Submitted by PPG Pediatria e Sa?de da Crian?a (pediatria-pg@pucrs.br) on 2018-05-21T13:12:10Z No. of bitstreams: 1 Vers?o completa da disserta??o-stefaniemuraro.pdf: 4426933 bytes, checksum: 5733e09060e6e08135de26c11374b171 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2018-05-28T17:29:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Vers?o completa da disserta??o-stefaniemuraro.pdf: 4426933 bytes, checksum: 5733e09060e6e08135de26c11374b171 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-28T17:34:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vers?o completa da disserta??o-stefaniemuraro.pdf: 4426933 bytes, checksum: 5733e09060e6e08135de26c11374b171 (MD5) Previous issue date: 2018-03-16 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Respiratory syncytial virus (RSV) is a major cause of diseases of the respiratory tract in humans being mainly associated with bronchiolitis, chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma exacerbation. RSV infection occurs primarily in pulmonary epithelial cells and, once infection is established, an innate immune response is triggered and mainly neutrophil recruitment is induced. Neutrophils can extrude neutrophil extracellular traps (NETs) capable of entrapping and inactivate a multitude of microorganisms because of its composition and due to the stringy nature of DNA fibers. Recently, was demonstrated that RSV particles and its fusion (F) protein were able to induce the release NETs coated with neutrophil elastase and myeloperoxidase, both antimicrobial peptides. Also, was observed that the excessive formation of NETs can have negative consequences to the host, such as airway obstruction during RSV infection. Therefore, the aim was to evaluate the mechanisms involved in NET formation induced by RSV infection of neutrophils, alveolar epithelial cells (A549) or lung fibroblasts (MRC5). Human neutrophils were infected with RSV and were able to induce NETs release only after 3 hours of stimulation indicating classical NETosis. Next was characterized NETs formation during infection associating DNA extrusion with MPO, NE and F protein of RSV. Was also observed NADPH oxidase and PAD4 dependence and PI3K/AKT, ERK and p38 MAPK pathways during infection. The inhibition of these signaling pathways, PAD4 and ROS production abolished NET formation. Considering a possible involvement of necroptosis during NETs production, were tested MLKL and RIPK inhibitors and evaluated LDH release in the supernatant of infected neutrophils. Neutrophils released LDH and depend on necroptosis induction to produce NETs. Likewise, neutrophils were co-cultured with A549 or MRC5 cells infected with RSV. Both A549 and MRC5 cells triggered NET release by human neutrophils in a virus concentration-dependent manner, the opposite occurs when used UV-inactivated virus. Briefly, RSV induces the classical/ROS-dependent NETosis by human neutrophils, and this effect relies on specific kinases activity. Furthermore, neutrophils are able to recognize pulmonary cells infected by RSV, releasing NETs. Thus, NETs release control could be crucial for minimizing tissue inflammation caused by RSV infection. / O v?rus sincicial respirat?rio (VSR) ? uma das principais causas de doen?as do trato respirat?rio em humanos sendo associado principalmente com bronquiolite, doen?a pulmonar obstrutiva cr?nica (DPOC) e exacerba??o de asma. O VSR infecta principalmente c?lulas epiteliais pulmonares e, uma vez que a infec??o ? estabelecida, uma resposta imune inata ? desencadeada e ocorre o recrutamento de c?lulas do sistema imune, principalmente neutr?filos. Os neutr?filos podem liberar redes extracelulares de neutr?filos (NETs) capazes de capturar e inativar uma grande quantidade de microrganismos devido ? sua composi??o e natureza fibrosa das fibras de DNA. Recentemente, foi demonstrado que part?culas do VSR al?m da prote?na de fus?o (F) do v?rus foram capazes de induzir a libera??o de NETs revestidas com elastase neutrof?lica e mieloperoxidase, ambos pept?deos com atividade antimicrobiana. Al?m disso, observou-se que a forma??o excessiva de NETs pode ter consequ?ncias negativas para o hospedeiro, como a obstru??o das vias a?reas durante a infec??o por VSR. Portanto, o objetivo foi avaliar os mecanismos envolvidos na forma??o de NET induzida pela infec??o por RSV em neutr?filos humanos, c?lulas epiteliais alveolares (A549) ou fibroblastos pulmonares (MRC5). Neutr?filos humanos foram infectados com VSR e foram capazes de induzir a libera??o de NETs somente ap?s 3 horas de infec??o, indicando uma NETose cl?ssica. Em seguida, foi caracterizada a forma??o de NETs durante a infec??o associando a extrus?o de DNA com as prote?nas MPO, NE e com a prote?na F do VSR. Tamb?m se observou a depend?ncia de NADPH oxidase e PAD4 e das vias de sinaliza??o PI3K / AKT, ERK e p38 MAPK durante a infec??o. A inibi??o dessas vias de sinaliza??o, da produ??o de PAD4 e de EROs aboliu a forma??o de NET. Considerando um poss?vel envolvimento da necroptose na produ??o de NETs, foram utilizados inibidores de MLKL e RIPK1 e foi avaliada a libera??o de LDH no sobrenadante de neutr?filos infectados. Os neutr?filos liberaram LDH e dependeram da ativa??o da necroptose para produzir NETs. Do mesmo modo, os neutr?filos foram co-cultivados com c?lulas A549 ou MRC5 infectadas com VSR. Ambas as c?lulas A549 e MRC5 desencadearam a libera??o de NET por neutr?filos humanos de uma maneira dependente da concentra??o de v?rus, o oposto ocorreu quando usado um v?rus UV-inativado. Resumidamente, o VSR induz a NETose cl?ssica / dependente de EROs em neutr?filos humanos, e este efeito depende de atividade espec?fica de quinases. Al?m disso, os neutr?filos s?o capazes de reconhecer c?lulas pulmonares infectadas pelo VSR, induzindo a libera??o NETs. Assim, o controle de libera??o de NETs pode ser crucial para minimizar a inflama??o do tecido causada pela infec??o por VSR.

Einen Aspekt dieser Arbeit stellt die Analyse der Stimulation von Ratten-Calvaria-Osteoblasten (RCA) mit den beiden Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 während der Proliferations- sowie Differenzierungs- und Mineralisierungsphase dar. Hierfür soll die Phosphorylierung und Aktivierung von Erk1 und Erk2, sowie von Smad1 und Smad2 mit Hilfe eines Kinase-Aktivitätsassays sowie der Westernblot-Analyse untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit soll weiterhin untersucht werden, welche Bedeutung die Wachstumsfaktoren TGF-b1 und BMP-4 auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP), einem wichtigen Differenzierungsmarker in Osteoblasten, ausüben. Enzymatische Aktivitätsbestimmungen und zytochemische Färbung aktiver ALP sollen darüber Aufschluss geben. Weiterhin soll der Gehalt an ALP-mRNA durch PCR bestimmt werden. Ein weiteres wichtiges Ziel dieser Arbeit ist die Analyse der Bedeutung von Erk1, Erk2, Smad1 und Smad2 auf die Aktivität der ALP. Dafür sollen Inhibitoren eingesetzt werden. Die enzymatische Aktivitätsbestimmung soll darüber aufklären. Außerdem soll mit Hilfe von kurzen, doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) ein knock down der Kinasen herbeigeführt werden und dessen Auswirkung auf die Aktivität der ALP enzymatisch bestimmt werden. Dafür muss zunächst die Wirksamkeit der siRNA auf RNA-Ebene mittels PCR und auf Proteinebene mittels Westernblot-Analysen überprüft werden. Zusätzlich soll die Bedeutung der Wachstumsfaktoren und der Kinasen Erk1 und Erk2 auf die Mineralisierung der RCA analysiert werden. Dafür wird die Menge des zellassoziierten Kalziums und Phosphats experimentell bestimmt, wodurch der Mineralisationsgrad der Zellen wiedergegeben werden kann.

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Invariant natural killer T (iNKT) cells are a versatile subclass of T lymphocytes which recognize glycolipid antigens. iNKT cells are capable of rapidly producing a broad array of cytokines in response to stimulation; thus, they play an important role in the early regulation of a variety of immune responses. It was hypothesized that iNKT cells express functional Toll-like receptors (TLRs) and that stimulation of TLRs by their ligands modulates iNKT cells responses. In the first objective, it was revealed that upon stimulation with anti-CD3 monoclonal antibody and interferon (IFN)-α, expression of TLRs was enhanced in iNKT cells. Furthermore, stimulation of iNKT cells with TLR ligands led to a significant increase in the expression of several cytokines. In the second objective, the mechanisms behind the modulatory effects of the TLR9 ligand (CpG-ODN) on iNKT cells were determined. Altogether, these findings suggest a direct role for TLRs in iNKT cell activation. / Ontario Graduate Scholarship

Streptococcus suis de type 2 est un microorganisme pathogène d’importance chez le porc. Il est la cause de différentes pathologies ayant comme caractéristique commune la méningite. C’est également un agent émergeant de zoonose : des cas cliniques humains ont récemment été rapportés en Asie. Cependant, la pathogénèse de S. suis n’est pas encore complètement élucidée. Jusqu’à présent, la réponse pro-inflammatoire initiée par S. suis n’a été étudiée qu’in vitro. L’étude du choc septique et de la méningite requiert toujours des modèles expérimentaux appropriés. Au cours de cette étude, nous avons développé un modèle in vivo d’infection chez la souris qui utilise la voie d’inoculation intra-péritonéale. Ce modèle a servi à l’étude de la réponse pro-inflammatoire associée à ce pathogène, tant au niveau systémique qu’au niveau du système nerveux central (SNC). Il nous a également permis de déterminer si la sensibilité aux infections à S. suis pouvait être influencée par des prédispositions génétiques de l’hôte. Le modèle d’infection par S. suis a été mis au point sur des souris de lignée CD1. Les résultats ont démontré une bactériémie élevée pendant les trois jours suivant l’infection. Celle-ci était accompagnée d’une libération rapide et importante de différentes cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) et de chémokines (KC, MCP-1 and RANTES), qui ont entraîné un choc septique et la mort de 20 % des animaux. Ensuite, pour confirmer le rôle de l’inflammation sur la mortalité et pour déterminer si les caractéristiques génétiques de l’hôte pouvaient influencer la réponse inflammatoire et l’issue de la maladie, le modèle d’infection a été étendu à deux lignées murines consanguines différentes considérées comme résistante : la lignée C57BL/6 (B6), et sensible : la lignée A/J. Les résultats ont démontré une importante différence de sensibilité entre les souris A/J et les souris B6, avec un taux de mortalité atteignant 100 % à 20 h post-infection (p.i.) pour la première lignée et de seulement 16 % à 36 h p.i. pour la seconde. La quantité de bactéries dans le sang et dans les organes internes était similaire pour les deux lignées. Donc, tout comme dans la lignée CD1, la bactériémie ne semblait pas être liée à la mort des souris. La différence entre les taux de mortalité a été attribuée à un choc septique non contrôlé chez les souris A/J infectées par S. suis. Les souris A/J présentaient des taux exceptionnellement élevés de TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN- γ, significativement supérieurs à ceux retrouvés dans la lignée B6. Par contre, les niveaux de chémokines étaient similaires entre les lignées, ce qui suggère que leur influence est limitée dans le développement du choc septique dû à S. suis. Les souris B6 avaient une production plus élevée d’IL-10, une cytokine anti-inflammatoire, ce qui suppose que la cascade cytokinaire pro-inflammatoire était mieux contrôlée, entraînant un meilleur taux de survie. Le rôle bénéfique potentiel de l’IL-10 chez les souris infectées par S. suis a été confirmé par deux approches : d’une part en bloquant chez les souris B6 le récepteur cellulaire à l’IL-10 (IL-10R) par un anticorps monoclonal anti-IL-10R de souris et d’autre part en complémentant les souris A/J avec de l’IL-10 de souris recombinante. Les souris B6 ayant reçu le anticorps monoclonal anti-IL-10R avant d’être infectées par S. suis ont développé des signes cliniques aigus similaires à ceux observés chez les souris A/J, avec une mortalité rapide et élevée et des taux de TNF-α plus élevés que les souris infectées non traitées. Chez les souris A/J infectées par S. suis, le traitement avec l’IL-10 de souris recombinante a significativement retardé l’apparition du choc septique. Ces résultats montrent que la survie au choc septique dû à S. suis implique un contrôle très précis des mécanismes pro- et anti-inflammatoires et que la réponse anti-inflammatoire doit être activée simultanément ou très rapidement après le début de la réponse pro-inflammatoire. Grâce à ces expériences, nous avons donc fait un premier pas dans l’identification de gènes associés à la résistance envers S. suis chez l’hôte. Une des réussites les plus importantes du modèle d’infection de la souris décrit dans ce projet est le fait que les souris CD1 ayant survécu à la septicémie présentaient dès 4 jours p.i. des signes cliniques neurologiques clairs et un syndrome vestibulaire relativement similaires à ceux observés lors de méningite à S. suis chez le porc et chez l’homme. L’analyse par hybridation in situ combinée à de l’immunohistochimie des cerveaux des souris CD1 infectées a montré que la réponse inflammatoire du SNC débutait avec une augmentation significative de la transcription du Toll-like receptor (TLR)2 et du CD14 dans les microvaisseaux cérébraux et dans les plexus choroïdes, ce qui suggère que S. suis pourrait se servir de ces structures comme portes d’entrée vers le cerveau. Aussi, le NF-κB (suivi par le système rapporteur de l’activation transcriptionnelle de IκBα), le TNF-α, l’IL-1β et le MCP-1 ont été activés, principalement dans des cellules identifiées comme de la microglie et dans une moindre mesure comme des astrocytes. Cette activation a également été observée dans différentes structures du cerveau, principalement le cortex cérébral, le corps calleux, l’hippocampe, les plexus choroïdes, le thalamus, l’hypothalamus et les méninges. Partout, cette réaction pro-inflammatoire était accompagnée de zones extensives d’inflammation et de nécrose, de démyélinisation sévère et de la présence d’antigènes de S. suis dans la microglie. Nous avons mené ensuite des études in vitro pour mieux comprendre l’interaction entre S. suis et la microglie. Pour cela, nous avons infecté des cellules microgliales de souris avec la souche sauvage virulente (WT) de S. suis, ainsi qu’avec deux mutants isogéniques, un pour la capsule (CPS) et un autre pour la production d’hémolysine (suilysine). Nos résultats ont montré que la capsule était un important mécanisme de résistance à la phagocytose pour S. suis et qu’elle modulait la réponse inflammatoire, en dissimulant les composants pro-inflammatoires de la paroi bactérienne. Par contre, l’absence d’hémolysine, qui est un facteur cytotoxique potentiel, n’a pas eu d’impact majeur sur l’interaction de S. suis avec la microglie. Ces études sur les cellules microgliales ont permis de confirmer les résultats obtenus précédemment in vivo. La souche WT a induit une régulation à la hausse du TLR2 ainsi que la production de plusieurs médiateurs pro-inflammatoires, dont le TNF-α et le MCP-1. S. suis a induit la translocation du NF-kB. Cet effet était plus rapide dans les cellules stimulées par le mutant déficient en CPS, ce qui suggère que les composants de la paroi cellulaire représentent de puissants inducteurs du NF-kB. De plus, la souche S. suis WT a stimulé l’expression de la phosphotyrosine, de la PKC et de différentes cascades liées à l’enzyme mitogen-activated protein kinase (MAPK). Cependant, les cellules microgliales infectées par le mutant déficient en CPS ont montré des profils de phosphorylation plus forts et plus soutenus que celles infectées par le WT. Finalement, la capsule a aussi modulé l’expression de l’oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) induite par S. suis et par la production subséquente d’oxyde nitrique par la microglie. Ceci pourrait être lié in vivo à la neurotoxicité et à la vasodilatation. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant l’induction de l’inflammation par S. suis, ce qui devrait permettre, d’établir éventuellement des stratégies plus efficaces de lutte contre la septicémie et la méningite. Enfin, nous pensons que ce modèle expérimental d’infection chez la souris pourra être utilisé dans l’étude de la pathogénèse d’autres bactéries ayant le SNC pour cible. / Streptococcus suis serotype 2 is an important swine pathogen responsible for diverse infections, meningitis being its most striking feature. In addition, it is an emerging agent of zoonosis, which has gained worldwide attention due to important outbreaks in Asia. Understanding the pathogenesis of S. suis infections still represents a challenge. Up to present, the pro-inflammatory response due to S. suis has only been studied in vitro, and there is still a great need of appropriate experimental models for both septic shock and meningitis. In the present study, we successfully developed an in vivo model of S. suis infection in adult mice infected by the intraperitoneal route. This model served to investigate the pro-inflammatory events that take place at both the systemic and Central Nervous System (CNS) levels associated with this important pathogen. In addition, this model was useful to determine if susceptibility to S. suis infection may be influenced by the genetic background of the host. The mouse model of S. suis infection was standardized in CD1 mice. Results showed sustained bacteremia during the 3 days post-infection (p.i.), accompanied by a quick and substantial release of different pro-inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6, IL-12p40/p70, IFN-ɣ) and chemokines (KC, MCP-1 and RANTES) that lead to septic shock and 20% mortality in mice. Once the hallmark of the septic phase of S. suis infection was established in CD1 mice, research continued with the objective to confirm the role of inflammation in mortality and to determine if the genetic background of the host may influence the inflammatory response toward this pathogen and the further outcome of the disease. For this, the mouse model of S. suis infection was used with two genetically different inbred mouse strains, this is, C57BL/6 (B6) and A/J mice, which are considered as the prototype of Th1-type and Th2-type mice, respectively. Results demonstrated a striking susceptibility to S. suis infection in A/J mice in comparison to B6 mice, with 100% mortality in the former mice strain at 20 h p.i., and 16 % mortality at 36 h p.i. for the latter. Very interestingly, and similarly to CD1 mice, bacteremia did not seem to be responsible for the death of mice, as both mice strains presented similar amounts of bacteria in blood and organs. Thus, it was postulated that the higher mortality in S. suis-infected A/J mice was due to uncontrolled septic shock. In fact, A/J mice presented very high levels of TNF-α, IL-12p40/p70, IL-1β and IFN-ɣ, that significantly exceeded those found in B6 mice. Remarkably, chemokine levels were similar between strains, suggesting their limited participation in the development of septic shock by S. suis. A greater survival of B6 mice was partially related to a better regulation of the pro-inflammatory cytokine cascade, as they showed a higher production of the anti-inflammatory cytokine IL-10 than A/J mice. The potential beneficial role of the IL-10 in mice infected with S. suis was confirmed using two approaches: the first, by blockage of the cell receptor of IL-10 (IL-10R) with an anti-mouse IL-10R monoclonal antibody (Mab) in B6 mice and the second by administrating recombinant mouse (rm)IL-10 (rmIL-10) to A/J mice. B6 mice that received the IL-10R MAb treatment before challenge with S. suis developed a clinical acute disease similar to that observed with A/J mice, with a striking and rapid increase in mortality and higher levels of TNF-α in comparison to those of infected mice that did not receive the treatment. Controversially, treatment with rmIL-10 significantly delayed the onset of septic shock in A/J mice infected with S. suis. These results show that survival from S. suis septic shock requires a tight regulation of pro- and anti-inflammatory mechanisms, and that the latter should be activated at the same time or soon after the onset of the pro-inflammatory response. This part of the study may represent a first step in the identification of host genes associated with resistance against S. suis. One of the most important achievements of the mouse model of infection described in this project is the development of distinct clinical signs of neurological disease in CD1 mice from 4 days p.i. Indeed, in CD1 mice that survived sepsis due to S. suis infection, clinical signs of neurological disease and vestibular syndrome, which are quite similar to those observed in clinical cases of S. suis meningitis in both pigs and humans, were observed. Studies of the brains of infected CD1 mice using in situ hybridization combined with immunocytochemistry, demonstrated that the CNS inflammatory response began with a significant increase in the transcription of Toll-like receptor (TLR)2 and CD14 initially in the brain microvasculature and choroid plexuses, suggesting that S. suis may use these structures as portals of entry to the brain. There also was activation of NF-κB (as indicated by transcriptional activation of IκBα as a reporter system) and TNF-α, IL-1β and MCP-1, mainly in cells identified as microglia and to a lesser extent in astrocytes. These signals reached different brain structures, mainly the brain cortex, corpus callosum, hippocampus, choroid plexuses, thalamus, hypothalamus and meninges. All of these pro-inflammatory events were associated with extensive areas of inflammation and necrosis, severe demyelination and presence of antigens of S. suis inside microglia. In vitro studies were conducted in order to better understand the interactions of S. suis and microglia. For this, mouse microglia were infected with a virulent wild type (WT) strain of S. suis. Two isogenic mutants deficient in capsule (CPS) or hemolysin production (suilysin, SLY) respectively, were also included for comparative purposes. The CPS was important for S. suis resistance to phagocytosis, and it also modulated the inflammatory response by hiding pro-inflammatory components from the bacterial cell wall. On the other hand, the absence of SLY, a potential cytotoxic factor, did not have a major impact on S. suis interactions with microglia. Studies with microglia helped to confirm previous findings in vivo in mice, as the WT S. suis strain induced the up-regulation of TLR2 and the production of several pro-inflammatory mediators, including TNF-α and MCP-1. As observed in mice, S. suis induced NF-kB translocation, which was more rapid for cells stimulated with the CPS-deficient mutant, suggesting that bacterial cell wall components are potent inducers of NF-kB. Moreover, WT S. suis promoted phosphotyrosine, PKC and different mitogen-activated protein kinase (MAPK) events. However, microglia infected with the CPS-deficient mutant showed overall stronger and more sustained phosphorylation profiles. Finally, the CPS also modulated S. suis-induced inducible nitrogen oxide synthase (iNOS) expression and further nitric oxide production in microglia, which could be related to neurotoxicity and vasodilatation in vivo. We are confident that our results may help to more fully understand the mechanisms underlying S. suis induction of inflammation, leading to the design of more efficient anti-inflammatory strategies for sepsis and meningitis. Finally, we believe this experimental model of infection in mice could also be useful for studying the pathogenesis of infections of the CNS, due to other bacteria.

Les tumeurs des cellules de la granulosa (GCTs) sont des tumeurs avec un potentiel malin ayant tendance à récidiver, provoquant ainsi la mort dans 80% des cas de stade avancé consécutif à une rechute. Bien que les GCTs représentent 5% des tumeurs ovariennes, peu d’études ont évalué les protocoles de traitement adjuvant pour la maladie avancée ou récurrente. Notre but était d’évaluer l’efficacité de la voie de signalisation du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire A (VEGFA) comme cible pour le traitement de la GCT utilisant le modèle murin transgénique Ptentm1Hwu/tm1Hwu; Ctnnb1tm1Mmt/+; Amhr2tm3(cre)Bhr/+ (PCA) qui reproduit le stade avancé de la maladie humaine. Un anticorps anti-VEGFA a été administré une fois par semaine par voie intrapéritonéale (IP) à partir de 3 semaines d’âge. La thérapie anti-VEGFA a permis une réduction de la taille des tumeurs à 6 semaines d’âge (p<0.05) et une prolongation de la survie des animaux traités, lorsque comparé aux animaux contrôles. L’analyse des GCTs a montré une réduction significative de la prolifération cellulaire (p<0.05) et de la densité microvasculaire (p<0.01) mais aucune différence significative n’a été détectée dans l’apoptose cellulaire. p44/p42 MAPK, un effecteur de la signalisation pour le récepteur 2 de VEGFA (VEGFR2) associé à la prolifération cellulaire, était moins activé dans les tumeurs traitées (p<0.05). Par contre, l’activation d’AKT, un effecteur impliqué dans la survie cellulaire, était similaire d’un groupe à l’autre. Ces résultats suggèrent que l’anticorps anti-VEGFA réduit la prolifération cellulaire et la densité microvasculaire chez les souris PCA par inhibition de la voie de signalisation VEGFR2-MAPK, inhibant ainsi la croissance tumorale. En conclusion, l’efficacité de la thérapie anti- VEGFA mérite d’être évaluée en essais contrôlés randomisés pour le traitement des GCTs chez l’homme. / Ovarian granulosa cell tumors (GCTs) are potentially malignant tumors that have a tendency for late recurrence and cause death in 80% of women with advanced GCT due to recurrent disease. Although GCTs represent 5% of ovarian tumors in women, few studies have evaluated adjuvant treatment protocols for advanced or recurrent disease. Our goal was to determine the potential of targeting the vascular endothelial growth factor A (VEGFA) signaling pathway for the treatment of GCT. We used a genetically engineered mouse model, Ptentm1Hwu/tm1Hwu; Ctnnb1tm1Mmt/+; Amhr2tm3(cre)Bhr/+ (PCA), which imitates the advanced human disease. A monoclonal anti-VEGFA antibody was administered by intra-peritoneal injection once a week beginning at 3 weeks of age. Anti-VEGFA therapy significantly decreased tumor weights by 6 weeks of age (p<0.05) and increased survival in treated animals in comparison to controls. Significant decreases in tumor cell proliferation (p<0.05) and microvessel density (p<0.01), but no significant difference in apoptosis was found in PCA tumors. p44/p42 MAPK, a VEGFA receptor 2 (VEGFR2) signaling effector associated with cell proliferation, was significantly less activated in anti-VEGFA-treated tumors (p<0.05). In contrast, AKT activation, a VEGFR2 signaling effector associated with cell survival was similar among all groups. These results suggest that anti-VEGFA therapy effectively reduces cell proliferation and microvessel density in PCA mice by inhibition of the VEGFR2-MAPK pathway, resulting in inhibition of GCT growth. We conclude that anti-VEGFA therapy merits further investigation in the form of controlled randomized trials for the treatment of human GCT.

Les premières cellules progénitrices lympho-myéloïdes (LMPP) entrent dans le thymus et commencent leur processus de différenciation au stade double négatif (DN, CD4-CD8-). Après un réarrangement fonctionnel de la chaine bêta de leur récepteur des cellules T (RCT), les cellules reçoivent des signaux de différenciation, de prolifération, de survie et de sélection et passent au stade double positif (DP, CD4+CD8+). Ensuite, la chaine alpha du RCT est réarrangée et testée via les sélections positive et négative. Si le RCT reçoit un signal ni trop fort, ni trop faible, les cellules passent au stade simple positif où elles exprimeront soit la molécule CD4 ou CD8. ERK3, une MAPK non-conventionnelle, joue un rôle important dans le développement thymique. Des études précédentes ont démontré qu’une déficience en ERK3 diminue de 50 % la cellularité thymique et de 75% le nombre de cellules simples positives CD4 (CD4SP). Nous avons posé comme hypothèses qu’il y a une augmentation de l’apoptose chez les thymocytes DP de souris Erk3-/- et que cette déficience chez les thymocytes DP affecterait la sélection positive des cellules DP, réduisant ainsi le nombre de thymocytes CD4SP. Afin de vérifier la première hypothèse, nous avons regardé les niveaux d’apoptose grâce à la cytométrie en flux et par immunohistochimie. Dans les deux cas, nous étions incapables de détecter une différence du niveau d’apoptose chez les thymocytes DP entre les souris Erk3+/+ et Erk3-/-. Ensuite, nous nous sommes posés la question suivante : La demi-vie des thymocytes DP Erk3-/- était-elle plus courte que le type sauvage? La demi-vie des thymocytes DP a été mesurée à l’aide de l’étude des réarrangements secondaires de la chaine alpha du RCT par PCR semi-quantitatif et à l’aide de cultures de thymus fœtaux. En effet, ERK3 semble important pour prolonger la demi-vie des thymocytes DP. Ensuite, nous avons utilisé des marqueurs cellulaires différentiels (CD69, CD5 et RCT) pour regarder si les thymocytes DP sont capables de passer la sélection positive. En effet, il y a moins de thymocytes DP Erk3-/- qui sont CD69fort, CD5fort et RCTfort. Finalement, nous voulons savoir si les fonctions de ERK3 passent par MK5, son seul partenaire d’interaction connu à ce jour. Après la caractérisation du thymus de la souris Mk5-/-, nous observons que seulement la réduction du nombre de thymocytes CD4SP est identique à celle des thymocytes CD4SP de la souris Erk3-/-. En conclusion, ces résultats révèlent des fonctions importantes pour la molécule ERK3 lors du processus de sélection positive, le maintient de la demi-vie des thymocytes DP et lors de la régulation de développement thymique de manière MK5-dépendante et -indépendante. / Early thymic progenitor cells (ETP) enter the thymus and begin their differentiation process at the double negative (DN) stage, having no CD4 and CD8 expression. After a functional rearrangement of the beta chain of the T-cell receptor (TCR), the cells receive differentiation, proliferation, survival, and selection signals and pass to the double positive (DP) stage and acquire the expression of CD4 and CD8 molecules. Then, the TCR alpha chain is rearranged and the fully composed TCR is tested through positive and negative selection. If the TCR receives a signal that is just right (not too strong or too weak), the cells pass to the single-positive stage by acquiring either the CD4 or CD8 molecule. ERK3, an unconventional MAPK, plays an important role in thymic development. Previous studies have shown that a deficiency in ERK3 decreases by 50% the total thymic cellularity and by 75% the number of CD4 single- positive cells (CD4SP). We hypothesized that there is an increase in apoptosis in DP thymocytes of Erk3-/- mice for and that this deficiency would affect the positive selection of DP cells, resulting in a reduced number of CD4SP. To test the first hypothesis, we looked at apoptosis levels by flow cytometry and immunohistochemistry. In both cases, we were unable to detect a difference in the level of apoptosis in DP thymocytes from Erk3+/+ and Erk3-/- mice. We then made a second assumption, that the half-life of Erk3-/- DP thymocytes for was shorter, which was measured by secondary rearrangements of the RCT alpha chain by semi-quantitative PCR and cultures of fetal thymi. Indeed, ERK3 seems important to extend the half- life of DP thymocytes. Next, we used differential cell markers (CD69, CD5, and TCR) to see if the DP thymocytes are able to pass positive selection. Indeed, there are less DP thymocytes Erk3-/- that are CD69hi, CD5hi, and TCRhi. Finally, we wanted to know whether the functions of ERK3 passes through MK5, its only interacting partner known to date. After characterization of the thymus of Mk5-/- mice, we observe that only the reduction of CD4SP thymocytes is identical to that of CD4SP thymocytes of Erk3-/-mice. In conclusion, these results reveal important functions for the molecule ERK3 for maintaining the half-life of DP thymocytes, for the process of positive selection and for regulating T-cell development in a MK5-dependent and - independent manner.

Mammalian oocytes undergoing meiotic maturation are transcriptionally silent and gene expression is therefore regulated at the level of translation. One of the well established mechanisms employed in translational regulation of maternal mRNAs in oocytes is cytoplasmic polyadenylation. This process is generally controlled by phosphorylation and activation of cytoplasmic polyadenylation element binding protein (CPEB). The aim of this thesis is to determine the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) in regulation of CPEB-mediated cytoplasmic polyadenylation in maturing mouse and porcine oocytes. For this purpose, MAPK activity was inhibited using its specific inhibitor, GDC-0994 and the effect of MAPK inhibition on cyclin B1 mRNA polyadenylation was monitored. In mouse oocytes, MAPK inhibition impaired neither cyclin B1 mRNA polyadenylation nor its translation and MAPK is thus unlikely to be involved in regulation of cytoplasmic polyadenylation in this species. Based on the results of experiments performed using porcine oocytes, the possible role of MAPK in CPEB-mediated cytoplasmic polyadenylation can neither be confirmed nor ruled out. Keywords: cytoplasmic polyadenylation, mouse oocyte, porcine oocyte, mitogen-activated protein kinase (MAPK), cyclin B1, GDC-0994 inhibitor

Le cancer papillaire de la thyroïde (CPT) est la tumeur endocrine la plus fréquente. Des anomalies moléculaires activant la voie des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases) sont identifiées, de façon mutuellement exclusive, dans environ 70% des cas. Il s’agit de réarrangements chromosomiques, le plus souvent de type RET/PTC (10%), de mutations ponctuelles activatrices des trois isoformes de l’oncogène RAS (H, N et K-RAS) (10%), ou de l’oncogène B-RAF (50%). La mutation « hot spot » B-RAFV600E est la plus fréquemment identifiée, elle est associée à une plus grande agressivité clinique (diagnostic à un stade tardif, risque de récidives et de décès accru). Ces évènements moléculaires ont pour conséquence commune l’activation de la voie des MAPK, se traduisant en aval par la phosphorylation de MEK (Mitogen-activated Extracellular signal-Regulated Kinase) puis de ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase). Cette dernière est régulée négativement par des phosphatases, appartenant à la famille des Dual Specificity Phosphatases (DUSPs), d’expression ubiquitaire, et en particulier de deux phosphatases spécifiques de ERK, l’une cytoplasmique (DUSP6) et l’autre nucléaire (DUSP5). Nous avons fait l’hypothèse que ces phosphatases pouvaient être soit des gènes suppresseurs de tumeurs (leur perte d’expression conduisant à une augmentation de phosphorylation de ERK et une prolifération accrue), soit des marqueurs du degré d’activation de la voie MAPK dans le cadre d’une boucle de rétrocontrôle négatif. Ceci nous a conduits à analyser la régulation et l’expression de ces phosphatases dans trois modèles : la lignée cellulaire PCCL3 (thyroïde de rat), exprimant l’un des trois principaux oncogènes mutés dans les CPT (RET/PTC3 ou H-RASV12 ou B-RAFV600E) sous le contrôle d’un promoteur inductible par la doxycycline, des lignées cellulaires humaines dérivant de CPT et des CPT humains. (...) / Papillary thyroid cancer (PTC) is the most common endocrine malignancy. Mutually exclusive and activating alterations of the MAPK pathway (Mitogen-Activated Protein Kinases) are identified in 70% of cases. Common mutations found in PTCs are point mutation of the B-RAF (50%) and RAS genes (10%) as well as RET/PTC chromosomal rearrangements (10%). The hot spot B-RAFV600E mutation is the most frequently alteration identified and is connected with agressive clinical characteristics (high stage at diagnosis, high recurrence risk and death). These molecular events lead to constitutive activation of the MAPK pathway, resulting in MEK (Mitogen-activated Extracellular signal-Regulated Kinase) and ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) phosphorylation. ERK is negatively regulated by phosphatases and among them, Dual Specificity Phosphatases (DUSPs), ubiquitary expressed, in particular two ERK-specific phosphatases DUSP5 (nuclear) and DUSP6 (cytosolic). We hypothesized that these phosphatases could have tumor supressor properties (i.e. their loss would be associated with an increase in MAPK pathway activation) or may serve as a surrogate marker of MAPK pathway activation in the context of a negative feedback loop. We analysed regulation and expression of both phosphatases in 3 models: three PCCL3 cell lines (rat thyroid cells) expressing one of the most common oncogene identified in PTCs (RET/PTC3 or H-RASV12 or B-RAFV600E) under the control of a doxycycline-inducible promoter, human PTC-derived cell lines and human PTC. We demonstrated that MAPK pathway activation was correlated with induction of DUSP5 and DUSP6. These phosphatases are involved in a negative feedback loop that contributes to a tight regulation of phospho-ERK levels. DUSP5 and DUSP6 mRNA are overexpressed in human PTCs, especially in B-RAF mutated tumors suggesting a higher MAPK signaling output in these agressive PTCs. Silencing of DUSP5 and/or DUSP6 by small interfering RNA does not affect proliferation of human B-RAFV600E thyroid carcinoma-derived cell lines, suggesting the lack of tumor suppressor gene role. Compensatory changes in expression of DUSPs when a specific one is inactivated may explain this lack of effect. On the opposite, a DUSP6 pharmacological inhibitor induced a concentration dependent decrease in proliferation of human B-RAFV600E cells, suggesting « off-target » effect of this inhibitor. In a second part, we analysed the regulation of DUSP5 expression, which is a target of the MAPK pathway activation. We demonstrated, using pharmacological inhibitors, that DUSP5 is an early response gene, regulated mostly by the MAPK pathway, at the transcriptional level. Two contiguous CArG boxes that bind serum response factor (SRF) were found in a 1Kb promoter region, as well as several E twenty-six transcription factor family binding sites (EBS). These sites potentially bind Elk-1, a transcription factor activated by ERK1/2. Using wild type or mutated DUSP5 promoter reporters, we demonstrated that SRF plays a crucial role in serum induction of DUSP5 promoter activity, the proximal CArG box being important for SRF binding in vitro and in living cells. Moreover Elk-1 was bound in vitro to a promoter region containing the proximal CArG box and a putative EBS. Its specific binding to SRF was necessary to elicit promoter response to dominant positive Elk-VP16 and to enhance the response to serum stimulation. Altogether our results suggest that the MAPK pathway is more active in B-RAFV600E PTC than in PTC with other genetic alteration and could explain their clinical agressivity. DUSP5 and DUSP6, as well as phosphorylated MEK, are markers of activation of the MAPK pathway. Neither phosphatase has tumor suppressor properties in our thyroid cancer cell models. Our results suggest redundancy and functional compensation among DUSPs. 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