Made available in DSpace on 2016-05-02T13:04:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 sandy_pereira_ioc_mest_2015.pdf: 4606163 bytes, checksum: dd466130d43a2f24db28ac921bec5343 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os macrófagos são um dos principais fagócitos do sistema imunológico atuando tanto na resposta imune inata quanto na adaptativa. Na infecção por Leishmania são as principais células infectadas nos hospedeiros vertebrados, tendo, portanto, a função de controlar ou favorecer a proliferação do parasito. Diferentes espécies do parasito produzem diferentes manifestações clínicas, mas o perfil genético assim como a resposta imunológica do hospedeiro pode modular o desenvolvimento da doença. Para melhor compreensão da biologia das leishmanioses, utilizam-se modelos de infecção experimental em camundongos como ferramenta para estudo da imunologia, resistência e suscetibilidade ao parasito. Neste trabalho estudamos a infecção por Leishmania amazonensis em macrófagos de três linhagens de camundongos com diferentes graus de suscetibilidade ao parasito. Para isso macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, C57BL/10 e C3H/He foram infectados com promastigotas de L. amazonensis para avaliação da multiplicação de amastigotas intracelulares, produção de óxido nítrico (NO) e produção de citocinas. Macrófagos de C3H/He infectados por 2 MOI de L. amazonensis apresentaram número de amastigotas e taxa de infecção similares a células de BALB/c e C57BL/10 nas primeiras 48h de infecção. No entanto, a partir de 72 horas a taxa de infecção e número total de amastigotas foi menor quando comparadas com células de origem BALB/c. Quando as células foram estimuladas com LPS e IFN-!, a carga parasitária dos macrófagos das três linhagens foram reduzidas, porém os macrófagos BALB/c permaneceram com carga parasitária maior do que os de origem C3H/He A produção de NO pelas células infectadas só foi diferente sob estimulação, quando os macrófagos de origem BALB/c produziram menos NO do que os C3H/He e C57BL/10. A dosagem de citocinas no sobrenadante das culturas sem estimulo mostrou que os macrófagos de C3H/He apresentaram altos níveis de IFN-!, IL-12 e IL-10, sendo este último exacerbado pela infecção, quando comparados as demais linhagens. A estimulação por LPS e IFN-! aumentou a produção de citocinas dos macrófagos de BALB/c e C57BL/10. Já as células de origem C3H/He quando estimuladas mostraram pouca ou nenhuma produção de IL-1", IL12 e IL-10 e uma estimulação moderada de TNF e IL-6. Finalmente, a inibição da iNOS pela aminoguanidina não foi capaz de diminuir a resistência dos macrófagos de C3H/He. Podemos, portanto, concluir que macrófagos de camundongos C3H/He são menos suscetíveis a infecção por L. amazonensis, mas essa sua resistência não é dependente da produção de óxido nítrico e nem de uma resposta do tipo Th1 / Macrophages are the main phagocytes of the imune system, participating on the inate and adaptative responses. They are the main host cell during Leishmania infection, participating on the control or multiplication of the parasite.Different species of the parasite produce different clinical manifestations, but the genetic background and the imune response of the host may modulate the development of the disease. In order to understand the biology of the leishmaniasis the mouse experimental model is used as a tool for the study of immunology and resistance/susceptibility to the parasite. In this work we have studied Leishmania amazonensis infection in macrophages obtained from three different inbred mouse strains, presenting different degrees of susceptibility to infection. Therefore, peritoneal macrophages of BALB/c, C57BL/10 and C3H/He mice were infected with L. amazonensis promastigotes in order to evaluate the number of intracelular amastigotes and infection rate. C3H/He macrophages infected with 2 MOI of L. amazonensis presented similar number of amastigotes and infection rate as BALB/c and C57BL/10 cells on the first 48 hours after infection. However, after 72 hours infection rate and number of amastigotes per cells were higher in BALB/c cells. When cells were stimulated with LPS and IFN-!, parasite load of all three inbred strains was reduced, but macrophages from BALB/c remained with a higher parasite load than C3H/He. Nitric oxide production by infected macrophages was only different under stimulation, when macrophages from BALB/c produced less NO than C3H/He and C57BL/10. Cytokine dosage of culture supernatants showed that all non-stimulated cultures produced of macrophages from C3H/He produced high levels of IFN-!, IL-12 and IL-10, the later being further exacerbated by infection, when compared with the others stains. Stimulation by LPS and IFN-! enhanced cytokine production by BALB/c and C57BL/10 macrophages. C3H/He cells when stimulated showed low or no production of IL1 ", IL-12 and IL-10 and a moderate enhancement of TNF and IL-6. Finally, iNOS inhibition by aminoguanidine was not able to reduce the resistance of C3H/He macrophages. We can then conclude that macrophages from C3H/He are less susceptible to L. amazonensis infection, but resistance is not dependent on nitric oxide production of a Th1 response. / 2016-12-17

A homeostase intracelular do colesterol é mantida, em células de mamíferos, por meio de uma série de mecanismos, porém pode haver uma ruptura deste balanço intracelular podendo levar ao desenvolvimento de doenças, como a lesão aterosclerótica que hoje em dia está acometendo grande parte da população mundial. A enzima HMG-CoA redutase, que possui cisteínas reativas em sua estrutura, pode ser alvo de estudos sobre o bloqueio do processo aterosclerótico, por meio de prostaglandinas da família das ciclopentenônicas (CP-PGs), particularmente a prostaglandina A2 (PGA2), que desviam completamente a síntese de novo de colesterol no sentido da síntese de fosfolípides em macrófagos/foam cells e outras preparações de macrófagos inflamatórios. Dessa forma o objetivo deste estudo foi investigar o efeito da PGA2 sobre a HMG-CoA redutase, em tipos celulares relacionados ao processo aterogênico, demonstrando seu mecanismo de ação por ligação covalente a cisteínas reativas desta enzima. Utilizaram-se macrófagos U937 que foram incubados ou não com LDL oxidada, tornando-se-os foam cells. As células foram tratadas com dose não tóxica (1 μM) de PGA2 ou com mistura controle por um período de 24 h. Outros grupos de macrófagos U937 e foam cells foram tratados com PGA2 biotinilada (com ou sem ditiotreitol, DTT 10 mM) na presença ou ausência de PGA2 (10 μM e 20 μM), por 2 h e 6 h. Foi feito também um estudo da atividade da HMG-CoA, através de kit específico e curvas de crescimentos celular em resposta PGA2. Nossos resultados mostraram aumento na imunodetecção de HMG-CoA redutase em macrófagos, quando tratados com LDL oxidada e tratados com PGA2 biotinilada por 2 h e 6 h, sendo que o tratamento com DTT produziu uma dramática redução na incorporação da mesma à enzima. A PGA2 foi capaz de reduzir a atividade da HMG-CoA em até 86,4% nas doses utilizadas. Macrófagos e foam cells tratados com PGA2 (1 μM) tiveram um aumento na proliferação celular quando comparados com aqueles que não receberam tratamento ou que foram tratadas com doses mais altas da PGA2. Nossos achados contribuem para esclarecer o mecanismo pelo qual ocorre a ação da PGA2 na reversão do processo aterosclerótico via inibição da enzima HMG-CoA redutase via ligação covalente nas cisteínas reativas desta enzima. / The intracellular cholesterol homeostasis is maintained in mammalian cells by a variety of mechanisms, although there may be intracellular breakdown of this balance that can lead to the development of diseases such as atherosclerotic lesions that are nowadays mostly affecting the population worldwide. The enzyme HMG-CoA reductase, which has critical reactive cysteines in its structure, may be target anti-atherosclerotic treatments , once cyclopentenonic prostaglandins (CP-PGs), particularly prostaglandin A2 (PGA2), which completely diverts de novo synthesis of cholesterol toward the direction of phospholipid synthesis in macrophages/foam cells in macrophage/foam cells and other inflammatory macrophage preparations. Thus the objective of this study was to investigate the effect of PGA2 on the HMG-CoA reductase in cell types related to the atherogenic process, demonstrating its mechanism of action by covalent binding to reactive cysteines of this enzyme. Macrophages U937 were used were incubated or not with LDL oxidized, making-up the foam cells. Cells were treated with non-toxic dose of PGA2 (1 μM) or with a mixture control for a period of 24 h. Other groups and U937 macrophage foam cells were treated with biotinylated PGA2 (with or without dithiothreitol, DTT, 10 mM) in the presence or absence of PGA2 (10 mM and 20 mM) for 2 h and 6 h. Was also made a study of the activity of HMG-CoA through kit specific and cell growth curves in response to PGA2. Our results showed the increase in immunodetection of HMG-CoA reductase into macrophages, when treated with LDL oxidized and treated with biotinylated PGA2 for 2 h and 6 h, and the DTT treatment produced a dramatic reduction the incorporation of the same enzyme. The PGA2 was able to reduce the activity of HMG-CoA to 86.4% at the doses used. Macrophages and foam cells treated with PGA2 (1 mM) had an increase in cell proliferation compared with those receiving no treatment or were treated with higher doses of PGA2. Our findings help to clarify the mechanism by which the action occurs in the PGA2 reversal of atherosclerosis by inhibiting the enzyme HMG-CoA reductase by way of covalent bond in the reactive cysteines of this enzyme.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by giuliana silveira (giulianagphoto@gmail.com) on 2016-01-29T18:19:03Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_HemocompatibilidadeEfeitoSistema.pdf: 2208570 bytes, checksum: acb77550e215beb05ad2fc60501c516c (MD5) / Approved for entry into archive by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2016-02-01T15:43:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_HemocompatibilidadeEfeitoSistema.pdf: 2208570 bytes, checksum: acb77550e215beb05ad2fc60501c516c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-01T18:17:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_HemocompatibilidadeEfeitoSistema.pdf: 2208570 bytes, checksum: acb77550e215beb05ad2fc60501c516c (MD5) Previous issue date: 2015 / Lipossomas são sistemas de vetorização constituídos basicamente por fosfolipídios e colesterol e que têm sido amplamente usados como carreadores de fármacos, apresentando, dentre outras vantagens, a redução de efeitos adversos em comparação aos observados pelo uso de fármacos na forma livre. Devido ao fato possibilidade dos lipossomas serem naturalmente direcionados aos macrófagos, os quais são alvos da infecção por Leishmania, seu uso apresenta-se promissor para o tratamento das leishmanioses. Como ainda não existe disponível nenhuma formulação lipossomal contendo antimoniato de meglumina (AM), fármaco de primeira escolha na terapia das leishmanioses, a proposição de uma formulação contendo esse fármaco que apresente bons resultados no tratamento da doença e segurança adequada é alvo de inúmeras pesquisas. Formulações promissoras contendo AM têm sido propostas, porém algumas reações adversas têm sido apontadas pelo uso desse sistema, as quais parecem estar relacionadas ao uso do fosfolipídio dicetilfosfato (DCP). Assim, foi proposta uma nova formulação lipossomal em que o DCP foi substituído pelo fosfolipídio dipalmitoilfosfatidilgicerol (DPPG) com o objetivo de tentar reduzir as reações adversas observadas. Dessa forma, neste trabalho, foram realizados testes in vitro para avaliar o efeito das duas formulações vazias sobre componentes celulares e plasmáticos, a saber, a avaliação do efeito sobre as hemácias e sobre a hemostasia. Também foram realizados testes para avaliação do efeito das vesículas lipossomais sobre a linhagem J774 de macrófagos, através da determinação da viabilidade celular e da produção de óxido nítrico, e o efeito sobre o sistema complemento, avaliado pela formação de C3a e de SC5b-9. Os resultados encontrados no presente estudo mostraram que as duas formulações não tiveram efeito sobre a maioria dos testes realizados. Porém, a formulação lipossomal constituída por DCP provocou ativação do sistema complemento, com aumento da formação de C3a. Além disso, essa formulação provocou uma diminuição da viabilidade de macrófagos. Esses dados sugerem que as reações adversas observadas em estudos anteriores podem ser devido ao DCP presente na vesícula lipossomal. ____________________________________________________________________________________ / ABSTRACT : Liposomes are a type of vectoring system consisting primarily of phospholipids and cholesterol. These particles have the advantage to reduce the adverse effects observed with drugs encapsulated in comparison to free drugs. Due to the fact that liposomes are naturally targeted to macrophages of the mononuclear phagocytic system (FMS), which are targets of infection by parasites of the genus Leishmania, they are adequate for the treatment of leishmaniasis. Since there is not any liposomal formulation containing meglumine antimoniate (AM), drug of choice in the treatment of leishmaniasis, the proposition of a formulation containing this drug that presents good results in the treatment of disease and adequate security is target of numerous research. Promising formulations containing AM have been proposed, however, some adverse reactions have been identified, such as hematological disorders. Some of these changes seem to be related to the use of dicetylphosphate phospholipid (DCP). Thus, a new liposomal formulation was testes in which DCP was replaced by dipalmitoilfosfatidilgicerol phospholipid (DPPG) in order to reduce adverse reactions observed. Thus, in vitro tests were performed to evaluate the effect of the two formulations over cellular components and plasmatic components, namely the evaluation of the hemolytic effect and influence on hemostasis. Furthermore, tests were performed to evaluate the effect of liposome vesicles on the J774 macrophage lineage, by determining the cell viability and the production of nitric oxide, as well as the effect on complement system, measured by the formation of C3a and SC5b-complex -9. The results of this study showed that both formulations had no effect on most of the tests. However, liposomal formulation comprised of DCP was capable of activating the complement system, with increased formation of C3a. In addition, this formulation caused a decrease in the viability of macrophages. These data suggest that the adverse effects observed in previous studies may be due to phospholipid DCP present in the liposomal vesicle.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340733.pdf: 4900918 bytes, checksum: 4ded1757ae8581e2321959028f243ffc (MD5) Previous issue date: 2016 / Elie Metchnikoff descreveu pela primeira vez os macrófagos e suas funções, uma delas é a fagocitose e eliminação de patógenos. Porém, alguns microrganismos desenvolveram estratégias para sobreviver dentro destas células, um exemplo de sucesso é o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose. Este bacilo ganha acesso ao interior dos macrófagos utilizando receptores na superfície destas células. Devido à sua grande heterogeneidade, os macrófagos apresentam diversas moléculas em sua superfície, é possível que Mtb utilize diferencialmente essas moléculas para sua sobrevivência intracelular. A heterogeneidade dos macrófagos foi explorada neste trabalho através de duas subpopulações distintas de macrófagos derivados de medula óssea (MMOs). Estas subpopulações foram separadas, por citometria de fluxo, baseadas em características de tamanho, complexidade e por moléculas expressas em sua superfície. A subpopulação maior e mais complexa, foi denominada A e apresenta uma frequência média de 65%, já a subpopulação menor e menos complexa, denominada B, apresenta uma frequência média de 15%. Para estudar a interação destas subpopulações com Mtb, ensaios de adesão e fagocitose foram realizados. Foi possível observar que Mtb adere e é mais fagocitado pela subpopulação B, a qual foi caracterizada como SSCloFSCloF4/80intCD11bint quando comparada à subpopulação A. As análises de citometria de fluxo indicavam que CD195 (CCR5) era um receptor envolvido no aumento da interação entre a subpopulação B e Mtb, porém MMOs derivados de camundongos nocautes para este receptor apresentam o mesmo perfil de adesão que MMOs de camundongos selvagens. Além disso, também foi investigado se o estágio de maturação da subpopulação B poderia estar envolvido com o aumento da adesão destes macrófagos à Mtb, contudo o estágio de maturação não parece participar neste processo. Em conjunto, os dados deste trabalho mostram que macrófagos de medula óssea apresentam duas subpopulações distintas, chamadas A e B. A subpopulação B apresenta maior interação com Mtb e esta interação não é dependente de CD195. Além disso, a subpopulação B foi caracterizada como SSCloFSCloF4/80intCD11bint quando comparada à subpopulação A.<br> / Abstract : Elie Metchnikoff first described macrophages and its functions, one of them is the phagocytosis and killing of pathogens. However, some microorganisms developed strategies to survive inside macrophages, one successful example is Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causing agent of tuberculosis. This bacilli access the macrophage s intracellular environment through surface receptors. Because of its great heterogeneity macrophages express different surface molecules and it is possible that Mtb exploits these differentially expressed molecules to survive inside the cell. The heterogeneity of macrophages was explored here using two distinct subpopulations of bone marrow macrophages (BMMs). These subpopulations were separated by flow cytometry based on size and complexity and also by expression surface molecules. The subpopulation, which was bigger and more complex, was called A and displays a mean frequency of 65%, on the other side the smaller and less complex subpopulation, was called B and displays a mean frequency of 15%. To study the interaction between Mtb and these two subpopulations binding and phagocytosis assays were performed. It was observed that subpopulation B presents higher bacterial binding and phagocytosis and it was phenotypically characterized as SSCloFSCloF4/80intCD11bint when compared to subpopulation A. The flow cytometry analysis indicates that CD195 (CCR5) was involved in higher bacterial binding of subpopulation B, nevertheless BMMs from mice knockout for CD195 showed the same levels of bacterial binding then wild-type BMMs. Furthermore, it was also investigated if the maturation status of subpopulation B could be associated with the augmented mycobacterial binding, however it does not seems to participate in this process. Taken together, these data shows that BMMs presents two distinct subpopulations, which were named A and B. The subpopulation B, displays higher bacterial binding and phagocytosis and CD195 does not participate in these processes. Additionally, subpopulation B was phenotypically characterized as SSCloFSCloF4/80intCD11bint when compared to subpopulation A.

HMGB1é a proteína não-histona mais abundante no núcleo celular e foi inicialmente descrita como reguladora da transcrição gênica por ligar-se ao DNA promovendo alterações conformacionais na fita dupla e assim permitindo a ação de outros fatores nucleares. Em 1999, a HMGB1 foi detectada no soro de pacientes com sepse em estágios tardios, e sua concentração plasmática foi inversamente proporcional à sobrevivência. Desde então a busca para elucidar o papel sinalizador da proteína nuclear HMGB1, tem gerado resultados paradoxais. HMGB1 é secretada por macrófagos, células dendríticas, tumores, células endoteliais e também é liberada com o processo de necrose. Duas classes de receptores já foram descritos estarem relacionados com a sinalização da HMGB1: RAGE e TLRs. As vias de transdução do sinal interno ativado por HMGB1 envolvem quinases da família das MAPK que convergem para a translocação nuclear de NF-κB. Suas primeiras ações caracterizadas relacionam-se ao processo pró-inflamatório, mas recentes pesquisas mostram a participação da HMGB1 na promoção da recuperação celular. Supõe-se que o fator limitante no direcionamento do sinal da proteína nuclear sejam suas concentrações e a especificidade celular. Com o intuito de relacionar a sinalização de HMGB1 e sua possível ação sobre agentes redox-sensíveis, utilizamos culturas de macrófagos peritoneais de ratos submetidas a 2 doses de HMGB1 e analisamos os níveis de nitritos no meio de cultivo celular; dosamos a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase; e avaliamos a translocação de fatores de transcrição para o núcleo. As duas concentrações de HMGB1 ativaram NF-κB, mas apenas a menor dose foi capaz de induzir um aumento na atividade enzimática da catalase. Ambas as doses não alteraram a atividade da superóxido dismutase e também não promoveram um acúmulo de nitritos. Nossos resultados comprovam que os efeitos da HMGB1 são dose-dependentes. Mais investigações ajudarão a elucidar se a HMGB1 em leves doses pode agir como um fator pré-condicionador. / HMGB1 is the non-histone protein most abundant in the cell nucleus. This protein was initially described as a DNA-binding agent that promotes transcription regulation by bending the double-helix, thus allowing the action of nuclear factors. In 1999, serum HMGB1 was detected in sepsis patients with time delay. HMGB1 concentrations and survival were inversely proportional. Then, the search for HMGB1 actions has generated inverse results. HMGB1 is secreted by macrophages, dendritic cells, endothelial cells and tumors cells; however, during the process of necrosis, HMGB1 is released to extracellular environment. Two receptor families were described: RAGE and TLRs. The HMGB1 transduction signals involve MAPK kinases that converge to NF-κB translocation. HMGB1 actions were related with pro-inflammatory process, but recent research showed HMGB1 beneficial effects. Protein concentrations could cause different tissue-specific responses. Our purpose was to analyze macrophages responses to low doses of HMGB1. Rat peritoneal macrophage cultures were treated with two HMGB1 concentrations. Supernatant nitrites, superoxide dismutase activity and catalase activity were determined. Plus, transcriptional factor translocation was evaluated. Both HMGB1 concentrations activated NF-κB, but only the low HMGB1 concentration induced an increase in the catalase enzymatic activity. Both HMGB1 concentrations did not alter the superoxide dismutase activity and also they did not change nitrite amount. Our results showed biological HMGB1 effect. More studies will help elucidate the HMGB1 role primed-like agent.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2017. / Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo liberado: Resumos e referências. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-07-03T21:09:27Z No. of bitstreams: 1 2017_JéssicadosSantosFolha_PARCIAL.pdf: 294375 bytes, checksum: 61910b439c6baaa52f5602c55bb55f2c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-22T20:57:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_JéssicadosSantosFolha_PARCIAL.pdf: 294375 bytes, checksum: 61910b439c6baaa52f5602c55bb55f2c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-22T20:57:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_JéssicadosSantosFolha_PARCIAL.pdf: 294375 bytes, checksum: 61910b439c6baaa52f5602c55bb55f2c (MD5) Previous issue date: 2017-08-22 / Projeto financiado pelo Edital Auxílio à Pesquisa DPP-UnB Nº 02/2016 - Auxílio Financeiro a Estudantes para o Desenvolvimento de Pesquisas de Natureza Científica. / A criptococose, micose sistêmica causada por leveduras do gênero Cryptococcus, atinge principalmente indivíduos imunocomprometidos, e é atualmente uma importante doença fúngica sistêmica em todo mundo. Está fortemente ligada ao estado imunitário do hospedeiro, sendo os macrófagos considerados as principais células efetoras na imunidade contra essa levedura. Nosso grupo de pesquisa faz parte da Rede de Criptococose brasileira que tem por objetivo estudar o perfil epidemiológico e a evolução clínica dos casos de criptococose primária e oportunista no Brasil, identificando fatores de risco associados aos diversos desfechos clínicos. Mais especificamente, nosso grupo vem trabalhando na caracterização fenotípica de isolados clínicos de Cryptococcus quanto a sua habilidade de produzir diferentes fatores de virulência e interagir com diferentes modelos hospedeiros. E esse trabalho teve como objetivo analisar fatores associados à interação de 16 isolados clínicos de Cryptococcus neoformans obtidos pela FIOCRUZ (Fundação Oswaldo Cruz) RJ/Brasil com macrófagos murinos primários (BMMs). Após ensaios de interação dos diferentes isolados clínicos com macrófagos, foram analisados os diferentes percentuais de fagocitose, as taxas de sobrevivência fúngica, bem como produção de citocinas inflamatórias produzidos pelos macrófagos. Tais resultados foram então correlacionados com resultados previamente obtidos da análise de produção in vitro de fatores de virulência por esses isolados realizadas por outros componentes do nosso grupo de pesquisa (produção de cápsula, melanização, mediana de sobrevida de larvas de Galleria mellonella infectadas com os diferentes isolados, etc). As porcentagens de fagocitose e sobrevivência fúngica apresentaram valores bastante variados entre os diferentes isolados clínicos estudados. Além disso, as diferentes linhagens foram capazes de promover aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6 e MCP-1 pelos macrófagos. Foram obtidas correlações significativas entre a taxa de sobrevivência fúngica após a interação com macrófagos e a porcentagem de fagocitose (p= 0,0066) e também entre porcentagem de fagocitose e a sobrevida de larvas de G. mellonella infectadas com os diferentes isolados (p= 0,0052). Também observamos uma correlação significativa da produção das citocinas pró-inflamatórias detectadas com a porcentagem de fagocitose dos diferentes isolados. Esses resultados demostram a variabilidade fenotípica desses diferentes isolados clínicos de C. neoformans na sua interação com macrófagos.Uma melhor caracterização desses fungos, bem como a correlação desses fenótipos com características clínicas desses isolados poderão colaborar futuramente como o estabelecimento de estratégias mais eficazes para o tratamento de criptococose no Brasil. / Cryptococcosis, a systemic mycosis caused by yeasts of the genus Cryptococcus, is currently an important systemic fungal disease affecting mainly immunocompromised people worldwide. It is strongly associated with the immune status of the host, being macrophages considered the main effector cells against the immunity against this yeast. Our group is part of the Brazilian Cryptococcosis Research Network which aims to study the epidemiological and clinical evolution of primary and opportunistic cases of cryptococcosis in Brazil, identifying risk factors associated with clinical outcomes. Our group is more specifically working on phenotypic characterization of clinical isolates of Cryptococcus regarding their ability to produce different virulence factors and interact with different host models. This work aimed to analyze factors associated with the interaction of sixteen clinical isolates of Cryptococcus neoformans obtained from FIOCRUZ (Oswaldo Cruz Fundation) Rio de Janeiro/Brazil with primary murine macrophages (BMMs). After interaction assays of the different isolates with macrophages, we analyzed the different percentages of phagocytosis, rates of fungal survival and production of inflammatory cytokines by macrophages. Those results were correlated to previous results regarding the in vitro production of virulence factors obtained from our group (capsule production, melanization, mean survival of infected Galleria mellonella larvae, etc). The percentages of fungal phagocytosis viability post interaction showed a significant variation among the clinical strains studied. Additionally, all the strains were able to induce production of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, IL-6 and MCP-1 by macrophages. We observed a significant correlation between fungal survival and the percentage of phagocytosis (p=0,0066), and also between percentage of phagocytosis and median survival of G. mellonella larvae infected with the different fungal isolates (p=0,0052). Also, there was a significant correlation of production of all the detected cytokines with the percentage of phagocytosis. These results demonstrated the phenotypic variability of those clinical isolates of C. neoformans. Further characterization of these fungal isolates, and the correlation of this features to their clinical profiles may help in the development of new strategies more efficient for the treatment of cryptococcosis in Brazil.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Nayara Silva (nayarasilva@bce.unb.br) on 2016-06-23T21:08:18Z No. of bitstreams: 1 2016_MarcoAntôniodeOliveira.pdf: 1771418 bytes, checksum: b431a54249eeded83422448470f561fb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-30T18:43:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarcoAntôniodeOliveira.pdf: 1771418 bytes, checksum: b431a54249eeded83422448470f561fb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T18:43:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarcoAntôniodeOliveira.pdf: 1771418 bytes, checksum: b431a54249eeded83422448470f561fb (MD5) / Durante o processo de interação patógeno-hospedeiro ambos os organismos envolvidos sofrem uma ampla reprogramação do padrão global de expressão gênica, o que tem sido mostrado ser crucial na definição da resultante dessa interação. Dentre os inúmeros genes com expressão alterada no hospedeiro encontram- se aqueles que codificam microRNAs (miRNAs), um grupo de pequenas moléculas de RNA regulatórias atuante nos mais diversos processos celulares, incluindo a regulação da resposta imune tanto inata quanto adaptativa. Embora vários trabalhos venham mostrando a importância dos miRNAs na resposta imune de hospedeiros mamíferos a bactérias e vírus, pouco se sabe a respeito do papel desses reguladores em infecções fúngicas. Nesse sentido, buscamos analisar o papel de miRNAs na resposta imune inata de hospedeiros murinos à infecção por Paracoccidioides brasiliensis, um dos agentes etiológicos da Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Os ensaios iniciais com macrófagos peritoneais de camundongos das linhagens A/J e B10.a, modelos definidos de resistência e suscetibilidade à PCM, respectivamente, e leveduras do isolado virulento Pb18 de P. brasiliensis revelaram o aumento dos cinco miRNAs avaliados: miR-125b, miR-132, miR-146a, miR-155 e miR-455, sugerindo a participação dessas moléculas na regulação da resposta a P. brasiliensis. No entanto, a ausência de um padrão de indução distinto entre as duas linhagens possivelmente indica que os miRNAs avaliados não possuem papel determinante no estabelecimento de respostas distintas entre as duas linhagens nas fases iniciais da interação com o fungo. Devido seu papel chave na regulação da resposta imune e aos altos níveis de acúmulo diferencial em resposta a P. brasiliensis aqui descritos, o miRNA miR-155 foi escolhido para análises mais abrangentes envolvendo sua biogênese e ação na modulação de transcritos alvo. O acúmulo do precursor pri-miR-155 observado sugere uma maior transcrição do gene MIR155HG contribuindo em parte para os altos níveis do miRNA maduro. Por sua vez, o aumento na razão entre os níveis de miR-155-3p e miR-155-5p pode indicar uma modulação do grau de estabilidade da fita 3p e regulação de seus processos de decaimento. A avaliação dos níveis de transcritos alvo de miR-155-5p forneceu resultados variáveis. Enquanto o aumento de TNFα e redução de SHIP1 estão de acordo com o já descrito na literatura em resposta a miR-155, o aumento nos níveis de SOCS1 e SOCS3, negativamente regulados pelo miRNA, demonstra as dificuldades de se estabelecer paralelos diretos entre os níveis de um miRNA e seus alvos em um contexto de alta reprogramação do padrão global de expressão gênica. Também foram realizados ensaios de infecção empregando macrófagos derivados de medula de animais nocautes para os genes de TLR4 e dectina-1 para avaliação da sua participação na modulação dos níveis de miR-155-5p. Os resultados obtidos evidenciam a sinalização desses receptores de membrana como reguladores negativos, direta ou indiretamente, de miR-155-5p em resposta a P. brasiliensis. Para possibilitar o estudo do papel funcional de miRNAs na resposta imune, experimentos foram realizados visando validar um modelo de silenciamento de miRNAs através da transfecção in vitro de inibidores (antimiR). Resultados preliminares utilizando sondas marcados com fluorescência e inibidores de um miRNA controle demonstraram uma alta eficiência de transfecção de BMDMs e eficácia no silenciamento do miRNA controle let-7. Desta forma, os resultados aqui apresentados são de relevância por sugerirem, pela primeira vez, a participação de miRNAs na regulação de vias envolvidas na resposta imune inata a P. brasiliensis. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / During host-pathogen interactions both organisms go through a wide genetic reprogramming, a process believed to be crucial in the establishment of the infection. Amongst all the host’s genes showing this altered expression are the ones encoding for microRNAs (miRNAs), small regulatory RNA molecules acting on many biological processes, including regulation of both innate and adaptive immune responses. Although the importance of microRNAs in the immune response to bacteria and viruses by mammalian hosts has been reported by many groups, little is known about their participation in fungal infections. In this context, we aimed at analyzing the role of microRNAs in the innate immune response of murine hosts to infection by Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM) – the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Initial infection assays performed with peritoneal macrophages from resistant (A/J) and susceptible (B10.a) mouse strains and yeast cells from the virulent isolate Pb18 of P. brasiliensis showed an increase of the levels of five miRNAs: miR-125b, miR-132, miR-146a, miR-155 e miR-455, indicating a participation of these molecules on the regulation of the response to P. brasiliensis. However, the similar patterns of miRNA induction on both strains possibly suggests that the miRNAs studied do not have a determinant role in the establishment of the distinct inflammatory responses presented by the two strains in the early stages of interaction with the fungus. Therefore, we chose to perform the following analyses just with the A/J strain. miR-155 was selected for a more complete characterization of its biogenesis and target transcripts regulation based on its key role in regulating many aspects of the immune response and the high levels of differential accumulation in response to P. brasiliensis observed by us. The accumulation of the precursor pri-miR-155 observed suggests an influence of the transcription of the gene MIR155HG on the increase in the mature miRNA levels. The changes in the miR-155-3p to miR-155-5p ratio following P. brasiliensis infection may indicate an altered stability degree and turnover rate of the 3p strand. The assessment of the levels of miR-155-5p target mRNAs showed varying results. While upregulation of TNFα and downregulation of SHIP1 are in accordance with the expected effects of miR-155-5p, the high levels of SOCS1 and SOCS3, negatively regulated by this miRNA, reflect the difficulties in establishing direct parallels between the levels of a miRNA and its targets in a context of broad genetic reprogramming. Finally, we performed infection assays using BMDM from TLR4 or dectin-1 knockout mice to assess the role of these receptors in the regulation of miR-155 levels. Results show that in the absence of the receptors miR-155 accumulates in even higher levels, pointing the signaling by TLR4 and dectin-1 as negative regulators, directly or indirectly, of miR-155 in respose to P. brasiliensis. In order to allow the study of the functional role of miRNAs in the immune response, we tested a model for miRNA silencing by in vitro transfection of miRNA inhibitors (antimiR). Preliminary results using fluorescent-labelled antimiR and inhibitors for a control miRNA showed a high transfection efficiency in primary macrophages and proper effect on silencing the control miRNA let-7. In conclusion, the results presented are of great significance for suggesting, for the first time, the involvement of miRNAs in the regulation of the innate immune response to Paracoccidioides brasiliensis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-02-29T16:31:53Z No. of bitstreams: 1 2015_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 5665217 bytes, checksum: 9f6e99bb7df736ed20ba2e9203882c3c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-03-02T21:53:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 5665217 bytes, checksum: 9f6e99bb7df736ed20ba2e9203882c3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-02T21:53:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CalliandraMariadeSouzaSilva.pdf: 5665217 bytes, checksum: 9f6e99bb7df736ed20ba2e9203882c3c (MD5) / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença endêmica, considerada a micose sistêmica mais prevalente no Brasil. A resposta ao agente etiológico, o fungo Paracoccidioides spp. é multifatorial e complexa, sendo que a natureza da resposta imune inicial, ou inata, resultará em um padrão de suscetibilidade ou resistência à PCM. Este estudo teve como principal foco a análise dos padrões moleculares de suscetibilidade ao P. brasiliensis, comparando as diferenças na resposta de células importantes na primeira linha de defesa ao fungo, por meio da análise da expressão gênica, em duas linhagens de camundongo: uma suscetível (B10.A) e outra resistente (A/J). Para isto, células dendríticas (BMDC) e macrófagos polarizados (M1-like, GM-BMM, e M2-like, M-BMM), derivados da medula óssea dessas duas linhagens murinas, foram co-cultivados, na ausência ou na presença de leveduras de P. brasiliensis. Após 6 horas, de co-cultivo, o RNA das BMDCs foi extraído e empregado em análises transcritômicas em larga escala (RNA-seq). As análises preliminares validam a qualidade das sequências obtidas e asseguram seu uso nas etapas subsequentes das análises dos dados gerados pelo experimento de RNA-seq. Dentre os genes descritos como diferencialmente expressos entre o grupo controle (não infectado) e o grupo experimental, oito tiveram sua expressão validada por qRT-PCR. Os genes diferencialmente expressos em ambas as linhagens foram agrupados por ontologia gênica e vias de KEGG para fornecer um panorama geral da reprogramação do transcritoma em resposta à infecção por P. brasiliensis. Em resumo, as BMDCs da linhagem A/J montam uma resposta controlada com poucos genes diferencialmente expressos em relação à condição controle. Já, as BMDCs da linhagem B10.A apresentam uma resposta intensa, com uma maior variação de expressão diferencial de genes. Neste trabalho, também avaliamos o impacto da polarização de macrófagos no modelo murino de PCM. Em geral, independente da linhagem de camundongos, os macrófagos com polarização similar a M2 (M-BMM), mostraram-se mais bem equipados para combater o fungo, apresentando o aumento nos níveis de transcritos de quimiocinas e citocinas. Ainda sobre o padrão desta resposta de macrófagos do tipo M2, também foi observado que comparado a B10.A, os M2-like de A/J desenvolveram uma resposta mais efetiva quanto ao controle da infecção, tendo sido também observado o aumento nos níveis de transcritos associados às vias de transdução de sinal dos TLRs, Dectina-1 e complemento, entre ouros. Por outro lado, os macrófagos com a diferenciação similar a M1 (GM-BMM) de ambas as linhagens de camundongo aumentaram os níveis dos transcritos de IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 e TNF-α quando comparados aos M-BMMs (tipo M2) infectados. GM-BMMs de B10.A mostrou uma diminuição nos níveis de alguns transcritos associados às vias de sinalização a partir de TLRs, Dectina-1 e complemento, entre outros PRRs anti-fúngicos, quando comparados aos GM-BMMs da linhagem A/J. / Paracoccidioidomycosis (PCM), a rural and suburban endemic disease, is considered the most prevalent systemic mycosis in Brazil. The response to its etiological agent (Paracoccidioides spp.) is multifactorial and complex. However, the manner in which the initial response is developed will determine if the patient presents a resistance or susceptibility to this infection. The focus of this study was to analyze the molecular patterns of susceptibility to P. brasiliensis infection, by comparing the differences in gene expression of cells of a susceptible (B10.A) and a resistant (A/J) mice strain, important in the first line of defense, in response to this fungus. To this end, dendritic cells (BMDC) and polarized macrophages (M1-like, GM-BMM, and M2-like, M-BMM) derived from the bone marrow of both murine strains were co-cultured with P. brasiliensis. After 6 hours co-culture, the RNA extracted from dendritic cells were sequenced by RNA-seq. Preliminary analysis of the RNA-seq data validated the quality of the sequences obtained and therefore ensured their use in subsequent steps of analysis. Of these, the expression of eight genes, up-regulated and/or not modulated, were validated by qRT-PCR. The genes differentially expressed in both strains were grouped then by gene ontology and KEGG pathways to provide an overview of the transcriptome reprogramming to P. brasiliensis infection. In summary, the BMDCs of the A/J strain mounts a controlled response with few differentially expressed genes relative to the control condition. While, the BMDCs of B10.A strain presents a more intense response with a wider range of differential gene expression. In this work, we also evaluated the impact of macrophage polarization in the murine model of PCM. In general, regardless of mouse strain, macrophages with M2-type polarization (M-BMM), proved to be better equipped to fight the fungus, with increase transcripts accumulation of chemokines and cytokines. Even within this polarazition, in comparison with B10.A M-BMMs, A/J M-BMMs developed a more effective control of infection, being also observated an increase in the transcripts levels associated with the signal transduction of TLRs, Dectin-1, complement, and others. Moreover, the macrophages with type M1 differentiation (GM-BMM) infected with P. brasiliensis of both mouse strains increased transcript levels of IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 and TNF-α when compared to infected M-BMMs (M2 type). B10.A GM-BMM showed a decrease in the levels of some transcripts associated with TLR, Dectin-1 and complement signaling pathways, and other associated antifungal PRRs when compared to A/J GM-BMM.

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Coorientador: Glenda Nicioli da Silva / Banca: Luís Fernando Barbisan / Banca: Denise Crispim Tavares / Resumo: Devido a propriedades terapêuticas, várias plantas e seus constituintes químicos vêm sendo muitas vezes utilizados como o primeiro recurso para o tratamento de diversas doenças. Nesse contexto, compostos isolados de plantas têm sido alvos de inúmeros estudos que avaliam, além da atividade, seus possíveis mecanismos de ação. Dentre os compostos com potencial quimioprotetor, o citral e o eugenol merecem atenção devido suas estruturas químicas de monoterpeno e de composto fenólico, respectivamente, e por seus potenciais anti-inflamatório, antiparasitário e antioxidante. Considerando que mutação no DNA pode ser a primeira etapa de várias doenças, e que lesões induzidas nessa molécula podem ser prevenidas ou moduladas por compostos naturais, este estudo objetivou avaliar, pelo teste do cometa, o potencial genotóxico do citral (25, 50 e 100 Tg/mL) e do eugenol (0,31, 0,62, 1,24 e 2,48 Tg/mL), após diferentes tempos de tratamento (6, 10, 24 e 30 h) e, também, seus possíveis efeitos moduladores sobre danos induzidos no DNA pela doxorrubicina (DOX), em diferentes protocolos de tratamento (pré, pós e simultaneamente à DOX) e momentos de análise (12, 24 e 36 h), em macrófagos peritoneais de camundongos. Além disso, foi avaliado o potencial toxicogenômico do citral e do eugenol por meio da modulação da expressão dos genes NF-kB1, COX-2 e TNF-α (relacionados a processos inflamatórios) em macrófagos ativados ou não por lipopolissacarideo de bactéria (LPS). Os resultados mostraram que ambos os compostos apresentaram potencial genotóxico. No caso do citral, a genotoxicidade foi observada para as duas maiores concentrações, mas apenas no tempo de 6h; para o eugenol, o aumento de danos no DNA foi detectado para todas as concentrações, em pelo menos um momento de análise. Com relação ao potencial... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Because of the therapeutic properties, several plants and their chemical constituents have been used for treatment of various diseases. Therefore, isolated compounds from plants have been targets of numerous studies that evaluate their activity and mechanisms of action. Among compounds with chemopreventive potential, citral and eugenol have gain attention because of their chemical structures, monoterpene and phenol,respectively, and for their anti-inflammatory, antioxidant and antiparasitic potentials. Since DNA mutation is the first step for some diseases, and since the lesions induced in this molecule can be prevented or modulated by natural compounds, aim of the present study was first to evaluate the genotoxic potential of citral (25, 50 and 100 Tg/mL) and eugenol (0.31, 0.62, 1.24 and 2.48 Tg/mL) at different times after exposure (6, 10, 24 and 30 h), and then, their ability to modulate DNA damage induced by doxorubicin (DOX) at different treatment protocols (pre, post and simultaneous with DOX) and times (12, 24 and 36 h) in mice peritoneal macrophages. In addition, the toxicogenomic potential of citral and eugenol by modulating the expression of NF-KB1, COX-2 and TNF-α (related to inflammatory processes) genes in macrophages activated or not by bacterial lipopolysaccharide (LPS) was also investigated. The results showed that both compounds have genotoxic potential. In the case of citral, genotoxicity was observed for the two major concentrations, but only 6h after the exposure. For eugenol, increased DNA damage was detected for all concentrations, in at least one moment of analysis. Related to the antigenotoxicity, both citral and eugenol presented protective effects at different concentrations and treatment protocols, and the more effective activities were detected at simultaneous and pre-treatment... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Alexandre Duharte / Banca: Filipe Vieira Rocha / Resumo: O câncer, manifestação originada pelo crescimento descontrolado de células, afeta milhões de indivíduos e é uma das principais causas de morte em todo mundo. Tendo em vista que os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento apresentam eficácia limitada (como a cisplatina) comumente atrelada à alta toxicidade, a busca por novos compostos capazes de combater células cancerígenas é uma necessidade premente. Com isso, cresce o interesse de se investigar novas substâncias que não sejam tóxicas, mas sim seletivas. Os compostos de paládio(II) têm sido estudados como uma alternativa aos fármacos disponíveis, mostrando-se promissores por sua menor toxicidade e capacidade de estimular a resposta imune antitumoral. Os macrófagos são as primeiras células a serem ativadas para participar de uma resposta imunológica propriamente dita e são células capazes de secretar mais de cem produtos biologicamente ativos, entre esses, espécies reativas de nitrogênio e citocinas atuantes na resposta imunológica e na formação tecidual. Neste trabalho foram testados sete compostos de paládio(II) quanto ao potencial imunológico e antitumoral, sendo eles: [Pd(dmba)(μ-Cl)]2 (1), [Pd(dmba)(μ-N3)]2•H2O (2), [Pd(dmba)(μ-NCO)]2 (3), [Pd(dmba)Cl(isn)] (4), [Pd(dmba)(N3)(isn)] (5), [Pd(dmba)(NCO)(isn)] (6) {DMBA= N,Ndimetilbenzilamina; ISN= isonicotinamida; Cl= cloro; N3= azida; e NCO= cianato}; e [Pd(Cdmba)( NCS)(dppp)] (7) {DMBA = N,N-dimetilbenzilamina; NCS = tiocianato e DPPP = difenilfosfinapropano}. Os compostos foram testados quanto pelo teste colorimétrico de MTT, brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio. Os compostos que apresentaram melhores resultados (3,4 e 7, em comparação com a cisplatina), foram submetidos ao teste do MTT a fim de traçar seu perfil citotóxico e citostático frente a linhagem celular LM3 (carcinoma mamário murino), além de quantificar citocinas e analisar a apoptose por Citometria ... / Abstract: The cancer manifestation caused by uncontrolled growth of cells, affects millions of individuals and is a major cause of death worldwide. Considering that the drugs currently available for the treatment of limited efficacy (such as cisplatin) commonly linked to high toxicity, the search for new compounds capable of fighting cancer cells is urgently needed. With this growing interest in investigating new substances that are not toxic, but selective. Compounds of palladium(II) have been studied as an alternative to available drugs showing be promising for its low toxicity and ability to stimulate antitumor immune response. Macrophages are the first cells to be activated to participate in an immune response itself and cells are able to secrete more than hundred biologically active products, among these, reactive nitrogen species and active cytokines in the immune response and tissue formation. In this work seven compounds of palladium(II) were tested for potential antitumor and immune being: [Pd(dmba) (μ-Cl)]2 (1), [Pd(dma)(μ-N3)]2•H2O (2), [Pd (dmba)(μ-NCO)]2 (3), [Pd(dmba)Cl(isn)] (4), [Pd(dmba)(N3)(isn)] (5), [Pd(dmba)(NCO)(isn)] (6) {DMBA = N, Ndimethylbenzylamine; ISN = -isonicotinamide; Cl = chloro; N3 = azide; and NCO = cyanate}; and [Pd(C-dmba)(NCS)(dppp)] (7) = {DMBA = N,N‟ - dimethylbenzylamine; NCS= thiocyanate and DPPP = difenilfosfinapropano}. The compounds were tested by colorimetric assay of MTT, 3 [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium. Compounds that showed better results (3.4 and 7, compared with cisplatin) were subjected to the MTT assay in order to trace their cytostatic and cytotoxic profile against LM3 cell line (murine mammary carcinoma), and analysis of apoptosis Flow Cytometry results involving cytotoxicity on these two cell types showed that each compound acts differently. Featured, against LM3 lineage compound 3 showed efficacy at a concentration of 25 mg / mL, as compound 4 showed the best ... / Mestre