Os biofilmes constituem uma forma de crescimento que permite a maior sobrevivência e resistência de microrganismos a agentes de controle como antibióticos e desinfetantes. Apesar da grande disponibilidade de agentes antimicrobianos no mercado, há escassez de produtos específicos e efetivos na erradicação/inibição de biofilmes. Existe atualmente grande interesse na seleção de moléculas capazes de inibir o crescimento dos biofilmes ou removê-los quando já estabelecidos. Doenças como fibrose cística (P. aeruginosa) e cárie dentária (S. mutans), são patologias intrinsecamente ligadas à formação de biofilmes. O principal objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de chalconas sintéticas e derivados no controle e erradicação de biofilmes. As chalconas foram testadas quanto à capacidade de inibir a formação de biofilme e de remover biofilmes pré-estabelecidos. Os biofilmes de P. aeruginosa foram inibidos pela presença da molécula (E)-1-(3-hidroxinaftalen-2-il)-3-fenilprop-2-em-1-ona (11), mostrando redução de 48,8% na biomassa e 60,2% na viabilidade. A redução máxima na biomassa atingiu 70,9%. Já para o tratamento de biofilmes pré-estabelecidos, a molécula (1E,4E)-1,5-difenilpenta-1,4-dien-3-ona (10) mostrou redução de 53,5% na biomassa do biofilme de P. aeruginosa. Na formação do biofilme de S. mutans, a presença da molécula (1E, 4E)-1,5-bis(4-bromofenil)penta-1,4-dien-3-ona (15) reduziu a biomassa em 67,4%. Em concentrações elevadas essa redução chegou a 95,1%. Em biofilmes pré-estabelecidos de S. mutans, o tratamento com a molécula (2E,4E)-1,5-difenilpenta-2,4-dien-1-ona (12) reduziu a biomassa celular em 62,7%, e a viabilidade celular em 58,4%. Já a molécula (E)-3-(2-hidroxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona (21), quando utilizada no tratamento de biofilmes pré-estabelecidos, mostrou redução de 26,4% na biomassa e 91,6% na viabilidade de S. mutans; além de evidenciar danos à estrutura celular do microrganismo. Todas as moléculas supracitadas promoveram redução na espessura dos biofilmes. Os antibióticos ampicilina e polimixina foram menos eficientes na remoção de biofilmes comparativamente às moléculas testadas. As moléculas não apresentaram CIM frente às bactérias, entretanto, afetaram a viabilidade celular. O tratamento da superfície de poliestireno com as chalconas não impediu a adesão das bactérias, e resultou na redução da hidrofobicidade do material. A superfície celular de S. mutans apresentou predomínio de cargas negativas e forte caráter hidrofóbico enquanto que P. aeruginosa apresentou baixa hidrofobicidade além de caráter básico. Os resultados evidenciam a potencialidade do uso das chalconas e seus derivados para o controle e erradicação de biofilmes Streptococcus mutans e Pseudomonas aeruginosa. / Biofilms constitute a growth mode which allows greatest survival and resistance of microorganisms to antibiotics and disinfectants. Despite the wide availability of antimicrobial agents in the market, there are few specific and effective products to the eradication / inhibition of biofilms. Thus, there is a great interest in the search of molecules able to inhibit biofilms or remove them once established. Diseases such as cystic fibrosis (P. aeruginosa) and dental caries (S. mutans), are intrinsically linked to the formation of biofilms. The aim of this study was to evaluate the potential of chalcones and their synthetic derivatives to the control and eradication of biofilms. The chalcones were tested for the ability to inhibit biofilm formation and also to remove pre-established biofilms. Biofilms of P. aeruginosa was inhibited by the presence of the molecule (E) -1- (3-hydroxynaphthalen-2-yl) -3-phenylprop-2-en-1-one (11) showing reduction of 48.8% biomass and 60.2% viability. The maximum reduction in biomass reached 70.9%. For the treatment of pre-established biofilms, the molecule (1E, 4E) -1,5-difenilpenta-1,4-dien-3-one (10) showed a 53.5% reduction in biomass of P. aeruginosa biofilm. Biofilms of S. mutans, growing in the the presence of the molecule (1E, 4E) -1,5-bis (4-bromophenyl) penta-1,4-dien-3-one (15) showed a biomass reduction of 67.4 %. At higher concentrations this reduction reached 95.1%. In pre-established biofilms of S. mutans, treatment with the molecule (2E, 4E) -1,5-difenilpenta-2,4-dien-1-one (12) reduced cell biomass in 62.7%, and cell viability by 58.4%. The molecule (E) -3- (2-hydroxyphenyl) -1-phenylprop-2-en-1-one (21), when used in the treatment of pre-established biofilms, showed 26.4% reduction in biomass and 91.6% in the viability of S. mutans; furthermore, the chalcone 21 caused damage to the cellular structure of the microorganism. All the aforementioned molecules promoted a reduction in the thickness of biofilms. The antibiotics polymyxin and ampicillin were less efficient on removing biofilms comparatively to the chalcones. The molecules affected cell viability however, no MIC was observed under the range of concentrations evaluated. The treatment of the polystyrene surface with chalcones did not prevent bacterial adhesion moreover, hydrophobicity of the material was reduced. S. mutans cell surface showed a predominance of negative charges and strong hydrophobic character while P. aeruginosa showed low hydrophobicity and basic character. The results demonstrate that synthetic chalcones and derivatives are potential candidates to the control and eradication of Streptococcus mutans and Pseudomonas aeruginosa biofilms.

O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) com a utilização de azul de metileno a 0,01%, combinado ao laser de diodo, na viabilidade e na produção de polissacarídeos, de biofilmes de S. mutans. Biofilmes de cepas de S. mutans UA159 foram cultivados em discos de resina acrílica e expostos oito vezes por dia, durante 1 min, à solução de sacarose a 10%. Após 48 horas da formação do biofilme, as amostras foram distribuídas aleatoriamente em relação aos tratamentos (n=4): aplicação de solução salina a 0,9% (controle negativo), aplicação de 0,12% de digluconato de clorexidina (controle positivo), ou aplicação da terapia fotodinâmica antimicrobiana. Para aplicação da terapia fotodinâmica antimicrobiana, foi utilizado azul de metileno a 0,01%, combinado ao laser de diodo com comprimento de onda de 660 nm. Foram usados os seguintes parâmetros: área da secção transversal do feixe de laser 0,028 cm&sup2;, potência de 100 mW, energia de 9J, densidade de energia de 320J/cm&sup2;, durante 90s. Os tratamentos foram realizados duas vezes ao dia. Após 120 h, os biofilmes de S. mutans formados sobre cada disco de resina acrílica foram coletados, de modo a determinar o número de bactérias viáveis e a concentração do polissacarídeo extracelular insolúvel (PECI) e do polissacarídeo intracelular (PIC). A análise variância um critério (ANOVA) e o teste de Tukey revelaram que as contagens das bactérias nos biofilmes formados foram significativamente diferentes entre os tratamentos. A aPDT mostrou inibição do crescimento do biofilme, quando comparado ao grupo do NaCl (p<0,05). A concentração de PECI e PIC foi maior no biofilme exposto ao NaCl do que a encontrada nos outros grupos (p<0,05) e não foi observada diferença significativa entre os grupos digluconato de clorexidina e aPDT (p>0,05). De acordo com as condições experimentais do presente estudo, sugere-se que o tratamento realizado duas vezes ao dia com aPDT utilizando-se azul de metileno a 0,01%, combinado ao laser de diodo (&lambda; = 660 nm; 320 J/cm&sup2;; 100 mW; 90s; 9J), diminui a viabilidade do biofilme e afeta sua organização estrutural. / The aim of this study was to evaluate the effect of Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) using methylene blue 0.01% combined with diode laser on biofilm viability and polysaccharides produced by Streptococcus mutans. S. mutans UA 159 biofilms were grown on acrylic resin discs and exposed eight times/day for 1 min in a 10% sucrose solution. After the biofilms were allowed to grow for 48 h, they were treated two times/day according to the treatments (n=4): 0.9% saline solution (negative control), 0.12% chlorhexidine digluconato (positive control) or Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT). For the application of Antimicrobial Photodynamic Therapy has been used methylene blue 0.01% in combination with the diode laser with 660 nm wavelength. The parameters adopted were: spot size of 0.028 cm&sup2;, fixed output power of 100 mW, energy density of 320 J/cm&sup2;, time exposure of 90 s and energy of 9 J. Treatments were performed twice daily. After 120 h of growth, the biofilm formed on each disc was collected to determine the number of viable bacteria, and concentration of the insoluble exopolysaccharide (IEPS) and intracellular polysaccharide (IPS). The analysis of variance one-way (ANOVA) and Tukey test revealed that the counts of bacteria in the biofilms formed differ significantly among the treatments and aPDT showed biofilm inhibition when compared to NaCl group (p<0.05). The concentration of IEPS and IPS was higher in biofilm exposed to NaCl than that found in the other groups (p<0.05) and no significant difference was observed among CHX and aPDT groups (p>0.05). According to experimental conditions of the present work, the results suggest that a twice-daily treatment with aPDT using methylene blue 0.01% in combination with the diode laser (&lambda;=660 nm, 320 J/cm&sup2;, 100 mW, 90 s; 9J) decreases biofilm viability and affects its structural organization.

Streptococcus mutans é considerado o principal agente etiológico da cárie dental humana, uma doença crônica e de caráter infeccioso. A doença apresenta uma ampla incidência e é considerada um importante problema de saúde pública mundial. A adesão inicial de S. mutans à superfície dental é dependente da interação da proteína de superfície P1 e a aglutinina salivar adsorvida ao dente. Sendo assim, a proteína P1 e seus fragmentos são considerados importantes alvos em novas estratégias vacinais contra a cárie dental. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar estratégias vacinais de mucosa contra S. mutans, em que empregamos como antígeno modelo a proteína P139-512, um fragmento N-terminal derivado da proteína P1. Para esse fim, empregamos esporos não recombinantes de Bacillus subtilis e um mutante atóxico da toxina termo-lábil (LTK63) de Escherichia coli enterotoxigência (ETEC) como adjuvantes vacinais. A proteína P139-512 foi obtida por meio de sistema de expressão baseado em linhagem recombinante de B. subtilis. As formulações vacinais foram baseadas na coadministração da proteína P139-512 com os esporos e/ou LTK63 pela via sublingual. Os resultados obtidos demostraram as propriedades imunomoduladoras dos dois adjuvantes sobre as respostas de anticorpos. No entanto, o adjuvante LTK63 foi capaz de induzir maiores títulos de anticorpos antígeno-específicos e desencadear respostas de mucosa com a indução de anticorpos IgA secretores (S-IgA) em amostras de saliva. Além disso, a formulação com esse adjuvante induziu repostas de anticorpos mais eficientes na capacidade de reconhecer a proteína P1 nativa, expressa na superfície de linhagens de S. mutans. A estratégia utilizando os dois adjuvantes não foi capaz de aumentar a magnitude das respostas de anticorpos sistêmicos e de S-IgA quando comparada à administração da P139-512 + LTK63. Em conclusão, os resultados abrem perspectivas para o desenvolvimento de estratégias vacinais de mucosa direcionadas para o controle da cárie dental baseadas na coadministração de antígenos de S. mutans com o adjuvante LTK63. / Streptococcus mutans is considered the major etiological agent of human dental caries, a chronic and infectious disease. The disease has a broad incidence and is considered an important worldwide public health problem. The initial adhesion of S. mutans to the tooth surface depends on the interaction of the surface-exposed P1 protein and the salivary agglutinin adsorbed to the tooth. Therefore, the P1 protein and fragments derived from it are considered important targets in vaccine strategies to prevent dental caries. The present work aimed to develop and characterize new mucosal vaccine strategies against S. mutans, using as antigen model the protein P139-512, a N-terminal fragment derived from the P1 protein. For this purpose, we used non-recombinant Bacillus subtilis spores and a non-toxic mutant of the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) heat-labile toxin (LTK63) as vaccine adjuvants. The P139-512 protein was obtained using a recombinant B. subtilis strain. Vaccine formulations were based on the co-administration of the P139-512 protein with spores and/or LTK63 via sublingual route. The results demonstrated that both adjuvants showed immunomodulatory properties on antibody responses. However, the LTK63 adjuvant was capable to induce the highest antigen-specific antibody titers and elicited mucosal responses with the induction of secretory IgA (S-IgA) antibodies in saliva samples. In addition, the formulation using this adjuvant induced enhanced responses mediated by effector antibodies capable to recognize the native P1 protein expressed on the surface of S. mutans strains. The combination of both adjuvants did not increase the magnitude of systemic antibody and S-IgA responses when compared to the administration of P139-512 + LTK63. In conclusion, the results open perspectives for the development of vaccination strategies for the control of dental caries based on the co-administration of S. mutans antigens and LTK63.

A quitosana é um produto natural que apresenta propriedades antimicrobianas ainda não totalmente elucidadas, principalmente em biofilmes cariogênicos. Em acréscimo, tem sido sugerido que a forma de apresentação da molécula pode alterar seus efeitos biológicos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da dispersão e de micropartículas de quitosana em células planctônicas e em biofilmes de Streptococcus mutans. Dispersões de quitosana de médio peso molecular foram preparadas em ácido acético 0,1 M e caracterizadas parcialmente quanto ao seu perfil de textura (consistência, coesividade e adesividade) a 25 ºC e 37 °C. As micropartículas de quitosana foram preparadas por secagem da dispersão 2 % em spray dryer e caracterizadas quanto ao seu tamanho, potencial zeta, morfologia externa e teor de umidade. A atividade em células planctônicas de ambas as formas foi avaliada pela concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) (n=3). Em seguida, as duas formas de quitosana foram avaliadas quanto ao seu efeito em biofilmes de 5 dias de S. mutans, os quais foram formados em lamínulas de vidro utilizando-se banhos de sacarose 8x/dia. No terceiro dia de formação, os biofilmes foram expostos por 1 minuto à dispersão ou suspensão de micropartículas de quitosana a 0,25 % e a 1 % (n=4). Clorexidina e solução salina foram utilizados como controles positivo e negativo, respectivamente. Solução de etanol em tampão fosfato foi utilizado como controle de veículo no experimento com as micropartículas. A viabilidade celular e a acidogenicidade dos biofilmes foram determinadas. Após análise estatística, os resultados mostraram que o perfil de textura da dispersão não foi influenciado pela temperatura da análise; a coesividade e a adesividade da dispersão foram diretamente proporcionais à concentração. As micropartículas apresentaram pequena distribuição de tamanho e potencial zeta positivo. Os valores de CIM da dispersão e das micropartículas de quitosana foram de 0,00052 % e 0,00131 %, respectivamente. A CBM apresentou o mesmo valor que a CIM para ambas as formas de quitosana. A dispersão de quitosana apresentou menor efeito na acidogenicidade dos biofilmes se comparadas às micropartículas, principalmente na concentração de 1 %. Após o tratamento com a dispersão, a viabilidade dos biofilmes diminuiu de forma concentração dependente. Já as micropartículas a 0,25 % não apresentaram ação antimicrobiana em relação ao controle, mas o efeito das micropartículas a 1% foi superior ao da dispersão na mesma concentração. Embora ambas as formas de apresentação de quitosana tenham apresentado efeitos sobre células livres e biofilmes de S. mutans, os resultados sugerem que as micropartículas a 1% podem alterar significativamente a viabilidade e a acidogenicidade de biofilmes cariogênicos, podendo ser consideradas para futuras aplicações na Odontologia / Chitosan is a natural product with antimicrobial property not fully elucidated, especially on cariogenic biofilms. Furthermore, the physical form of chitosan is suggested to influence its biological effects. The aim of the study is to evaluate the effect of chitosan in the form of dispersion and microparticles against Streptococcus mutans planktonic cells and biofilms. Chitosan medium molecular weight dispersions (0.25 % and 1 %) were prepared in 0.1 M acetic acid and partially characterized by its texture profile (consistency, cohesiveness and adhesiveness) at 25 °C and 37 °C. Microparticles were prepared by spray drying 2 % dispersion and partially characterized by particle size, zeta potential, external morphology and moisture content. Antimicrobial activity of both forms was evaluated on planktonic cells by the determination of minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). Then, activity of both forms was evaluated on S. mutans biofilms grown for 5 days, formed on glass slides and exposed to sucrose 8x/day. On the third day of formation, biofilms were exposed for 1 min to 0.25 % and 1 % chitosan dispersions or microparticles suspension (n=4). Chlorhexidine and saline solution were used as positive and negative controls, respectively. Ethanol solution in phosphate buffer was used as vehicle control in microparticles assay. Biofilm cellular viability and acidogenicity were determined. After statistical analysis, results showed that dispersion texture was not influenced by temperature; cohesiveness and adhesiveness were directly proportional to concentration. Microparticles were spherical, with narrow size distribution and high positive zeta potential. On the antimicrobial activity evaluation, dispersion and microparticles MICs were 0.00052 % and 0.00131 %, respectively. MBC values were equal to MIC for both forms. Chitosan dispersion had lower effect on biofilm acidogenicity compared to microparticles, especially at 1 % concentration. Dispersion treatment reduced biofilm viability in concentration- dependent form. Microparticles at 0.25 % did not have antimicrobial action; in contrast to microparticles at 1 %, viability decreased more than the dispersion at same concentration. Despite both forms having effect on S. mutans planktonic cells and biofilms, results suggest that 1 % microparticles could significantly change cariogenic biofilm cellular viability and acidogenicity, so it could be considered for future applications in Dentistry

Este estudo teve por objetivos (1) estudar os efeitos de diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de células planctônicas e biofilme de S. mutans UA159, (2) verificar a viabilidade de uso de um modelo para crescimento de biofilme bacteriano no estudo do processo de desmineralização, (3) avaliar a capacidade da terapia fotodinâmica em controlar o processo de desmineralização mediado por biofilme de S. mutans crescidos sobre discos de dentina bovina e (4) mensurar a capacidade da terapia fotodinâmica em promover estresse celular a S. mutans UA159 com deleção do gene VicK. Os procedimentos de terapia fotodinâmica foram realizados pela associação do fotossensibilizador Photogem® e de um LED vermelho visível (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) como fonte de luz. A viabilidade de células bacterianas foi determinada por dois métodos distintos: teste de atividade metabólica pelo uso da resazurina (etapa 1) e contagem de UFC (etapas 1,2 e 3). Microrradiografia transversal e análise da concentração de cálcio por espectrometria de absorção atômica foram os métodos de escolha para a determinação do perfil do conteúdo mineral (%vol), perda mineral integrada (PMI, %vol x m), profundidade de lesão (PL, m) e concentração de cálcio liberado em meio de cultura (mg/dL). A intensidade de fluorescência emitida pela modulação da proteína GFP após ensaio de estresse celular foi determinada por citometria de fluxo. Os diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica foram capazes de reduzir a viabilidade de células planctônicas de S. mutans, bem como das células organizadas em biofilme (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05), sendo o resultado dose-dependente. Quando Photogem® a 0,25 mg/mL foi associado ao LED a 150 J/cm2, uma redução de aproximadamente 3,9 log10 na contagem de células viáveis provenientes de biofilme foi observada. O modelo para crescimento de biofilme permitu a progressão do processo de desmineralização (24 h PMI: 1905±391 vol% x m, PL: 69,9±12,2 m; 48 h - PMI: 3529±886 vol% x m, PL: 114,2±24,6 m; 72 h - PMI: 4186±1099 vol% x m, PL: 146,1±20,1 m) em função do tempo. As associações de Photogem® 0,25 mg/mL + LED 75 J/cm2 e Photogem® 0,25 mg/mL + LED 150 J/cm2 foram capazes de controlar por 24 h a perda mineral integrada, a profundidade de lesão e a concentração de cálcio liberada em relação ao grupo controle (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Os diferentes tipos de tratamento utilizados no ensaio de estresse celular (H2O2 a 0,0025%, H2O2 a 0,005%, Photogem® a 0,00625%, Photogem® a 0,0125%, LED 4,5 J/cm2, Photogem® a 0,00625% + LED 4,5 J/cm2 e Photogem® a 0,0125% + LED 4,5 J/cm2) produziram aumento significativo da fluorescência captada pela citometria de fluxo em relação ao grupo controle (água deionizada) (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Entretanto, diferenças significativas não foram notadas entre os grupos de tratamento. Portanto, a terapia fotodinâmica foi capaz de reduzir a viabilidade de células planctônicas e células organizadas em biofilme (S. mutans UA159), bem como controlar o processo de desmineralização mediado por bactéria durante 24 h. Além disso, pelo modelo utilizado, a terapia fotodinâmica pode ser capaz de modular estresse celular comparável àquele obtido com a utilização do peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações. / The present study aimed (1) to assess the effects of different parameters of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) on the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, (2) to test the effectiveness of a biofilm model in evaluating the demineralization process, (3) to assess the influence of PACT on the control of demineralization process mediated by S. mutans biofilm growth on dentin discs, and (4) to measure the ability of PACT in promoting cellular stress on S. mutans UA159 knockout vicK gene. PACT procedures were performed by association between a photosensitizer (Photogem®) and a visible red LED (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) as light source. Viability of bacterial cells was determined by two distinct methods: resazurin assay (phase 1) and Colony Forming Unit (CFU) counts (phases 1, 2, and 3). Transversal microradiography and calcium release analysis by atomic absorption spectrometry were chosen to analyze mineral content profile (%vol), integrated mineral loss (IML, %vol x m), lesion depth (LD, m), and concentration of calcium release in culture media (mg/dL). Fluorescence intensity levels, which were modulated by expression of Green Fluorescent Protein-reporter (GFP) after cellular stress, were measured by flow cytometer. A dose-dependent effect on the reduction of viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans was observed after application of different parameters of PACT (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED decreased in nearly 3.9 log10 the viability of S. mutans biofilm. Progression of demineralization process was correlated with the time (24 h IML: 1905±391 vol% x m, LD: 69.9±12,2 m; 48 h - IML: 3529±886 vol% x m, LD: 114.2±24.6 m; 72 h - IML: 4186±1099 vol% x m, LD: 146.1±20.1 m). Integrated mineral loss, lesion depth and concentration of calcium release were controlled for 24 h by the following associations: 0.25 mg/mL Photogem® plus 75 J/cm2 LED, and 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED, in comparison to control group (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). Different treatments (0.0025% H2O2, 0.005% H2O2, 0.00625% Photogem®, 0.0125% Photogem®, 4.5 J/cm2 LED, 0.00625% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED, and 0.0125% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED) increased significantly the fluorescence levels emitted by S. mutans, when compared with levels of the control group (demi water) (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). However, significant statistical differences were not observed among treatment groups. Therefore, PACT was able to decrease the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, as well as controlling the demineralization process mediated by bacteria for 24 h. Moreover, according to present methods, PACT may modulate cellular stress similar to hydrogen peroxide.

Saliva e Streptococcus mutans foram utilizados neste estudo para avaliar a atividade antimicrobiana da quitosana associada à clorexidina. Os testes de atividade antimicrobiana foram realizados utilizando-se soluções de quitosana e quitosana:clorexidina preparadas em ácido acético 1%, em diversos valores de pH (3,5-5,0) e valores de concentração variando entre 0,1 e 1,5% (m/v). Antes de cada experimento o pH da solução estoque de quitosana (grau de desacetilação 76% e massa molar 400.000 g/mol) foi ajustado até o pH desejado pela adição de NaOH. A atividade antimicrobiana aumentou com o pH, com a concentração, com o tempo de exposição e com a associação quitosana/ clorexidina. Aumentando-se a concentração de clorexidina não se observam efeitos significativos, indicando que em presença de quitosana é possível liberar este composto em concentrações menores, o que irá minimizar os efeitos colaterais indesejados de pigmentação e sensação de alteração de sabor / Saliva and Streptococcus mutans were used to evaluate antimicrobial activity of chitosan/chlorexidine solutions. Antimicrobial tests were conducted using chitosan and chitosan/ chlorexidine solutions in 1.0 % acetic acid solution, at various pH values (3.5-5.0) and concentrations ranging from 0.1 to 1.5% (w/v). Prior to each experiment, chitosan (DA 76%, 400.000 g/mol) stock solution pH was adjusted to the desired pH using NaOH. The antimicrobial activity increased with pH, concentration, exposition time and with the association of chitosan and chlorexidine. Increasing the concentration of chlorexidine did not have a significant effect indicating that in presence of chitosan it is possible to deliver this compound at a lower concentration which will avoid unwanted side effects including staining and altered taste sensations

O objetivo desse trabalho foi avaliar, in vitro, a influência da contaminação com Streptococcus mutans e da desinfecção com solução de digluconato de clorexidina 2% na adesão de dois sistemas adesivos (um sistema adesivo com condicionamento ácido prévio e um sistema adesivo autocondicionante) à dentina de molares humanos. Para o estudo, foram utilizados 80 terceiros molares humanos hígidos, com a face oclusal lixada até a exposição de uma superfície plana de dentina. Os dentes foram divididos aleatoriamente em 8 grupos (n=10) de acordo com o sistema adesivo utilizado e tratamento superficial realizado: G1 ? Controle Single Bond 2 (SB); G2 ? Controle Clearfil SE Bond (SE); G3 ? Desinfecção com clorexidina SB; G4 ? Desinfecção com clorexidina SE; G5 ? Contaminação com Streptococcus mutans SB; G6 ? Contaminação com Streptococcus mutans SE; G7 ? Contaminação com Streptococcus mutans e desinfecção com clorexidina SB e G8 ? Contaminação com Streptococcus mutans e desinfecção com clorexidina SE. Corpos de prova em resina composta foram confeccionados nas superfícies tratadas e os dentes foram armazenados em água destilada à 37ºC por 24 horas. As amostras foram seccionadas verticalmente obtendo-se espécimes com área de secção transversal de aproximadamente 0,8mm2, que foram tracionados a velocidade de 0,5mm/min em máquina de ensaios universal. Cinco espécimes de cada grupo tiveram a interface adesiva analisada em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os resultados de resistência de união foram analisados usando os testes estatísticos ANOVA e Tukey (p<0,05). Os modos de fraturas foram avaliados por meio de lupa esteroscópica (25X). Discos de dentina foram obtidos de 6 dentes adicionais, para observação em MEV das superfícies submetidos aos mesmos tratamentos realizados para o teste de microtração. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos controles (G1 = 31,52 ± 6,24 e G2 = 42,88 ± 2,31), o tratados com clorexidina (G3 = 34,41 ± 6,92 e G4 = 40,14 ± 2,91) e os grupos que foram submetidos à contaminação com Streptococcus mutans e descontaminação com clorexidina (G7 = 31,12 ± 5,31 e G8 = 39,09 ± 3,86). Os grupos submetidos à contaminação com Streptococcus mutans que não foram descontaminados antes da aplicação dos sistemas adesivos tiveram resultados significantemente menores que os grupos estéreis e descontaminados (G5 = 23,61 ± 7,13 e G6 = 33,15 ± 3,35). O sistema adesivo Clearfil SE Bond apresentou valores de resistência de união significantemente maiores que o sistema adesivo Single Bond 2, independente do tratamento da superficial dentina. Pôde-se concluir que a contaminação in vitro com Streptococcus mutans comprometeu a adesão dos dois sistemas adesivos e a solução de digluconato de clorexidina 2% foi capaz de eliminar a contaminação, restabelecendo os valores de resistência de união obtidos com o substrato estéril. / The purpose of this study was to evaluate, in vitro, the influence of Streptococcus mutans contamination and 2% chlorhexidine digluconate disinfection on the bond strength of two adhesive systems (an etch-and-rinse system and a self-etch system) to human dentin molars. Flat dentinal surfaces were prepared in 80 extracted human third molars. Teeth were randomly divided into 8 groups (n=10) according to the adhesive system and the dentin superficial treatment: G1 ? Single Bond 2 (SB) control; G2 ? Clearfil SE Bond (SE) control; G3 ? Desinfection with chlorhexidine SB; G4 ? Desinfection with chlorhexidine SE; G5 ? Contamination with Streptococcus mutans SB; G6 ? Contamination with Streptococcus mutans SE; G7 ? Contamination with Streptococcus mutans and desinfection with chlorhexidine SB e G8 ? Contamination with Streptococcus mutans and desinfection with chlorhexidine SE. Composite resin blocks were built up over treated surfaces, and teeth were then stored in water at 37 degrees C for 24 h. Samples were vertically sectioned, obtaining specimens with 0.8mm2 cross-sectional area. Specimens were stressed in tension at 0.5 mm/min crosshead speed. Five specimens of which group were observed under SEM. Bond strength results were evaluated using ANOVA and Tukey tests(p<0.05). The modes of failures were verified using optical microscope (25X). Dentin disks were obtained from 6 additional teeth treated in the same manner for observation under SEM. No statistically significant differences of bond strength values were found between controls groups (G1 = 31,52 ± 6,24 e G2 = 42,88 ± 2,31), groups treated with chlorhexidine (G3 = 34,41 ± 6,92 e G4 = 40,14 ± 2,91) and groups contaminated with Streptococcus mutans (G7 = 31,12 ± 5,31 e G8 = 39,09 ± 3,86). The groups contaminated with Stretococcus mutans that were not desinfected before the adhesive systems application presented significantly lesser results than sterile or desinfected groups (G5 = 23,61 ± 7,13 e G6 = 33,15 ± 3,35). Clearfil SE Bond presented significant high bond strenght values than Single Bond 2, independent of dentin superficial treatment. It was concluded that the contamination in vitro with Streptococcus mutans reduced bond strength of the two adhesives systems and 2% chlorhexidine digluconate solution eliminated the contamination, reestablishing the bond strength values gotten with sterile substrates.

O objetivo do presente estudo foi avaliar, em aparelhos disjuntores de Haas, a contaminação in situ por estreptococos do grupo mutans, sob a forma de colônias/biofilmes, nas diferentes superfícies (acrílico, fios, bandas e parafusos), com e sem o uso de bochechos com gluconato de clorexidina a 0,12%, por meio de Cultura Microbiana e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Adicionalmente, a corrosão na área da união entre o fio, a solda de prata e a banda dos aparelhos foi avaliada por meio de Estereomicroscopia Ótica, MEV e análise em Espectrometria de Energia Dispersiva (EDS). Foram selecionados 34 pacientes de 7 a 12 anos de idade, que compareceram à clínica de Ortodontia Preventiva da FORP/USP, com necessidade de correção com aparelho disjuntor de Haas por problemas transversais da maxila (mordida cruzada posterior). Em seguida, utilizando uma tabela de números randômicos, os pacientes foram aleatoriamente divididos em dois grupos de 17 indivíduos cada (Grupos I e II). Durante todo o período de permanência dos aparelhos na cavidade bucal, no Grupo I (controle; n=17) os pacientes foram orientados a utilizar dentifrício fluoretado para escovação diária e não empregar bochechos com soluções antimicrobianas. Por outro lado, no Grupo II (experimental; n=17) os pacientes foram orientados a realizar, além da escovação diária com o uso de dentifrício fluoretado, 2 bochechos por semana com solução de gluconato de Clorexidina a 0,12% (Periogard®). Decorridos cerca de 4 meses da permanência na cavidade bucal, os aparelhos foram removidos. Sendo seccionadas, aleatoriamente, partes dos aparelhos constituídas de uma banda com fio soldado, para análise em estereomicroscopia ótica, MEV e EDS. Os resultados em estereomicroscopia foram submetidos à análise estatística por meio do teste de Fisher, com nível de significância de 5%. Em seguida, os aparelhos foram submetidos ao processamento microbiológico, em meio de cultura CaSa B, para contagem das colônias/biofilmes de estreptococos do grupo mutans. O teste estatístico não-paramétrico de Mann-Whitney foi aplicado para verificação de possíveis diferenças entre os grupos, com relação à formação de colônias/biofilmes sobre a superfície das diferentes áreas (parafuso, resina acrílica, bandas, fio vestibular e fio palatino), como também para verificar se havia diferença entre a formação de colônias/biofilmes sobre as superfícies livres (voltadas para a cavidade bucal) e as superfícies não-livres (em contato direto com a mucosa palatina e sulco gengival). O nível de significância adotado foi de 5%. Após cultura microbiana, partes dos aparelhos representativas de cada grupo foram submetidas ao processamento e análise em MEV. Os resultados obtidos evidenciaram que, com relação às colônias/biofilmes das superfícies nãolivres dos Grupos I e II, não houve diferença entre os grupos (p=0,009). No entanto, quando as superfícies livres dos Grupos I e II foram comparadas, evidenciou-se diferença significante entre os 2 grupos, em todas as áreas analisadas (parafuso, resina acrílica e bandas) (p<0,001). Os resultados da cultura microbiana foram confirmados em MEV. A análise em estereomicroscopia ótica evidenciou a presença de áreas de alteração de coloração sugestivas de corrosão na região de solda em contato com a banda e com o fio, em ambos os grupos (p=1). Os picos dos elementos químicos observados em EDS também foram semelhantes em ambos os grupos. Pôde-se concluir que o uso do gluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard®), sob a forma de bochecho, apresentou eficácia na redução da formação de colônias/biofilmes nas superfícies livres dos aparelhos disjuntores de Haas, in situ, sem elevação nos níveis de corrosão. / The purpose of this study was to evaluate, in situ, in Haas expanders, the contamination of different surfaces (acrylic resin, wires, bands and screws) by mutans group streptococci colonies/biofilms with and without prescription of 0.12% chlorhexidine gluconate mouthwashes, by means of microbial culture and scanning electron microscopy (SEM). Additionally, the corrosion in the area of union between the appliances wire, silver soldering and band was assessed by optical stereomicroscopy, SEM and energy dispersive spectroscopy (EDS). Thirty-four children aged 7 to 12 years were selected among the patients attending the Preventive Orthodontic Clinic at FORP/USP with need of corrective orthodontics with Haas expander due to transversal problems of the maxilla (posterior crossbite). Thereafter, using a table of random numbers, the patients were randomly assigned to two groups of 17 individuals each (Groups I and II). Throughout the time that the appliances remained in the oral cavity, the patients in Group I (control; n=17) were instructed to use a fluoridated dentifrice for daily toothbrushing and not to use antimicrobial mouthwash solutions. On the other hand, in Group II (experimental; n=17), in addition to daily toothbrushing with a fluoridated dentifrice, mouthwashes with an antimicrobial agent (0.12% chlorhexidine gluconate - Periogard®) were prescribed to the patients. After approximately 4 months of maintenance in the patients mouth, the appliances were retrieved. Thereafter, components of the appliances (consisting of a band with soldered wire) were sectioned at random for analysis under optical stereomicroscopy, SEM and EDS. The results of the optical stereomicroscopy were submitted to statistical analysis using Fisher\'s test at 5% significance level. The appliances were sent to microbiology processing, in CaSa B culture medium, for counting of the number of mutans streptococci colonies/biofilms. Mann-Whitney non-parametric statistical test was applied to verify possible differences between the groups with respect to the formation of colonies/biofilms on the surface of different areas (screw, acrylic resin, bands, buccal wire and palatal wire), as well as to determine whether there were differences between the formation of colonies/biofilms on free surfaces (facing the oral cavity) and non-free surfaces (in direct contact with the palatal mucosa and gingival sulcus). The level of significance was set at 5%. After microbial culture, components of the appliances that were representative of each group were submitted technical processing and SEM analysis. The obtained results showed that there was no statistically significant difference between Groups I and II (p=0.009) regarding the formation of colonies/biofilms on the non-free surfaces. However, when the free surfaces of Groups I and II were compared, statistically significant difference was observed between these groups in all analyzed areas (screw, acrylic resin and bands) (p<0.001). The results of the microbial culture were confirmed by the SEM analysis. The optical stereomicroscopic analysis showed the existence of color alteration suggestive of corrosion in the solder region in contact with the band and with the wire in both groups (p=1). The peaks of chemical elements observed in EDS were also similar in both groups. It may concluded that the use of 0.12% chlorhexidine gluconate mouthwashes (Periogard®) showed efficacy in reducing the formation of colonies/biofilms on the free surfaces of Haas expanders, in situ, without increasing the corrosion levels.

A saúde bucal, na maioria dos municípios brasileiros, constitui ainda um grande desafio aos princípios do Sistema Único de Saúde, principalmente no que se refere à universalização, à eqüidade do atendimento e alto custo envolvido na terapia restauradora. A procura pela descoberta de novos compostos metabólicos com atividade antibacteriana para a prevenção de doenças bucais e talvez com menores impactos a saúde e financeiros, seria muito importante para obtenção de um meio efetivo de controle da formação de um biofilme patogênico e da cárie dental. O objetivo deste trabalho é estudar a viabilidade biotecnológica do uso de venenos nativos de diferentes serpentes quanto à capacidade de inibir o crescimento de Streptococcus mutans, principal agente envolvido na cárie dental. Nossos resultados mostraram que os venenos das serpentes Bothrops moojeni e Bothrops jararacussu inibiram o crescimento de Streptococcus mutans e o componente responsável pela inibição parece ser a peróxido de hidrogênio. Apesar de ainda não totalmente conclusivos, os ensaios já realizados, permitem afirmar que venenos de serpentes são ferramentas importantes na inibição do crescimento de patógenos, especificamente daqueles envolvidos nas doenças cariogênicas. / The oral health at the most of Brazilian municipalities is still a big challenge to the principles of the Brazilian Health Unique System (SUS), particularly with regard to the globalization, the equity of care and high cost involved in restorative therapy. The demand for discovery of new natural products with antibacterial activity in order to prevent dental diseases and perhaps with fewer health and financial impacts, would be very important to achieve an effective means to control the formation of a pathogenic biofilm and dental caries. The objective of this work is to study the feasibility of the use of different snakes crude venom in inhibiting the growth of Streptococcus mutans, the principal agent involved in dental caries. Our results showed that Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu venoms were able to inhibit the growth of Streptococcus mutans and the component responsible for that inhibition appears to be the hydrogen peroxide. Though still not fully conclusive, the tests already carried out, show that snake venoms are important tools to inhibit the growth of pathogens, specifically those involved in caries diseases. MOSCA, R.C., 2008 7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................................

O S. mutans é o agente etiológico da cárie dental humana, uma doença com ampla distribuição mundial. A adesão à superfície dental depende da interação entre a proteína de superfície P1 e a aglutinina salivar (SAG) adsorvida ao dente. A região N-terminal da P1 é um alvo vacinal importante que está diretamente associada às funções de adesão e agregação. Este trabalho teve o objetivo de avaliar estratégias vacinais contra o S. mutans baseadas na proteína P1 usando linhagens recombinantes de B. subtilis. O B. subtilis é uma bactéria gram positiva, formadora de esporos, não patogênica, empregada como sistema de expressão de proteínas heterólogas e como veículo vacinal administrado por vias de mucosas. Empregamos o B. subtilis para expressar e purificar a proteína P139-512 derivada da proteína P1 de S. mutans UA159. O antígeno P139-512 apresentou epítopos lineares e conformacionais semelhantes aos presentes na proteína P1 nativa. O sítio de ligação à SAG está preservado nessa proteína assim como suas propriedades imunogênicas. A coadministração parenteral do antígeno com adjuvantes vacinais promoveu resposta sistêmica específica com anticorpos eficazes no bloqueio da adesão de S. mutans. Por fim, usamos esporos de B. subtilis como veículo de entrega de mucosa para o antígeno alvo de S. mutans. Esporos de B. subtilis foram modificados para expressar na superfície adesinas bacterianas (SlpA, InvA ou Inv600) com capacidade de ligação ao epitélio intestinal e, quando no estágio de célula vegetativa, expressar intracelularmente o antígeno P139-512. A imunização oral com os esporos adesivos induziu altas concentrações de anticorpos sistêmicos e de mucosa. A imunização nasal ou sublingual com os esporos recombinantes induziu níveis de anticorpos sistêmicos maiores do que aqueles obtidos após a imunização oral. Além disso, esses anticorpos foram mais eficientes em bloquear a adesão de S. mutans à SAG imobilizada, sem interferir com a agregação. Em conclusão, os resultados obtidos abrem perspectivas interessantes para o desenvolvimento de vacinas anti-cárie baseadas em linhagens de B. subtilis. / S. mutans is the major etiologic agent of human dental caries, a disease with worldwide distribution. The adhesion to the tooth surface is dependent on the interaction of the P1 surface protein and salivary agglutinin (SAG) adsorbed to the tooth. The N-terminal region of P1 is an important vaccine target that is directly associated with adhesion and aggregation functions. This study aimed to evaluate vaccination strategies against S. mutans based on the P1 protein using recombinant B. subtilis strains. B. subtilis is a gram positive, spore-forming, non-pathogenic bacterium used as expression system for heterologous proteins and as a vaccine vehicle administered by mucosal routes. Inicially, we employed a recombinant B. subtilis strain to express and purify the P139-512 protein derived from the S. mutans UA159 P1 protein. The P139-512 antigen showed important conformational and linear epitopes similar to those present in the native P1 protein. The SAG-binding site is preserved in P139-512 as well as immunological properties. The parenteral co-administration of antigen with vaccine adjuvants stimulated systemic antibodies effective in blocking adhesion of S. mutans to SAG. Lastly, we used B. subtilis spores as a mucosal delivery vehicle for antigen targeting. B. subtilis endospores were modified to display bacterial adhesins (SlpA, InvA or Inv600), capable to bind to the intestinal epithelium, on the spore surface and to express intracellularly the P139-512 antigen during the vegetative cell stage. Oral immunization with adhesives spores induced high systemic and mucosal specific antibodies levels. The nasal or sublingual immunization with B. subtilis recombinant spores induced higher amounts of systemic antibodies than the oral immunization. Furthermore, the specific antibodies were highly effective in blocking the adherence of S. mutans to immobilized SAG, without interfering with aggregation. In conclusion, the results open interesting perspectives for the development of anti-caries vaccines based on B. subtilis strains.