Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-23T15:56:42Z No. of bitstreams: 1 2017_AnaLygiadosSantosCâmara.pdf: 13092362 bytes, checksum: 8fe97c28a245124fcbc630f949de0084 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-15T21:46:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AnaLygiadosSantosCâmara.pdf: 13092362 bytes, checksum: 8fe97c28a245124fcbc630f949de0084 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-15T21:46:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AnaLygiadosSantosCâmara.pdf: 13092362 bytes, checksum: 8fe97c28a245124fcbc630f949de0084 (MD5) Previous issue date: 2018-01-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O cloridrato de doxorrubicina (DOX) é um antibiótico antineoplásico citotóxico largamente utilizado no tratamento de diversas neoplasias, incluindo tumores sólidos. Entretanto, a alta cardiotoxicidade irreversível causada limita o sucesso do tratamento, levando a um baixo índice terapêutico. Além disso, a resistência a quimioterápicos é responsável pelo insatisfatório índice terapêutico em aproximadamente 90% dos pacientes que possuem metástases. Sendo a entrega de fármacos no tecido tumoral um dos objetivos da nanotecnologia e perante a necessidade de desenvolver terapias mais eficazes, novos estudos propõem a latenciação de fármacos como uma promissora modalidade terapêutica. Os objetivos gerais do presente trabalho foram: 1) obter e caracterizar nanoemulsões contendo DOX pH-sensível; 2) avaliar a atividade anticâncer in vitro e in vivo, e 3) avaliar o perfil de biodistribuição do nanossistemas obtido. A formulação obtida consistiu de um novo sistema (NE C16- DOX), em que a nanoemulsão encapsulou a DOX conjugada a um ligante pH-sensível, inativando sua ação farmacológica fora do pH baixo. A NE C16-DOX apresentou-se responsiva a pH, diâmetro hidrodinâmico de 23,72 ± 1,28 nm, índice de polidispersão 0,082 e potencial zeta de +4,49 ± 0,26, sendo compatível para administração parenteral. Nos teste in vitro, foram utilizadas as células de adenocarcinoma mamário murino (4T1), de fibroblasto murino como célula não tumoral (NIH-3T3), de carcinoma cervical (HeLa) e células de carcinoma cervical resistentes a DOX (KB-V1). A NE C16- DOX reduziu significativamente a viabilidade das células tumorais, inclusive das células resistentes. Os testes de atividade hemolítica comprovaram a segurança da NE não induzindo hemólise eritrocitária quando testado sem e com o pró-fármaco. Os ensaios de interiorização mostraram que a NE C16-DOX é mais interiorizada do que a DOX livre em células 4T1. Os ensaios de citometria de fluxo mostraram que a NE C16-DOX induz morte celular por apoptose. Na avaliação de mecanismo de endocitose não houve redução da interiorização da DOX com nenhum dos bloqueadores de endocitose testados. Na microscopia, os resultados obtidos mostraram mudanças nos perfis de distribuição intracelular de DOX entre o fármaco livre e a NE. A análise de perfil de biodistribuição da NE C16-DOX mostrou maior acumulação no tecido tumoral em relação ao fármaco livre. Os resultados mostram a NE C16-DOX como um promissor nanossistema para o tratamento de tumores sólidos, permitindo a translação para a aplicação clínica. / Doxorubicin hydrochloride (DOX) is a cytotoxic antineoplastic antibiotic widely used in the treatment of various neoplasms, including solid tumors. However, the high irreversible cardiotoxicity caused limits the success of the treatment, leading to a low therapeutic index. In addition, resistance to chemotherapy is responsible for the unsatisfactory therapeutic index in approximately 90% of patients who have metastases. As the delivery of drugs in the tumor tissue is one of the objectives of nanotechnology and in view of the need to develop more effective therapies, new studies propose the latency of drugs as a promising therapeutic modality. The general objectives of this work were: 1) to obtain and characterize nanoemulsions containing DOX pH-sensitive; 2) to evaluate the anticancer activity in vitro and in vivo, and 3) to evaluate the biodistribution profile of the obtained nanosystems. The formulation obtained consisted of a new system (NE C16-DOX), in which the nanoemulsion encapsulated DOX conjugated to a pH-sensitive binder, inactivating its pharmacological action out of the low pH. The NE C16-DOX was responsive to pH, hydrodynamic diameter of 23.72 ± 1.28 nm, polydispersity index 0.082 and zeta potential of +4.49 ± 0.26 and compatible for parenteral administration. Murine adenocarcinoma cells (4T1), murine fibroblast as non-tumor cell (NIH-3T3), cervical carcinoma (HeLa) and DOX (KB-V1) resistant cervical carcinoma cells were used in the in vitro tests. NE C16-DOX significantly reduced the viability of tumor cells, including resistant cells. Hemolytic activity tests have shown the safety of NE not inducing erythrocyte hemolysis when tested with and without the prodrug. Internalization assays showed that NE C16-DOX is more internalized than free DOX in 4T1 cells. Flow cytometry assays showed that C16-DOX NE might induces cell death by apoptosis. In the evaluation of endocytosis mechanism there was no reduction of DOX internalization with any of the endocytosis blockers tested. In microscopy, the results obtained showed changes in the profiles of intracellular distribution of DOX between free drug and NE. The biodistribution profile analysis of NE C16-DOX showed greater accumulation in the tumor tissue in relation to the free drug. The results show the NE C16-DOX as a promising nanosystem for the treatment of solid tumors, allowing translation for clinical application.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2010. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T18:45:48Z No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-06-20T13:38:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T13:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Dietas ricas em leguminosas têm sido associadas à baixa incidência de câncer em populações humanas, sendo essas plantas, ricas em inibidores de proteases. O BTCI (black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor) é um inibidor de protease da família Bowman-Birk, isolado de sementes da leguminosa Vigna unguiculata (feijão-de-corda), que inibe a tripsina e a quimotripsina simultaneamente. Diversos estudos mostraram o efeito de um Inibidor Bowman-Birk (BBI) no controle de vários tipos de câncer. Recentemente, o BTCI foi caracterizado como um agente anticarcinogênico em estudos in vitro utilizando células de câncer de mama. Os resultados encontrados nesse estudo apontam para efeitos citotóxicos e citostáticos, no entanto, o mecanismo molecular envolvido nesses eventos ainda não foi elucidado. Considerando que o câncer está, de forma geral, relacionado a disfunções no ciclo celular, a via ubiquitina-proteassoma torna-se alvo promissor para o controle de células cancerosas. A investigação dos efeitos do BTCI no proteassoma é uma das principais metas que nortearam o presente trabalho. A caracterização físico-química e molecular da associação BTCI-proteassoma é fundamental para a compreensão da atividade do BTCI, relacionada ao controle do ciclo celular de células de câncer de mama, visando à possível aplicação desse inibidor como agente anticarcinogênico. O BTCI apresentou inibição contra as três atividades proteolíticas do proteassoma 20S: quimotripsina, tripsina e caspase-like. Adicionalmente, peptídeos derivados do BTCI, com apenas um sítio de inibição, apresentaram inibição do proteassoma com menor afinidade, ou ativação de algumas atividades proteolíticas desse complexo macromolecular. O BTCI e o proteassoma 20S formaram complexos estáveis em temperaturas até 55ºC e em pHs neutros e básicos, sendo esse complexo sensível ao NaCl. Estudos in vitro mostraram que o BTCI é colocalizado com o proteassoma em células de câncer de mama MCF-7 no citoplasma e no núcleo e não altera a ubiquitinação de proteínas nessas células. O peptídeo derivado de BTCI, Pep1, que inibe o sítio da quimotripsina, não afeta o conteúdo de proteínas ubiquitinadas nas células MCF-7, o que pode estar relacionado com a inibição de proteínas E3 ligase, envolvidas na ubiquitinação de proteínas celulares. Esses dados indicam que a via ubiquitina-proteassoma está relacionada aos efeitos anticarcinogênicos do inibidor BTCI em células de câncer de mama, MCF-7, o que justifica a ampliação dos estudos nessa linha de pesquisa, visando à aplicação biotecnológica desse inibidor na terapia contra o câncer de mama. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diets rich in leguminous, a rich source of protease inhibitors, have been associated with low incidence of cancer in humans. The BTCI (black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor) is a Bowman-Birk protease inhibitor isolated from Vigna unguiculata (black-eyed pea) seeds, which inhibits trypsin and chymotrypsin simultaneously. Several studies have shown the effect of a Bowman-Birk inhibitor (BBI) in various types of cancer. Recently, BTCI was characterized as an anticancer agent in studies in vitro using breast cancer cells. The results from this study show cytotoxic and cytostatic effects of BTCI, however, the molecular mechanism involved in these events has not yet been elucidated. Considering that cancer is, in general, related to dysfunction in the cell cycle, the ubiquitin-proteasome pathway becomes a promising target for cancer cells control. The investigation of the BTCI effects on proteasome is one of the main purposes of the present study. The physical-chemical and molecular characterization of the BTCI-proteasome association is essential for understanding the activity of BTCI, related to cell cycle control in breast cancer cells, in order to consider its pharmacological application as anticarcinogenic agent. BTCI showed inhibition against all three proteolytic activities of 20S proteasome: chymotrypsin, trypsin and caspase-like. Additionally, peptides derived from BTCI, with only one inhibition site, showed proteasome inhibition with lower affinity or activation of some proteolytic activities of this macromolecular complex. The BTCI and the 20S proteasome formed stable complexes at temperatures up to 55°C and neutral and alkaline pHs, however, this complex is sensitive to NaCl. In vitro studies showed that BTCI colocalizes with the proteasome in breast cancer cells, MCF-7, at cytoplasm and nucleus, and does not alter the ubiquitination of proteins in these cells. The peptide derived from BTCI, Pep1, which inhibits the chymotrypsin site, does not affect the ubiquitinated proteins content in MCF-7 cells, which may be related to inhibition of E3 ligase protein, involved in the ubiquitination of cellular proteins. These data indicate that the ubiquitin-proteasome pathway is related to the anticarcinogenic effects of BTCI in breast cancer cells MCF-7, which justifies the further studies in the same research line, aimed the biotechnological application of this inhibitor in therapy against breast cancer.

Dissertação (mestrado)–Universidade de Brasília, Universidade UnB de Planaltina, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Materiais, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-07-15T13:21:44Z No. of bitstreams: 1 2016_IsisPiresThomé.pdf: 1759165 bytes, checksum: 802581531ad1c8049db8b4a6e5545850 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-08-19T11:51:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_IsisPiresThomé.pdf: 1759165 bytes, checksum: 802581531ad1c8049db8b4a6e5545850 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-19T11:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_IsisPiresThomé.pdf: 1759165 bytes, checksum: 802581531ad1c8049db8b4a6e5545850 (MD5) / O câncer é uma doença muito agressiva que atinge milhões de pessoas no mundo. Entre os vários tipos de câncer, o carcinoma mamário é o segundo mais frequente no mundo e o que mais acomete as mulheres. A quimioterapia é uma abordagem terapêutica bastante empregada, especialmente no caso de doença metastática. Contudo, este tipo de tratamento apresenta limitações como falta de especificidade às células tumorais e ocorrência de quimioresistência. Por isso, faz-se necessário o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes contra esta doença. Com o objetivo de melhorar a eficácia da quimioterapia para aumentar a expectativa de vida dos pacientes, várias propostas têm sido sugeridas. Os complexos metálicos vêm se mostrando agentes antitumorais promissores. Dentre eles, os complexos de Rutênio (Ru), como o KP1019, têm se destacado, pois apresentam (1) capacidade em se ligar à biomoléculas como transferrina; (2) considerável labilidade química; (3) atuação em células que desenvolveram resistência à cisplatina e (4) capacidade em participar de reações de oxirredução permitindo a existência dos mais importantes estados de oxidação em meio biológico. No presente trabalho, foi realizada a síntese do KP1019 e sua caracterização por ressonância magnética nuclear (RMN). Além disso, avaliou-se o efeito citotóxico deste complexo em células murinas de carcinoma mamário (4T1) e normais de fibroblastos (NIH-3T3). A citotoxicidade do KP1019 foi avaliada por testes de viabilidade celular por meio do método colorimétrico de MTT. As células foram tratadas com doses que variaram de 1,25 a 200 μM de KP1019 e cisplatina por períodos de 24, 48 e 72 horas. O KP1019 foi sintetizado e depois caracterizado por RMN e avaliado quanto à sua toxicidade. Após 24 h de tratamento, KP1019 induziu citotoxicidade semelhante à cisplatina em ambas as linhagens celulares. Além disso, notou-se que as linhagens 4T1 e NIH-3T3 tiveram a mesma sensibilidade ao tratamento com KP1019. No período de 48 horas, o KP1019 induziu diferente citotoxicidade nas duas linhagens, sendo que este não apresentou citotoxicidade para 4T1, enquanto que a cisplatina foi mais citotóxica para esta linhagem (doses acima de 12,5 μM). Em contrapartida, o KP1019 foi mais citotóxico para NIH-3T3 em doses a partir de 25 μM. Já no período de 72 horas, ambos os complexos foram similarmente citotóxicos em ambas as linhagens celulares a partir das doses 12,5 μM. Além disso, o efeito citotóxico de KP1019 e cisplatina foram diferentes na linhagem 4T1 (doses 1,25 e 2,5 μM). Ademais, a morfologia das células 4T1 foi analisada em microscópio óptico após tratamento por 24 horas com 20 μM de KP1019 ou cisplatina (IC50) e observou-se várias alterações relacionadas à citotoxicidade como arredondamento das células e aumento na quantidade de vesículas citoplasmáticas. Dessa forma, sugere-se que o efeito citotóxico de KP1019 foi dependente da dose, linhagem celular e tempo avaliados e, esta citotoxicidade está associada a alterações morfológicas provenientes de processo de morte celular, o que reforça o excelente potencial de KP1019 para uso na quimioterapia do câncer de mama. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cancer is a very aggressive disease that affects millions of people worldwide. Among the various types of cancer, breast cancer is the second most frequent in the world and that most affects women. Chemotherapy is fairly a therapeutic approach employed, particularly for metastatic disease. However, this treatment has limitations such as lack of specificity for tumor cells and occurrence of chemoresistance. Therefore, it is necessary to develop more effective treatments for this disease. In order to improve the effectiveness of chemotherapy to increase the life expectancy of patients, various proposals have been suggested. The metal complexes have shown to be promising antitumor agents. Among them, the complexes of ruthenium (Ru) as the KP1019, have been highlighted as present (1) the ability to bind to biomolecules such as transferrin; (2) substantial chemical lability; (3) operating in cells that have developed resistance to cisplatin and (4) the ability to participate in redox reactions allowing the existence of the most important oxidation states in biological medium. In the present work, the synthesis of KP1019 and its characterization by nuclear magnetic resonance imaging was performed (NMR). In addition, it evaluated the cytotoxic effect of this complex on murine mammary carcinoma cells (4T1) and normal fibroblasts (NIH-3T3). The cytotoxicity of KP1019 was evaluated by cell viability tests using the MTT colorimetric method. Cells were treated with doses ranging from 1.25 to 200 mM of KP1019 and cisplatin for periods of 24, 48 and 72 hours. The KP1019 was synthesized and then characterized by NMR and evaluated for their toxicity. After 24 h of treatment, KP1019 induced cytotoxicity similar to cisplatin in both cell lines. Furthermore, it was observed that the 4T1 and NIH-3T3 lines showed the same sensitivity to treatment with KP1019. Within 48 hours, the KP1019 induced cytotoxicity in two different strains, and this showed no cytotoxicity for 4T1, while cisplatin was more cytotoxic to this strain (over 12.5 uM doses). In contrast, KP1019 was more cytotoxic to NIH-3T3 at doses from 25 uM. In the 72-hour period, both complexes were cytotoxic similar in both cell lines from 12.5 uM doses. Additionally, the cytotoxic effect of cisplatin were KP1019 and different in lineage 4T1 (doses 1.25 and 2.5 uM). Furthermore, the morphology of 4T1 cells was examined under an optical microscope after treatment for 24 hours with 20 uM of KP1019 or cisplatin (IC50) and observed several changes related to cytotoxicity and rounding of the cells and increasing the amount of cytoplasmic vesicles. Thus, it is suggested that the cytotoxic effect of KP1019 was dose-dependent cell line and evaluated time and this cytotoxicity is associated with morphologic changes from cell death process, which enhances the excellent potential KP1019 for use in cancer chemotherapy breast cancer.

Dissertação (mestrado)–Universidade de Brasília, Universidade UnB de Planaltina, Programa de Pós-Graduação em Ciência de Materiais, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-08-01T14:06:58Z No. of bitstreams: 1 2016_PriscillaAmaralGuede.pdf: 2007056 bytes, checksum: b00c37f76daad8abedd65974283257a0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-08-02T22:17:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PriscillaAmaralGuede.pdf: 2007056 bytes, checksum: b00c37f76daad8abedd65974283257a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T22:17:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PriscillaAmaralGuede.pdf: 2007056 bytes, checksum: b00c37f76daad8abedd65974283257a0 (MD5) / O câncer é uma doença extremamente agressiva. Entre os tipos de cânceres, o carcinoma mamário é o segundo mais frequente no mundo e o que mais ocorre no sexo feminino. Dessa forma, torna-se imperativo o estudo de medidas alternativas que visem o tratamento eficaz desta doença. Sabe-se que os tratamentos mais utilizados apresentam algumas limitações. Um dos grandes empecilhos enfrentados na quimioterapia, por exemplo, é a sua falta de especificidade em relação às células tumorais e a quimioresistência. Desse modo, com o objetivo de melhorar a eficácia da quimioterapia, várias propostas têm sido sugeridas e estudadas no intuito de oferecer melhor expectativa de vida e maior taxa de sobrevivência aos indivíduos. Complexos metálicos têm mostrado resultados promissores como agentes quimioterápicos para tratamento de câncer. Dentre eles, os complexos de rutênio (Ru) vêm se tornando cada vez mais atraentes porque além de apresentarem atividade anticancerígena, estes apresentam: (1) capacidade em mimetizar íons de ferro (Fe), se ligando a biomoléculas responsáveis por transportar o Fe, como a transferrina e a albumina e, dessa forma, íons de Ru são transportados mais especificamente nas células tumorais; (2) importante papel em reações de oxirredução, o que permite a existência dos mais importantes estados de oxidação em fluidos biológicos e (3) mecanismos de atuação que podem superar os problemas de resistência encontrados nas drogas de platina. Em nosso estudo, realizamos a síntese e a caracterização de NAMI-A por meio de ressonância magnética nuclear e por infravermelho, bem como avaliamos seu efeito citotóxico e citostático em células de carcinoma mamário murino da linhagem 4T1 (linhagem que apresenta potencial metastático) e normais de fibroblastos da linhagem NIH-3T3. A cisplatina foi usada como controle positivo. Para avaliar estes efeitos, inicialmente realizou-se testes de viabilidade celular por meio do ensaio colorimétrico de MTT. As células foram tratadas com doses que variaram entre 1,25 a 4000 μM por períodos de 24, 48 ou 72 horas. Notou-se que o NAMI-A foi citotóxico em doses acima de 200 μM e a partir de 48 h. Já a cisplatina apresentou-se mais citotóxica, pois inibiu a viabilidade celular a partir da dose de 50 μM em 24 h. Ainda, no tratamento com 250 a 4000 μM de NAMIA, a citotoxicidade foi proporcional ao aumento da dose sendo que, em 72 horas de tratamento, os efeitos citotóxicos foram mais pronunciados em células tumorais (4T1) do que em células saudáveis (NIH-3T3). Nas análises posteriores, adotamos avaliar apenas a linhagem 4T1 e a dose que inibiu 50% das células (IC50 – 1800 μM ± 0,7) no período de 24 h. Por conseguinte, analisamos os efeitos de NAMI-A sob a morfologia, fragmentação do DNA e perfil do ciclo celular por meio de análise em microscópio óptico e em citômetro de fluxo. Após 24 horas de exposição das células 4T1 com 1800 μM de NAMI-A foram observadas várias alterações morfológicas e estruturais como arredondamento das células, condensação da cromatina e aumento da quantidade de vesículas em relação ao controle. Além disso, notou-se um aumento da fragmentação do DNA e acúmulo de células na subfase G2, indicando o efeito citostático de NAMI-A e, mais uma vez, corroborando seu efeito citotóxico na linhagem tumoral. Portanto, sugerimos que o NAMI-A induziu citotoxicidade que foi dependente da dose, tempo e linhagem celular e também que este composto induziu alterações morfológicas e estruturais na célula e no seu DNA e ainda no perfil do ciclo celular. Assim, este estudo confirmou vários resultados relatados na literatura e agregou novas informações que poderão ser utilizadas em futuras investigações sobre o potencial antimetastático de NAMI-A em 4T1. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Cancer is an extremely aggressive disease. Among the types of cancers, breast cancer is the second most frequent in the world and what occurs more in females. Thus, it becomes imperative to study alternative measures to the effective treatment of this disease. It is known that the most widely used treatments have some limitations. One of the major obstacles faced in cancer chemotherapy, for example, is their lack of specificity for the tumor cells and chemoresistance. Thus, in order to improve the efficacy of chemotherapy, several proposals have been suggested and studied in order to offer improved life expectancy and higher survival rate of individuals. metal complexes have shown promising results as chemotherapeutic agents for cancer treatment. Among them, the complex ruthenium (Ru) are becoming increasingly attractive because besides having anticancer activity, they present: (1) ability to mimic iron ions (Fe), by binding to biomolecules responsible for carrying Fe, such as albumin and transferrin, and thus Ru ions are transported more specifically in tumor cells; (2) important role in redox reactions, allowing the existence of the most important oxidation states in biological fluids, and (3) mechanisms of action which can overcome resistance problems found in platinum drugs. In our study, we performed the synthesis and characterization of NAMI-A by nuclear magnetic resonance and infrared, as well as evaluate their cytotoxic effect and cytostatic in murine mammary carcinoma cells 4T1 lineage (lineage that has metastatic potential) and normal fibroblast NIH-3T3 line. Cisplatin was used as a positive control. To assess these effects initially held cell viability tests using the colorimetric MTT assay. Cells were treated with doses ranging from 1.25 to 4000 uM for periods of 24, 48 or 72 hours. It was noted that the Nami-A was cytotoxic at doses above 200 uM and after 48 h. Since cisplatin had to be more cytotoxic therefore inhibited cell viability from the dose of 50 uM for 24 h. Furthermore, treatment with 250 to 4,000 uM Nami-A cytotoxicity was proportional to dose increase and, in 72 hours of treatment, the cytotoxic effects were more pronounced in the tumor cells (4T1) than in healthy cells (NIH -3T3). In later analyzes, we adopted to evaluate only the 4T1 line and the dose that inhibited 50% of the cells (IC50 - 1800 ± 0.7 uM) in 24 hour period. Therefore, we analyzed the effects Nami-A on the morphology, DNA fragmentation and cell cycle profile analysis by optical microscope and flow cytometry. After 24 hours of exposure of 4T1 cells with 1800 uM Nami-A were observed several morphological and structural changes such as cell rounding, chromatin condensation and increasing the amount of vesicles as compared to control. In addition, it was noted an increase in DNA fragmentation and cell accumulation in G2 subphase indicating the cytostatic effect Nami-A and, again, confirming its cytotoxic effect on the tumor. Therefore, we suggest that Nami-A induced cytotoxicity which was dose-dependent, time and cell lineage and also that this compound induced structural and morphological changes in the cell and its DNA and still in the cell cycle profile. This study confirmed several results reported in the literature and added new information that may be used in future research on the antimetastatic potential of NAMI-A in 4T1.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-02T17:21:35Z No. of bitstreams: 1 2016_KarollynedaSilvaMorais.pdf: 1281173 bytes, checksum: b0efd37124c639ccd7ed0e47dc36d9f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-04T18:32:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_KarollynedaSilvaMorais.pdf: 1281173 bytes, checksum: b0efd37124c639ccd7ed0e47dc36d9f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T18:32:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_KarollynedaSilvaMorais.pdf: 1281173 bytes, checksum: b0efd37124c639ccd7ed0e47dc36d9f9 (MD5) / As células normais tem potencial proliferativo regulado, e na maioria dos tipos celulares, obedecem a um número determinado de ciclos. Para que uma célula possa proliferar indefinidamente e de forma autônoma e ser considerada uma célula de câncer, ela deve passar pelo processo de imortalização. Os telômeros estão intimamente relacionados com o processo de imortalização, pois encurtam a cada ciclo celular, limitando a capacidade proliferativa. A telomerase é uma enzima que restaura a integridade dos telômeros, e está presente em 85% dos tipos de câncer, o que a torna um potencial alvo terapêutico. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais incidente em todo o mundo, e entre as mulheres é o primeiro em mortalidade. Dada a sua importância epidemiológica, foram utilizadas neste estudo linhagens de câncer de mama que expressam telomerase, MCF-7 e MDA-MB-231, submetidas a tratamentos de curto e longo prazo com o inibidor de telomerase MST-312. Este foi citotóxico para ambas as linhagens em tratamentos de curto prazo, com morte celular acentuada nas doses de 5 μM em MCF-7 e 10 μM em MDA-MB-231, efeito este que independe da crise telomérica. Após 18 semanas de tratamento em dose subtóxica do MST-312, as linhagens foram novamente submetidas aos ensaios de citotoxicidade. A linhagem de MCF-7 apresentou maior sensibilidade ao MST-312 após o tratamento de longo prazo, com sinais de senescência celular acentuadas nos grupos tratados com o inibidor e cariótipos característicos de crise telomérica. Enquanto que a linhagem MDA-MB-231 demonstrou sinais de aquisição de resistência à droga, não demonstrando senescência celular, e maior viabilidade celular no grupo tratado com MST-312 por 18 semanas, quando comparado com o grupo controle. Demonstrando que células que expressam telomerase respondem de maneira diferente ao mesmo inibidor. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Normal cells show a limited potential proliferative, presenting a reduced number of cell cycles. For one cell to be able to proliferate indefinitely and it becomes a tumoral cell, it needs to suffer an immortalization process. The telomeres are closely relating to the immortalization cell process, once that to each cell cycle they are facing a shortening which limits the proliferative capacity of them. Additonally, the telomerase enzyme, the protein that plays an importante role in to restore the telomere integrity and is present in about 85% of câncer types, it became a potential therapeutic target. The breast câncer is the second câncer type with the major incidence in the world and the first cause of mortality by tumor among women. Due its epidemiologic importance, in this study were used two cell lineages of breast câncer which express the telomerase enzyme, MCF-7 and MDA-MB-231, which they were submitted to treatments of long and short duration with the telomerase inhibitor MST-312. Both cell lineages utilized in this work showed citotoxicity in the treatments of short duration, with accentuated death cell in response to 5 μM dose of MST-312 in MCF-7 and 10 μM dose in the MDA-MB-231, this effect probably is independent of telomeric shortening. After 18 weeks of treatment using sub-toxic doses of the MST-312 inhibitor, the cell lineages were submitted to citotoxicity essays. The MCF-7 lineage presented a sensibility more elevated during the treatment of long duration showing cell senescence signals more accentuated in the group treated with the inhibitor and with intrinsic karyotypes of telomeric crisis. As results, the cell lineage MDA-MB-231 demonstrated signals of resistence acquisition to drug employed in this work, without signals of cell senescece, and in the citotoxicity essay under 10 μM dose, it was showed a significative cell number of inviable cells in the control group in comparing to the group treated for 18 weeks with MST-312 inhibitor. These results demonstrate that cells which are able to express the telomerase enzyme can respond of different ways to the same inhibitor.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Pós-Graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-03-16T13:17:08Z No. of bitstreams: 1 2017_LudmillaDaviddeMoura.pdf: 10005759 bytes, checksum: 0dffad8627684ae75103063895782539 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-03-21T15:29:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_LudmillaDaviddeMoura.pdf: 10005759 bytes, checksum: 0dffad8627684ae75103063895782539 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-21T15:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_LudmillaDaviddeMoura.pdf: 10005759 bytes, checksum: 0dffad8627684ae75103063895782539 (MD5) / O câncer é caracterizado por um complexo de alterações que afetam a atividade molecular intracelular e também as comunicações entre as células e tecidos. Dentre todos os tipos de cânceres existentes, o câncer de mama representa 25% do total de neoplasias no mundo, com possibilidade de metástases. Ressalta-se que as terapias atuais, incluindo a cirurgia, a terapia hormonal, quimioterapia e terapia de radiação, são pouco seletivas para a eficácia no tratamento do câncer de mama primário e metastático. Portanto, são necessárias novas terapias que possam ser mais eficazes no tratamento deste tumor, de modo a destruir a propagação de metástases. Um dos tratamentos em ascensão é o uso da terapia fotodinâmica (TFD), a qual envolve três elementos fundamentais, sendo eles: um agente fotossensibilizante ou fotossensibilizador, uma fonte de luz específica e moléculas de oxigênio. Ademais, o uso de nanoestruturas associadas à TFD, tem proporcionado bons resultados aos tratamentos para o câncer, pois aumenta a eficiência dos fármacos, no caso os fotossensibilizadores, utilizados. Assim, o objetivo deste trabalho, foi desenvolver um tratamento para o câncer de mama utilizando a terapia fotodinâmica, com uma nanopartícula contendo o fotossensibilizador cloreto de alumínio - ftalocianina, de forma a promover a mortalidade de células tumorais mamárias primárias e possíveis focos de metástases. Para tal, foram desenvolvidas e caracterizadas três nanoformulações, sendo elas: Nanoemulsão de Fatalocianina de Cloro-Alumínio (NE-ALCLFT), Nanoemulsão de Ftalocianina de Cloro-Alumínio com Ácido Fólico (NE-FO-ALCLFT) e Micela de Ácido Fólico (MIC-FO-ALCLFT). Para a caracterização, foram utilizadas as metodologias: análise de estabilidade, ZetaSizer, FT-IR, RAMAN, Microscopia eletrônica de Transmissão (MET) e de Varredura (MEV), análise por Espectrofluorímetro e o estudo da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS). Posteriormente, foi realizado o estudo in vitro para avaliação da viabilidade celular e citotoxicidade, utilizando duas linhagens celulares, sendo uma de adenocarcinoma mamário (4T1) e outra de fibroblastos (NIH/3T3), pela avaliação do método colorimétrico MTT e análise morfológica das células pós-tratamentos por Microscopia de Fluorescência e contraste de fase. Nestes testes também foram avaliados a interferência da potência utilizada pelo LED para a aplicação da TFD, sendo testadas as potências 10mW/cm², 50mW/cm² e 100mW/cm². Por fim, foram realizados os testes in vivo e ex vivo, que incluem o estudo da biodistribuição das três nanoformulações pela via de administração endovenosa, por meio da avaliação de imageamento em tempo real no equipamento IVIS Lumina XR. Posteriormente ao estudo da biodistribuição, foi selecionada uma das nanoformulações (aquela que apresentou melhores resultados) para o tratamento do câncer de mama utilizando a TFD. Nesta última fase do trabalho, foram realizadas três formas de tratamento, sendo elas: sistêmica ( usando a administração do fármaco por via endovenosa e irradiação do LED também sistêmico (corpo todo do animal)), parcialmente sistêmica (com administração do fármaco por via endovenosa e irradiação apenas no local do tumor), e local (utilizando a administração do fármaco por via intratumoral e irradiação do LED também no local do tumor). Foram avaliados o peso dos camundongos, o volume tumoral, análises bioquímicas, hematológicas, análise por microtomografia computadorizada pelo equipamento PET/SPECT (avaliando o volume pulmonar e ósseo) e análise histopatológica. Os resultados apresentam todos os preparos das nanoformulações e suas respectivas caracterizações, sugerindo relevante estabilidade das nanopartículas. Os ensaios de viabilidade celular mostram que as nanoformulações apresentam citotoxicidade para ambas as linhagens celulares testadas, e que o uso apenas do LED (sem a presença dos nanoformulações) provocam o aumento da viabilidade celular na linhagem de fibroblastos. O ensaio de biodistribuição ressalta os principais órgãos atingidos pelas nanoformulações, sendo especialmente o fígado, baço e rins. Além disso, concluiu-se que a nanoformulação NE-ALCLFT, foi a que apresentou melhor biodistribuição para a região tumoral. Por fim, os tratamentos in vivo com o uso da TFD, apontam efeitos de necrose tumoral e infiltrados inflamatórios. Além disso, foi possível concluir que a melhor forma de tratamento, dentre as analisadas, foi utilizar a nanoformulação por administração endovenosa, e a irradiação do LED no local da região do tumor, onde apresentou 80% de eficiência do tratamento, com 4 camundongos apresentando todos tecidos normais (n=5). Portanto, com este trabalho, foi possível desenvolver um método eficiente para o tratamento do câncer de mama, utilizando a TFD com uma nanoemulsão de ftalocianina de cloro alumínio, por administração endovenosa. / Cancer is characterized by a complex of alterations that affect intracellular molecular activity as well as communications between cells and tissues. Among all types of cancer, breast cancer represents 25% of the total number of neoplasms worldwide, with the possibility of metastases. It is noteworthy that current therapies, including surgery, hormone therapy, chemotherapy and radiation therapy, are not completely selective for efficacy in the treatment of primary and metastatic breast cancer. Therefore, new therapies are needed that may be more effective in treating this tumor, in order to destroy the spread of metastases. One of the rising treatments is the use of Photodynamic Therapy (PDT), which involves three fundamental elements: a photosensitizing or photosensitizing agent, a specific light source and oxygen molecules. In addition, the use of nanostructures associated with PDT has provided good results for cancer treatments, since it increases the efficiency of the drugs, in this case the photosensitizers, used. Thus, the objective of this work was to develop a treatment for breast cancer using photodynamic therapy with a nanoparticle containing the photosensitizer Chloro-Aluminum Phthalocyanine in order to promote the mortality of primary mammary tumor cells and possible foci of metastases . To that end, three nanoformulations were developed and characterized: Nanoemulsion of Fatalocyanine Chlorine-Aluminum (NE-ALCLFT), Folic Acid Chlorine-Aluminum Phthalocyanine Nanoemulsion (NE-FO-ALCLFT) and Folic Acid Micelle -FO-ALCLFT). For the characterization, the methodologies were used: stability analysis, ZetaSizer, FT-IR, RAMAN, Transmission Electron Microscopy (SEM) and Scanning (SEM), Spectrofluorimeter analysis and the study of the production of reactive oxygen species ). The in vitro study was carried out to evaluate cell viability and cytotoxicity, using two cell lines, one of the squamous cell carcinoma (4T1) and the other of fibroblasts (NIH / 3T3), by the evaluation of the MTT colorimetric method and the morphological analysis of the Post-treatment cells by Fluorescence Microscopy and phase contrast. These tests also evaluated the interference of the power used by the LED for the application of the PDT, being tested the powers 10mW / cm², 50mW / cm² and 100mW / cm². Finally, the in vivo and ex vivo tests were carried out, including the study of the biodistribution of the three nanoformulations through intravenous administration, by means of real time imaging evaluation in the Lumina XR IVIS equipment. After the biodistribution study, one of the nanoformulations (the one that presented the best results) was selected for the treatment of breast cancer using PDT. In this last phase of the study, three forms of treatment were performed: systemic (using intravenous drug administration and systemic LED irradiation (whole body of the animal)), partially systemic (with intravenous administration of the drug And irradiation only at the tumor site), and local (using intratumoral drug administration and LED irradiation also at the tumor site). The weight of the mice, tumor volume, biochemical and hematological analyzes, PET / SPECT (evaluating lung and bone volume) and histopathological analysis were analyzed by microtomography. The results show all the syntheses of the nanoformulations and their respective characterizations, suggesting the relevant stability of the nanoparticles. The cell viability assays show that the nanoformulations have cytotoxicity for both cell lines tested, and that the use of LEDs alone (without the presence of nanoformulations) provokes an increase in cell viability in the fibroblast lineage. The biodistribution test highlights the main organs affected by nanoformulations, especially the liver, spleen and kidneys. In addition, it was concluded that the NE-ALCLFT nanoformulation presented the best biodistribution to the tumor region. Finally, in vivo treatments with the use of PDT, point to effects of tumor necrosis and inflammatory infiltrates. In addition, it was possible to conclude that the best form of treatment, among those analyzed, was to use nanoformulation by intravenous administration, and LED irradiation at the site of the tumor region, where it presented 80% of treatment efficiency, with 4 mice presenting all normal tissues (n = 5). Therefore, with this work, it was possible to develop an efficient method for the treatment of breast cancer, using PDT with a chlorthal aluminum phthalocyanine nanoemulsion, by intravenous administration.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2015. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2015-11-17T20:29:05Z No. of bitstreams: 1 2015_KellianeAlmeidadeMedeiros_Parcial.pdf: 193575 bytes, checksum: 222ab66ed210c48e91c5eb4e6ebdfc80 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-11-19T10:52:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_KellianeAlmeidadeMedeiros_Parcial.pdf: 193575 bytes, checksum: 222ab66ed210c48e91c5eb4e6ebdfc80 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-19T10:52:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_KellianeAlmeidadeMedeiros_Parcial.pdf: 193575 bytes, checksum: 222ab66ed210c48e91c5eb4e6ebdfc80 (MD5) / O câncer de mama é considerado o tipo de câncer que tem maior incidência em mulheres nos países em desenvolvimento. O tratamento mais comum para os cânceres é com quimioterápicos isoladamente ou em associação a outros procedimentos, que têm revelado diversos efeitos colaterais adversos ao organismo. Por isso, novas formas de tratamento são necessárias. Biomoléculas encontradas em animais tem se revelado alternativas aos quimioterápicos. Dentre as biomoléculas, o peptídeo melitina é citotóxico e não seletivo devendo, assim, ser aprisionado em nanossistemas utilizando polímeros e, ainda, ser direcionada a célula-alvo, por meio de moléculas como peptídeos. Dentre os polímeros, a quitosana (QS) é utilizada por ser biocompatível e biodegradável. A QS, quando na presença de ânions como o tripolifosfato de sódio (TPP), forma nanopartículas espontaneamente pelo método de geleificação iônica. As nanopartículas de QS têm tendência à aglomeração, assim é necessária a adição de copolímeros como o polietilenoglicol (PEG). O presente estudo teve como objetivo desenvolver nanopartículas de QS e PEG com peptídeo direcionador visando à liberação sustentada in vitro e in vivo de melitina a células tumorais de mama. Assim, foi extraída a melitina da peçonha de Apis mellifera e sintetizados peptídeos direcionadores. Esses peptídeos foram associados em nanopartículas, que foram testadas in vitro e in vivo. Todas as nanopartículas foram polidispersas e aumentavam de tamanho de acordo com o aumento nas concentrações de TPP e PEG. Nos testes in vitro, notou-se que a melitina livre foi citotóxica, enquanto os dois peptídeos direcionadores não foram citotóxicos. Apenas as nanopartículas formuladas com 2 mg/mL de TPP foram tóxicas apenas quando continham melitina associada. Em outra abordagem experimental, a melitina foi substituída nas nanopartículas pela peçonha da abelha parcialmente hidrolisada e um novo peptídeo presente nesta. Foi observado que a peçonha perde a citotoxicidade com a hidrólise parcial. Assim, foram escolhidas as formulações com 2 mg/mL de TPP e 13,3 mg/mL de PEG 2000 homogeneizados em ultraturrax para os testes in vivo. As análises in vivo tiveram início com a comparação do implante de células ectópico (flanco) em relação ao ortotópico (4ª mama). Não foram observadas células neoplásicas nos órgãos analisados em nenhum tipo de implante e o ortotópico foi escolhido por formar único e uniforme tumor, o que facilita o tratamento intratumoral. As análises in vivo seguiram com o implante ortotópico na 3ª mama, o qual apresentou desenvolvimento diferente, mais agressivo, o que levou muitos animais a óbito. Houve metástase na forma de pólipos, ao longo do peritônio dos animais, mas não foram observadas células neoplásicas nos órgãos analisados. Os animais tratados com melitina livre e nanopartícula contendo melitina (completa) não apresentaram pólipos. Todos os animais apresentaram alterações hematológicas e os animais que receberam os tratamentos com melitina e completa apresentaram alterações bioquímicas. Ainda houve alterações histopatológicas evidenciando dano no fígado em todos os grupos, hemólise em alguns órgãos no tratamento com melitina livre e maior regressão de células neoplásicas no tratamento com melitina em relação ao tratamento com nanopartícula. A atuação imediata da melitina livre na inibição tumoral, em relação às nanopartículas completa, também foi confirmada com a maior expressão de proteínas antitumorais. Contudo o tratamento com nanopartículas de quitosana contendo melitina foi menos agressivo para o organismo, por não causar hemólise, e foi ativo sobre células neoplásicas de mama. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Breast cancer is considered the cancer that has a higher incidence in women in developing countries. The most common treatment for cancers is with chemotherapy alone or associated with other treatments, which has revealed many adverse side-effects in the body. Therefore, new treatments are needed. Biomolecules found in animals has proven alternatives to chemotherapy. Among biomolecules, the melittin peptide is cytotoxic and not selective, should be entrapped in nanosystems using polymers and, also, be directed to targets using molecules, such as peptides. Among the polymers, the chitosan (QS) is used to be biocompatible and biodegradable. QS, in the presence of anions such as sodium tripolyphosphate (TPP), form spontaneously nanoparticles by ionic gelation method. The QS nanoparticles tend to agglomerate, so it is necessary to add copolymers such as polyethylene glycol (PEG). This study aimed to develop nanoparticles with PEG and QS and driver peptide at sustained release in vitro and in vivo of melittin to breast tumor cells. So, it was extracted melittin from the venom of Apis mellifera and synthesized driving peptides. These peptides were associated in nanoparticles, which were tested in vitro and in vivo. All nanoparticles were polydisperse increased in size and in accordance with the increase in TPP and PEG concentrations. In in vitro tests, it was noted that the free melittin was cytotoxic, whereas both driving peptides were not cytotoxic. The nanoparticles formulated with 2 mg/mL of TPP were toxic only when were associated melittin. In another experimental approach, melittin was replaced in nanoparticles by the partially hydrolyzed bee venom and a new peptide present in this venom. It was observed that the venom loses cytotoxicity when partially hydrolyzed. Thus, the formulations were selected with 2 mg/mL of TPP and 13.3 mg/mL PEG 2000 homogenized in the ultraturrax for in vivo tests. The in vivo tests were started by the comparison of the ectopic cells implant (flank) over the orthotopic (4th breast). Neoplastic cells were not observed in organs examined on either type of implant and orthotopic was chosen to form unique and uniform tumor, which facilitates the intratumoral treatment. In vivo analyses followed with orthotopic implantation in the 3rd breast, which presented different development, more aggressive, leading many animals to dye. There were metastasis in the form of polyps along the peritoneum of the animals, but not observed cancer cells in analyzed organs. The animals treated with free nanoparticles containing melittin and melittin (complete) showed no polyps. All animals showed hematological changes and the animals that received the treatments with melittin and complete had biochemical changes. All the animal groups still showed histopathological changes associated with damages in the liver, hemolysis in some organs in the treatment with free melittin and enhanced regression of neoplastic cells on the treatment with melittin when compared treatment with the nanoparticle. Immediate action of free melittin in tumor inhibition, compared to the full nanoparticles was confirmed with the highest expression of anti-tumor proteins. However, the treatment with chitosan nanoparticles containing melittin was less aggressive to the body, does not cause hemolysis, and was active on neoplastic breast cells.

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Orientadora : Profª Drª Giseli Klassen / Coorientadora : Profª Drª Edneia A. S. R. Cavalieri / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia). Defesa: Curitiba, 22/03/2017 / Inclui referências : f. 65-73 / Resumo: O câncer de mama é o mais diagnosticado e a principal causa de morte por câncer no mundo entre as mulheres. A propagação metastática das células tumorais é responsável por aproximadamente 90% das mortes por este câncer. A progressão dos carcinomas, que culminam nas metástases, está associada com a perda de características epiteliais e a aquisição de fenótipo mesenquimal pelas células tumorais, processo este denominado de transição epitélio-mesênquima (TEM). A identificação de fármacos já aprovados em novas indicações terapêuticas para outras doenças, como o câncer, é conhecida como reposição de fármacos. Isto é possível devido às origens moleculares comuns de diversas doenças. Estudos recentes mostram que agonistas do receptor de GLP-1, como a exenatida, apresentam efeitos pró-apoptóticos e seletivos em células tumorais, especialmente em linhagens tumorais de mama. A liraglutida é um análogo de GLP-1 mais estável que a exenatida, utilizada na terapia da diabetes mellitus do tipo 2. Diante disso, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito in vitro da liraglutida em células tumorais de câncer de mama. A viabilidade celular com este fármaco foi testada nas concentrações de 10, 30, 50, 70 e 100 nM tanto nas linhagens tumorais de mama, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436, como na linhagem normal de mama HB4a. A liraglutida não apresentou efeito inibitório de viabilidade nas linhagens. A partir deste teste, foram feitos os ensaios de migração celular, análises de expressão gênica dos marcadores da TEM, como o CDH1, marcador epitelial, e o VIM, marcador mesenquimal, assim como para as análises de metilação do promotor desses genes, com a concentração de 30 nM de liraglutida. Os resultados mostraram que a liraglutida diminuiu em aproximadamente 40% a migração das linhagens mesenquimais MDA-MB- 231 e MDA-MB-436. Em ambas as linhagens houve aumento significativo da expressão de CDH1, associada com a desmetilação do promotor deste gene. Além disso, foi feito a indução da TEM na linhagem epitelial MCF-7, após exposição com o fator de crescimento epidermal (EGF), e este ensaio apresentou aumento da migração celular, juntamente com o aumento da expressão dos genes VIM e SNAIL e diminuição de CDH1, alterações estas características da indução da TEM. O tratamento na linhagem MCF-7 com liraglutida, nas células tratadas com EGF, inibiu a motilidade celular e a expressão de CDH1, revertendo a indução da TEM causada pelo EGF. Como conclusão, os dados obtidos mostram que a liraglutida afeta o potencial migratório das linhagens tumorais de mama, pela redução de migração celular e pelo aumento da expressão de CDH1. Palavras-chave: Câncer de mama; TEM; Liraglutida. / Abstract: Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer and the main cause of cancer death in the world among women. The propagation of metastatic tumor cells is responsible for approximately 90% of human breast cancer death. Carcinoma progression, which results in metastasis, is associated with the loss of epithelial features, and the acquisition of a mesenchymal phenotype by tumor cells, and this process is called of epithelial mesenchymal transition (EMT). Drug repurposing is the identification of new therapeutic indications for already approved drugs in others pathologies, like cancer. This is possible because of the common molecular origins of diverse diseases. Recent studies with Glucagon-like-peptide-1 (GLP-1) receptor agonists, as exenatide, has showed pro-apoptotic and selective effects in tumor cells, especially in breast cancer cell lines. Liraglutide is a human GLP-1 analogue more stable than exenatide, used in type 2 diabetes mellitus therapy. Then, the aim of this study was to evaluate the in vitro effects of liraglutide on breast cancer cell lines. The cell viability with liraglutide was tested in the concentrations of the 0, 10, 30, 50, 70 and 100 nM both in breast cancer, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436, and normal breast, HB4a, cell lines. Liraglutide does not affect the cell viability in the cell lines. From this assay, the following assays were done with 30 nM of liraglutide: wound healing, analyses of gene expression of EMT markers, like CDH1 epithelial marker and VIM mesenchymal marker and DNA methylation of promoter from CDH1 and VIM. The results showed that liraglutide decreased nearly 40% the cell migration of the mesenchymal cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-436. These two cell lines had up regulation of CDH1, associated with demethylation of this gene. Furthermore, the epithelial cell line MCF-7 was induced to EMT, after stimulation with epidermal growth factor (EGF), and it resulted in an increased cell motility and up regulation of mesenchymal markers VIM and SNAIL and decreased of CDH1, these alterations are characteristics of EMT. Treatment of MCF-7 cells with a combined stimulation of EGF and liraglutide inhibited the motility and decreased levels of CDH1, reverting EGFinduced EMT. In summary, these data showed that liraglutide affects the migratory behavior of the breast cancer cell lines by the reduction of cell migration and up regulation of CDH1. Key words: Breast cancer; EMT; Liraglutide.

Orientador : Profª. Drª. Giseli Klassen / Coorientador : Profª. Edneia A. S. R. Cavalieri / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 26/08/2016 / Inclui referências : f. 71-86 / Área de concentração: Patologia / Linha de pesquisa: Epigenética e câncer / Resumo: As metástases são a causa das mortes por câncer em 90% dos casos. No processo de metástases a destruição ou degradação da matriz extracelular é muito importante para o deslocamento das células tumorais malignas. Este processo é mediado por diversas enzimas, destacando-se a gelatinase B ou MMP-9. A epigenética estuda mecanismos de regulação da expressão gênica utilizando a metilação do DNA (em citosinas adjacentes a guaninas) e modificações pós-traducionais de histonas como principais mediadores. As ilhas de CpGs ao longo do promotor podem ser hipermetiladas e assim promover o silenciamento gênico e vice-versa. A partir deste conhecimento vem sendo utilizados diversos análogos de citosina a fim de inibir o processo de metilação de DNA. Nesse sentido esta em avançado estudo clínico o uso do 5-aza-2'- deoxicitosina (5-azadC) ou decitabine em alguns tipos de leucemias e doenças mielodisplásicas e provável inicio de utilização em tumores sólidos. Neste estudo o objetivo foi avaliar a expressão do gene MMP9 em linhagens de câncer de mama e com esses dados estudar o efeito da metilação do DNA e modificações de histonas no promotor e corpo do gene com e sem tratamento com decitabine. Para isso clonamos e sequenciamos uma região contendo CpGs da região promotora do gene MMP9 e também e ilhas de CpG no corpo do gene utilizando linhagens tumorais, PMC42, HeLa, MCF7 e MDA-MB-436. As linhagens MCF7 e MDA-MB-436 expressam baixos níveis de MMP9. Apos o tratamento destas 5- azadC foi observado aumento da expressão do gene e proteína MMP-9. O sequenciamento de CpGs na região promotora revelou que a metilação do DNA regula a expressão deste gene nas linhagens tumorais. Além disso a análise em amostras tumorais de pacientes que expressam MMP-9 também possuem estes CpGs desmetilados. A região intragênica contém 4 ilhas de CpG que foram clonadas em 2 fragmentos e denominadas CGI1 e CGI2. A CGI1 é altamente metiladas com ou sem tratamento com decitabine nas linhagens tumorais. Por outro lado a CGI2 apresentou alguns CpGs nas posições 12 a 30 que estavam metilados nas linhagens tumorais sem tratamento com decitabine, e que são desmetiladas após o tratamento. Novamente os resultados de contrapartida com amostras de tumores primários, estes mesmos CpGs encontraram-se desmetilados nos tumores mais agressivos e com presença de MMP-9 na imunohistoquímica. Afim de se avaliar o provável envolvimento de modificações de histonas foi realizada a imunoprecipitação de cromatina para as marcas de cromatina para abertura H3K4me3 e fechamento H3K27me3. Utilizando a linhagem MCF7 observou-se que após o tratamento com decitabine houve o enriquecimento da marca de abertura na região promotora onde se ligam os fatores de transcrição AP1 e NFkB. Além disso os CpGs 12-30 da CGI2 também apresentaram aumento da marca de abertura. Em conjunto esses resultados mostram um provável novo mecanismo de regulação da expressão gênica através de CpGs localizados em íntron no gene MMP9. Esses resultados são importantes no contexto do entendimento de mecanismos de expressão de MMP-9 em câncer de mama e também para o estudo de possível efeito de ativação de metástases com o uso do medicamento decitabine. / Abstract: Metastases are the cause of cancer deaths in 90% of cases. In the process of metastasis destruction or degradation of extracellular matrix it is important for the displacement of malignant tumor cells. This process is mediated by several enzymes, especially B-gelatinase or MMP-9. Epigenetic studies of regulatory mechanisms of gene expression using DNA methylation (adjacent cytosine to guanine) and post-translational modifications of histones as major mediators. The CpG islands along the promoter may be hypermethylated and thus promote gene silencing and vice versa. From this knowledge different cytosine analogues are used to inhibit the DNA methylation process. Accordingly this in advanced clinical study using 5-aza-2'-deoxicitosine (5-azadC) or decitabine in some types of leukemias and myelodysplastic diseases and probable beginning of use in solid tumors. In this study our goal was to evaluate the expression of MMP9 gene in breast cancer cell lines and study the effect of DNA methylation and histone modifications in the promoter gene and intragenic region with and without treatment with decitabine. To this we have cloned and sequenced a region containing CpGs of the MMP9 promoter region and CpG islands in the gene's body using tumor cell lines, PMC42, HeLa, MCF7 and MDA-MB-436. The lines MCF7 and MDA-MB-436 expressed low levels of MMP9. After treatment with 5-azadC was observed an increase in the gene expression and MMP-9 protein. The sequencing CpGs in the promoter region revealed that the DNA methylation regulates the expression of this gene in tumor cell lines. Further analysis of tumor samples from patients expressing MMP-9 also have these demethylated CpGs. The MMP9 intragenic region contains 4 CpG islands that were cloned in two fragments and called CGI1 and CGI2. The CGI1 was highly methylated with or without treatment with decitabine in tumor cell lines. On the other hand CGI2 have showed some CpGs in positions 12 to 30 that were methylated in tumor cell lines without treatment with decitabine, and are demethylated following treatment. Again counterpart results with primary tumor samples, the same CpG were demethylated in more aggressive tumors of MMP-9 positive in immunohistochemistry. In order to evaluate the probable involvement of histone modifications was performed chromatin immunoprecipitation to chromatin marks for H3K4me3 H3K27me3 opening and closing respectivelly. Using the MCF7 it was observed that after treatment with decitabine was enriching the opening tag in the promoter region which bind transcription factors NFkB and AP1. Additionally the CpG 12-30 of CGI2 also increased too. Together these results showed a possible new mechanism for regulation of gene expression through CpGs located in intron in MMP9 gene. These results are important in the context of understanding of MMP-9 expression mechanisms in breast cancer and also for the study of possible metastases activation with the use of decitabine drug.