Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Diversos sÃo os relatos de resistÃncia in vitro de cepas de Candida spp. a fÃrmacos antifÃngicos, em especial a derivados azÃlicos. Deste modo, a prospecÃÃo de novos compostos com propriedade antifÃngica se faz necessÃria. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifÃngica do sesquiterpeno farnesol, sua aÃÃo sinÃrgica com antifÃngicos fluconazol (FLC), itraconazol (ITC), voriconazol (VRZ), anfotericina B (AMB) e caspofungina (CASP), bem como avaliar sua aÃÃo sob a atividade enzimÃtica de fosfolipases e proteases, consideradas importantes fatores de virulÃncia em Candida spp. Para tanto, foram avaliadas cepas de C. albicans (n=23), C. parapsilosis (n=16) e C. tropicalis (n=6). A concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) foi determinada por meio da tÃcnica de microdiluiÃÃo, preconizada pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Em adiÃÃo, foi investigado o efeito do farnesol sobre a atividade de fosfolipase utilizando Ãgar Sabouraud suplementado com gema de ovo e a atividade de protease por tÃcnica espetrofotomÃtica. Paralelamente 14 cepas escolhidas aleatoriamente, foram prÃ-incubadas em trÃs concentraÃÃes sub-CIM de farnesol, afim de avaliar se o farnesol era capaz de causar algum dano na sensibilidade da cepa. Para as 45 cepas avaliadas, os valores de CIM para farnesol variaram de 9,37 a 150 ÂM para Candida spp. Para os derivados azÃlicos, o intervalo dos valores de CIM para fluconazol foi de 0,03125 a > 64 Âg/ml, observando-se a presenÃa de 18 cepas resistentes (CIM > 64 Âg/mL). Em relaÃÃo ao itraconazol, os valores de CIM variaram de 0,03125 a >16 Âg/mL e 35 cepas apresentaram resistÃncia a esse antifÃngico (CIM ≥1 Âg/mL). Constatou-se que das 45 cepas em estudo, 19 apresentaram resistÃncia a anfotericina B, com CIM > 1 Âg/mL. Quanto a caspofungina, os valores de CIM variaram de 0,0625 a 2 Âg/mL, com apenas seis cepas exibido resistÃncia, com CIM de 2 Âg/mL. A combinaÃÃo anfotericina B e farnesol apresentou sinergismo em 94,7% (18/19) das cepas de Candida spp. resistentes, evidenciado pelos valores de FICI ≤ 0,5. Na associaÃÃo fluconazol e farnesol, observou-se uma interaÃÃo sinÃrgica frente a todas as cepas de Candida spp. avaliadas, apresentando FICI ≤ 0,5. Trinta e seis cepas (18 C. albicans, 12 C. parapsilosis e 6 C. tropicalis) foram testadas frente à associaÃÃo de itraconazol e farnesol, observando a ocorrÃncia de sinergismo (FICI ≤ 0,5) em 94,4% dos isolados. Quanto à caspofungina todas as cepas testadas (C. parapsilosis, n=4; C. albicans, n=2) tiveram FICI ≤ 0,5, caracterizando associaÃÃo sinÃrgica com o farnesol. ApÃs constataÃÃo de que 17 das 45 cepas expressavam a enzima fosfolipase, as mesmas foram incubadas em concentraÃÃes sub-CIM de farnesol, por 24 horas, quando observouâse uma medida de Pz mÃdia de 0,73 para as cepas testadas sem contato com farnesol e valores de 0,71, 0,61, e 0,54 para aquelas incubadas em doses sub-inibitÃria de farnesol. Em relaÃÃo à produÃÃo de protease, observou-se que todas as 14 cepas produziam a enzima, em baixas concentraÃÃes, variando de 0,002 a 0,02 U/mL, e que a prÃ-incubaÃÃo com farnesol nÃo interferiu na produÃÃo enzimÃtica. No tocante a prÃ-incubaÃÃo das cepas com farnesol constatou-se que o mesmo interferi direta e indiretamente no fenÃmeno de resistÃncia das cepas. Estes resultados demonstram, em especial, o efeito do composto farnesol sobre a sensibilidade antifÃngica de Candida spp., abrindo a perspectiva de novos estudos com o intuito de determinar os mecanismos de aÃÃo desses compostos no metabolismo celular dos fungos. / There are several reports of in vitro resistance to antifungal drugs, especially azole derivatives, in strains of Candida spp. For this reason, the pursuit for new compounds that present antifungal properties is necessary. Thus, this study aimed at evaluating the antifungal activity of farnesol and its interaction with classical antifungal drugs against Candida spp., as well as evaluating its effect on the production of phospholipase and protease, which are important virulence factors for Candida species. Fourty-five strains of Candida spp. (23 C. albicans, 16 C. parapsilosis and 6 C. tropicalis) were tested through broth microdilution as described by the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), document M27A2, and the minimum inhibitory concentrations (MICs) for amphotericin B (AMB), fluconazole (FLC), itraconazole (ITC), caspofungin (CAS) and farnesol (FAR) were individually determined. In addition, the effect of FAR on phospholipase activity was assessed by growing the strains on 2% Sabouraud agar, supplemented with egg yolk, and protease activity was determined through spectrophotometry. Then, 13 strains were randomly chosen, pre-incubated at three sub-inhibitory concentrations of FAR for 24 hours and re-submitted to microdilution assay. For the 45 evaluated Candida spp. strains the MIC values for FAR varied from 9.37 to 150 ÂM. For the classical antifungal drugs, MICs ranged from 0.0625 to 4 Âg/mL for AMB, with 19 resistant strains (MIC>1 Âg/mL); from 0.0125 to >64 for FLC, with 18 resistant strains (MIC> 64 Âg/mL); from 0.03125 to >16 Âg/mL for ITC, with 35 resistant strains (MIC ≥1 Âg/mL), and from 0.0625 to 2 Âg/mL for CAS, with six resistant strains (MIC≥2 Âg/mL). All resistant strains were tested against the combination of FAR with the drug to which they presented resistance. The combination of AMB and FAR was synergistic against 94.7% (18/19) of the Candida spp. isolates, as shown through the obtention of FICI≤0.5. FAR and FLC interacted synergistically against all tested strains (n=18), exhibiting FICI values of ≤0.5. The combination of FAR and ITC presented synergistic interactions (FICI≤0.5) against 94.4% of the tested isolates (33/35). Finally, FAR and CAS showed to interact synergistically (FICI≤0.5) against all tested strains. Concerning virulence factors, it was observed that 17/45 isolates produced phospholipase, with a mean Pz of 0.71. After incubating these strains at three different concentrations of FAR the mean Pz values of 0.71, 0.61 and 0.54 were obtained, after incubation at the lowest, the intermediate and the highest concentrations of FAR, respectively. In addition, it was observed that the 14 randomly chosen strains that were screened for protease activity produced low concentrations of these enzymes, varying from 0.002 to 0.02 U/mL and that FAR presented no effect on enzymatic production. Finally, it was observed that pre-incubating strains at the highest sub-inhibitory concentration of FAR reduced the MIC range of the tested antifungal drugs. These results especially show the effects of FAR on the susceptibility of Candida species to classical antifungal drugs, providing perspectives for the development of researches on the mechanisms of this compound on fungal cell metabolism

nÃo hà / O aumento nos Ãltimos anos de indivÃduos imunocomprometidos, como portadores da SÃndrome da ImunodeficiÃncia Adquirida, de doenÃas malignas, transplantados e outros usuÃrios de terapias imunossupressoras, favorece o surgimento de infecÃÃes oportunistas, principalmente as de teor fÃngico, como a candidÃase e a criptococose. Apesar de a terapia antifÃngica atual ser eficiente na maioria dos casos, algumas vezes fazem-se necessÃrias novas drogas que atuem como alternativa ou como coadjuvantes no tratamento para potencializar o efeito dos antifÃngicos utilizados. As estatinas sÃo fÃrmacos hipolipemiantes mais prescritos mundialmente para doenÃas cardiovasculares. Entretanto, recentemente, tem sido descritos outros efeitos benÃficos destas drogas, como, por exemplo, o controle de infecÃÃes. Este trabalho teve como objetivo determinar a atividade antifÃngica in vitro das estatinas ante 51 cepas de Candida, sendo 16 de C. albicans, 11 de C. krusei, 12 de C. tropicalis e 12 de C. parapsilosis, e 25 cepas de Cryptococcus, sendo 12 de C. gattii e 13 de C. neoformans, por meio de testes de microdiluiÃÃo em caldo, segundo documento M27-A3 padronizado pelo CLSI. O intervalo de concentraÃÃo testado para pravastatina foi de 50 a 0,0977 mg/mL, para sinvastatina, 1 a 0,0020 mg/mL e para atorvastatina, 10 a 0,0200 mg/mL. Pravastatina inibiu 37 leveduras do gÃnero Candida apresentando concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) na faixa de 1,56 a 6,25 mg /mL e as cepas restantes nÃo foram inibidas mesmo na maior concentraÃÃo testada (50 mg /mL), enquanto que sinvastatina e atorvastatina apresentaram atividade antifÃngica sobre todas as 51 cepas avaliadas, apresentando CIMs de 0,02 a 1 mg / mL e 0,04 a 5,00 mg / mL, respectivamente. Para o gÃnero Cryptococcus, apenas 4 cepas foram inibidas ante a pravastatina (CIM = 25 mg / mL), por outro lado, sinvastatina inibiu todas as 25 cepas (CIM = 0,06 a 1 mg / mL), e atorvastatina apenas 8 cepas (CIM = 0,62 a 2,5 mg / mL), sendo que as 17 restantes nÃo foram inibidas mesmo na maior concentraÃÃo testada ( ≥ 10 mg / mL). Foi determinada concentraÃÃo fungicida mÃnima (CFM) de pravastatina sobre 15 cepas do gÃnero Candida (CFM = 3,12 a 25 mg / mL), de sinvastatina sobre 34 cepas (CFM = 0,03 a 1 mg / mL), e de atorvastatina sobre 16 cepas (CFM = 0,04 a 0,31 mg / mL). Para o gÃnero Cryptococcus, das 25 cepas testadas, pravastatina exibiu CFM sobre apenas 3 cepas (CFM = 50 mg / mL), sinvastatina sobre 21 cepas (CFM = 0,12 a 1 mg / mL), e atorvastatina sobre 1 cepa (CFM = 1 mg / mL). Esta atividade inibitÃria in vitro de estatinas sobre espÃcies de Candida e Cryptococcus, abre uma perspectiva importante para a investigaÃÃo do possÃvel uso destas drogas com finalidade antifÃngica in vivo. / In the past years, fungal opportunistic infections, especially, candidiasis and cryptococcosis, have become more frequent because of the increase in the number of immunocompromised individuals, such as AIDS, transplant and cancer patients and those that are on immunosuppressive therapy. In spite of being effective, sometimes it is necessary to use new drugs as alternatives or as adjuvants in order to potentiate the effect of the classical antifungal therapy. Statins are the most prescribed hypolipemiant drugs worldwide for preventing cardiovascular diseases. However, other benefic effects for these drugs have been described, such as the control of infections. This work aimed at determining the antifungal activity of statins against Candida spp. and Cryptococcus spp. The minimum inhibitory concentrations (MICs) for three different statins (pravastatin, simvastatin and atorvastatin) were determined against 51 strains of Candida spp. (16 C. albicans, 11 C.krusei, 12 C. tropicalis and 12 C. parapsilosis) and 25 strains of Cryptococcus spp. (12 C. gattii and 13 C. neoformans), through broth microdilution assay, according to the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI - Document M27-A3). The concentration tested for pravastatin ranged from 50 to 0.0977 mg/mL, for simvastatin, it ranged from 1 to 0.0020 mg/mL and, for atorvastatin, it varied from 10 to 0.0200 mg/mL. Pravastatin inhibited 37 Candida strains, with MICs varying from 1.56 to 6.25 mg/mL and the remaining strains were not inhibited, even at the highest concentration tested (50 mg/mL). Simvastatin and atorvastatin, on the other hand, inhibited all 51 Candida strains evaluated, presenting MICs ranging from 0.02 to 1 mg/mL and from 0.04 to 5 mg/mL, respectively. Concerning Cryptococcus spp., only four strains were inhibited by pravastatin (MIC=25 mg/mL), while all 25 strains were inhibited by simvastatin (0.06≤MIC≤1 mg/mL) and eight were inhibited by atorvastatin (0.62≤MIC≤2.5 mg/mL) and the remaining 17 were not susceptible to the highest atorvastatin concentration tested (10 mg/mL). The minimum fungicidal concentrations (MFCs) for the tested statins were also determined. The MFC for pravastatin against Candida spp. was determined against 15 strains (3.12≤MIC≤25 mg/mL). The MFC values for simvastatin were determined for 34 strains of Candida spp. (0.03≤MFC≤1 mg/mL), while those for atorvastatin were determined against 16 strains (0.04≤MFC≤0,31 mg/mL). Concerning Cryptococcus spp., the 25 strains tested, MFC values for pravastatin were found against three strains (MFC=50 mg/mL), while those for simvastatin were determined against 21 strains (0.12≤MFC≤1 mg/mL) and those for atorvastatin were determined against one single strain (MFC=1 mg/mL). This in vitro inhibitory activity of statins against Candida spp. and Cryptococcus spp. creates an important perspective for the use of these drugs in vivo in order to control fungal infections.

A incidÃncia de infecÃÃes oportunistas causadas por fungos, com destaque para as leveduras do gÃnero Candida vem aumentando substancialmente. Estudos relatam que tem sido observado um notÃvel crescimento de infecÃÃes por espÃcies nÃo albicans (Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida krusei). Isolados clÃnicos resistentes aos azÃlicos, em especial ao fluconazol, sÃo cada vez mais relatados. As naftoquinonas sÃo uma importante classe de molÃculas biologicamente ativas, apresentando atividades antibacteriana, antifÃngica, antiviral, anti-inflamatÃria, antipirÃtica, anticancerÃgena e tripanocida e tem sido amplamente testadas em vÃrios estudos farmacolÃgicos. Nos Ãltimos anos intensificou-se o interesse nestas substÃncias, nÃo sà devido à sua importÃncia em processos bioquÃmicos vitais, como tambÃm ao destaque cada vez maior que apresentam em variados estudos farmacolÃgicos. O presente trabalho buscou avaliar e comparar o efeito antifÃngico de naftoquinonas frente a cepas de Candida tropicalis resistentes e sensÃveis ao fluconazol, utilizando diferentes tÃcnicas tais como mÃtodos de microdiluiÃÃo em caldo, procedimentos de citometria de fluxo e ensaio do Cometa. Utilizamos sete cepas de Candida tropicalis resistentes ao fluconazol para esse estudo, as quais foram isoladas de sangue e faziam parte da colecÃÃo de leveduras do LaboratÃrio de BioprospecÃÃo Experimental em leveduras (LABEL), afiliado com a Faculdade de FarmÃcia da Universidade Federal do Cearà . Foi utilizado trÃs compostos de naftoquinonas frente à 07 cepas de Candida tropicalis e foram submetidas aos testes de Sensibilidade in vitro , onde apresentaram uma potente atividade antifÃngica. AtravÃs da Citometria de Fluxo, foi possÃvel avaliar alteraÃÃes morfolÃgicas e de integridade da membrana significativas desses compostos frentes Ãs cepas, alÃm de disfunÃÃo mitocondrial e produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio. AtravÃs do ensaio do Cometa foi possÃvel encontrar danos significativos ao DNA. Em sÃntese, os resultados sugerem que estes compostos podem ser usados como agentes antifÃngicos para o tratamento de candidemias / The incidence of opportunistic infections caused by fungi, with emphasis on Candida species has increased substantially. Studies report that there has been a notable increase of infections by non-albicans species (Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida krusei). Clinical isolates resistant to azoles, particularly fluconazole, are increasingly reported. The naphthoquinones are an important class of active molecules biologically presenting antibacterial, antifungal, antiviral, antiinflammatory, antipyretic, anti-cancer and trypanocidal and has been tested extensively in several pharmacological studies. In recent years intensified the interest in in this substances, not only due to your importance in vital biochemical processes as well as the increasing emphasis that they show in various pharmacological studies. This study aimed to evaluate and compare the effect of antifungal naphthoquinones against strains of Candida tropicalis resistant and susceptible to fluconazole, using different techniques such as broth microdilution methods, procedures Flow Cytometry procedures and Comet assay. We use seven strains of Candida tropicalis resistant to fluconazole for this study, which were isolated from blood and were part of the collection of yeasts Experimental Laboratory Bioprospecting in yeast (LABEL), affiliated with the Faculty of Pharmacy, Federal University of CearÃ. We used three compounds of naphthoquinones against the seven strains of Candida tropicalis and were subjected to in vitro sensitivity tests, which showed an antifungal activity potent. Through Flow Cytometry, it was possible to assess morphological changes and membrane integrity of these compounds fronts to significant strains in addition to mitochondrial dysfunction and production of reactive oxygen species. Through the Comet assay was possible to find significant damage to DNA. In summary, the results suggest that these compounds may be used as antifungal agents for the treatment of candidemia

Leprosy household contacts are group at high risk of developing the disease. We investigated the presence M. leprae DNA in nasal mucosa and anti-PGL1 serum IgG/IgM and salivary IgA/IgM antibodies from leprosy household contacts (n=135) in two endemic regions, Ceara, Brazil. Good correlation between serum IgM and IgG isotypes was observed both in MB and in PB leprosy household contacts (r = 0.39, p <0.0001). However, their levels were much different (p <0.0001). Among the contacts positive for serum IgM, 74 (87%) were found to be negative for serum IgG. In respect to the salivary antibodies, PB leprosy household contacts showed correlation between IgA and IgM (r = 0.60, p <0.0001); the same was observed in MB leprosy contacts (r = 0.77, p <0.0001). It was observed that in 75.3% of the leprosy household contacts who were positive to serum anti-PGL1, their salivary antibodies were negative. On the other hand, 50% of the leprosy household contact who were negative to serum anti-PGL1 antibodies, their salivary antibodies were positive. M. leprae DNA was found in nasal swab in 9 MB household leprosy contacts (10.6%) and in 3 PB leprosy contacts (6.0%). We concluded that quantitative analysis of serum and salivary anti-PGL1 in leprosy contacts is necessary for mounting strategies to survey subclinical leprosy infections in order to prevent development of the disease / Os contatos de pacientes com hansenÃase à um grupo de alto risco de desenvolver a doenÃa, logo a precocidade no diagnÃstico à uma importante ferramenta para o controle da enfermidade. NÃs investigamos a presenÃa de DNA de Mycobacterium leprae, atravÃs da ReaÃÃo em Cadeia Polimerase (PCR), na mucosa nasal e anticorpos anti-PGL1 sÃricos, IgG/IgM, e salivares, IgA/IgM, por meio do ensaio imunoenzimÃtico ligado à fase sÃlida (ELISA), em contatos intradomiciliares de pacientes com hansenÃase (n=135) e seus casos Ãndices. O estudo foi realizado em duas cidades endÃmicas para a doenÃa no CearÃ, Crato e MaracanaÃ. Uma boa correlaÃÃo entre os isotipos IgA e IgM salivares e IgG sÃrico foi observada quando comparou-se os contatos intradomiciliares e seus casos Ãndices (p<0,01, p<0,005 e p<0.0001, respectivamente). Entretanto, essa relaÃÃo nÃo foi observada para IgM sÃrico anti-PGL1 (p>0,05). Observou-se alta frequÃncia de IgM sÃrico anti-PGL1 no grupo de contatos negativos para IgG sÃrico anti-PGL1 (71/121, 58,6%). Dentre os contatos positivos para IgG sÃrico anti-PGL1, o nÃvel de anticorpos sÃricos IgM anti-PGL1 tambÃm foi alto (10/14, 71,4%). Em relaÃÃo aos anticorpos salivares, contatos de pacientes com a forma clÃnica PB mostraram boa correlaÃÃo entre IgA e IgM (r = 0.54, p <0.0001); o mesmo foi verificado em contatos de pacientes com a forma clÃnica MB (r = 0.61, p <0.0001). Foi observado que dos contatos positivos para os anticorpos salivares anti-PGL1, 53,3% obtiveram nÃveis de anticorpos sÃricos negativos. Por outro lado, dos contatos que foram negativos para os anticorpos salivares, 71,1% obtiveram nÃveis de anticorpos sÃricos positivos. O DNA de Mycobacterium leprae foi encontrado em swabs nasais de 9 contatos de pacientes portadores da forma clÃnica MB da hansenÃase (10,6%) e em 3 contatos de pacientes portadores da forma clÃnica PB (6.0%). NÃs concluÃmos que anÃlises quantitativas de anticorpos sÃricos e salivares anti-PGL1 em contatos de pacientes com hansenÃase sÃo necessÃrias para montar estratÃgias de levantamento de infecÃÃes subclÃnicas da hansenÃase, a fim de prevenir o desenvolvimento da doenÃa

Universidade Federal do Cearà / A hansenÃase à uma doenÃa crÃnica causada pelo Mycobacterium leprae, que representa um importante problema de saÃde pÃblica mundial, especialmente no estado do CearÃ, Brasil. A incidÃncia nos menores de 15 anos de idade reflete a endemicidade da regiÃo e a dificuldade no seu controle. A doenÃa apresenta um espectro variado de manifestaÃÃes clÃnicas que està relacionado a resposta imune desenvolvida pelo indivÃduo, com as respostas Th1 e Th2 relacionadas com as formas paucibacilar e multibacilar, respectivamente. CÃlulas T regulatÃrias (Tregs) tÃm recebido atenÃÃo especial na literatura e tÃm sido relacionadas com o desenvolvimento de infecÃÃes crÃnicas, entretanto seu papel na hansenÃase nos menores de 15 anos ainda nÃo foi elucidado. Esse trabalho teve por objetivo avaliar a freqÃÃncia das Tregs CD4+CD25+FOXP3high, CD8+CD25+FOXP3high, CD4+CD25highFOXP3+ e CD8+CD25highFOXP3+ em pacientes com hansenÃase e contatos intradomiciliares, ambos menores de 15 anos. CÃlulas mononucelares de sangue perifÃrico foram cultivadas por 72 horas com ativadores (anti-CD3 e anti-CD28) e/ou com M.leprae total sonicado. ApÃs cultura, a frequÃncia das Tregs foi identificada por citometria de fluxo. Observamos maior freqÃÃncia de cÃlulas CD4+CD25+FOXP3high em pacientes do que em contatos,nÃo havendo diferenÃas entre eles com relaÃÃo Ãs outras populaÃÃes avaliadas. Os pacientes multibacilares apresentaram maior freqÃÃncia de cÃlulas CD4+CD25+FOXP3high e CD8+CD25+FOXP3high do que os contatos. Apenas nesses pacientes, as cÃlulas CD4+CD25+FOXP3high foram negativamente correlacionadas com linfÃcitos CD4+ e CD8+ nÃo-regulatÃrios e as cÃlulas CD8+CD25+FOXP3high com linfÃcitos CD4+ nÃo-regulatÃrios. A maior frequÃncia de Tregs com elevada expressÃo de FOXP3 nos menores de 15 anos com hansenÃase multibacilar, bem como sua correlaÃÃo inversa com a frequÃncia de linfÃcitos nÃo regulatÃrios nesses pacientes sugere a participaÃÃo dessas cÃlulas na perpetuaÃÃo da infecÃÃo pelo M. leprae. / Leprosy is a chronic disease caused by Mycobacterium leprae, which represents an important health problem worldwide, especially in CearÃ, Brazil. The incidence in under-15-year-olds reflects the endemicity of the region and the difficulty in its control. The disease presents a wide spectrum of clinical manifestations that reflects the immune response developed, with Th1 and Th2 responses related to the paucibacillary and multibacillary (MB) forms, respectively. Regulatory T cells(Tregs) cells have received special attention in the literature and have been associated with development of chronic infections, however its role in leprosy in children under-15-years-old has not yet been elucidated. This study aimed to evaluate the frequency of CD4+CD25+FOXP3high, CD8+CD25+FOXP3high, CD4+CD25highFOXP3+ and CD8+CD25highFOXP3+ Treg cells in patients with leprosy and household contacts(HHC), both under 15 years. Peripheral blood mononucelares cells were cultured for 72 hours with activators(anti-CD3 and anti-CD28) and/or with M.leprae total sonicated. After culture, Treg cells were identified by flow cytometry. We found a greater frequency of CD4+CD25+FOXP3high cells in patients than in HHC, where there were no differences in the other cell populations evaluated. The multibacillary patients had a higher frequency of CD4+CD25+FOXP3high and CD8+CD25+FOXP3high cells compared to HHC. Only these patients, CD4+CD25+FOXP3high cells were negatively correlated with CD4+ and CD8+ non-Treg lymphocytes , and CD8+CD25+FOXP3high cells with CD4+ non-Treg lymphocytes. The greater frequency of Tregs with high expression of FOXP3 in individuals with multibacillary leprosy under-15-years-old and its inverse correlation with the frequency of non-regulatory lymphocytes in these patients suggests the involvement of these cells in the perpetuation of M. leprae infection.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O papel carcinogÃnico de Helicobacter pylori està relacionado à sua capacidade de promover a inflamaÃÃo e, como conseqÃÃncia, a metilaÃÃo do DNA, caracterÃstica epigenÃtica frequentemente associada à carcinogÃnese gÃstrica. Por sua vez, o processo inflamatÃrio pode ser modulado pela presenÃa de alguns dos polimorfismos presentes em genes de interleucinas, bem como pelo genÃtipo bacteriano. Assim, os objetivos desse estudo foram: a) associar o perfil genotÃpico de virulÃncia de H. pylori (quanto aos genes cagA, cagE, vacA e virB11) e o perfil genotÃpico dos polimorfismos de interleucinas prÃ-inflamatÃrias, IL1&#946; -511 C/T, IL1RN, IL6 -174 G/C e TNF -308 G/A com a metilaÃÃo de promotores gÃnicos de CDKN2A, MLH1 e COX-2; b) verificar a associaÃÃo dos polimorfismos da IL6 -174 G/C e TNF -308 G/A com genÃtipo bacteriano no desenvolvimento do cÃncer gÃstrico, considerando os aspectos clinico-patolÃgicos. Para isso, foi extraÃdo DNA a partir de 125 amostras tumorais, coletadas de pacientes submetidos à gastrectomia em hospitais de Fortaleza â Cearà â Brasil. A genotipagem dos polimorfismos foi feita por PCR-RFLP e a anÃlise de metilaÃÃo, por MS-PCR. Os genes de virulÃncia de H. pylori foram analisados por PCR. Em algumas anÃlises, os genÃtipos bacterianos foram agrupados de acordo com os alelos de vacA e a integridade de cag-PAI. Neste estudo, foi verificado que nos tumores da cÃrdia a metilaÃÃo na regiÃo promotora de COX-2 estava associada ao alelo IL1RN*2 (p= 0,015), e o genÃtipo IL-1B -511 T + IL1RN*2 se mostrou importante para a metilaÃÃo desse gene (p=0,013), principalmente na presenÃa de cepas de H. pylori cagA+ (p=0,026) e vacA s1 (p=0,025). A combinaÃÃo genotÃpica IL6 CC+TNFGG parece estar envolvida na nÃo-metilaÃÃo dos promotores dos genes CDKN2A (p=0,046) e MLH1 (p=0,031), mesmo na presenÃa da infecÃÃo por cepa H. pylori cagA+. Considerando os aspectos clinico-patÃlogicos, uma correlaÃÃo positiva foi encontrada entre o gÃnero masculino e pacientes da faixa etÃria >65 anos (r=0,198; p=0,037), na qual esse gÃnero foi predominante (77,5%; p= 0.022). AlÃm disso, tambÃm foi encontrada correlaÃÃo positiva entre o gÃnero feminino e a faixa etÃria de 55-64 (r=+0,217; p=0,021). Quanto ao subtipo histolÃgico, foi visto que tumores difusos estavam correlacionados a pacientes mais jovens (15-44 anos, r=+0,207; p=0,033), enquanto o subtipo intestinal, a pacientes de mais idade (> 65 anos, r=+0,296; p=0,017). Tumores do subtipo difuso foram correlacionados com o gÃnero feminino e aqueles do subtipo intestinal, com o gÃnero masculino (r=+0,226; p=0,019). Quanto aos polimorfismos de interleucinas, o alelo C do polimorfismo IL6 -174G/C foi correlacionado negativamente com pacientes de menor faixa etÃria (r=â0,193; p=0,041), sendo o que pacientes com genÃtipo CC de IL6 foi associado com a infecÃÃo por cepas virulentas (grupo 1c) (r=+0,225; p=0,017); enquanto que pacientes portadores do genÃtipo heterozigoto IL6 -174 GC, com cepas virulentas (grupo 1c) (r=â0,215; p=0,023) e de menor virulÃncia (grupo 2c) (r=+0,204; p=0,031). Os achados desse estudo contribuem com o estabelecimento de um perfil genotÃpico envolvido na metilaÃÃo de alguns genes, no qual pacientes com genÃtipo mais inflamatÃrio e infectados por cepas de H. pylori mais virulentas estÃo associadas a uma maior taxa de metilaÃÃo de alguns genes envolvidos na carcinogÃnese gÃstrica, podendo tambÃm variar de acordo com a localizaÃÃo e o subtipo do tumor. Esse estudo, portanto, oferece uma contribuiÃÃo relevante no que diz respeito à associaÃÃo da cepa de H. pylori com polimorfismos de interleucinas, no qual cepas de maior virulÃncia parecem estar relacionadas com a infecÃÃo de pacientes com genÃtipos menos inflamatÃrios, sendo o contrÃrio tambÃm verdadeiro. / The carcinogenic role of Helicobacter pylori is related to its ability to promote inflammation and, consequently, DNA methylation, epigenetic trait often associated with gastric carcinogenesis. In turn, the inflammation can be modulated by the presence of polymorphisms in some interleukin genes, as well as the bacterial genotype. The objectives of this study were: a) link the genotypic profile of H. pylori virulence (cagA, cagE, vacA and virB11 genes) and genotypic profile of pro-inflammatory interleukins polymorphisms, IL1&#946; -511 C/T, IL1RN, IL6 -174 G/C and TNF-308 G/A with gene promoter methylation of CDKN2A, MLH1, and COX-2 b) verify the association of polymorphisms of IL6 -174 G/C and TNF -308 G/A with bacterial genotype in the gastric cancer development, considering the clinical and pathological aspects. For this, DNA was extracted from 125 tumor samples, collected from patients who underwent gastrectomy at hospitals in Fortaleza â Cearà â Brazil. Polymorphisms genotyping were identified by PCR-RFLP and methylation analysis by MS-PCR. Virulence genes of H. pylori were analyzed by PCR. In some analyzes, the bacterial genotypes were grouped according to the alleles of vacA and integrity of cag-PAI. In this study, we observed that in cardia tumors the methylation of COX-2 promoter region was associated with IL1RN*2 allele (p=0.015), and genotype IL-1B -511T+IL1RN*2 was important to methylation of this gene (p=0.013), especially in the presence of H. pylori cagA+strains (p=0.020) and vacA s1 (p=0.032). The genotype combination IL6 CC+TNFGG seems to be involved in non-methylation of promoters of genes CDKN2A (p=0.046) and MLH1 (p=0.031), even in the presence of infection by strain H. pylori cagA+. Considering the clinical and pathological aspects, a positive correlation was found between males and patients aged >65 years (r=0.198, p=0.037), in which this gender was predominant (77.5%, p=0.022) . In addition, positive correlation was found between female and patients aged 55-64 years (r=+0.217, p=0.021). Regarding the histologic subtype, we found that diffuse tumors were correlated with younger patients (15-44 years, r=+0.207, p=0.033), while the intestinal subtype, with the older patients (>65 years, r=+ 0.296, p=0.017). Tumors of the diffuse subtype were correlated with female gender and those of the intestinal subtype, with males (r=+0.226, p=0.019). Regarding polymorphisms of interleukins, the C allele of IL6 polymorphism -174G/C was negatively correlated with the younger group (r=-0.193, p=0.041), and the patients with CC genotype of IL6 was associated with infection by virulent strains (group 1c) (r=+0.225, p=0.017), whereas patients with the genotype IL6 -174 GC, with virulent strains (group 1c) (r=-0.215, p=0.023) and less virulent (group 2c) (r=+0.204, p=0.031). Our findings contribute to the establishment of a genotypic profile involved in methylation of some genes in which patients with genotype more inflammatory and infected with strains of H. pylori more virulent are associated with a higher rate of methylation of some genes involved in gastric carcinogenesis and may also vary according to location and tumor subtype. This study thus provides an important contribution with regard to the association of the strain of H. pylori polymorphisms interleukins, in which most virulent strains appear to be related to infection of patients with inflammatory genotypes less, and the converse is also true.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / In recent years there has been a significant increase in the incidence of fungal infections caused by Candida species. Although C. albicans be considered the principal representing of the genus, other species have been gaining prominence. C. tropicalis, for example, has been associated with serious invasive cadidiases, being the first or second type of non-Candida albicans Candida most commonly isolated in humans with candidemia and candiduria and is frequently isolated from healthy animals and animals with candidiasis. To establish infection, C. tropicalis expresses many virulence factors such as the secretion of enzymes phospholipases and proteases, biofilm production, among others. This study aimed to evaluate the in vitro antifungal susceptibility profile and production of virulence factors in strains of C. tropicalis (n=100) isolated from several animal species. The strains were subjected to in vitro susceptibility testing by broth microdilution test, M27-A3 protocol, standardized by the Clinical and Laboratory Standards Institute against amphotericin B, itraconazole and fluconazole. We also evaluated the virulence attributes, such as proteases and phospholipases production and biofilm formation. Regarding the susceptibility of C. tropicalis strains, 38% were resistant to itraconazole, 40% were resistant to fluconazole and 34% were resistant to both azoles. None of the strains were resistant to amphotericin B. Regarding the production of proteases, 84% of the strains secreted these enzymes in the medium with pH 5.0, whereas only 40% of the strains were active at pH 3.5. Only 8% of the strains produced phospholipases. The strains showed different pattern in biofilm production, which 63,2% were strong producers, 17,6% were moderate producers, and 13,3% were weak producers. In sumary, the C. tropicalis strains isolated from animals showed high rate of resistance to azoles and expressed important virulence factors, indicating a potential threat to human and animal health. / Nos Ãltimos anos houve um aumento significativo na incidÃncia de infecÃÃes fÃngicas causadas por leveduras do gÃnero Candida. Apesar de C. albicans ser considerada a principal representante do gÃnero, outras espÃcies vÃm ganhando destaque. C. tropicalis, por exemplo, tem sido associada à cadidÃases invasivas graves, sendo a primeira ou segunda espÃcie de Candida nÃo-albicans mais comumente isolada em candidemia e candidÃria em humanos, alÃm de ser frequentemente isolada da microbiota de animais saudÃveis e com candidÃase. Para estabelecer a infecÃÃo, C. tropicalis expressa diversos fatores de virulÃncia, como a secreÃÃo de enzimas protease e fosfolipase, a produÃÃo de biofilme, dentre outros. O presente trabalho buscou avaliar o perfil de sensibilidade antifÃngica in vitro e produÃÃo de fatores de virulÃncia de cepas de C. tropicalis (n=100) isoladas de diferentes espÃcies animais. As cepas foram submetidas a teste de sensibilidade in vitro por meio do mÃtodo de microdiluiÃÃo em caldo, protocolo M27-A3, padronizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute, frente anfotericina B, itraconazol e fluconazol. Foram avaliados ainda os atributos de virulÃncia: produÃÃo de enzimas proteases e fosfolipases e produÃÃo de biofilme. Quanto ao perfil de sensibilidade das cepas de C. tropicalis, 38% foram resistentes a itraconazol, 40% resistentes a fluconazol e 34% foram resistentes a ambos os derivados azÃlicos. Nenhuma cepa apresentou resistÃncia a anfotericina B. Quanto a produÃÃo de proteases, 84% das cepas secretaram estas enzimas em meio com pH 5,0, enquanto somente 40% das cepas foram ativas em pH 3,5. Somente 8% das cepas produziram fosfolipases. As cepas apresentaram padrÃo diferenciado na produÃÃo de biofilme, em que 63,2% foram consideradas fortes produtoras, 17,6% foram consideradas moderadas produtoras e 13,3% foram consideradas fracas produtoras. Em suma, os isolados de C. tropicalis provenientes de animais apresentaram resistÃncia a derivados azÃlicos e expressaram fatores de virulÃncia importantes, indicando potencial risco à saÃde humana e animal.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo a CiÃncia e Tecnologia / Coccidioidomicose à uma micose sistÃmica que acomete o homem e outros animais domÃsticos e silvestres, causada pelo fungo dimÃrfico geofÃlico Coccidioides posadasii. Nos Ãltimos anos, a melhoria dos mÃtodos de diagnÃstico micolÃgico e o aumento da ocorrÃncia de doenÃas imunossupressoras causaram grande impacto na incidÃncia das micoses profundas e oportunistas no mundo. Apesar da existÃncia de terapias antifÃngicas eficazes contra a coccidioidomicose, a busca por novas drogas para o tratamento desta doenÃa se faz necessÃria. O objetivo desse estudo foi determinar o efeito inibitÃrio, in vitro, e o mecanismo de aÃÃo dos anÃlogos quÃmicos da isoniazida, isolados e em combinaÃÃo com os antifÃngicos anfotericina B (AMB) e itraconazol (ITC), frente a cepas de Coccidioides posadasii (n=12). Para isso 12 cepas de C.posadasii, foram repicadas em Ãgar dextrose batata e utilizadas na realizaÃÃo dos testes de sensibilidade frente ao agente antituberculose isoniazida (INH) e seus anÃlogos quÃmicos. Os ensaios foram conduzidos por meio do teste de macrodiluiÃÃo em caldo ou definiÃÃo da concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) e o sinergismo foi avaliado pelo mÃtodo do tabuleiro. Os anÃlogos quÃmicos inibiram o crescimento de todas as cepas de C. posadasii testadas isoladamente, com valores de CIM para cada composto que variaram de 100 a 400 Âg/mL, para os anÃlogos P3-[Nâ-(1- (4-methoxifeniletilideno) isonicotinohidrazida] P5- [Nâ- (1-m-tolileilidene) isonicotinohidrazida] e P6- [Nâ-(1-(4-metilfenil) etilideno) isonicotinohidrazida], de 25 a 100 Âg/mL para a PACT- Nâ- (1-feniletilideno) isonicotinohidrazida e de 0,0625 a 0,125 Âg/mL para AMB e 0,125 a 0,5 Âg/mL para ITC. Quanto a combinaÃÃo entre as drogas antifÃngicas e os anÃlogos quÃmicos da droga isoniazida, todos foram capazes de inibir o crescimento in vitro das cepas de C. posadasii. Sinergismo foi detectado em 8 combinaÃÃes nÃo sendo observado nenhum antagonismo em nenhuma delas. Os anÃlogos da isoniazida apresentaram valores de CIM de 2, 4, 8, 16, 32 vezes superior à atividade da droga antituberculose padrÃo. A extraÃÃo dos esterÃis e a permeabilidade da membrana fÃngica foram averiguadas, respectivamente, por saponificaÃÃo com aquecimento e por meio da leitura do sobrenadante da suspensÃo fÃngica em comprimento de onda de 260 e 280 nm. Todos os compostos inibiram o crescimento in vitro das cepas de C. posadasii. Foi observado que os anÃlogos da isoniazida isolados e em combinaÃÃo com antifÃngicos foram capazes de causar reduÃÃo do teor de ergosterol celular; apenas os anÃlogos P3 e P6 foram capazes de alterar a permeabilidade da membrana plasmÃtica nas condiÃÃes testadas. Em conclusÃo, os resultados mostram que os anÃlogos derivados da isoniazida possuem atividade inibitÃria frente a C. posadasii

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A Burkholderia pseudomallei à um bacilo Gram-negativo nÃo-fermentador, saprÃfita ambiental capaz de causar melioidose em homens e animais. A doenÃa à considerada endÃmica em diversos paÃses, entre os quais destacam-se TailÃndia e AustrÃlia. Em fevereiro de 2003, ocorreu no Brasil, o primeiro isolamento e identificaÃÃo da bactÃria em quatro crianÃas da localidade de TejuÃuoca, CearÃ. Este trabalho consiste na caracterizaÃÃo fenotÃpica de 3 amostras de B. pseudomallei originÃrias dos pacientes do municÃpio de TejuÃuoca, com o propÃsito de comparar os dados obtidos de tais amostras com os dados da literatura. Foram avaliados: morfologia das colÃnias em diferentes meios de cultivo, assimilaÃÃo de L-arabinose, testes bioquÃmicos manuais e em sistema semi-automatizado API 20NE, teste de sensibilidade antibacteriano e diagnÃstico por PCR, a partir de cultivos bacterianos. Nos resultados obtidos, foi observado o padrÃo morfolÃgico caracterÃstico de B. pseudomallei em Ãgar sangue, chocolate, Ashdown, Mac Conkey, CLED e tripticase soja. As amostras 1 e 3 foram classificadas como mucÃides e a amostra 2 como rugosa. As trÃs amostras apresentaram os padrÃes fenotÃpicos caracterÃsticos de B. pseudomallei tanto nos testes bioquÃmicos manuais: motilidade, crescimento à 42ÂC, oxidase positiva e resistÃncia à polimixina B, como no Kit DiagnÃstico API 20NE. Neste Ãltimo, houve diferenÃa na esculina entre as amostras, o que nÃo interferiu no resultado final de identificaÃÃo, quando a leitura foi realizada com 48h. Todas as trÃs amostras foram incapazes de assimilar o carboidrato L-arabinose, quando testadas em meio sais mÃnimo e API 20NE, caracterÃstica de amostras virulentas de B. pseudomallei e utilizada tambÃm para diferenciar esta espÃcie da B. thailandensis, que à capaz de assimilar este carboidrato. O padrÃo de sensibilidade resultante do TSA em disco difusÃo apresentado pelas trÃs amostras foi o caracterÃstico da espÃcie B. pseudomallei. Os isolados foram resistentes à gentamicina, cefalotina, ciprofloxacina (1 amostra apresentou resistÃncia intermediÃria) e sulfa-trimetoprim; 2 amostras apresentaram sensibilidade intermediÃria à ceftriaxona. Todas as trÃs amostras foram sensÃveis à piperacilina-tazobactam, ticarcilina-Ãcido clavulÃnico, ceftazidima, imipenem, tetraciclina e cloranfenicol. Com o protocolo fenol-clorofÃrmio modificado de extraÃÃo de DNA, a PCR apresentou banda de 718 pb, o que confirmou o diagnÃstico da bactÃria tambÃm por mÃtodo molecular. O estudo confirma a presenÃa da B. pseudomallei em territÃrio brasileiro, com fenotipagem semelhante à descrita na literatura internacional. / Burkholderia pseudomallei is a Gram-negative non-fermentative bacilli, environmental saprophyte able to cause melioidosis on men and animals. The disease is considered endemic in several countries, especially in Thailand and Australia. The bacteria was isolated and identified for the first time in Brazil, february 2003, from four children that lived in a place called TejuÃuoca, CearÃ. This work consists of the phenotypic characterization of 3 strains of B. pseudomallei isolated from the patients from TejuÃuoca. The main aim of this study is to compare the data from these samples with the ones from the literature. It was assessed: the colonies morphology in different culture mediums, assimilation of L-arabinose, manual and semi-automatized biochemical tests in API 20NE, antibacterial sensitivity test and diagnosis by PCR, from bacterial cultures. In the obtained results, it was observed the morphological pattern of B. pseudomallei in blood agar, chocolate, Ashdown, Mac Conkey, CLED and trypticase soy agar. The strains 1 and 3 were classified as mucoid and the strain 2 as wrinkled. The three strains had shown the usual phenotypic patterns of B. pseudomallei as much in biochemical manual tests: motility, growth at 42ÂC, positive oxidase and resistance to polimixin B, as in the API 20NE Diagnosis Kit. In this last one, there was difference in the esculin test among the strains, when the reading was carried out with 48 hours, which did not change on the final identification. All of the three strains were unable to metabolize the carbohydrate L-arabinose, when tested in minimum medium salts and API 20NE, which is a characteristic of virulent strains of B. pseudomallei and is also used to differ this species from B. thailandensis, that is able to use the carbohydrate. The three isolates had shown a poor sensitivity pattern from disk diffusion on TSA, which were resistant to gentamicin, cefalotin, ciprofloxacin (one strain presented intermediate resistance) and sulfa-trimethoprim; two strains presented intermediate sensitivity to ceftriaxone. All of them were sensitive to piperacilin-tazobactam, ticarcilin-clavulanate, ceftazidime, imipenem, tetracycline and chloramphenicol. A modified extraction protocol based on phenol-chloroform was used to obtain DNA and later to test it by PCR, which had shown a 718 bp product, what also confirmed the diagnosis of the organisms by molecular method. The study confirms the presence of B. pseudomallei in Brazil with similar phenotype to that described in the international literature.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Coccidiodomycosis is a systemic infection, predominantly pulmonary, caused by the geophilic and dimorphic fungi, Coccidioides immitis and Coccidioides posadasii. In Brazil, coccidioidomycosis is associated with semi-arid areas in the Northeastern region of this country, which is considered one of the endemic areas of this disease in South America. These pathogens are morphologically indistinguishable species, but they exhibit molecular differences. Different molecular techniques have been described for the characterization of these species. The nuclear ribosomal DNA (rDNA) from Coccidioides spp. has been described as an important molecular marker for the identification, taxonomy and phylogeny. Currently, there are still shortages of maps for epidemiological approaches in order to direct the correlation between populations of Coccidioides spp. and the outbreaks of coccidiomycosis. Given the above, this study aimed at performing the molecular identification of 18 clinical and environmental isolates of C. posadasii, from Northeastern Brazil, maintained in the fungal collection of the Specialized Medical Mycology Center (CEMM), through PCR, as well as, to analyze the genetic diversity of these isolates by sequencing of 18S-28S regions of nuclear rDNA. The identification of the isolates was performed through PCR, using specific primers Coi9-1F and Coi9-R. The sequencing of the 18S-28S rDNA regions was performed through the method of chain termination by dideoxynucleotides, using the kit DYEnamicTM ET terminators cycle sequencing (GE Healthcare). The results confirmed the identification of all strains included in this study as belonging to the species C. posadasii. The phylogenetic tree based on 18S-28S rDNA region of C. posadasii from CEMM and Coccidioides spp. from Genbank. reveals the formation of a unique cluster encompassing the following strains CEMM 05-2-063, CEMM 05-2-064, CEMM 05-2-066 and CEMM 05-2-065, in a properly sustained branch, which apparently seems to group these isolates according to their geographical origin. The strains of C. posadasii showed lower genetic divergence in the ITS1 and ITS2 regions, when compared to strains of C. immitis. Analyses did not detect differences between strains of clinical origin and those of environmental origin. Further studies involving the analysis of fast evolving markers, such as microsatellites, can provide evidences to determine whether the groups found in this study are derived from a lineage of clonal reproduction. / A coccidioidomicose à uma infecÃÃo sistÃmica, predominantemente pulmonar, causada pelos fungos dimÃrficos e geofÃlicos, Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii. No Brasil, a coccidioidomicose està associada a locais situados na zona semi-Ãrida da regiÃo Nordeste, considerada uma das Ãreas endÃmicas da doenÃa na AmÃrica do Sul. Estes patÃgenos consistem em espÃcies morfologicamente indistinguÃveis, mas que exibem diferenÃas moleculares peculiares. O DNA ribossÃmico nuclear (rDNA) de Coccidioides spp. tem sido apontado como importante marcador molecular utilizado na identificaÃÃo, taxonomia e filogenia. Atualmente, ainda hà escassez de mapas de abordagens epidemiolÃgicas para direcionar a correlaÃÃo entre as populaÃÃes de Coccidioides spp. com os surtos de coccidioidomicose. Diante do exposto, este estudo teve por objetivo, realizar a identificaÃÃo molecular de 18 isolados clÃnicos e ambientais de C. posadasii, oriundos do Nordeste brasileiro, mantidos na Micoteca do Centro Especializado em Micologia MÃdica (CEMM), atravÃs da tÃcnica de PCR, bem como, analisar a diversidade genÃtica destes isolados por meio do seqÃenciamento das regiÃes 18S-28S do rDNA nuclear. A identificaÃÃo dos isolados foi realizada por PCR utilizando os primers especÃficos Coi9-1F e Coi9-R. O sequenciamento das regiÃes 18S-28S rDNA foi realizado pelo mÃtodo da terminaÃÃo da cadeia pelo didesoxinucleotÃdeo, usando-se o kit DYEnamicTM ET terminators cycle sequencing (GE Healthcare). Os resultados confirmaram a identificaÃÃo de todas as cepas incluÃdas neste estudo, como pertencentes à espÃcie C. posadasii. A Ãrvore filogenÃtica, baseada na regiÃo 18S-28S rDNA de C. posadasii do CEMM, juntamente com sequÃncias de Coccidioides spp. depositadas no Genbank. revela a formaÃÃo de um cluster exclusivo englobando as cepas CEMM 05-2-063, CEMM 05-2-064, CEMM 05-2-065 e CEMM 05-2-066, em um ramo adequadamente sustentado, que aparentemente parece agrupar estes isolados segundo sua origem geogrÃfica. As cepas de C. posadasii apresentaram menor Ãndice de divergÃncia genÃtica nas regiÃes ITS1 e ITS2, quando comparadas Ãs cepas de C. immitis A anÃlise nÃo detectou diferenÃas entre as cepas de origem clÃnica e as de origem ambiental. Estudos posteriores envolvendo a anÃlise de marcadores de evoluÃÃo mais rÃpida, os microssatÃlites, podem fornecer evidÃncias para determinar se os agrupamentos encontrados neste estudo sÃo resultantes de uma linhagem de reproduÃÃo clonal.