Orientador: Vital Paulino Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T16:59:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcellos_JosePauloCabralde_D.pdf: 988691 bytes, checksum: ed9aef7fcff38c1838bfc4261d1754b0 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

No desenvolvimento de software, a qualidade do produto está diretamente relacionada à qualidade do processo de desenvolvimento. Diante disso, atividades de Verificação, Validação & Teste (VV&T) realizadas por meio de métodos, técnicas e ferramentas são de extrema necessidade para o aumento da produtividade, qualidade e diminuição de custos no desenvolvimento de software. Do mesmo modo, técnicas e critérios contribuem para a produtividade das atividades de teste. Um ponto crucial para o teste de software é sua automatização, tornando as atividades mais confiáveis e diminuindo significativamente os custos de desenvolvimento. Na automatização dos testes, os oráculos são essenciais, representando um mecanismo (programa, processo ou dados) que indica se a saída obtida para um caso de teste está correta. Este trabalho de mestrado utiliza a ideia de mutação para criar implementações alternativas de oráculos de teste e, assim, avaliar a sua qualidade. O teste de mutação se refere à criação de versões do sistema em desenvolvimento com pequenas alterações sintáticas de código. A mutação possui alta eficácia na detecção de defeitos e é bastante flexível na sua aplicação, podendo ser utilizada em diversos tipos de artefatos. Adicionalmente, este trabalho propõe operadores de mutação específicos para oráculos, implementa uma ferramenta de apoio à utilização desses operadores para oráculos e também descreve um estudo empírico dos operadores, destacando benefícios e desafios associados ao seu uso. / In software development, product quality is directly related to the quality of the development process. Therefore, activities of Verification, Validation & Testing (VV&T) performed by methods, techniques and tools are urgently required to increase productivity, quality and cost reduction in software development. Similarly, testing technique and criteria contribute to the productivity of test activities. A crucial point for the software testing automation is making the most reliable activities and significantly reducing development costs. Regarding software testing automation, test oracles are essential, representing an mechanism (program, process or data) to indicate whether the actual output for a given test case is correct. This masters thesis aims to explore concepts of mutation testing to create alternative implementations of the oracle procedure and thus assess their quality. Mutation testing refers to the creation of system development versions with minor syntactic code changes. It has high efficiency on defects detecting and it is very flexible in its application and it is being used in various types of artifacts. This work also proposes specific mutation operators for oracles, implements an useful support tool for using these oracle mutation operators and conducts an empirical study of operators, highlighting benefits and challenges associated with their use.

Um dos pontos fundamentais na atividade de teste de software é o projeto de casos de teste. Diversos critérios de adequação têm sido propostos com o objetivo de fornecer meios que permitam que a avaliação e elaboração de casos de teste sejam feitas de maneira sistemática e fundamentadas teoricamente. Infelizmente, a maioria dos critérios de adequação de casos de teste definidos tem seu uso restrito ao teste de unidade. Para fases posteriores da atividade de teste, em particular para o teste de integração, nota-se a ausência de critérios de adequação, principalmente porque os critérios propostos definem requisitos de teste que se restringem aos limites de uma única unidade, não exercitando de maneira efetiva as interações entre as unidades, que devem ser alvo principal no teste de integração. Com exceção de alguns poucos trabalhos que procuram estender critérios estruturais para o nível interprocedimental, tem-se utilizado nessa fase de teste, quase que exclusivamente, critérios funcionais. Dada essa ausência de critérios e salientando ainda o caráter complementar entre as diferentes técnicas de teste, esta tese apresenta um critério de teste interprocedimental baseado em defeitos chamado de Mutação de Interface. Esse critério busca exercitar as interações entre as unidades através da seleção de casos de teste que distingam mutantes criados pela introdução de defeitos típicos e que, de acordo com um modo definido, caracterizamos erros de integração. Definiu-se um conjunto de operadores de Mutação de Interface que concentram sua aplicação em pontos do programa relacionados com as interações entre as unidades, como, por exemplo, chamadas de subprogramas e seus parâmetros. Dados o alto custo de aplicação, inerente de critérios baseados em mutação, e pelas próprias características do conjunto de operadores de Mutação de Interface, torna-se necessário definirem-se abordagens para reduzir esse custo. Assim, foram estabelecidas maneiras de se parametrizar a aplicação dos operadores de mutação, definindo-se critérios de Mutação de Interface alternativos, estendendo-se abordagem sutilizadas no teste de mutação convencional como mutação restrita. A aplicação de um critério de teste está fortemente condicionada à sua automatização. A definição de um critério de teste sem que pelo menos se apontem soluções para sua automatização tem pouca utilidade prática. Por isso, especificou-se e implementou-se a ferramenta PROTEUM/IM para apoiar a aplicação do critério Mutação de Interface. Essa ferramenta torna-se essencial neste trabalho à medida que permite que estudos empíricos possam ser realizados, avaliando o critério proposto. Dois estudos de caso são apresentados. Esses estudos aplicam o critério Mutação de interface em programas reais e buscam avaliar seu custo e sua eficácia em revelar erros. Estes estudos aplicam ainda critérios alternativos, mostrando que a Mutação de interface é bastante efetiva em revelar erros o de ter custo de aplicação bastante reduzido, quando aplicada de maneira incremental, utilizando-se as parametrizações que os operadores de mutação oferecem. / The project of test cases is one of the most important topics in the software testing activity. Several criteria have been proposed aiming at allowing the evaluation and selection of test cases in a systematic and theoretically well founded way. Unfortunately, the use of most of these criteria is restricted to the unit testing phase. For other testing phases, in particular for integration testing. there is a lack of such criteria, mainly because the existing criteria define test requirements only in the scope of a single unit. They arc not able to effectively exercise the interactions between units, what should be the focus of integration testing. Excepting some few works that extend structural criteria to the interprocedural level, only functional testing has been used at integration testing phase. Given this lack of criteria and the complementary characteristics of different testing techniques, this thesis presents an interprocedural fault based criterion named Interface Mutation. This criterion exercises the interactions between units through the selection of test cases that distinguish mutants created by introducing typical faults that characterize integration errors. A set of Interface Mutation operators was defined. The focus of these operators are the points of the program related to the unit interactions, for instance, subprogram calls and their parameters. Given the high cost associated to mutation testing in general and particularly to the Interface Mutation operators, it is necessary to define some approaches to reduce its application cost. Thus, some parameterizations were defined to the mutation operators, allowing to establish alternative Interface Mutation criteria, extending approaches already used in conventional mutation testing, as random mutation and constrained mutation. The application of any testing criterion strongly depends on its automatization. The definition of a criterion, without pointing out ways to its implementation has little practical utility. So, a tool named PROTEUM/IM was specified and implemented to support the application of Interface Mutation. This tool is an essential point in the present work because it allows the conduction of empirical studies aiming at evaluating the proposed criterion. Two case studies arc presented. In these studies the criterion Interface Mutation is applied to real programs and the cost of its application as well as its errors revealing effectiveness are evaluated. Alternative criteria are also used. Showing that Interface Mutation is very effective to reveal errors and can be applied with a reduced cost if used in an incremental way, taking advantage of the parameterization characteristics provided by the Interface Mutation operators set.

No desenvolvimento de software, a qualidade do produto está diretamente relacionada à qualidade do processo de desenvolvimento. Diante disso, atividades de Verificação, Validação & Teste (VV&T) realizadas por meio de métodos, técnicas e ferramentas são de extrema necessidade para o aumento da produtividade, qualidade e diminuição de custos no desenvolvimento de software. Do mesmo modo, técnicas e critérios contribuem para a produtividade das atividades de teste. Um ponto crucial para o teste de software é sua automatização, tornando as atividades mais confiáveis e diminuindo significativamente os custos de desenvolvimento. Na automatização dos testes, os oráculos são essenciais, representando um mecanismo (programa, processo ou dados) que indica se a saída obtida para um caso de teste está correta. Este trabalho de mestrado utiliza a ideia de mutação para criar implementações alternativas de oráculos de teste e, assim, avaliar a sua qualidade. O teste de mutação se refere à criação de versões do sistema em desenvolvimento com pequenas alterações sintáticas de código. A mutação possui alta eficácia na detecção de defeitos e é bastante flexível na sua aplicação, podendo ser utilizada em diversos tipos de artefatos. Adicionalmente, este trabalho propõe operadores de mutação específicos para oráculos, implementa uma ferramenta de apoio à utilização desses operadores para oráculos e também descreve um estudo empírico dos operadores, destacando benefícios e desafios associados ao seu uso. / In software development, product quality is directly related to the quality of the development process. Therefore, activities of Verification, Validation & Testing (VV&T) performed by methods, techniques and tools are urgently required to increase productivity, quality and cost reduction in software development. Similarly, testing technique and criteria contribute to the productivity of test activities. A crucial point for the software testing automation is making the most reliable activities and significantly reducing development costs. Regarding software testing automation, test oracles are essential, representing an mechanism (program, process or data) to indicate whether the actual output for a given test case is correct. This masters thesis aims to explore concepts of mutation testing to create alternative implementations of the oracle procedure and thus assess their quality. Mutation testing refers to the creation of system development versions with minor syntactic code changes. It has high efficiency on defects detecting and it is very flexible in its application and it is being used in various types of artifacts. This work also proposes specific mutation operators for oracles, implements an useful support tool for using these oracle mutation operators and conducts an empirical study of operators, highlighting benefits and challenges associated with their use.

Um dos pontos fundamentais na atividade de teste de software é o projeto de casos de teste. Diversos critérios de adequação têm sido propostos com o objetivo de fornecer meios que permitam que a avaliação e elaboração de casos de teste sejam feitas de maneira sistemática e fundamentadas teoricamente. Infelizmente, a maioria dos critérios de adequação de casos de teste definidos tem seu uso restrito ao teste de unidade. Para fases posteriores da atividade de teste, em particular para o teste de integração, nota-se a ausência de critérios de adequação, principalmente porque os critérios propostos definem requisitos de teste que se restringem aos limites de uma única unidade, não exercitando de maneira efetiva as interações entre as unidades, que devem ser alvo principal no teste de integração. Com exceção de alguns poucos trabalhos que procuram estender critérios estruturais para o nível interprocedimental, tem-se utilizado nessa fase de teste, quase que exclusivamente, critérios funcionais. Dada essa ausência de critérios e salientando ainda o caráter complementar entre as diferentes técnicas de teste, esta tese apresenta um critério de teste interprocedimental baseado em defeitos chamado de Mutação de Interface. Esse critério busca exercitar as interações entre as unidades através da seleção de casos de teste que distingam mutantes criados pela introdução de defeitos típicos e que, de acordo com um modo definido, caracterizamos erros de integração. Definiu-se um conjunto de operadores de Mutação de Interface que concentram sua aplicação em pontos do programa relacionados com as interações entre as unidades, como, por exemplo, chamadas de subprogramas e seus parâmetros. Dados o alto custo de aplicação, inerente de critérios baseados em mutação, e pelas próprias características do conjunto de operadores de Mutação de Interface, torna-se necessário definirem-se abordagens para reduzir esse custo. Assim, foram estabelecidas maneiras de se parametrizar a aplicação dos operadores de mutação, definindo-se critérios de Mutação de Interface alternativos, estendendo-se abordagem sutilizadas no teste de mutação convencional como mutação restrita. A aplicação de um critério de teste está fortemente condicionada à sua automatização. A definição de um critério de teste sem que pelo menos se apontem soluções para sua automatização tem pouca utilidade prática. Por isso, especificou-se e implementou-se a ferramenta PROTEUM/IM para apoiar a aplicação do critério Mutação de Interface. Essa ferramenta torna-se essencial neste trabalho à medida que permite que estudos empíricos possam ser realizados, avaliando o critério proposto. Dois estudos de caso são apresentados. Esses estudos aplicam o critério Mutação de interface em programas reais e buscam avaliar seu custo e sua eficácia em revelar erros. Estes estudos aplicam ainda critérios alternativos, mostrando que a Mutação de interface é bastante efetiva em revelar erros o de ter custo de aplicação bastante reduzido, quando aplicada de maneira incremental, utilizando-se as parametrizações que os operadores de mutação oferecem. / The project of test cases is one of the most important topics in the software testing activity. Several criteria have been proposed aiming at allowing the evaluation and selection of test cases in a systematic and theoretically well founded way. Unfortunately, the use of most of these criteria is restricted to the unit testing phase. For other testing phases, in particular for integration testing. there is a lack of such criteria, mainly because the existing criteria define test requirements only in the scope of a single unit. They arc not able to effectively exercise the interactions between units, what should be the focus of integration testing. Excepting some few works that extend structural criteria to the interprocedural level, only functional testing has been used at integration testing phase. Given this lack of criteria and the complementary characteristics of different testing techniques, this thesis presents an interprocedural fault based criterion named Interface Mutation. This criterion exercises the interactions between units through the selection of test cases that distinguish mutants created by introducing typical faults that characterize integration errors. A set of Interface Mutation operators was defined. The focus of these operators are the points of the program related to the unit interactions, for instance, subprogram calls and their parameters. Given the high cost associated to mutation testing in general and particularly to the Interface Mutation operators, it is necessary to define some approaches to reduce its application cost. Thus, some parameterizations were defined to the mutation operators, allowing to establish alternative Interface Mutation criteria, extending approaches already used in conventional mutation testing, as random mutation and constrained mutation. The application of any testing criterion strongly depends on its automatization. The definition of a criterion, without pointing out ways to its implementation has little practical utility. So, a tool named PROTEUM/IM was specified and implemented to support the application of Interface Mutation. This tool is an essential point in the present work because it allows the conduction of empirical studies aiming at evaluating the proposed criterion. Two case studies arc presented. In these studies the criterion Interface Mutation is applied to real programs and the cost of its application as well as its errors revealing effectiveness are evaluated. Alternative criteria are also used. Showing that Interface Mutation is very effective to reveal errors and can be applied with a reduced cost if used in an incremental way, taking advantage of the parameterization characteristics provided by the Interface Mutation operators set.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3568_1.pdf: 1259756 bytes, checksum: 154e32efaf8689e0a040b7294e125441 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas / O vírus da hepatite B (HBV) está classificado em oito genótipos, A H, com prevalências distintas em diferentes áreas geográficas. As divergências intergenotípicas foram definidas arbitrariamente como uma variação nucleotídica superior a 8% na seqüência completa do genoma viral. Naturalmente são encontradas variantes das regiões pré-S/S, pré-core/C e P. A mutação na região pré-core, G1896A geralmente é descrita em indivíduos portadores de infecções pelo HBV com ausência de HBeAg (antígeno e do vírus da hepatite B) e replicação viral ativa, apesar da presença de anti HBe. Enquanto, que a detecção das mutações na região basal do promotor core (BCP), A1762T e G1764A, independem do perfil HBeAg/anti-HBe. O objetivo deste estudo foi investigar os genótipos e a presença de mutações pré-core G1896A e BCP A1762T e G1764A no HBV, analisando carga viral, perfil HBeAg/anti-HBe e nível sérico de alanina aminotransferase (ALT) em pacientes portadores de infecções pelo HBV. Foi realizado um estudo transversal descritivo envolvendo pacientes encaminhados pelos Centros de Referências em Hepatites Virais do Estado de Alagoas, Brasil, durante o período de setembro de 2006 a abril de 2008. Foram selecionados 119 pacientes com HBsAg e anti-HBc positivos, entre os quais, 2,5% (3) tinham o diagnóstico de hepatite aguda, 69,7% (83) de portador assintomático e 27,8% (33) de hepatite crônica. As amostras de sangue foram submetidas aos procedimentos de extração e amplificação do genoma viral visando o seqüenciamento parcial do gene S e da região pré-core. O DNA HBV foi detectado em 70,6% (84/119) dos pacientes, e os genótipos foram identificados em 95,2% (80/84). O genótipo A em 92,5% (74/80), seguido do genótipo C em 5,0% (4/80) e 1,25% (1/80) para ambos os genótipos D e F. No genótipo A, a presença de timina/citosina na posição 1858 foi identificada em 50% (13/26) das seqüências analisadas, a mutação G1896A em 3,8% (1/26) e as mutações BCP A1762T e G1764A em 52,4% (11/21). A pesquisa demonstrou que o genótipo A foi predominante em Alagoas, Brasil e a maioria das infecções apresentou carga viral reduzida, concentração sérica normal da ALT e soroconversão do HBeAg para anti-HBe, caracterizando a fase residual da infecção crônica pelo HBV. O estudo também revelou a circulação de mutantes pré-core e BCP do genótipo A. As mutações BCP foram detectadas equitativamente nos portadores assintomáticos e com hepatite crônica, independentemente da carga viral e nível sérico de ALT

Dengue é uma doença viral que atinge vários países, infectando milhares de pessoas anualmente. Sua transmissão ocorre pelo repasto sanguíneo feito pelas fêmeas dos mosquitos Aedes sp. infectadas e seus sintomas tem um amplo espectro de variação, que vão desde quadros assintomáticos até quadros graves com hipovolemia, podendo levar a óbito. A necessidade de adaptação do vírus a sistemas tão distintos (inseto e mamífero) restringe o espectro de variabilidade que o mesmo pode adquirir, permitindo que o vírus se adapte a ambos os hospedeiros com eficiência replicativa semelhante. Estudos com outros flavivírus já mostraram que a aquisição de variabilidade ocorre de maneiras distintas no hospedeiro mamífero e no inseto vetor, permitindo ao vírus máxima adaptação nas células infectadas. Levando em consideração estes estudos, este trabalho investigou a adaptação de duas cepas do vírus da dengue, a ACS-46, não neurovirulenta para camundongos adultos e a cepa JHA, neurovirulenta para camundongos adultos. O estudo foi feito utilizando cultura de células de mosquito (C6/36), cultura de células de mamífero (HepG2) e infecção em cérebro de camundongos neonatos. Utilizando sequenciamento de nova geração, foi possível verificar as mutações adquiridas ao longo de passagens em cada sistema de cultura. Foram realizadas 20 passagens seriadas em célula C6/36 e seis passagens alternadas entre C6/36 e HepG2. Os vírus obtidos na décima sexta e vigésima passagens do modelo seriado e na quarta e sexta passagens do modelo alternado foram completamente sequenciados utilizando a plataforma de sequenciamento em larga escala Ion Torrent. A análise das sequências revelou duas populações virais claramente distintas, já observadas a partir de décima sexta passagem, identificadas através da deleção de dois códons no sítio de glicosilação do domínio I da proteína de Envelope. Essa deleção induziu aumento na fusão do vírus à célula de mosquito, visto que a partir dessa passagem houve aumento no efeito citopático do vírus e na carga viral produzida durante infecções em células de mosquito. Contudo, essa mutação teve um perfil deletério em células humanas, fato deduzido pelo total desaparecimento da população com a deleção durante as passagens alternadas. Além desta deleção, foram detectadas sete mutações não sinônimas em região de proteínas não estruturais com porcentagens muito próximas, sugerindo que as mesmas fazem parte de uma mesma população. A cepa JHA teve seu caráter neurovirulento perdido após 29 passagens em C6/36, porém rapidamente recuperado após uma única passagem em cérebro de camundongo neonato. O sequenciamento dos vírus dessas passagens mostrou certa variabilidade em sítios distintos entre as variantes do vírus parental, vírus não neurovirulento e vírus neurovirulento passado em camundongo. Esse resultado indicou que aparentemente, não há sítios específicos determinantes de neurovirulência em DENV2, ao menos no nosso modelo, mas sim, um conjunto de mutações podem levar ao fenótipo neurovirulento, a depender das condições as quais o vírus é exposto. / Dengue is a viral disease that affects several countries, infecting thousands of people annually. It is transmitted by blood meal of the female Aedes sp mosquitoes infected. Symptoms have a wide range of variation, ranging from asymptomatic to severe symptoms, including hypovolemia and death. The need for adaptation in such distinct systems (insect and mammalian) restricts the variability that the viruses can acquire, allowing them to adapt to both hosts with similar replicative efficiency. Studies performed with other flaviviruses have shown that acquisition of variability occurs differently between the mammalian host and the insect vector, allowing the virus to adaptat in both systems. Therefore, this study investigated the adaptation of two strains of dengue virus, the ACS-46, not neurovirulent for adult mice and JHA strain, which is neurovirulent for adult mice. The study was done using mosquito cells culture (C6/36), mammalian cells (HepG2) and in vivo infection in newborn mouse brain. Using next-generation sequencing, we analyzed the mutations acquired over passages in each culture system. Twenty serial passages were conducted in C6/36 cells and six alternate passages between C6/36 and HepG2. Viruses obtained in the sixteenth and twenty passages from the serial experiment and the fourth and sixth passages from alternate model were completely sequenced using the next generation sequencing platform Ion Torrent. Sequence analysis revealed two clearly distinct viral populations observed from the sixteenth passage identified by deletion of two codons in the glycosylation site in the envelope protein domain I. This deletion led to increased fusion of the virus to mosquito cell, since the cytopathic effect increased from this passage to next as well as the viral load. However, this mutation had a deleterious profile in human cells since the mutated population was vanished during the alternate passages. It was also identified seven non-synonymous mutations in the region of nonstructural proteins with very similar percentages, suggesting that they belong to the same population. JHA strain lost the neurovirulent characteristic after 29 passages in C6/36, but quickly recovered it after a single passage in newborn mouse brain. The sequencing of the virus of these passages showed some variability in different sites among the parental virus, not neurovirulent viruses and neurovirulent virus after the single passage in mice. These data indicated that apparently there is no specific determinants of neurovirulence in DENV2, at least in our model, but rather a set of mutations can lead to neurovirulent phenotype, depending on the conditions in which the virus is exposed.

INTRODUÇÃO: a síndrome de Noonan apresenta herança autossômica dominante e é considerada uma doença relativamente frequente na população, com uma incidência estimada entre 1/1000 e 1/2500 nascidos vivos. Dentre os seus acometimentos destacam-se: dismorfismos faciais, baixa estatura, alterações cardíacas e criptorquia. A síndrome de Noonan é muito confundida com as síndromes Noonan-like devido à sobreposição dos achados clínicos. Estas, mais raras que a síndrome de Noonan, incluem as síndromes de LEOPARD, neurofibromatose-Noonan, cardiofaciocutânea e Costello. Atualmente sabe-se que tanto a síndrome de Noonan como as síndromes Noonan-like envolvem mutações em genes pertencentes à via de sinalização RAS-MAPK. Na síndrome de Noonan, pelo menos quatro genes desta via são responsáveis pelo fenótipo: PTPN11, SOS1, RAF1 e KRAS. Mutações no gene PTPN11, o primeiro gene descrito em associação com a síndrome, são encontradas em aproximadamente 40% dos casos. O segundo gene descrito, o gene KRAS, é responsável por cerca de 2% dos casos que não apresentam mutações no gene PTPN11. Mutações no gene KRAS estão presentes em pacientes com síndrome de Noonan com retardo mental e/ou atraso no desenvolvimento mais acentuados e em pacientes com a síndrome cardiofaciocutânea cujo envolvimento ectodérmico é mais sutil. OBJETIVO: devido à recente associação do gene KRAS com a síndrome de Noonan e outras síndromes Noonan-like é importante: (1) testar a frequência de mutação neste gene em pacientes que apresentam ou não mutações no gene PTPN11 e (2) tentar estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo mais precisa, o que permitirá a realização de um aconselhamento genético mais adequado. MÉTODOS: foram avaliados 95 probandos com síndrome de Noonan e 30 com síndromes Noonan-like. O estudo molecular foi realizado através da reação em cadeia de polimerase, seguida das reações de purificação e sequenciamento bidirecional. RESULTADOS: foram encontradas mutações no gene PTPN11 em 20/46 (43%) pacientes com síndrome de Noonan, duas delas não descritas anteriormente. Relacionando o quadro clínico dos pacientes com síndrome de Noonan deste estudo, com e sem mutação no gene PTPN11, nota-se que os pacientes com mutação apresentam incidência significativamente maior de baixa estatura, de estenose pulmonar valvar e menor frequência de miocardiopatia hipertrófica. Uma mutação no gene KRAS foi encontrada em um paciente com síndrome de Costello, mutação esta ainda não relatada. Alterações gênicas em mais de um gene da via RAS-MAPK foram observadas em dois pacientes, sendo que uma delas em cada paciente não predizia um efeito fenotípico importante. Foram também encontrados três polimorfismos no gene KRAS, porém com mesma frequência no grupo controle. A fim de verificar a influência destes polimorfismos, as principais características da síndrome de Noonan foram relacionadas entre os pacientes com esta síndrome que apresentavam mutação no gene PTPN11 e comparadas quanto à presença ou ausência desses polimorfismos. Nenhuma diferença estatisticamente significante foi encontrada. CONCLUSÃO: Pacientes com síndrome de Noonan e mutações no gene PTPN11 apresentaram uma maior incidência de baixa estatura e de estenose pulmonar valvar e uma menor incidência de miocardiopatia hipertrófica. O gene KRAS, até então relacionado às síndromes de Noonan e cardiofaciocutânea, mostrou-se também responsável pela síndrome de Costello. Tanto as alterações gênicas consideradas não patogênicas como os polimorfismos encontrados no gene KRAS parecem não ter uma grande influência sobre a variabilidade fenotípica na síndrome de Noonan. Contudo, não é possível afastar totalmente que estas alterações apresentem um efeito sutil e que, em conjunto com outras variações genéticas e/ou ambientais, tenham um efeito modulador / INTRODUCTION: Noonan syndrome shows autosomal dominant inheritance, and is a relatively frequent disease in the population, with an estimated incidence between 1/1000 and 1/2500 live births. The main clinical features are: facial dysmorphisms, short stature, cryptorchidism and cardiac abnormalities. The differential diagnosis between Noonan syndrome and Noonan-like syndromes is not always easy, due to the overlap of the their clinicla findings. The Noonan-like syndromes, more rare that the Noonan syndrome, include the LEOPARD syndrome, neurofibromatosis-Noonan, cardiofaciocutaneous and Costello. Currently it is known that Noonan syndrome and Noonan-like syndromes involve mutations in genes belonging to the RAS-MAPK signaling pathway. In Noonan syndrome, at least four genes of this pathway are responsible for the phenotype: PTPN11, SOS1, RAF1 and KRAS. Mutations in PTPN11, the first gene described in association with this syndrome, are found in approximately 40% of cases. The second gene described, the KRAS gene, is responsible for about 2% of the cases that dont have mutations in the PTPN11 gene. Mutations in the KRAS gene are present in patients with Noonan syndrome with mental retardation and/or developmental delay more pronounced and in patients with cardiofaciocutaneous syndrome whose ectodermal involvement is more subtle. OBJECTIVE: Due to the recent association of the KRAS gene with Noonan and Noonan-like syndromes is important: (1) to test the frequency of mutation in this gene in patients with or without mutations in PTPN11 and (2) to estabilish a more precise genotype-phenotype correlation, allowing the realization of a more appropriate genetic counseling. METHODS: 95 probands with Noonan syndrome and 30 with Noonan-like syndromes were evaluated. The molecular analysis was performed by the polymerase chain reaction, followed by purification and bidirectional sequencing. RESULTS: PTPN11 gene mutation was found in 20/46 (43%) patients with Noonan syndrome, two of them not previously described. By correlating the clinical features of patients with Noonan syndrome in this study, with or without mutations in the PTPN11 gene, it was noted that patients with mutations have significantly higher incidence of short stature, pulmonary stenosis and lower incidence of hypertrophic cardiomyopathy. Mutations in KRAS gene were found in two patients a patient with Noonan syndrome ant the other with Costello syndrome. Gene alterations in more than one gene at the RASMAPK patway were observed in two patients, but one of the mutations in each patient didnt predict a significant phenotypic effect. Were also foud three polymorphisms in the KRAS gene, but with the same frequency in the control group. To check the influence of these polymorphisms, the main features of Noonan syndrome were related among patients with this syndrome who had mutations in the PTPN11 gene and compared of the presence or absence of these polymorphisms. No statistically significant difference was found. CONCLUSION: Patients with Noonan syndrome and PTPN11 gene mutation had a higher incidence of short stature and pulmonary valve stenosis and a lower incidence of hypertrophic cardiomyopathy. The KRAS gene, previously related to Noonan and cardiofaciocutaneous syndrome, was also responsible for Costello syndrome. Gene alterations considered as nonpathogenic and polymorphisms found in the KRAS gene seem to have a not great influence on the phenotypic variability in Noonan syndrome. However, it is not possible to completely rule out that these changes have a subtle effect and that, together with other genetic variations and/or environmental factors, may have a modulating effect

Neste trabalho, realizou-se a análise molecular do gene CFTR em indivíduos com e sem características sugestivas de fibrose cística (FC), em diferentes grupos populacionais do Estado do Maranhão e do Pará, com o objetivo de determinar a freqüência das mutações DF508, G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X, consideradas as mais comuns do gene CFTR, e do polimorfismo 4002A/G (localizado no exon 20, o mesmo da mutação W1282X). Em dois isolados afro-brasileiros verificou-se, também, a freqüência da mutação 3120+1GÕA, cuja prevalência está aumentada em populações de origem africana. A freqüência da deleção DF508 foi de 0,8%, enquanto a das mutações G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X foi de 0% entre os 180 indivíduos da população miscigenada do Maranhão. Nessa amostra, a freqüência do polimorfismo 4002A/G foi de 8,3%, tendo sido encontrado tanto em heterozigose (24) quanto em homozigose (03). Entre os 37 indivíduos de origem caucasóide (ascendência portuguesa) do isolado populacional de Santa Flor (Bequimão-MA), DF508 teve uma freqüência de 5,4%. Nenhuma das outras 5 mutações foi identificada nessa amostra. Quanto ao polimorfismo 4002A/G, a freqüência foi de 4,1%, tendo ocorrido apenas em heterozigose. Nenhuma das 6 mutações mais comuns do gene CFTR foi detectada nos remanescentes de quilombos do Pontal (54 indivíduos) e do Cajual (39 indivíduos), assim como a mutação 3120+1GÕA também não foi encontrada entre esses negróides do Maranhão. Já o polimorfismo 4002A/G teve uma freqüência de 23,15% no Pontal e de 9% no Cajual. A comparação das freqüências da mutação DF508 nos 4 grupos (população miscigenada do Maranhão; Santa Flor-Bequimão, MA; Pontal-Bequimão, MA; Cajual-Alcântara, MA) mostra diferenças significativas entre a amostra tri-híbrida e os caucasóides de Santa Flor, e entre estes e os negróides do Pontal. Essa elevada freqüência de DF508 em Santa Flor pode ser explicada pelo princípio do Efeito do Fundador, considerando-se que este isolado populacional é descendente de portugueses. Uma freqüência menor nos indivíduos miscigenados seria devida à contribuição étnica do índio e do negro africano. Considerando-se a origem étnica da população do Maranhão e dos isolados populacionais aqui estudados, não é surpreendente que as mutações G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X não tenham sido identificadas na população normal. Uma possível explicação para a ausência da mutação 3120+1GÕA nos remanescentes de quilombos seria a região africana da qual vieram os negros para o Maranhão. Na amostra de 21 pacientes maranhenses e 19 araenses, (brancos, miscigenados e negros), a reqüência de DF508 foi de 7,1% (sendo um homozigoto e o outro heterozigoto) e 18,4% (dois homozigotos e três heterozigotos), respectivamente, enquanto a das mutações G542X, G551D, N1303K, W1282X e R553X foi de 0%. A ausência dessas mutações nos afetados é compatível com os achados populacionais. A comparação entre os indivíduos maranhenses e os paraenses não mostrou diferença significativa, portanto a freqüência total de DF508 nessa amostra de suspeitos de FC foi de 12,5%. Esta freqüência está diminuída tanto em relação às populações caucasóides (66%), quanto à encontrada até então para os brasileiros com FC (48,8%). As causas disso seriam: a origem étnica dessa amostra; os pacientes com FC estariam sendo subdiagnosticados ou diagnosticados incorretamente como FC. A comparação da freqüência de DF508 entre os grupos normais a da amostra de suspeitos de FC mostra uma semelhança entre esta última e Santa Flor (comunidade descendente de portugueses). Considerase importante, então, a triagem dessa mutação nesses dois grupos para diagnóstico e aconselhamento genético em famílias com afetados. Além disso, apesar da baixa freqüência de DF508 na população miscigenada e na de suspeitos de FC, ela tem importância na triagem de pacientes maranhenses e paraenses, pois os indivíduos que tiveram um diagnóstico mais conclusivo apresentaram a mutação. O polimorfismo 4002A/G foi detectado em todas amostras de indivíduos normais para FC, mas tem freqüência aumentada em Pontal, inclusive quando se compara a freqüência de Pontal (23,1%) com a da Europa (2,9%). Talvez esse polimorfismo seja mais comum em populações negróides. Entre os pacientes maranhenses e paraenses, o polimorfismo 4002A/G teve freqüências respectivas de 2,4% e 5,3%. Como as duas amostras são estatisticamente semelhantes, a freqüência total foi de 3,7%. A análise estatística mostrou que as freqüências do polimorfismo 4002A/G foi semelhante entre todos os grupos analisados, com exceção de Pontal, onde a freqüência dessa variante encontra-se aumentada. A origem étnica e a ausência de FC poderiam explicar esta diferença. Na amostra do Pontal, todos os indivíduos são negros e normais para FC.

Por muitos anos o fluconazol tem sido uma opção usual para tratamento de infecções por Candida. Entretanto, o uso indiscriminado desta terapia antimicótica tem favorecido o surgimento de microrganismos resistentes. A redução da afinidade da enzima alvo dos antifúngicos, 14--demetilase (ERG11p), tem sido descrita como um importante mecanismo de resistência, caracterizado por mutações em seu gene codificante ERG11. Neste estudo, foi investigada a suscetibilidade ao fluconazol de 87 isolados de C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei e C. glabrata, com valores de MIC determinados através do método de microdiluição em caldo M27-A3 (CLSI, 2008); verificou-se que dezessete isolados apresentavam decréscimo da suscetibilidade ao fluconazol. A triagem de mutações foi realizada através da amplificação de quatro regiões do gene ERG11 com primers específicos delineados neste estudo, para cada espécie de Candida, seguida de análise pela técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado. Foram identificadas 217 mutações, incluindo 185 silenciosas e 32 por troca de sentido (que altera o aminoácido resultante). Estas últimas foram observadas em 19 isolados e 17 resíduos distintos, sendo 7 deles ainda não descritos anteriormente: L321F em C. albicans; K53M em C. krusei; Y221F, K344T, V362M e R371S em C. tropicalis; e R398I em C. parapsilosis. Confrontando os resultados entre a técnica de eletroforese SSCP e seqüenciamento automatizado, não houve associação direta entre as mudanças na migração eletroforética e alterações na seqüência nucleotídica do gene ERG11. Sugerimos que a freqüência elevada de alterações no gene ERG11 de Candida deve ser considerada no design de novos fármacos que visem a enzima ERG11p / For many years, fluconazole has been a usual option for treatment of Candida infections. However, the indiscriminate use of antimycotic therapy has favored the emergence of resistant organisms. The decrease in the affinity of the enzyme target of antifungal agents, 14--demethylase (ERG11p), has been described as an important mechanism of resistance, characterized by mutations in its encoding gene ERG11. In this study, we investigated the susceptibility to fluconazole of 87 strains of C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei and C. glabrata with MIC values determined by broth microdilution M27-A3 (CLSI, 2008), found that seventeen isolates showed decreased susceptibility to fluconazole. Mutation screening was performed by the amplification of four regions of the ERG11 gene with specific primers designed in this study for each Candida species, followed by electrophoresis SSCP analysis and sequencing. We identified 217 mutations, including 185 silent mutations and 32 missense mutations. Missense mutations were observed in 19 isolates and 17 distinct residues, 7 of them still not described earlier: L321F in C. albicans, K53M in C. krusei; Y221F, K344T, V362M and R371S in C. tropicalis, and R398I in C. parapsilosis. Comparing the results between SSCP electrophoresis technique and sequencing, there was no direct association between changes in electrophoretic migration and changes in the nucleotide sequence of the ERG11 gene. We suggest that the high frequency of changes in ERG11 gene of Candida should be considered in the design of new drugs targeting the enzyme ERG11p