for muscle cells to delaminate, migrate and fuse. Collagen XXV is part of the MACIT (Membrane Associated Collagens with Interrupted Triple Helices) collagen family together with collagen XIII, collagen XVII and collagen XXIII. Collagen XIII is involved in cell migration and collagen XXIII in cell adhesion. Collagen XXV was first described in Alzheimer disease, as a component of the Aβ amyloid aggregates. Furthermore, Collagen XXV is necessary for the formation of neuromuscular junctions in diaphragm. At E18.5, col25a1-/- embryos show muscle aplasia and atrophy in diaphragm, probably due to lack of innervation. This collagen is strongly expressed during primary myogenesis in limb buds from E12.5 embryos, long before innervation of limb muscles. But the role of this collagen during early myogenesis has never been analyzed. In this work, I demonstrated the role of collagen XXV during early myogenesis. In vitro assays showed that collagen XXV is involved in the muscle differentiation process. In vivo, limb muscles from E12.5 and E14.5 col25a1-/- embryos have defects in the formation of plurinucleated myofibers, suggesting a role of this collagen in the fusion of myoblasts into myotubes during mouse myogenesis. In this work, I demonstrated that col25a1 transcripts are down-regulated by miR-208b and miR-499 without synergic or additional effects. Complementary results suggest that col25a1 expression could be regulated by the transcription factor, NFATc2. In E12.5 nfatc2-/- embryos, col25a1 expression is decreased. This result could explain the muscle atrophy observed in nfatc2-/- mice. It could be interesting to restore muscle atrophy in nfatc2-/- mouse by overexpressing col25a1 in these mice.

Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la guérison est fréquemment problématique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le développement d’un tissu de granulation exubérant ou « bouton de chair », qui mène à une cicatrisation excessive due à la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non épithélialisé, est caractérisé par une occlusion au niveau de la microcirculation due à l’hypertrophie des cellules endothéliales, qui laisse supposer la présence d’hypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prédisposées au développement de tissu de granulation exubérant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une étude thermographique a révélé un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau moléculaire, la littérature rapporte que le facteur de transcription «hypoxia inducible factor» (HIF) est à l’origine de plusieurs changements dans les niveaux d’expression de divers gènes régulés par l’hypoxie. L’objectif du présent projet de recherche était de définir la contribution de l’hypoxie à la guérison cutanée chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait à mesurer l’expression protéique temporelle du HIF1A dans des échantillons tissulaires en provenance de plaies cutanées guérissant normalement et d’autres développant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les résultats obtenus suggèrent que la mesure de HIF1A, dans les échantillons pluricellulaires de cette étude, reflète l’épithélialisation de la plaie plutôt que les niveaux d’oxygène tissulaire. En effet, le HIF1A semble réguler l’homéostasie et la prolifération des kératinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques équins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou d’hypoxie (à 1% d’O2 ou à l’aide d’un mimétique, le CoCl2) afin d’en étudier le comportement (capacités de prolifération et de synthèse protéique). Les résultats obtenus soutiennent une contribution de l’hypoxie à la cicatrisation extensive chez le cheval puisque l’hypoxie favorise la prolifération des fibroblastes en plus d’encourager la synthèse de collagène de type 1 et de diminuer la synthèse de la métalloprotéinase de type 2. Les changements observés semblent dépendre de facteurs extrinsèques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de façon similaire indépendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de l’étude ont permis d’élucider une part des mécanismes sous-jacents à la formation du tissu de granulation exubérant lors de guérison cutanée chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mènera à une meilleure compréhension de la pathologie et ainsi, permettra de développer des méthodes de traitement spécifiques à la condition. / The horse is often victim of traumatic wounds for which healing can be problematic, mainly when the wound occurs on the limb. The development of exuberant granulation tissue, also known clinically as “proud flesh”, leads to extensive scarring characterized by overproduction of fibrous tissue and the absence of an epithelial cover. This scar tissue suffers from occlusion of the microcirculation within the residual granulation tissue, due to endothelial cell hypertrophy, suggesting tissue hypoxia. The presence of relative hypoxia in limb wounds of horses was recently confirmed using near infrared spectroscopy. Additionally, thermography showed decreased perfusion in limb wounds. Abundant literature incriminates "hypoxia inducible factor” (HIF) in the regulation of expression of a number of genes in response to hypoxia. The overall objective of this research project was to define the contribution of hypoxia to problematic wound healing in horses. The first phase of the project (in vivo) aimed to measure the temporal expression of HIF1A protein in tissue samples taken from skin wounds healing normally and others developing exuberant granulation tissue and subsequent extensive scarring, according to various anatomical sites (trunk, limb). Results suggest that the expression of HIF1A within the pluricellular tissue samples of this study reflects wound epithelialization rather than tissue oxygen levels. Indeed, HIF1A appears to regulate the homeostasis and proliferation of skin keratinocytes. The second phase of the project (in vitro) consisted in the culture of equine dermal fibroblasts from the body or the limb, under conditions of normoxia or hypoxia (1% O2 or using a mimetic, CoCl2) in an effort to study their behavior (proliferation and protein synthesis). Results corroborate the contribution of hypoxia to over-scarring in the horse since hypoxia promotes both the proliferation of dermal fibroblasts and the synthesis of collagen type 1 while decreasing the synthesis of matrix metalloproteinase 2. Extrinsic factors (environmental) appear to govern the behavior of equine dermal fibroblasts since these cells behave similarly regardless of their anatomic origin (body or limb). In summary, the two phases of the study contributed to the elucidation of a portion of the mechanisms underlying the development of exuberant granulation tissue during wound healing in horses. Further research in this area will provide a better understanding of the pathology and thus aid in the design and development of targeted therapies.

La motilité des cellules est un phénomène fondamental en biologie souvent étudié sur des surfaces planes, conditions peu physiologiques. Nous avons analysé la migration cellulaire dans une matrice cellulaire 3D contenant de la fibronectine fluorescente. Nous démontrons que les cellules y sont confinées, et déforment leur environnement de manière cyclique avec une période de ~14 min avec deux centres de contractions à l’avant et à l’arrière de la cellule qui contractent avec un déphasage de ~3.5 min. Une perturbation de ces cycles entraîne une réduction de la motilité. Par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques, nous avons identifié l’acto-myosine comme étant l’acteur principal de ce phénomène. En imposant des contractions-relaxations locales par ablations laser, nous avons déclenché la motilité cellulaire ce qui confirme notre hypothèse. L’ensemble de cette étude met en évidence un nouveau mécanisme fondamental de dynamique cellulaire impliqué dans le mouvement des cellules. / Cell motility is an important process in Biology. It is mainly studied on 2D planar surfaces, whereas cells experience a confining 3D environment in vivo. We prepared a 3D Cell Derived Matrix (CDM) labeled with fluorescently labeled fibronectin, and strikingly cells managed to deform the matrix with specific patterns : contractions occur cyclically with two contraction centers at the front and at the back of the cell, with a period of ~14 min and a phase shift of ~3.5 min. These cycles enable cells to optimally migrate through the CDM, as perturbation of cycles led to reduced motility. Acto-myosin was established to be the driving actor of these cycles, by using specific inhibitors. We were able to trigger cell motility externally with local laser ablations, which supports this framework of two alternating contractions involved in motion. Altogether, this study reveals a new mechanism of dynamic cellular behaviour linked to cell motility.

Bacillus subtilis est une bactérie à Gram positif ubiquitaire vivant dans différents environnements terrestres et aquatiques. Différents polymères extracellulaires entrant dans la composition de la matrice des biofilms à B. subtilis ont été décrits. Des polysaccharides sont à la base de ces propriétés mécaniques, la viscoélasticité étant modulée par la teneur du biofilm en différents polymères extracellulaires comme les protéines amyloïdes et l’ADN extracellulaire.L’objectif de ce travail était d’étudier le rôle des exopolymères dans les biofilms à B. subtilis en utilisant la souche type de l’espèce CIP52.65T et différentes autres souches sauvages, cliniques et mutantes. La composition de la matrice varie en fonction de la présence de saccharose dans le milieu de culture, ainsi les effets d’une supplémentation du milieu Trypticase Soja (TS) en saccharose (20% p/v) ont été étudiés sur la croissance planctonique, la production de polymères de matrice et la formation de biofilm pour toutes ces souches de B. subtilis. Enfin, parmi les protéines de la matrice, B. subtilis produit une protéine formant des fibres amyloïdes appelée TasA. Son rôle exact dans le biofilm reste encore mal connu. Le but de cette seconde étude était de mieux comprendre le mécanisme d'auto-assemblage de TasA et de comprendre son rôle dans la matrice. En regroupant toutes les caractérisations effectuées sur les biofilms et sur les peptides amyloïdes, la conception de matrice biomimétique a permis d’effectuer de première approche sur les propriétés mécaniques de celle-ci, en reproduisant des matrices artificielles à base d’exopolysaccharides (lévane), de peptides amyloïdes et d’ADN. / Bacillus subtilis is a ubiquitous gram-positive bacterium that lives in different terrestrial and aquatic environments. Various extracellular polymers involved in the composition of the B. subtilis biofilm matrix have been described. Polysaccharides are the basis of these mechanical properties, the viscoelasticity being modulated by the content of the biofilm in different extracellular polymers such as amyloid proteins and extracellular DNA.The aim of this work was to study the role of exopolymers in B. subtilis biofilms using the type CIP52.65T strain and various other wild, clinical and mutant strains. The composition of the matrix varies according to the presence of sucrose in the culture medium, so the effects of supplementation of the medium Trypticase Soy (TS) sucrose (20% w/v) were studied on the planktonic growth, matrix polymer production and biofilm formation for all these B. subtilis strains. Finally, among the proteins in the matrix, B. subtilis produces an amyloid-forming protein called TasA. Its exact role in the biofilm remains poorly understood. The purpose of this second study was to better understand the self-assembly mechanism of TasA and to understand its role in the matrix. By grouping all the characterizations carried out on the biofilms and the amyloid peptides, the biomimetic matrix design made it possible to carry out a first approach on the mechanical properties of this one, by reproducing artificial matrices based on exopolysaccharides (levan), amyloid peptides and DNA.

La Ténascine-C (TNC) est un composé majeur de la matrice extracellulaire tumorale et sa forte expression est directement corrélée à l’angiogenèse tumorale et au processus métastatique. Lors de ma thèse j’ai pu démontrer que la TNC dérégulait DKK1, un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt et par ce biais augmentait l’activité de cette voie impliquée dans la cancérogenèse. La diminution de la formation des fibres de stress en présence de TNC est l’un des mécanismes majeurs qui contribue à la diminution de DKK1. L’activité de MKL1, facteur co-transcriptionnel de SRF et régulable par l’actine, s’avère diminuée en présence de TNC. Mes données indiquent que la fonction de MKL1 n’est peut-être pas le mécanisme majeur de la régulation de DKK1 par la statu de l’actine. D’autres facteurs, probablement liés aux fibres de stress d’actine pourraient être impliqués. L’augmentation de l’activité de la voie de signalisation Wnt, dépendante de DKK1, est probablement le mécanisme majeur par lequel la TNC active la progression tumorale. Cette étude a permis de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation de DKK1 faisant intervenir l’intégrité du cytosquelette d’actine. / Tenascin-C (TNC) is a major component of the tumor specific extracellular matrix and its expression has been linked to tumor angiogenesis and metastasis. I demonstrated that TNC downregulates the expression of the Wnt signalling inhibitor DKK1 and by that enhances Wnt/-catenin signalling. Reduced stress fibre formation in the presence of TNC was identified as a major mechanism contributing to DKK1 downregulation. The activity of the actin-regulated SRF co-transcription factor MKL1 was found to be reduced in the presence of TNC. My results indicate that TNC-regulated MKL1 function maybe one, but not the major mechanism of DKK1 regulation by the actin status and that other factors, presumably regulated by actin stress fibres, are involved. Enhanced Wnt signalling activity downstream of TNC-induced DKK1 downregulation might be a major mechanism by which TNC promotes tumor progression. Furthermore, this study discovered a novel mechanism of regulating the Wnt inhibitor DKK1 by the integrity of the actin cytoskeleton.

La matrice extracellulaire est un réseau enchevêtré de macromolécules variées, en étroite relation avec les cellules qu'elle environne. Les interactions bidirectionnelles qui s'établissent entre les cellules et leur microenvironnement matriciel régulent mutuellement leur comportement et devenir. La diversité biochimique des constituants moléculaires de la matrice, leurs propriétés biophysiques, leur architecture tout comme leur dynamique représentent autant de signaux régulateurs. Parmi les constituants de la matrice, la fibronectine (FN) est une glycoprotéine structurale et fonctionnelle majeure intervenant dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Ces fonctions diverses sont directement liées à la dynamique structurale de cette protéine et à sa capacité à interagir avec les autres molécules matricielles, dont elle-même. Retrouvée sous forme soluble dans les fluides biologiques, la FN est incorporée dans les matrices insolubles sous forme d'assemblages supramoléculaires principalement fibrillaires mais aussi sous forme d'agrégats. Ces assemblages sembleraient être impliqués dans des processus physiologiques et pathologiques distincts.Si l'étude des assemblages de FN est rendue possible par l'élaboration de modèles in vitro, les mécanismes de polymérisation et l'effet d'assemblages de structures définies sur le comportement cellulaire restent cependant à mieux élucider et constituent le cœur de ce travail.Les travaux ont donc consisté à élaborer des assemblages de FN, à caractériser les mécanismes et structures impliqués dans leur polymérisation, et à étudier leur influence sur un modèle de cellules cancéreuses ovariennes. D'autre part, des études préliminaires comparatives ont été menées avec un analogue végétal de la FN.L'irréversibilité de la dénaturation thermique de la FN entraîne la formation d'agrégats de type amyloïde. Deux populations d'agrégats coexistent en solution. Cette agrégation est corrélée à une diminution de l'accessibilité des sites de liaison à la gélatine et des sites RGD, et à une diminution de l'incorporation dans les réseaux matriciels. De plus, si la FN sous sa forme agrégée n'est pas cytotoxique pour les cellules étudiées, la modification de la conformation de la FN favorise leur migration isolée et aléatoire.Ces résultats soulèvent la question de l'implication de ces agrégats de FN dans des processus pathologiques tels que le développement tumoral. / Extracellular matrix is a complex meshwork of various macromolecules that have a tight relationship with the surrounding cells. Bidirectional interactions between cells and the microenvironment control their respective behaviors and fate. The biochemical diversity of matrix molecular components, their biophysical properties, their architecture but also their dynamic represent as many regulator signals. Among the components of the matrix, fibronectin (FN) is a major structural and functional glycoprotein involved in numerous physiological and pathological processes. These various functions are directly linked to the structural dynamic of this protein and its ability to interact with others matrix components, in particular with itself. Found as a soluble protein in biological fluids, FN is also incorporated in insoluble matrix as supramolecular assemblies, mainly fibrils but also aggregates. These assemblies could be involved in distinct physiological and pathological processes.If the study of the assembly of the FN is possible with the help of in vitro models, the mechanism of polymerization and the effects of defined assemblies on the cell behavior still have to be better defined.Therefore, this work consisted in elaborating FN assemblies, in characterizing the mechanisms and structures involved in their polymerization and in studying their influence on behaviors of a model of ovarian cancer cells. Besides, preliminary comparative studies have been performed with a plant analogous of FN.We show that irreversible thermal unfolding of FN triggers amyloid-like aggregation. Two states of aggregates could coexist in solution. FN aggregation correlates with a decrease of gelatin-binding domain and RGD sequence accessibility, and a decrease of the incorporation in the matrix network. Moreover, if aggregates are not cytotoxic for the studied cells, conformation change of FN promotes their single-cell and random migration.These results raise questions about the role of FN aggregates in pathological processes like tumor development.

Les vaisseaux sanguins sont composés de cellules enchâssées dans la matrice extracellulaire (MEC). Certaines interactions entre les cellules et les composés de la MEC sont impliquées dans plusieurs changements pathologiques et physiologiques au niveau de la paroi artérielle. L'hypertension systolo-diastolique provoque deux formes de remodelage vasculaire : hypertrophique dans les artères de conductance et eutrophique dans les artères de résistance. Les mécanismes régissant le remodelage eutrophique ne sont pas encore bien éclaircis. Afin de les étudier, nous avons utilisé un modèle d'hypertension systolodiastolique induite par l'inhibition de la synthèse de monoxyde d'azote. Nous avons démontré que la contribution des protéines de désadhésion semblait différer d'un type de remodelage à l'autre et que les métalloprotéinases matricielles (MMPs) ne jouaient pas un rôle crucial dans le développement du remodelage eutrophique, contrairement au remodelage hypertrophique. Au cours du vieillissement, on observe des modifications de la paroi vasculaire des artères de conductance, augmentant leur rigidité : une fragmentation des fibres élastiques, leur calcification (élastocalcinose), une augmentation des liens covalents entre les protéines de la MEC et une fibrose. Cette rigidité conduit au développement de l'hypertension systolique isolée. Afin d'évaluer l'implication des MMPs dans la fragmentation de l'élastine et leur rôle dans le développement de l'élastocalcinose, nous avons utilisé un modèle animal d'élastocalcinose basé sur l'inhibition de la maturation de la matrix Gla protein (MGP), une protéine anti-calcifiante, par la warfarine. Nous avons observé une augmentation rapide et transitoire de l'activité de la MMP-9, suivie de l'activation du transforming growth factor-ß (TGF-ß). L'inhibition de l'activité des métalloprotéinases et de TGF-ß a permis de prévenir l'élastocalcinose. Par ailleurs, l'élastocalcinose est accélérée par le diabète. Cette accélération est reliée à la durée et à la sévérité du diabète. Or, ce dernier est associé à une augmentation de la synthèse des produits avancés de glycation (AGEs) pouvant former des liens covalents iv entre les protéines de la MEC. Ne disposant pas de modèle animal pour étudier l'implication des AGEs dans l'élastocalcinose associée au diabète, nous en avons créé un. Dans ce modèle, le diabète est induit par une diète riche en lipides et une injection de streptozotocine (30 mg/kg/jr). L'élastocalcinose est provoquée par l'inhibition de la maturation de la MGP. Nous avons observé une accélération de l'élastocalcinose, liée à la durée du diabète, et une accumulation de AGEs dans la paroi des artères fémorales. L'utilisation de pyridoxamine, un inhibiteur de la formation des AGEs, et de l'ALT711, un briseur des liaisons covalentes formées par les AGEs, a permis de prévenir et de limiter, respectivement, la calcification dans ce modèle. En outre, nous avons montré que la stimulation du récepteur des AGEs (RAGE), pouvait être impliquée dans l'élastocalcinose et élucidé certains éléments de signalisation dans ce processus. Ces travaux ont fait émerger le rôle des MMPs, de TGF-ß et des produits avancés de glycation dans le remodelage hypertrophique et l'élastocalcinose associée ou non au diabète. Ceux-ci sont reliés à l'apparition de l'hypertension systolo-diastolique et systolique isolée, respectivement. L'inhibition de ces acteurs pourrait constituer de nouvelles thérapies anti-hypertensives.

La sclérose systémique est une maladie autoimmune dont l’une des complications majeures est la fibrose. La DNA topoisomérase I (topo) est l’un des principaux autoantigènes associés à cette maladie. Toutefois, aucun lien n’a encore pu être établi entre la présence des anti-topo et le développement de la fibrose. Les travaux antérieurs du laboratoire d’accueil ont montré une interaction directe de la topo avec la surface des fibroblastes et la matrice extracellulaire. Nous avons voulu caractériser ces interactions du point de vue moléculaire. La topo a donc été exprimée sous forme de 5 fragments, déterminés à partir de ses principaux domaines structuraux et de ses épitopes majeurs, chez E. coli. Les fragments purifiés ont été analysés pour leur interaction avec l’héparine, représentant les héparane sulfates de la surface des fibroblastes, et avec des protéines purifiées de la matrice extracellulaire. Nous avons montré que le fragment topo-N est le principal responsable de l’interaction avec l’héparine, ce qui suggère donc l’implication potentielle de ce domaine dans l’interaction de la topo avec la surface des fibroblastes. Le fragment topo-DIDII est responsable de l’interaction avec la plupart des protéines de la matrice extracellulaire étudiées, alors que le fragment topo-H15 n’interagit qu’avec la vitronectine. Aucune interaction des fragments topo-DIII et topo-C n’a été décelée. Ces résultats pourront maintenant servir à mieux comprendre le rôle potentiel de la topo et des autoanticorps circulants anti-topo dans la fibrose présente chez les personnes atteintes de sclérose systémique en contribuant à l’identification de la cible de la topo sur les fibroblastes. / Systemic sclerosis is an autoimmune disease in which one of the major complications is fibrosis. DNA topoisomerase I (topo) is a major autoantigen associated with this disease. However, no link has yet been established between the presence of anti-topo and the development of fibrosis. Previous work of the host laboratory showed a direct interaction of the topo with the surface of fibroblasts and extracellular matrix. We wanted to characterize these interactions at the molecular level. Topo was expressed in 5 fragments, determined from its main structural domains and its major epitopes, in E. coli. The purified fragments were analyzed for their interaction with heparin, representing heparan sulfates on the surface of fibroblasts, and with purified proteins of the extracellular matrix. We have shown that the topo-N fragment is responsible for interaction with heparin, suggesting hence, potential involvement of this domain in the interaction of topo with the surface of fibroblasts. The topo-DIDII fragment is responsible for the interaction with most proteins of the extracellular matrix studied, whereas the topo-H15 fragment only binds to vitronectin. No interaction of fragments topo-DIII and topo-C was found. These results can now be used to better understand the potential role of topo and circulating anti-topo autoantibodies in the fibrosis present in patients with systemic sclerosis in helping to identify the target of topo on fibroblasts.