Chez les mammifères, l'environnement est un puissant régulateur de l'expression des gènes. Par exemple, en fonction de l'alimentation, la disponibilité en nutriments, en particulier en acides aminés, est responsable de l'induction de l'expression d'un certain nombre de gènes. Ainsi, des mécanismes moléculaires sont mis en jeu de façon à permettre la détection de ces variations et d'y répondre de façon appropriée. Lorsque l'un des neuf acides aminés essentiels vient à manquer, on observe une augmentation de la transcription de certains gènes. Cette activation de la transcription requière d'une part l'accumulation du facteur de transcription ATF4 et d'autre part la phosphorylation du facteur de transcription ATF2. La voie ATF4 a été identifiée et relativement bien décrite. En revanche les éléments régulateurs de la voie de signalisation en amonts du facteur ATF2 restent inconnus. Le but de ma thèse était donc de déterminer les différents intermédiaires responsables de la phosphorylation d'ATF2 en réponse à une carence en acides aminés. J'ai ainsi montré qu'une carence en acides aminés provoque la mise en jeu d'un module MAPK composé de MEKK1>MKK7>JNK2 contrôlant la phosphorylation d'ATF2 sur les résidus thréonine 69 et 71. J'ai montré que ce module est régulé en amont par deux GTPases Cdc42+Rac1 et par la protéine Gα12. Enfin, j'ai démontré l'impact de cette nouvelle voie de signalisation sur la transcription AARE-dépendante du gène ATF3 en réponse à une carence en acides aminés.

Introduction : Dans le cœur adulte, l'ischémie et la reperfusion entraînent des perturbations électriques, mécaniques, biochimiques et structurales qui peuvent causer des dommages réversibles ou irréversibles selon la sévérité de l'ischémie. Malgré les récents progrès en cardiologie et en chirurgie fœtales, la connaissance des mécanismes impliqués dans la réponse du myocarde embryonnaire à un stress hypoxique transitoire demeure lacunaire. Le but de ce travail a donc été de caractériser les effets chrono-, dromo- et inotropes de l'anoxie et de la réoxygénation sur un modèle de cœur embryonnaire isolé. D'autre part, les effets du monoxyde d'azote (NO) et de la modulation des canaux KATP mitochondriaux (mitoKATP) sur la récupération fonctionnelle postanoxique ont été étudiés. La production myocardique de radicaux d'oxygène (ROS) et l'activité de MAP Kinases (ERK et JNK) impliquées dans la signalisation cellulaire ont également été déterminées.<br />Méthodes : Des cœurs d'embryons de poulet âgés de 4 jours battant spontanément ont été placés dans une chambre de culture puis soumis à une anoxie de 30 min suivie d'une réoxygénation de 60 min. L'activité électrique (ECG), les contractions de l'oreillette, du ventricule et du conotroncus (détectées par photométrie), la production de ROS (mesure de la fluorescence du DCFH) et l'activité kinase de ERK et JNK dans le ventricule ont été déterminées au cours de l'anoxie et de la réoxygénation. Les cœurs ont été traités avec un bloqueur des NO synthases (L-NAME), un donneur de NO (DETA-NONOate), un activateur (diazoxide) ou un inhibiteur (5-HD) des canaux mitoKATP, un inhibiteur non-spécifique des PKC (chélérythrine) ou un piégeur de ROS (MPG).<br />Résultats : L'anoxie et la réoxygénation entraînaient des arythmies (essentiellement d'origine auriculaire) semblables à celles observées chez l'adulte, des troubles de la conduction (blocs auriculo-ventriculaires de 1er, 2ème et 3ème degré) et un ralentissement marqué du couplage excitation-contraction (E-C) ventriculaire. En plus de ces arythmies, la réoxygénation déclenchait le phénomène de Wenckebach, de rares échappements ventriculaires et une sidération myocardique. Aucune fibrillation, conduction rétrograde ou activité ectopique n'ont été observées. Le NO exogène améliorait la récupération postanoxique du couplage E-C ventriculaire alors que l'inhibition des NOS la ralentissait. L'activation des canaux mitoKATP augmentait la production mitochondriale de ROS à la réoxygénation et accélérait la récupération de la conduction (intervalle PR) et du couplage E-C ventriculaire. La protection de ce couplage était abolie par le MPG, la chélérythrine ou le L-NAME. Les fonctions électrique et contractile de tous les coeurs récupéraient après 30-40 min de réoxygénation. L'activité de ERK et de JNK n'était pas modifiée par l'anoxie, mais doublait et quadruplait, respectivement, après 30 min de réoxygénation. Seule l'activité de JNK était diminuée (-60%) par l'activation des canaux mitoKATP. Cet effet inhibiteur était partiellement abolit par le 5-HD.<br />Conclusion: Dans le cœur immature, le couplage E-C ventriculaire semble être un paramètre particulièrement sensible aux conditions d'oxygénation. Sa récupération postanoxique est améliorée par l'ouverture des canaux mitoKATP via une signalisation impliquant les ROS, les PKC et le NO. Une réduction de l'activité de JNK semble également participer à cette protection. Nos résultats suggèrent que les mitochondries jouent un rôle central dans la modulation des voies de signalisation cellulaire, en particulier lorsque les conditions métaboliques deviennent défavorables. Le cœur embryonnaire isolé représente donc un modèle expérimental utile pour mieux comprendre les mécanismes associés à une hypoxie in utero et pour améliorer les stratégies thérapeutiques en cardiologie et chirurgie fœtales.

La phosphorylation des protéines constitue la modification post-traductionnelle la plus importante chez les eucaryotes. Réalisée par des protéines kinases, elle intervient dans plusieurs processus cellulaires et en particulier dans la signalisation. La grande famille des kinases est subdivisée en plusieurs groupes dont les MAPKs qui sont caractérisées par un relais de phosphorylation comprenant trois niveaux (MAPKKK-MAPKK-MAPK). Le rôle des MAPKs a été démontré chez un grand nombre d’organismes et est lié fonctionnellement à plusieurs processus biologiques. Dans ce projet, nous avons essayé de mettre en évidence la fonction de trois MAPKKK (MKKK19, MKKK20 et MKKK21) chez Arabidopsis thaliana, une plante modèle dont le génome a été entièrement séquencé en 2000. Ces trois kinases sont similaires aux kinases FRK1 et FRK2 qui sont impliquées dans le développement des gamètes mâles et femelles chez la pomme de terre sauvage Solanum chacoense. Les MKKK19-21 sont fortement exprimées au niveau de la fleur et plus précisément dans le pollen. L’analyse des lignées de plantes simples mutants pour ces trois kinases ne montre aucun défaut développemental évident en conditions normales suggérant fortement une redondance fonctionnelle entre ces gènes. Par contre, les plantes sous-exprimant les MKKK19-21 produisent un grand nombre de grains de pollen déformé et non viable. La croissance des tubes polliniques est aussi affectée dans ces mutants. Les observations microscopiques ont montré que c’est au stade tricellulaire de la microsporogenèse que ces lignées mutantes sont affectées. Ainsi, ces trois kinases joueraient un rôle important dans la phase tardive du développement pollinique chez Arabidopsis. De façon à déterminer les protéines pouvant agir tant en amont qu’en aval des MKKK19-21, un criblage par la méthode de double hybride chez la levure a été réalisé à partir d’une banque d’ADNc des transcrits d’A.thaliana. Ceci nous a permis d’identifier un grand nombre d’interactants, dont plusieurs protéines kinases pouvant former des voies de signalisation avec les trois MKKK19-21. C’est le cas de la MPK18 qui interagit spécifiquement avec la MKKK20 et pour laquelle un rôle dans la régulation des microtubules corticaux (MTC) avait été démontré. Les résultats de l’analyse des mutants MKKK20 ainsi que les essais kinases nous ont permis de placer la MKKK20 en amont de la MPK18 dans la régulation des MTC. De plus, nous avons pu montrer que la MKK3 interagit spécifiquement avec la MKKK20 parmi les dix MKKs d’Arabidopsis et que ces deux kinases peuvent former un module MAPK aussi lié fonctionnellement aux MTC. L’analyse des doubles mutants (mkkk20/mpk18 et mkk3/mpk18) ainsi que les essais kinases et les observations microscopiques des polymères microtubulaires nous ont permis de caractériser deux voies impliquées dans la régulation des MTC. La première voie, celle de la MKKK20 et de la MPK18 est non canonique, ne nécessitant pas la présence d’une MKK entre les deux, alors que la deuxième voie serait canonique et comprend la MKKK20, MKK3 et possiblement d’autre(s) MPK(s) en aval. Nos résultats suggèrent que ces deux voies sont indépendantes et non synergiques jouant un rôle dans l’instabilité dynamique des MT chez Arabidopsis. / Protein phosphorylation is the major post-translational molecular mechanism through which many eukaryotic proteins are regulated. Phosphorylation is involved in several biological processes and is carried out by kinase enzymes. The very large family of kinases is divided into many subgroups including MAPKs which function as a canonical module of three stepwise phosphorylation events (MAPKKK-MAPKK-MAPK). In this project, we aimed to study the function of three MAPKKK, MKKK19, 20 and 21 in Arabidopsis thaliana, as it has been shown that two of their potential orthologues, FRK1 and 2 in Solanum chacoense are involved in male (pollen) and female (embryo sac) gametophyte development. We found that the MKKK19-21 were highly expressed in reproductive organs, more specifically inside pollen grains. MKKK19-21 single mutants showed WT phenotype under normal conditions, suggesting a possible functional redundancy from these genes. To overcome this, down-regulation of endogenous MKKK19-21 expression via transformation of WT A. thaliana with an artificial microRNA (amiRNA) construct was made. This led to the production of plants exhibiting a high number of dead pollen grains, as well as with defects in pollen tube growth for the viable ones. Microscopic observations of microsporogenesis showed that pollen developmental defects occurred at the tricellular stage. Consequently, the three MKKK19-21 are functionally important for the late stage of pollen development in A. thaliana. In order to find proteins acting both upstream and downstream of MKKK20, a yeast two-hybrid screen was performed against an Arabidopsis cDNA library. This led to the identification of a large number of interacting proteins. These proteins belong to several functional categories with some that could act in signaling pathways with MKKK19-21. Among them, MAPK18 that was demonstrated to regulate cortical microtubules (CMT) and that was found to interact specifically with MKKK20. The results of MKKK20 mutant plants analyses and kinase assays indicate that MKKK20 would act upstream of MPK18 in regulating CMT. The MKK3 was also found from a directed Y2H screen, and was shown to specifically interact with MKKK20 among the 10 Arabidopsis MKKs. MKK3 mutant analysis showed that both kinases could form a MAPK signaling pathway functionally linked to CMT. Furthermore, double mutants (mkkk20/mpk18 and mkk3/mpk18) analysis and kinase assays as well as microscopic observations of microtubule polymers allowed us to postulate that two different signaling pathways are involved in the regulation of CMT. The first one, considered as non-canonical MAPK pathway consists of MKK20 and MPK18, bypassing the need of an MKK, while the second one is a canonical pathway that comprises MKKK20, MKK3 and possibly other MPK(s). We concluded from these results that the two pathways are independent and do not work synergistically in MT dynamic instability in Arabidopsis cells.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) est un peptide vasoconstricteur qui joue un rôle proéminent dans la progression des maladies cardiovasculaires, grâce à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), ainsi que par l'hyperactivation des voies de signalisation qui promeuvent la croissance et l'expression aberrante des gènes. Les histones désacétylases (HDACs), par leur aptitude à modifier le statut d'acétylation des résidus lysine dans les protéines d'histones et non-histones, régulent la transcription des gènes. Des études récentes ont montré qu'une activation accrue des HDACs, notamment HDAC5, est associée à des troubles vasculaires tels que l'athérosclérose. Cependant, le rôle de l'IGF-1 dans l'activation des HDACs par phosphorylation demeure mal caractérisé. Donc, dans les études présentes, on a examiné l’effet de l’IGF-1 sur la phosphorylation de HDAC5 dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) de type A10 et on a identifié les voies de signalisation impliquées dans ce processus. Le traitement des CMLV avec l’IGF-1 a augmenté la phosphorylation de HDAC5 sur la serine 498 de manière temps- et dose-dépendante. La pré-incubation des cellules avec l’AG1024, un inhibiteur pharmacologique du récepteur membranaire à l’IGF-1, a significativement atténué la phosphorylation d’HDAC5 induite par l'IGF-1. Par contre, le prétraitement avec l’AG1478, un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique, n'a pas eu d'effet significatif sur les niveaux de phosphorylation d’HDAC5. En outre, le blocage pharmacologique de la voie MAP kinase avec divers inhibiteurs (PD98059, UO126, SP600125 et SB203580) n’a pas abrogé la phosphorylation d’HDAC5, cependant les inhibiteurs de la voie protéine kinase B (PKB)/PI3-K, SC-66 et wortmannine respectivement, ont complètement aboli la phosphorylation d’HDAC5 induite par l’IGF-1. Ces données ont été confirmées par des expériences d’immunofluorescence et de silençage génique de PKB par interférence d’ARN. En outre, le prétraitement des cellules avec le diphénylèneiodonium (DPI) et l’apocynine, deux inhibiteurs de la NAD(P)H oxydase, ainsi que l'antioxydant N-acétyl-cystéine (NAC), a atténué la phosphorylation de HDAC5 et de PKB par l’IGF-1. De plus, le silençage génique de Nox4, la principale NAD(P)H oxydase des CMLV, a atténué la phosphorylation d’HDAC5 induite par l’IGF-1. De plus, l’utilisation des techniques d’extraction nucléaire a indiqué que le SC-66 et le DPI inhibent l’exportation nucléaire de HDAC5 induit par IGF-1. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1 induit la phosphorylation et l’exportation nucléaire de HDAC5 de façon ERO et PKB-dépendante dans les CMLV. / Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), a potent mitogenic and vasoactive factor, has been shown to play a role in the development of cardiovascular diseases. This occurs through the generation of reactive oxygen species (ROS) as well as through the hyperactivation of mitogenic and growth promoting signaling pathways and the subsequent alteration in gene expression. Histone deacetylases (HDACs), by their ability to modify the acetylation status of the lysine residues in histone and non-histone proteins, regulate gene transcription. Recent studies have demonstrated that a heightened activation of HDACs, notably HDAC5, is associated with vascular disorders such as atherosclerosis. However, a role of IGF-1 in HDAC phosphorylation and activation has not been investigated. Therefore, in the present studies, we examined the effect of IGF-1 on the phosphorylation of HDAC5 in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and identified the signaling pathways involved in this process. Treatment of A10 VSMCs with IGF-1 enhanced the phosphorylation of HDAC5 at serine 498 in a time and dosedependent fashion. Pretreatment of cells with AG1024, a selective pharmacological inhibitor of IGF-1R, significantly inhibited IGF-1-induced HDAC5 phosphorylation in A10 VSMCs whereas AG1478, a selective inhibitor of epidermal growth factor receptor (EGFR), did not have an inhibitory effect on the levels of phospho-HDAC5. Pharmacological blockade of the MAPK pathway with PD98059, UO126, SP600125 and SB203580 had no effect on HDAC5 phosphorylation, whereas inhibitors of the PI3K/ PKB pathways, wortmannin and SC-66 respectively, almost completely attenuated IGF- 1-induced HDAC5 phosphorylation. These findings were confirmed by immunofluorescence localization of phospho-HDAC5 and by siRNA-induced silencing of PKB. In addition, pretreatment of A10 VSMCs with Diphenyleneiodonium (DPI) and apocynin, two NAD(P)H oxidase inhibitors, as well as the antioxidant N-Acetyl-Cysteine (NAC), resulted in an attenuation of IGF-1-induced HDAC5 and PKB phosphorylation. Furthermore, siRNA-induced silencing of Nox4, the main NADPH oxidase expressed in VSMC, inhibited IGF-1 induced HDAC5 phosphorylation. Moreover, IGF-1-induced phosphorylation of HDAC5 resulted in its nuclear export, which was reversed by blockade of PKB by SC-66 or NAD(P)H oxidase inhibition by DPI. In summary, these data demonstrate that IGF-1 induces the phosphorylation and nuclear export of HDAC5 in a Nox4-derived ROS- and PKB-dependent fashion in VSMCs.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Endometrial adenocarcinoma (EAC) is the most frequently diagnosed gynecological cancer of the female genital tract in the Western world. Research studies in EC is difficult to conduct on human tumor samples due to the complex nature of tumor arousal and genetic heterogeneousness in the human population. Therefore, inbred animal models can be promising tools to use in EC research due to similar histopathology and pathogenesis as humans. Studies performed on MAP2K1 and CCND1 has shown that their altered expression play a crucial role in carcinogenesis. CCND1 has been demonstrated to have oncogenic properties when overexpressed in human neoplasias. The aim of this study is to investigate gene expression levels of MAP2K1 and CCND1 in BDII rat model of endometrial adenocarcinoma cells. Quantitative real-time PCR was used to analyze expression levels of MAP2K1 and CCND1 genes in BDII/Han rat model of endometrial cancer cells using TaqMan approach. The differences in gene expression levels of MAP2K1 and CCND1 between pathologically EAC malignant and nonmalignant cells showed an upregulation of MAP2K1 and CCND1 in EAC malignant cells. The analyzed data presented observable mean differences between MAP2K1 and CCND1 in several endometrial cell lines that were examined. Although no statistical significance was reached, an alteration in gene expression levels in malignant and nonmalignant endometrial cells could be observed. Furthermore, this present study shows observable upregulation of MAP2K1 and CCND1 in endometrial carcinoma cells vs. nonmalignant endometrium cells and encourages further investigation of the role of CCND1 and MAP2K genes in endometrial carcinogenesis.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Our laboratory is primarily interested in novel pharmacological intervention of cell proliferation and survival pathways expressed in various types of cancer. These cyto-protective pathways can be activated in response to growth factor stimulation, toxic insult and radiation. In our studies, we utilized novel drug combinations with and without radiation to enhance breast & prostate tumor cell death both in vitro and in vivo. Previous studies from our group have shown that UCN-01 and MEK1/2 inhibitors interact to cause tumor cell death in transformed cell lines in vitro. We extended this observation to an in vivo animal model system using the estrogen dependent breast cell carcinoma line MCF-7 and the estrogen independent breast cell carcinoma line MDA-MB-231. This drug combination was shown to profoundly reduce tumor cell proliferation in vivo and also exhibited the ability to significantly reduce ex-vivo tumor cell colony formation 30 days after cessation of the combination drug treatment. In addition, tumor cell death coincided with decreased ERK112 phosphorylation, reduced immunoreactivity of Ki67 and CD31. Overall, these studies demonstrate that UCN-01 and MEK112 inhibitors have the potential to suppress mammary tumor growth in vivo which is independent of p53 status, estrogen dependency, caspase-3 levels or oncogenic K-RAS expression. In our LnCap prostate carcinoma cell studies we demonstrated the impact of hCG and lovastatin in combination with ionizing radiation to radiosensitize and enhance tumor cell lethality. This enhancement was attributed to the hCG-induced activation of ERBB1 via a GPCR, MEK112 and metalloprotease dependent paracrine mechanism which was further enhanced by radiation. This enhanced cell killing effect was shown to involve prolonged activation of PARP1 which could be suppressed by inhibition of ERBB1, MEKl , PI3 kinase or PARP1. Therefore, the combination of hCG, lovastatin and radiation may represent a novel approach to kill prostate cancer cells and potential new therapy.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.