L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs. / Atherosclerosis is a chronic vascular inflammatory disease that develops gradually during life. While the control mechanisms of this disease are complex and variable, research continues to identify new protein candidates involved in atherogenesis. Angiopoietin-like2 (Angptl2) is a relatively unknown protein, recently shown to display angiogenic and pro-inflammatory properties. Based upon structural homology, Angptl2 is a member of the angiopoietin family; however, the Angptl2 receptor has not yet been clearly identified. The reported pathological situations in which Angptl2 may play a crucial role are multiple, but its molecular contribution in the development of atherosclerosis remains unknown. By differential display, we initially identified Angptl2 as being overexpressed in senescent endothelial cells, isolated and cultivated from internal mammary arteries of atherosclerotic patients undergoing coronary bypass. This observation was at the basis of my project. My specific objectives were 1) to determine the abundance of vascular Angptl2 in the presence of risk factors such as smoking and dyslipidemia, 2) to produce and purify a functional recombinant human Angptl2 protein in order to examine its effects on cellular function in vitro, and 3) to study the pro-atherogenic potential of Angptl2 in vivo using a mouse model of severe dyslipidemia. We showed that Angptl2 is preferentially secreted under pro-oxidant and pro-inflammatory conditions, with a 6-fold increase in endothelial Angptl2 expression in smoker coronary patients with chronic obstructive pulmonary disease. Based on these results, we hypothesized that, in addition to its known pro-inflammatory functions, Angptl2 has pro-oxidant properties. Accordingly, we demonstrated that recombinant Angptl2 stimulates the production of free radicals by HUVEC, an action exerted, at least in part, by the inhibition of the cytoprotective antioxidant pathway, Nrf2/HO-1, and potentially via the activation of the intracellular p38 MAPK pathway. In dyslipidemic LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice, we showed that the levels of endogenous Angptl2 in plasma, vascular tissue and atherosclerotic lesions increase in parallel with the development of atherosclerosis. In addition, stimulation with recombinant Angptl2 induces an inflammatory response, as assessed by the expression of cytokines and adhesion molecules and by infiltration of leukocytes into the vascular endothelium. Furthermore, intravenous infusion of purified recombinant Angptl2 for four weeks promoted a 10-fold increase in the formation of atherosclerotic plaques in LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice and doubled their circulating cholesterol levels. Finally, we also demonstrated that plasma Angptl2 is 6-fold higher in atherosclerotic patients than in age-matched healthy subjects. These studies therefore strongly suggest that Angptl2 could directly contribute to the development of atherosclerosis by promoting senescence, inflammation and oxidation in endothelial cells. Such properties indicate that Angptl2 may be both a new biomarker of atherosclerosis, as well as one of its contributors.

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20- 40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs. Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc, préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30 min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée. Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du DOR soit survenue. / Opioids are the most effective analgesics available but their use is limited by tolerance. Tolerance is related, at least in part, to receptor desensitization. Hence, the role of the present study was to better characterize the desensitization process, in particular concerning the role of the tyrosine kinase Src on regulation of delta opioid receptor signalling. Our results show that pharmacological inhibition with PP2 (administered at low concentration: 20-40µM) or molecular inhibition of the kinase with low expression levels of a dominant negative mutant of Src (0,2µg of DNA) potentiate the magnitude and duration of agonist-dependent (DPDPE; 1µM; 5 min) activation of the ERK pathway. We also showed that higher concentrations of Src inhibitors (80 and 100µM of PP2 or 1µg/ml of dominant negative mutant DNA) block the MAPK cascade following DOR stimulation by DPDPE. These observations indicate that Src has a biphasic effect on ERK activity, respectively potentiating or inhibiting agonist stimulation of the MAPK cascade at low and high levels of Src inhibition. We reasoned that high levels of Src blockers were interfering with ERK activation mechanism while low levels of inhibition were interfering with receptor desensitization. This possibility was tested by using cAMP accumulation assays to evaluate the effect of Src blockers (PP2, 20 µM; 1h) on agonist-induced desensitization. DOR stimulation by DPDPE inhibited forskolin stimulated cAMP production in a dose dependent manner with a maximal reduction of 61%. This inhibitory response was reduced by 72% following pre-exposure to DPDPE (1 µM, 30 min), an effect that was blocked by pre-treating cells with PP2 (PP2, 20 µM; 1 h) before desensitization. The protective effect of Src blockers did not involve changes in DOR internalization but interfering with internalization by using an internalization-deficient DOR mutant or hypertonic medium (0.4M sucrose) reduced this protection, indicating the need for optimal internalization in order for the protective effect of Src blockers to take place. Based on the latter observation it was possible to conclude that Src contribution to DOR desensitization is post-endocytic.

Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. / Vascular complications including increased contractility and cell proliferation are most common complications in diabetes, and chronic hyperglycemia seem to be an important contributing factor in this process. Gqα signaling pathway plays an important role in the regulation of vascular tone and aberration of these mechanisms may contribute to vascular complications in hyperglycemia/diabetes. The levels and activity of protein kinase C (PKC) and diacylglycerol (DAG) were shown to be up-regulated in diabeteshyperglycemia. In addition, studies on the expression of upstream signaling molecules of phosphatidyl inositol (PI) turnover were lacking. The enhanced activity/levels of protein PKC and DAG induced by high glucose in VSMC have been shown to be attributed to the increased oxidative stress. Furthermore, the levels of various vasoactive peptides including Ang II and ET-1 which are augmented in diabetes and under hyperglycemic conditions, may also contribute to the enhanced oxidative stress in diabetes/hyperglycemia. The work presented in this thesis was therefore undertaken to examine if hyperglycemia/diabetes could also modulate the expression of Gqα and phospholipase Cb (PLCβ) proteins and associated PI turnover signaling in A10 VSMC exposed to high glucose and to explore the molecular mechanisms by which high glucose modulates Gqα/PLC signaling. The first study was undertaken to investigate if hyperglycemia can modulate the expression of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 and associated signaling. Pre-treatment of A10 VSMC with high glucose (26 mM) for 3 days augmented the levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and β-2 proteins as compared to control cells which were restored to control levels by endothelin-1 (ET-1) ETA and ETB and angiotensin II (Ang II) AT1 receptor antagonists. In addition, ET-1-stimulated IP3 formation was also significantly higher in VSMC exposed to high glucose. Furthermore, treatment of A10 VSMC with Ang II and ET-1 also increased significantly the levels of Gq/11α and PLCβ proteins which were restored towards control levels by ETA/ETB and AT1 receptor antagonists. These results suggest that high glucose augmented the expression of Gq/11α, PLCβ and -mediated signaling in VSMC which may be attributed to activation of AT1, ETA and ETB receptors. The second study was undertaken to investigate the implication of oxidative stress in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and associated signaling in A10 VSMC and to explore the mechanism responsible for high glucose induced enhanced oxidative stress. We showed that the increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins in A10 VSMCs exposed to high glucose were restored to control levels by the antioxidant diphenyleneiodonium (DPI), and catalase, a scavenger of hydrogen peroxide, but not by 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) and uric acid, scavengers of peroxynitrite. In addition, endothelin-1 (ET-1)-stimulated production of IP3 that was enhanced by high glucose was also restored towards control levels by DPI and catalase. These results suggest that high glucose-induced enhanced oxidative stress that contributes to the enhanced expression of Gq/11α and PLCβ protein and signaling. Furthermore, the enhanced production of superoxide anion (O2-), NADPH oxidase activity and enhanced expression of p22(phox) and p47(phox) proteins induced by high glucose was restored to control levels by losartan, BQ123 and BQ788, the antagonists of angiotensin AT1 and endothelin-1 ETA/ETB receptors respectively. These results suggest that high glucose-induced enhanced levels of endogenous Ang II and ET-1, by increasing oxidative stress may contribute to the increased levels of Gq/11α and-mediated signaling in A10 VSMC. Since high glucose has been shown to increase growth factor receptor activation, we investigated, in the third study, the role of epidermal growth factor receptor (EGF-R) and platelet-derived growth factor receptor (PDGF-R) transactivation in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. The increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins induced by high glucose were restored to control levels by AG1478, an inhibitor of EGF-R, and AG1295, an inhibitor of PDGF-R as well as by PP2, an inhibitor of c-Src. High glucose-induced increased phosphorylation of EGF-R and PDGF-R which were abolished by AG1478, AG1295 and PP2. High glucose-induced enhanced levels of Gq, G11α and PLCβ were also attenuated by PD98059, an inhibitor of mitogen-activated protein kinase (MAPK), and wortmannin, an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K). In addition, high glucose-induced enhanced phosphorylation of ERK1/2 and AKT was also attenuated by AG1478 and AG1295. These results suggest that c-Src-induced transactivation of growth factor receptor contributes to the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α/PLC and-mediated cell signaling through MAPK/PI3K pathway. In conclusion, the studies presented in this thesis indicate that hyperglycemia increased the levels of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and mediated signaling. We provided evidence that high glucose-induced increased levels of Ang II and ET-1 may contribute to the enhanced production of O2- and H2O2 and results in enhanced oxidative stress which may be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. Finally, we demonstrated that high glucose-induced transactivation of growth factor receptors may also be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2.

L’athérosclérose est une maladie vasculaire inflammatoire chronique qui se développe progressivement au cours de la vie. Les mécanismes impliqués sont complexes et la recherche de nouveaux candidats impliqués dans l'athérogénèse est toujours d'actualité. L’Angiopoietine-like 2 (Angptl2) est une protéine relativement peu connue, aux propriétés pro-angiogéniques et pro-inflammatoires, qui appartient par homologie à la grande famille des angiopoietines, mais dont le récepteur n'est pas encore clairement identifié. Les situations pathologiques dans lesquelles l’Angptl2 jouerait un rôle crucial sont diverses, mais sa contribution moléculaire dans le développement de l’athérosclérose est inconnue. Par differential display, nous avons initialement identifié l'Angptl2 comme étant surexprimée dans des cellules endothéliales sénescentes, isolées et cultivées à partir d'artères mammaires internes de patients athérosclérotiques ayant subi un pontage coronarien. Cette découverte a été la à base de mon projet, et mes objectifs ont été 1) de déterminer l'implication de l’Angptl2 vasculaire en présence de facteurs de risques tels que le tabagisme et la dyslipidémie, 2) de produire et de purifier une protéine recombinante fonctionnelle de l’Angptl2 afin d'identifier in vitro de nouvelles propriétés cellulaires de l'Angptl2 et 3) d'étudier in vivo le potentiel pro-athérogénique de l'Angptl2 recombinante dans un modèle murin de dyslipidémie sévère. Nous avons montré que l’Angptl2 est sécrétée préférentiellement dans des conditions pro-oxydantes et pro-inflammatoires, avec une augmentation de son expression endothéliale de l’ordre de 6 fois chez des patients coronariens fumeurs atteints de maladie pulmonaire obstructive chronique. Suite à ces résultats, nous avons émis l’hypothèse que l’Angptl2, en plus de ses fonctions pro-inflammatoires connues, possède des propriétés pro-oxydantes. Nous avons démontré que l’Angptl2 recombinante stimule en effet la production de radicaux libres dans des HUVEC en culture, via l’inhibition partielle de la voie cytoprotectrice antioxydante Nrf2/HO-1 et potentiellement via l'activation de kinase intracellulaire de type p38. A l'aide de souris dyslipidémiques LDLr-/-; hApoB-100+/+, nous avons démontré que le niveau d’Angptl2 plasmatique, vasculaire et dans les plaques athéromateuses, augmente parallèlement avec le développement de l’athérosclérose. De plus, une stimulation avec l’Angptl2 recombinante engendre chez ces souris une réponse inflammatoire évaluée par l’expression endothéliale de cytokines et de molécules d'adhésion et par l’infiltration de leucocytes sur l’endothélium vasculaire. Finalement, l’administration intraveineuse de la protéine recombinante d’Angptl2 pendant quatre semaines à des souris LDLr-/-; hApoB-100+/+ augmente de 10 fois l'expansion de la plaque athérosclérotique et double leur taux de cholestérol circulant. Nous avons aussi montré que chez des patients athérosclérotiques, l'Angptl2 plasmatique est 6 fois plus élevée que chez des sujets sains du même âge. Nos études semblent donc définir l’Angptl2 comme un facteur contribuant directement au développement de l'athérosclérose en favorisant la sénescence, l’inflammation et l’oxydation des cellules endothéliales. Ces propriétés pourraient globalement définir l'Angptl2, non seulement comme un nouveau biomarqueur circulant de l’athérosclérose, mais également comme l'un de ses promoteurs. / Atherosclerosis is a chronic vascular inflammatory disease that develops gradually during life. While the control mechanisms of this disease are complex and variable, research continues to identify new protein candidates involved in atherogenesis. Angiopoietin-like2 (Angptl2) is a relatively unknown protein, recently shown to display angiogenic and pro-inflammatory properties. Based upon structural homology, Angptl2 is a member of the angiopoietin family; however, the Angptl2 receptor has not yet been clearly identified. The reported pathological situations in which Angptl2 may play a crucial role are multiple, but its molecular contribution in the development of atherosclerosis remains unknown. By differential display, we initially identified Angptl2 as being overexpressed in senescent endothelial cells, isolated and cultivated from internal mammary arteries of atherosclerotic patients undergoing coronary bypass. This observation was at the basis of my project. My specific objectives were 1) to determine the abundance of vascular Angptl2 in the presence of risk factors such as smoking and dyslipidemia, 2) to produce and purify a functional recombinant human Angptl2 protein in order to examine its effects on cellular function in vitro, and 3) to study the pro-atherogenic potential of Angptl2 in vivo using a mouse model of severe dyslipidemia. We showed that Angptl2 is preferentially secreted under pro-oxidant and pro-inflammatory conditions, with a 6-fold increase in endothelial Angptl2 expression in smoker coronary patients with chronic obstructive pulmonary disease. Based on these results, we hypothesized that, in addition to its known pro-inflammatory functions, Angptl2 has pro-oxidant properties. Accordingly, we demonstrated that recombinant Angptl2 stimulates the production of free radicals by HUVEC, an action exerted, at least in part, by the inhibition of the cytoprotective antioxidant pathway, Nrf2/HO-1, and potentially via the activation of the intracellular p38 MAPK pathway. In dyslipidemic LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice, we showed that the levels of endogenous Angptl2 in plasma, vascular tissue and atherosclerotic lesions increase in parallel with the development of atherosclerosis. In addition, stimulation with recombinant Angptl2 induces an inflammatory response, as assessed by the expression of cytokines and adhesion molecules and by infiltration of leukocytes into the vascular endothelium. Furthermore, intravenous infusion of purified recombinant Angptl2 for four weeks promoted a 10-fold increase in the formation of atherosclerotic plaques in LDLr-/-; hApoB-100+/+ mice and doubled their circulating cholesterol levels. Finally, we also demonstrated that plasma Angptl2 is 6-fold higher in atherosclerotic patients than in age-matched healthy subjects. These studies therefore strongly suggest that Angptl2 could directly contribute to the development of atherosclerosis by promoting senescence, inflammation and oxidation in endothelial cells. Such properties indicate that Angptl2 may be both a new biomarker of atherosclerosis, as well as one of its contributors.

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Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. / Vascular complications including increased contractility and cell proliferation are most common complications in diabetes, and chronic hyperglycemia seem to be an important contributing factor in this process. Gqα signaling pathway plays an important role in the regulation of vascular tone and aberration of these mechanisms may contribute to vascular complications in hyperglycemia/diabetes. The levels and activity of protein kinase C (PKC) and diacylglycerol (DAG) were shown to be up-regulated in diabeteshyperglycemia. In addition, studies on the expression of upstream signaling molecules of phosphatidyl inositol (PI) turnover were lacking. The enhanced activity/levels of protein PKC and DAG induced by high glucose in VSMC have been shown to be attributed to the increased oxidative stress. Furthermore, the levels of various vasoactive peptides including Ang II and ET-1 which are augmented in diabetes and under hyperglycemic conditions, may also contribute to the enhanced oxidative stress in diabetes/hyperglycemia. The work presented in this thesis was therefore undertaken to examine if hyperglycemia/diabetes could also modulate the expression of Gqα and phospholipase Cb (PLCβ) proteins and associated PI turnover signaling in A10 VSMC exposed to high glucose and to explore the molecular mechanisms by which high glucose modulates Gqα/PLC signaling. The first study was undertaken to investigate if hyperglycemia can modulate the expression of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 and associated signaling. Pre-treatment of A10 VSMC with high glucose (26 mM) for 3 days augmented the levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and β-2 proteins as compared to control cells which were restored to control levels by endothelin-1 (ET-1) ETA and ETB and angiotensin II (Ang II) AT1 receptor antagonists. In addition, ET-1-stimulated IP3 formation was also significantly higher in VSMC exposed to high glucose. Furthermore, treatment of A10 VSMC with Ang II and ET-1 also increased significantly the levels of Gq/11α and PLCβ proteins which were restored towards control levels by ETA/ETB and AT1 receptor antagonists. These results suggest that high glucose augmented the expression of Gq/11α, PLCβ and -mediated signaling in VSMC which may be attributed to activation of AT1, ETA and ETB receptors. The second study was undertaken to investigate the implication of oxidative stress in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and associated signaling in A10 VSMC and to explore the mechanism responsible for high glucose induced enhanced oxidative stress. We showed that the increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins in A10 VSMCs exposed to high glucose were restored to control levels by the antioxidant diphenyleneiodonium (DPI), and catalase, a scavenger of hydrogen peroxide, but not by 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) and uric acid, scavengers of peroxynitrite. In addition, endothelin-1 (ET-1)-stimulated production of IP3 that was enhanced by high glucose was also restored towards control levels by DPI and catalase. These results suggest that high glucose-induced enhanced oxidative stress that contributes to the enhanced expression of Gq/11α and PLCβ protein and signaling. Furthermore, the enhanced production of superoxide anion (O2-), NADPH oxidase activity and enhanced expression of p22(phox) and p47(phox) proteins induced by high glucose was restored to control levels by losartan, BQ123 and BQ788, the antagonists of angiotensin AT1 and endothelin-1 ETA/ETB receptors respectively. These results suggest that high glucose-induced enhanced levels of endogenous Ang II and ET-1, by increasing oxidative stress may contribute to the increased levels of Gq/11α and-mediated signaling in A10 VSMC. Since high glucose has been shown to increase growth factor receptor activation, we investigated, in the third study, the role of epidermal growth factor receptor (EGF-R) and platelet-derived growth factor receptor (PDGF-R) transactivation in high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. The increased levels of Gqα, G11α, PLCβ-1 and PLCβ-2 proteins induced by high glucose were restored to control levels by AG1478, an inhibitor of EGF-R, and AG1295, an inhibitor of PDGF-R as well as by PP2, an inhibitor of c-Src. High glucose-induced increased phosphorylation of EGF-R and PDGF-R which were abolished by AG1478, AG1295 and PP2. High glucose-induced enhanced levels of Gq, G11α and PLCβ were also attenuated by PD98059, an inhibitor of mitogen-activated protein kinase (MAPK), and wortmannin, an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K). In addition, high glucose-induced enhanced phosphorylation of ERK1/2 and AKT was also attenuated by AG1478 and AG1295. These results suggest that c-Src-induced transactivation of growth factor receptor contributes to the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α/PLC and-mediated cell signaling through MAPK/PI3K pathway. In conclusion, the studies presented in this thesis indicate that hyperglycemia increased the levels of Gq/11α and PLCβ1/2 proteins and mediated signaling. We provided evidence that high glucose-induced increased levels of Ang II and ET-1 may contribute to the enhanced production of O2- and H2O2 and results in enhanced oxidative stress which may be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ. Finally, we demonstrated that high glucose-induced transactivation of growth factor receptors may also be responsible for the high glucose-induced enhanced expression of Gq/11α and PLCβ1/2.

Les fichiers accompagnant le document sont en format Microsoft Excel 2010. / Les modèles classiques de signalisation cellulaire eucaryotes sont généralement organisés en voies linéaires et hiérarchiques, impliquant un ensemble de facteurs restreint. Ces facteurs forment un circuit isolé qui transmet une information externe vers sa destination, d’où une réponse cellulaire sera alors engendrée. Or, ces modèles sont justement le fruit d’approches expérimentales réductionnistes qui ne permettent pas d’intégrer aisément la contribution de facteurs multiples, ni de faire une évaluation quantitative de l’apport des composantes du système. Le développement de techniques d’investigation plus holistiques, telles la génomique fonctionnelle et la protéomique, permettent d’examiner de manière systématique et quantitative l’apport d’ensembles larges de facteurs et de les mettre en relation avec d’autres systèmes cellulaires. Il y aurait donc lieu de réévaluer le modèle de voie de signalisation linéaire au profit d’un modèle de réseau de signalisation multiparamétrique, comportant plusieurs branches d’entrée et sortie de signal interagissant avec d’autres systèmes cellulaires. Cet ouvrage porte sur la voie RAS/MAPK, l’un des principaux axes de signalisation associé à la prolifération et la différenciation cellulaires. Le sujet y est d’abord abordé sous l’angle d’une perspective historique, en mettant l’emphase sur les contributions des études de génétique classique chez les organismes modèles D. melanogaster et C. elegans. Il fait ensuite état du développement du criblage par ARNi pan-génomique dans ces deux modèles en le comparant aux approches de criblage génétique classique. Le corps de l’ouvrage décrit ensuite les résultats expérimentaux d’une campagne de criblage par ARNi visant à dresser une carte globale des régulateurs de la voie chez la drosophile. Trois groupes de régulateurs identifiés dans ce crible ont été caractérisés de manière plus détaillée. Dans un premier article, nous démontrons que les composantes du complexe EJC ont un impact sur l’épissage de mapk; une découverte doublement intéressante puisque l’EJC était jusqu’alors associé qu’à la régulation post-épissage des ARNm. Une seconde publication fait état de l’ensemble des résultats du crible ARNi, mettant l’emphase sur un ensemble de facteurs d’épissage qui modulent également mapk. Nous y montrons que l’impact de ces facteurs sur l’épissage alternatif est différent de celui de l’EJC, suggérant ainsi deux modes de régulation distincts. Finalement, dans un troisième manuscrit, nous nous attardons au rôle d’Usp47, une déubiquitinase qui, contrairement aux autres facteurs identifiés dans le crible, régule l’expression de MAPK de manière post-traductionnelle. Nous y détaillons une stratégie de criblage d’interaction génétique par ARNi visant à identifier des facteurs reliés fonctionnellement à Usp47. Ce second crible a permis l’identification de trois facteurs reliés au « N-end rule », un mécanisme de dégradation des protéines caractérisé par la reconnaissance des résidus N-terminaux de protéines ou peptides. Il existait jusqu’alors très peu de données quant à la régulation de l’expression des composantes de la voie MAPK, ce qui rend la description d’un large réseau de régulateurs agissant sur l’expression de MAPK d’autant plus insoupçonnée. L’absence d’un réseau équivalent rattaché aux autres composantes de la voie laisse supposer que MAPK serait un noeud servant de point d’entrée à ce type de régulation dans le système RAS/MAPK. De plus, nos travaux témoignent de la capacité de la génomique fonctionnelle à mettre en relation différents systèmes cellulaires de manière plus globale et à quantifier les liens établis entre eux. / The classical model of eukaryotic cellular signalling generally involves hierarchically organized linear pathways involving a restricted set of elements. These generally function together as an insulated circuit, transmitting information from the outside to the intracellular compartment involved in eliciting a response. These models, often the fruit of reductionist experimental approaches, do not allow for the integration of multiple inputs nor for a gradation of responses. The recent emergence of more holistic investigation techniques has brought about the re-evaluation of these classical models in favor of multiparametric signalling networks. This thesis focuses on the RAS/MAPK pathway, one of the cell’s main proliferation and differentiation signalling conduits, beginning with a historical perspective covering the contributions of model organism genetics to the current pathway model. This provides context for the description of a whole-genome RNAi screen experiment that we carried out to obtain a global view of regulators in Drosophila. Three groups of factors emerging from this screen were then examined in more detail. A first article shows that the exon junction complex (EJC) plays a role in mapk alternative splicing, an observation that is unexpected given that this complex was not previously known to act on splicing. A second paper details the genome wide screening campaign and focuses on a large set of splicing factors that also regulate mapk, albeit in a distinct manner than the EJC’s. Finally, a manuscript in a third segment examines Usp47 function and finds it to control MAPK levels post-translationally. An RNAi-based genetic interaction screen is then used to identify factors functionally related to Usp47 capable of counteracting its impact on MAPK levels. Three such factors identified through this technique are linked to the N-end rule protein degradation pathway. Regulation of core pathway component expression is a poorly described process, which makes the identification of a large set of factors regulating MAPK expression all the more unusual. Moreover, the absence of such regulation linked to other pathway components suggests that MAPK may act as a node incorporating inputs of this type into RAS/MAPK signaling dynamics.

G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest family of membrane receptors and are involved in numerous physiological processes. Collectively, these receptors are also prominently targeted by the pharmaceutical industry due to their implications in multiple diseases and disorders. GPCR signaling is tightly regulated. Several kinases, activated downstream of the receptor, initiate negative feedback loops; and arrestins play a crucial role in these regulatory processes by desensitizing the ligand–activated receptor and promoting its endocytosis. By doing so, arrestins control the duration and the amplitude of signal transduction at the cell surface. In the last few years, several non-canonical roles have also been attributed to arrestins, such as the post-endocytic activation of several signalling pathways, or the regulation of crosstalks between GPCRs and various other signalling events. My thesis project was aimed at providing a better understanding of the non-canonical functions of arrestins. The first objective of my research work was to investigate a possible reciprocal effect of the activation of the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) on GPCR signaling. We demonstrated that stimulation of ERK1/2, either by a cell surface receptor or a constitutively active mutant, leads to a reduction in steady-state expression levels of many GPCRs at the cell surface. This receptor redistribution mechanism is dependent on beta-arrestins phosphorylation. In vitro kinase assays combined with complementation experiments in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) lacking beta-arrestins, revealed that beta-arrestin-2 phosphorylation on Ser14 and Thr276 is essential for the ERK1/2-promoted GPCR sequestration. This ERK1/2- and arrestins mediated regulatory process was found to result in a global dampening of cell responsiveness. The second objective of my research work was to identify and develop a small organic compound that inhibits the interaction between arrestins and the adaptor protein AP-2, without interfering with the recruitment of arrestin to the receptor. This inhibitor, named Barbadin, was found to specifically block endocytic processes that are dependent on the interaction between arrestins and the appendage domain of the b-subunit of AP-2. We demonstrated its value as an analytical tool in studying the role of the arrestins in GPCR signaling, such as cAMP production and ERK1/2 activation. These results support the concept that beta-arrestin/AP-2-dependent signaling is important to both G protein-dependent and -independent pathways. The third objective of my research work was to develop a BRET-based biosensor able to detect signal-dependent PTEN conformational changes. This biosensor was validated by monitoring PTEN activation induced by targeted mutations affecting key intramolecular interactions or by modulating signalling pathways that impact PTEN function. We also demonstrated the value of this biosensor in studying PTEN/protein interactions using two known interactors that activate PTEN, beta-arrestin-2 and RhoA. Finally, we uncovered PTEN activation by several GPCRs, previously unknown as PTEN regulators. Given the central role of the tumor suppressor PTEN in oncogenesis, this biosensor could also provide a precious tool for anti-cancer drug research. To conclude, my research work highlighted non-canonical mechanisms for arrestins to activate GPCR-dependent signaling pathways, such as cAMP, ERK1/2 and PTEN, as well as negatively regulate GPCR signaling upon phosphorylation by ERK1/2. This work was made possible by the development of new tools: a beta-arrestin inhibitor named Barbadin and a PTEN BRET-based biosensor that have both shown their usefulness in studying beta-arrestin noncanonical signaling. / Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques. Cette famille de récepteurs constitue aussi une cible majeure dans la recherche pharmaceutique au vu de son importance dans de nombreuses pathologies. La signalisation des RCPG est étroitement régulée. Plusieurs kinases activées en aval du récepteur initient des boucles de régulation négative. Les arrestines jouent un rôle clé dans ces processus de régulation en favorisant la désensibilisation du récepteur activé par le ligand, suivie de son endocytose. Ainsi, les arrestines contrôlent la durée et l’amplitude de la transmission du signal à la surface de la cellule. Ces dernières années, plusieurs rôles non-canoniques ont été attribués aux arrestines comme l’activation de voies de signalisation post-endocytiques, ou la modulation de la régulation croisée entre les RCPG et d’autres acteurs de la signalisation cellulaire. Le premier objectif de mon travail de recherche est d’examiner l’effet réciproque de l’activation des kinases ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2) sur la signalisation des RCPG. Nous avons démontré que la stimulation de ERK1/2, soit par un récepteur de surface soit par l’utilisation d’un mutant constitutivement actif, conduit à la baisse de l’expression de surface basale de nombreux RCPG. Des essais kinases in vitro, combinés à des expériences de complémentation dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), où les gènes beta-arrestine-1/2 ont été supprimés, démontrent l’importance de la phosphorylation par ERK1/2 des résidus Ser14 et Thr276 dans ce mécanisme de séquestration des RCPG. Cette régulation, contrôlée par ERK1/2 et arrestine, conduit à une baisse globale de la capacité de réponse de la cellule aux stimuli extracellulaires. Le deuxième objectif de mon travail de recherche est d’identifier et de développer une petite molécule organique qui inhibe l’interaction entre l’arrestine et la protéine adaptatrice du complexe d’endocytose AP-2, sans toutefois empêcher la formation du complexe arrestine/récepteur. Cet inhibiteur, nommé Barbadin, bloque sélectivement les processus d’internalisation dépendants de l’interaction entre arrestine- et la sous-unité beta2 de la protéine adaptatrice AP-2. Barbadin représente le premier inhibiteur des fonctions d’arrestine, et nous avons démontré son utilité comme outil analytique pour déterminer la contribution des arrestines dans l’activation de plusieurs voies de signalisation en aval des RCPG, telles que la production d’AMP cyclique (AMPc) ou l’activation des kinases ERK1/2. Nos résultats démontrent l’importance du complexe arrestine/AP-2 dans la signalisation dépendante et indépendante des protéines G. Le troisième objectif de mon travail de recherche est de développer un biosenseur BRET capable de mesurer les changements de conformation du suppresseur de tumeur PTEN. Nous avons validé ce biosenseur en mesurant l’activation de PTEN suite à des mutations ciblées déstabilisant les interactions intramoléculaires au sein de cette protéine ou en modulant différentes voies de signalisation qui affectent sa fonction. Nous avons démontré l’intérêt de ce nouvel outil dans l’étude des interactions entre PTEN et des partenaires protéiques, en utilisant deux interacteurs connus pour activer PTEN : b-arrestine-2 et RhoA. Finalement, en utilisant ce biosenseur, nous avons démontré pour la première fois la capacité de plusieurs RCPG à induire l’activation de PTEN. Étant donné le rôle central de PTEN dans le développement tumoral, ce biosenseur constitue aussi un outil précieux pour la recherche de nouveaux médicaments anticancer. Ainsi, au travers de ces trois lignes directrices, nous avons pu mettre en lumière de nouveaux rôles non-canoniques des arrestines, soit dans l’activation de voies de signalisation, (comme la production d’AMPc, l’activation de ERK1/2 ou de PTEN), soit comme régulateur négatif de la signalisation des RCPG après phosphorylation par ERK1/2. Ce travail a été rendu possible par le développement de nouveaux outils pour l’étude des RCPG : un inhibiteur de beta-arrestine, Barbadin, et un biosenseur BRET de PTEN ; tous deux ayant démontré leur utilité dans l’étude des voies de signalisation non-canoniques des arrestines.

La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est causée par une prolifération anormale de cellules souches sanguines immatures. Notre laboratoire se concentre sur un sous-groupe de la LMA représentant près de 30% de la LAM pédiatrique et caractérisé par la translocation chromosomique KMT2A-MLLT3. L'analyse par séquençage de l’ARN (RNA-seq) dans notre modèle de LMA médiée par la fusion KMT2A-MLLT3 et des échantillons de patients leucémiques a révélé que les gènes codant la chimiokine CCL23 et son récepteur correspondant CCR1 sont surexprimés dans cette maladie. Bien qu'il ait été rapporté que CCL23 et CCR1 sont impliqués dans le trafic de leucocytes et le développement de l'inflammation, les rôles exacts de ces deux protéines dans la leucémogenèse sont inconnus. Pour illustrer les effets de la signalisation CCL23/CCR1 dans la leucémie causée par la fusion KMT2A-MLLT3, nous avons utilisé la technique de transfert d'énergie de résonance de bioluminescence 2 améliorée (ebBRET2) avec des tests d'immuno-empreintes. Nos résultats ont révélé que la signalisation de l'axe CCL23/CCR1 active plusieurs effecteurs de signalisation intermoléculaire, y compris Gi2, G12/13 et β-arrestine 1/2, mais avec un biais vers le recrutement de la β-arrestine. Nous avons également montré que le récepteur CCR1 présente une activité constitutive qui peut se coupler à une voie médiée par la protéine G et activer la voie impliquant les MAP kinases. Enfin, nous avons montré que la signalisation de l'axe CCL23/CCR1 provoque une activation de ERK1/2 dans les lignées cellulaires LMA potentiellement par une voie médiée par la β-arrestine. Ces résultats indiquent que la signalisation de l'axe CCL23/CCR1 active plusieurs voies biologiques pouvant fournir des avantages majeurs pour le développement et la progression de la LMA et présentent ainsi CCL23 et CCR1 comme deux candidats intéressants pour une thérapie ciblée contre la LMA de type KMT2A-MLLT3. / Acute Myeloid Leukemia (AML) is caused by abnormal proliferation of immature blood stem cells. Our lab focuses on an AML subgroup accounting for almost 20% of pediatric AML and characterized by a chromosomal translocation that generates the gene fusion: KMT2A-MLLT3 (KM3). Interestingly, RNA-seq analysis of our KM3 AML model and AML patient samples has revealed that the chemokine CCL23 and its corresponding receptor CCR1 are highly upregulated in this disease. Although it has been reported that CCL23 and CCR1 are implicated in leukocyte trafficking and development of inflammation, the exact roles of these two proteins in leukemia are unknown. To illustrate the effects of CCL23/CCR1 signaling in the KMT2A-MLLT3 rearranged leukemia we employed the enhanced bystander bioluminescence resonance energy transfer 2 (ebBRET2) technique along with phospho-immunoblots assays. Our results revealed that CCL23/CCR1 axis signaling activates multiple intermolecular signaling effectors, including Gi2, G12/13, and β-arrestin1/2 albeit with a bias towards β-arrestin recruitment. We also showed that the CCR1 receptor exhibits a constitutive activity which can couple to a G-protein mediated pathway to activate the MAPK cascade. Finally, we showed that CCL23/CCR1 axis signaling causes an activation of ERK1/2 in AML cell lines potentially through a β-arrestin-mediated pathway. These results indicate that the CCL23/CCR1 axis signaling activates several biological pathways than can provide major advantages for the AML disease development and progression thus presenting both CCL23 and CCR1 as interesting candidates for targeted therapy against KMT2A-MLLT3 AML.