Orientador: Claudio Chrysostomo Werneck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:55:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braga_GuilhermeGambogi_M.pdf: 40426167 bytes, checksum: 2843f77911936a8afd4b180bb9db3b50 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Fibrilina-1 é um importante componente da rede de microfibrilas da matriz extracelular. As microfibrilas estão presentes nas fibras elásticas que são responsáveis pela elasticidade e resistência de tecidos dos pulmões, pele e grandes vasos. Mutações no gene da Fibrilina-1 estão associadas com a síndrome de Marfan. Pacientes com esta síndrome apresentam muitas manifestações clínicas nos pulmões, sistema cardiovascular e olhos. Modelos de síndrome de Marfan tem sido criados no sentido de obter informações sobre o desenvolvimento desta doença. Estudos recentes em modelos de camundongos tem sugerido a importância da atividade exacerbada do TGF ? promovendo a quase totalidade das alterações fenotípicas encontradas nestes camundongos, o que pode ser revertido pelo tratamento com o Losartan. O principal objetivo deste projeto foi avaliar a formação de fibras elásticas em cultura de células obtidas de animais deficientes em fibrilina-1, bem como o possível efeito do tratamento destas células com losartan. Os fibroblastos derivados de animais deficientes em fibrilina- 1 foram estudados usando imunofluorescência, western blotting, microscopia eletrônica de varredura e transmissão e real-time PCR. Assim, a deficiência em fibrilina-1 ocasionou uma redução conjunta da deposição de fibrilina-2, MAGP-1 e tropoelastina na matriz extracelular em cultura de fibroblastos de derme. Foi possível verificar aumento no níveis de expressão das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9. O tratamento dos fibroblastos derivados de animais deficientes em fibrilina-1 com o fármaco losartan levou a recuperação parcial da deposição das proteínas Fibrilina-2, MAGP-1 e tropoelastina na matriz extracelular de cultura in vitro. Porém, o tratamento dos fibroblastos derivados de animais deficientes em fibrilina-1 com fármaco Captopril e os peptídeos de Angiotensina I e II não influenciaram na deposição das mesmas na matriz extracelular de cultura in vitro / Abstract: Fibrillin-1 is an important microfibril network component. Microfibrils are present in elastic fiber responsible for resilience and elastic properties from structures like lungs, skin and large vessels. Mutations in Fibrillin-1 gene are associated with Marfan's Syndrome. Marfan's Syndrome patients shown many different clinical manifestations in lungs, cardiovascular system and eyes tissues. Marfan's models have been created to get better insights about this disease development. Recent studies from mice models have suggested an important role to unbalanced TGF ? activity promoting almost whole alterations found in those mice which might be rescued by losartan treatment. Our main goal were evaluate elastic fiber formation in cell culture obtained from fibrillin-1 defficient mice as well as losartan's treatment effect on those cells. The fibroblasts derived from deficient animals in fibrillin-1 were studied using immunofluorescence, western blotting, scanning electron microscopy and transmission and real-time PCR. Thus, the deficiency in fibrillin-1 led to a joint reduction of the deposition of fibrillin-2, MAGP-1 and tropoelastin in the extracellular matrix in culture of fibroblasts in the dermis. It was possible to observe an increase in levels of expression of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 were found. The treatment of the fibroblasts derived from deficient animals in fibrillin-1 with the drug losartan has led to the partial recovery of the deposition of protein fibrillin-2, MAGP-1 and tropoelastin in the extracellular matrix of culture in vitro. However, the treatment of fibroblasts derived from deficient animals in fibrillin-1 with drug Captopril and the peptides of Angiotensin I and II not influenced in the deposition of the same in the extracellular matrix of culture in vitro / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Claudio Chrysostomo Werneck / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:06:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_CatherineNatalia_M.pdf: 4403950 bytes, checksum: 7142bd3654bd7f9d99e12cda4d33aeeb (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Fibrilina-1 (FBN-1) é um importante componente da rede de microfibrilas da matriz extracelular (MEC). As microfibrilas estão presentes nas fibras elásticas que são responsáveis pela resiliência de tecidos como pulmões, pele e grandes vasos. Mutações no gene da fibrilina-1 estão associadas à Síndrome de Marfan, doença autossômica dominante, caracterizada por uma desordem do tecido conjuntivo. Pacientes com esta Síndrome apresentam anomalias no sistema esquelético e trato cardiovascular. Dados da literatura relacionam a menor quantidade de FBN-1 na MEC com a atividade exacerbada do TGF-? promovendo a quase totalidade das alterações fenotípicas encontradas. Estudos preliminares em nosso laboratório com camundongos que possuem menor quantidade de FBN-1 de um camundongo normal tem demonstrado que necessitam do dobro do tempo para a formação de trombo em um modelo de trombose arterial. As plaquetas tem fundamental importância neste processo, quando são ativadas secretam várias moléculas que determinam a formação dos trombos. Realizamos um estudo comparativo do proteoma de plaquetas e da artéria aorta de camundongos selvagens e deficientes em FBN-1, através da técnica de eletroforese bidimensional (2DE) juntamente com a espectrometria de massas a fim de encontrar diferenças no perfil proteico que justificassem tais sintomas. Diversas proteínas plaquetárias foram encontradas apenas no grupo controle, como endoplasmina, fator de von Willebrand, calpaína, dentre outras; assim como a proteína vinculina foi encontrada apenas no grupo deficiente em FBN-1. Todas as proteínas encontradas podem ser de grande interesse para o esclarecimento a respeito do maior tempo de formação de trombo e os sintomas relacionados à Síndrome de Marfan / Abstract: Fibrillin-1 (FBN-1) is an important microfibril network component of extracellular matrix (ECM). Microfibrils are present in elastic fibers responsible for tissues resiliency, such as lungs, skin and great vessels. Mutations in fibrillin-1 gene are associated with Marfan Syndrome, a dominant autosomal disease characterized by connective tissue disorder. Patients with this syndrome show abnormalities in skeletal system and cardiovascular tract, aorta dilatation and aneurysms. Literature data relate less FBN-1 in the ECM with TGF-? heightened activity, promoting almost all the phenotypic alterations. Preliminary studies in our laboratory demonstrated that mice containing half amount of FBN-1 presented prolonged thrombosis time when compared to wild-type mice submitted to an arterial thrombosis model. Platelets are important in this process, when activated they release several molecules and factors which determine thrombi formation. We conducted a comparative proteome study of platelet and aorta from wild-type against FBN-1 deficient mice by two-dimensional electrophoresis (2DE) coupled with mass spectrometry in order to find some differences in protein profile that could justify such symptoms. Several platelet proteins were found only into control group, as endoplasmin, von Willebrand factor, calpain; as well as vinculin was found only in the FBN-1 deficient group. All proteins found may have great interest for understanding the prolonged thrombus formation time, and symptoms related to Marfan Syndrome / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

A Síndrome de Marfan (SMF) é uma doença de caráter autossômico dominante que acomete o tecido conjuntivo. As principais manifestações clínicas afetam o sistema cardiovascular, ótico e ósseo. A SMF é causada por mutações no gene FBN1, que codifica a proteína extracelular fibrilina-1, componente principal das microfibrilas, que formam as fibras elásticas. Estudos mostraram que mutações no gene da fibrilina-1 levam a um aumento indiscriminado do TGF-Β ativo na matriz, que resulta nos principais fenótipos da doença. O Sistema Renina Angiotensina (RAS) tem como produto principal a Angiotensina II (Ang-II), envolvida na regulação da massa óssea e da atividade do TGF-Β. Estratégias terapêuticas para a SMF utilizando fármacos que agem no RAS têm sido alvos de estudos em modelos animais. Em camundongos, Ramipril, inibidor da ACE (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), aumenta a transcrição do gene Fbn1 em 35% e melhora a cifose, característica do fenótipo ósseo no modelo animal mgΔloxPneo. O mecanismo de ação do Ramipril no sistema ósseo ainda não está totalmente elucidado, sendo que pode agir por diminuição na produção de Ang-II e consequente diminuição nos níveis de TGF-Β, ou pela inibição de degradação da bradicinina (BK) pela Ang-II. A bradicinina ativa diretamente seu receptor B2R, que induz ações fisiológicas opostas às da Ang-II. O objetivo deste trabalho foi avaliar e compreender os mecanismos gerais da patogênese óssea do modelo murino mgΔloxPneo para a SMF. Para tanto, foi analisado o fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo e selvagens controle e tratados com Ramipril. Foi verificado que, além da cifose, os animais mutantes apresentaram pior estrutura óssea. O tratamento melhorou a cifose, porém não alterou a qualidade óssea dos animais mutantes. Portanto, o efeito benéfico do Ramipril na cifose dos animais mgΔloxPneo não se deve a uma melhora da estrutura óssea, e pode estar relacionado à integridade do ligamento que sustenta a coluna vertebral. Com o intuito de testar a hipótese de que a sinalização pelo receptor B2R da BK possa estar envolvida no desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo, foram gerados animais mgΔloxPneo e knockout para o receptor B2R. Os resultados mostram que o receptor B2R não interfere no desenvolvimento da cifose, sendo apenas o genótipo para Fbn1 o fator determinante para a manifestação desse fenótipo. Foi realizada a análise de RNA-seq para verificar genes e vias diferencialmente expressas que possam explicar o mecanismo de desenvolvimento do fenótipo ósseo dos animais mgΔloxPneo. Foram encontradas vias como da adesão focal, interação receptor-meio extracelular (MEC), junção ocludente, reparação por excisão de nucleotídeo e de reparação missmatch, que podem explicar alterações no metabolismo de células ósseas. Além disso, foram encontradas diferenças de expressão de genes relacionados ao metabolismo muscular esquelético, o que está de acordo com a hipótese de regulação parácrina entre o tecido muscular e ósseo, levando a uma pior estrutura óssea / Marfan syndrome (MFS) is an autosomal dominant disease that affects the connective tissue. The main clinical manifestations affect the cardiovascular, optical and bone systems. MFS is caused by mutations in the FBN1 gene, that encodes the extracellular protein fibrillin-1, a major component of microfibrils, which form elastic fibers. Studies have shown that mutations in the fibrillin-1 gene lead to an indiscriminate increase in active TGF-Β in the matrix, which results in the major phenotypes of the disease. The Renin Angiotensin System (RAS) has as its main product Angiotensin II (Ang-II), involved in bone mass regulation and TGF-Β activity. Therapeutic strategies using drugs targeting the RAS have been studied in animal models. Ramipril, an ACE inhibitor (Angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEi), increase Fbn1 gene expression in 35% and improve kyphosis index in the mgΔloxPneo mouse model for SMF. Its mechanism of action in bone tissue is not completely elucidated, and it may act by decreasing Ang-II production and consequent reduction in TGF-Β levels, or by inhibiting degradation of bradykinin (BK) by Ang II. BK directly activates its B2R receptor, which induces opposite physiological actions to Ang-II. This study aims to evaluate and understand the general mechanisms of bone pathogenesis in the mgΔloxPneo mouse model. We analyzed the bone phenotype of mgΔloxPneo and wildtype animals treated, or not, with Ramipril by measuring the kyphosis index (KI), micro computed tomography (μCT) and Real-time PCR (RT-PCR). We found that mutant animals showed a greater degree of kyphosis and an altered bone structure. Ramipril improved kyphosis but did not alter bone quality of mutant animals, while in wild type animals Ramipril decreased bone structure without altering KI. Therefore, the beneficial effect of Ramipril on mgΔloxPneo animals\' kyphosis is not due to an improvement in bone structure. In order to test the hypothesis where signaling through BK B2R receptor may be involved in the development of bone phenotype of mgΔloxPneo animals, a mouse model with the mgΔloxPneo mutation and knockout for B2R receptor was generated. The analysis of these animals show that the B2R receptor does not interfere with the development of kyphosis, with Fbn1 genotype as sole determinant for this phenotype manifestation. RNA-seq analysis was performed to verify differential expression of genes and altered cellular pathways, which could reveal mechanisms of bone phenotype development in mgΔloxPneo animals. Altered pathways found included focal adhesion, receptor- extracellular matrix (ECM) interaction, tight junction, nucleotide excision repair and missmatch repair, which may explain changes in bone cells metabolism. In addition, there were differences in gene expression related to skeletal muscle metabolism, which is in agreement with the paracrine regulation of bone and muscle tissue, leading to worst bone structure

No description available.

BACKGROUND: Sirtuin-1 (SirT1) is a NAD+-dependent deacetylase essential for maintaining the structure and function of the vasculature. Reduced SirT1 expression and activity has been correlated with the development of vascular diseases, mainly attributed to loss of SirT1’s anti-oxidant and anti-inflammatory beneficial effects. We previously found that deletion of vascular smooth muscle (VSM) SirT1 in mice is associated with increased matrix metalloproteinases (MMPs) and the subsequent development of aortic dissections or ruptures in response to the hypertensive peptide angiotensin II. Based on these previous findings, we hypothesize that loss of SirT1 activity is involved in the pathogenesis of AA. SirT1 is a stress response gene, its deacetylase activity can be impaired by excessive oxidative stress. We postulate that mutating three cysteine residues in SirT1’s catalytic domain can prevent its inactivation by oxidative insults and protect against AA and other vascular diseases. OBJECTIVES: assess the role of SirT1 in a genetic mouse model of Marfan Syndrome that develops AA; (2) Determine design and optimize an enzyme-based colorimetric ELISA to determine SirT1 activity in mouse VSM cells and aortas; (3) Produce an adeno-associated virus (AAV) expressing an oxidant-resistant triple mutant SirT1 in VSM cells that has the potential to mitigate the downstream outcomes derived from alterations in SirT1 activity, such as MMPs activation and development of AA in mgR-/- mice. METHODS: mgR-/- and littermate mgR+/+ (WT) mice aortas and VSM cells were cultured in conditioned medium and the activity of released MMPs was determined by in-gel zymography. For the development of the SirT1 activity assay, we designed a multi-step sandwich ELISA that captures a biotin- and FLAG-tagged acetylated p53 peptide, used as SirT1 deacetylase substrate. Amounts of acetylated and total p53 peptide were sequentially detected with antibodies and colorimetric substrates as index of SirT1 deacetylase activity. AAVs expressing a control or triple mutant SirT1 (3M) were produced in HEK293T cells; VSM cells were then infected with control or 3M AAV and SirT1 protein expression levels were measured by Western Blot. RESULTS: MMPs activity is increased in aortas and VSMC of mgR-/- mice; the first stage of optimization of the SirT1 activity assay successfully defined the assay conditions and experimental design, and it is ready to be optimized with mgR-/- cell and tissue samples; our novel control and SirT1 triple mutant AAVs were produced and successfully overexpressed in VSM cells. / 2024-03-14T00:00:00Z

A Síndrome de Marfan (MFS) é uma doença autossômica dominante do tecido conjuntivo, que acomete principalmente os sistemas esquelético, ocular e cardiovascular. O fenótipo cardiovascular, em especial o aneurisma de aorta, é responsável pela maior parte da morbi-mortalidade. MFS é resultante da mutação da fibrilina-1, uma glicoproteína que além de ser um dos principais componentes estruturais da matriz extracelular, tem como função a regulação da atividade do TGF-Beta, por meio de seu sequestro mecânico na matriz extracelular. No entanto, os mecanismos pelos quais a mutação da fibrilina-1 determina aneurismas de aorta torácica com elevada variabilidade fenotípica são ainda pouco elucidados. Um alvo central na fisiopatologia do aneurisma são células musculares lisas vasculares (VSMC), que constituem a maior porção da camada média da aorta. Por meio do controle do tônus contrátil da aorta, da estrutura do citoesqueleto e da interação com a matriz extracelular controlam a estrutura da aorta e a resposta a estímulos patológicos. Mutações que geram perda de função no aparato contrátil de VSMCs prejudicam força contrátil e respostas mecanoadaptativas. No entanto, o papel da VSMC na MFS foi pouco estudado. Neste estudo, investigamos se alterações do fenótipo de VSMCs correlacionam-se a prejuízos na geração de força e alterações em respostas biomecânicas em VSMC cultivadas a partir de aortas obtidas de camundongos com ou sem a mutação mgDeltalpn para MFS na fase inicial (3 meses) e tardia (6 meses). Aos 3 meses de evolução, detectamos importantes alterações fenotípicas nas MFS-VSMC, com maior proliferação celular e redução de alguns marcadores de diferenciação (calponina-1), porém aumento de outros (alfa-actina e SM22). Ao mesmo tempo, ocorreu mudança morfológica, com aumento da área da célula e perda do formato fusiforme. Tais alterações foram consistentes com transição para fenótipo mesenquimal, que foi confirmada pela expressão de vários marcadores. Marcadores de estresse do retículo endoplasmático (RE) aumentaram em MFS-VSMC vs. WT (wild-type) -VSMC condição basal, sem aumento pós estiramento mecânico. Correção da matriz de fibrilina-1 defeituosa em MFS-VSMC promoveu reversão de alguns aspectos do fenótipo, mas não do estresse do RE. MFS-VSMC mostra perfil protêomico divergente de WT-VSMC, em particular menor expressão de proteínas regulatórias do citoesqueleto. Importante, MFSVSMC têm reduzida capacidade de gerar força de tração quando semeadas em substrato com rigidez fisiológica e geram momento contrátil in vitro, no entanto, sem perda na capacidade de adesão. Importante, MFS-VSMC têm forte atenuação da resposta de tração a aumentos da rigidez do substrato. Em paralelo, MFS-VSMC exibem menor densidade em fibras de estresse de actina em relação às WT-VSMC. A maioria destas alterações não foram observadas aos 6 meses de evolução da doença. Os dados indicam que na fase precoce da doença, MSF-VSMC exibem mudanças fenotípicas que vão além de uma simples modulação fenotípica, com aspectos de transição mesenquimal e reduzida capacidade de geração de força tensional associada não à adesão celular, porém à menor capacidade de geração de fibras de estresse de actina. Estes mecanismos, descritos pela primeira vez, contribuir para elucidar a fisiopatologia da MFS, com alguns aspectos comuns, porém outros distintos de outras modalidades de aneurisma de aorta / Marfan Syndrome (MFS) is an autosomal dominant connective tissue disease affecting to variable extents the musculoskeletal, ocular and cardiovascular systems. Cardiovascular phenotype and in particular thoracic aorta aneurysm/dissection (TAAD), is responsible for the bulk of disease morbimortality. MFS is due to mutations in fibrillin-1, one of the main structural proteins of the extracellular matrix (ECM), which in addition regulates TGF-Beta activity by means of its physical retention in the ECM. However, mechanisms by which fibrillin-1 mutation determines TAAD with elevated phenotypic variability are yet poorly understood. Vascular smooth muscle cells (VSMC), the main component of aortic medial layer, are central targets of aneurysm pathophysiology in general. By exerting regulation of contractile tone, cytoskeletal structure and ECM interaction, VSMC control aortic structure and response to pathologic stimuli. Mutations that promote loss of VSMC contractile apparatus impair contractile function and mechanoadaptative responses and associate with distinct types of TAAD. However, the role of VSMC mechanobiology in MFS pathophysiology is poorly known. In this study, we investigated whether VSMC loss of force-generating capacity occurs in MFS and whether it associates with specific changes in cell phenotype. Biomechanical VSMC responses were assessed in cells cultured from aortas collected from mice with the mgDeltalpn MFS mutation at early (3-monthold mice, the main focus of our study) and advanced (6-month-old mice) stages of disease evolution. At 3 months of disease evolution, we detected important phenotypic alterations in MFS-VSMC, with enhanced expression of markers for cellular proliferation and lower expression of some differentiation markers (calponin-1), but, increase in others (SM alfaactin and SM22). In parallel, there were important morphologic changes, with increased VSMC area and loss of its fusiform shape. Such alterations are consistent with a transition towards a mesenchymal-like phenotype, which was confirmed through the expression of several markers. Endoplasmic reticulum (ER) stress markers increased in MFS-VSMC vs. WT (wild-type)-VSMC in basal condition, without augmentation after cyclic mechanical stretching. Replacement of defective fibrillin-1 ECM from MFS-VSMC with a normal fibroblast-derived ECM promoted reversion of some aspects of the phenotype but not of ER stress. MFS-VSMC exhibited a proteomic profile divergent from that of WT-VSMC, particularly with respect to the lower expression of cytoskeleton regulatory proteins. Importantly, MFS-VSMC displayed a lower traction force-generating capacity when seeded in ECM under physiological stiffness and generated an impaired contractile moment in this situation. In particular, MFS-VSMC depicted a strong attenuation of the traction force response to enhanced ECM stiffening. These defects did not occur as a result of lower adhesion structure and decreased adhesion capacity of MFS-VSMC. In parallel, MFS-VSMC exhibited lower density of actin stress fiber vs. WT-VSMC. With 6 months of disease evolution, several of these alterations were not detectable. Both WTVSMC and MFS-VSMC showed reduced capacity of force generation, without evidence of cell senescence. In summary, starting already in the early stages of disease evolution, MSF-VSMC display important phenotypic changes which go beyond a simple reversible phenotypic modulation, with some aspects suggesting a transition mesenchymal-like phenotype, accompanied by reduced force-generating capacity not linked to loss of cell adhesion properties but rather to impaired organization of action stress fibers. These mechanisms, described for the first time, contribute to elucidate MFS pathophysiology, depicting both some aspects in common with the pathophysiology of other types of aortic aneurysm and some aspects peculiar to MFS

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-26. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:40Z : No. of bitstreams: 1 Publico-068.pdf: 848593 bytes, checksum: faea7296d3b3e87c6a1212049c181df8 (MD5) / Introdução: A Síndrome de Marfan (SM) é uma doença de herança autossômica dominante decorrente de mutações no gene da fibrilina 1 no cromossomo 15, e pode apresentar manifestações esqueléticas, oculares, cardiovasculares entre outras. A velocidade de onda de pulso(VOP) é utilizada como um índice da elasticidade e rigidez arterial e está relacionada as propriedades elásticas da parede vascular. A pratica de exercício é limitada para esta população. Objetivo: Avaliar o efeito agudo de exercício submáximo em pacientes portadores de SM sem dilatação da aorta ou no máximo com dilatação leve deste vaso e o comportamento das variáveis fisiológicas. Casuística e Método: A VOP e variáveis fisiológicas foram avaliadas antes e após a realização de um esforço submáximo em 33 pacientes com SM e 18 controles. Resultados: A VOP no grupo com SM foi de 8,51±0,58 m/s no repouso e de 9,10±0,63 m/s ao final do exercício (p=0,002) e no grupo controle de 8,07±0,35 m/s no repouso e 8,98±0,56 m/s ao final (p=0,004). A análise comparativa da VOP entre os grupos controle e os pacientes com SM no repouso (p=0,519) e ao final do esforço (p=0,866) não se mostrou diferente. Os valores finais da freqüência cardíaca do grupo controle ficaram 10% acima dos indivíduos com SM (p = 0,01). A pressão arterial sistólica final foi superior no grupo controle (p=0,02). O lactato não se mostrou diferente e o tempo de exercício foi superior no grupo controle(p=0,01). Conclusão: O comportamento da distensibilidade aórtica foi semelhante, nos pacientes com SM sem ou com dilatação leve da aorta, ao grupo controle. Todavia as respostas cronotrópicas e pressóricas foram inferiores. / Purpose: Marfan syndrome is a dominant autosomal disease provoked by mutations of gene of fibrillin 1, chromosome 15, and may exhibit skeletal, ocular, cardiovascular and other manifestations. Pulse wave velocity (PWV) is used as a measure of arterial elasticity and rigidity and is related to the elastic properties of the vascular wall. As the practice of exercise is limited in this population, it was of our interest to analyze the acute effect of moderate to intensive exercise on patients with Marfan syndrome with either no dilatation of the aorta or a maximum of mild dilatation of this vessel. Methods: PWV and physiological variables were evaluated before and after the performance of sub-maximal exercise in 33 patients with Marfan syndrome and 18 controls. Results: PWV in the group with Marfan syndrome was 8.51±0.58 m/s at rest and 9.10±0.63 m/s at the end of the exercise (p=0.002); in the control group, PWV was 8.07±0.35 m/s at rest and 8.98±0.56 m/s at the end of exercise (p=0.004). The comparative analysis between groups regarding PWV at rest (p=0.519) and at the end of exercise (p=0.866) revealed no statistically significant differences. The final heart rate values in the control group were 10% higher than values in the group with Marfan syndrome (p = 0.01). Final systolic arterial pressure was higher in the control group (p=0.02). There was no difference in lactate between groups. Exercise time was greater in the control group (p=0.01). Conclusions: The behavior of aortic distensibility was similar in the patients with Marfan syndrome without or with mild dilatation of the aorta to that of the control group. The chronotropic and pressure responses were lower in patients than in control group. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Claudio Chrysostomo Werneck / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T20:38:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braga_GuilhermeGambogi_D.pdf: 4636216 bytes, checksum: 190a4f198720c94edc5b356bdfbedb35 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A fibrilina-1 é um importante componente da rede de microfibrilas presentes nas fibras elásticas. Mutações no gene da fibrilina-1 leva ao surgimento da Síndrome de Marfan. Esta doença afeta a elastogênese de órgãos como pulmões, pele e sistema cardiovascular. Estudos recentes têm demonstrado que o desequilíbrio na atividade de TGF-beta é importante no aparecimento dos sinais e sintomas relacionados a essa síndrome. Estas alterações podem ser revertidas pelo uso de antagonistas de TGF-beta como o princípio ativo losartan. Os mecanismos pelo qual o losartan atua ainda não estão claramente descritos na literatura. Assim, utilizando um modelo de cultura de células primárias (fibroblastos de derme) derivadas de camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1, foi avaliado o perfil elastogênico por ensaios de imunofluorescência, zimografia in situ, Real-Time PCR, microscopia eletrônica de transmissão e varredura e western-blotting de diferentes proteínas de matriz extracelular e moléculas sinalizadoras importantes na síntese e degradação das fibras elásticas. Os dados apresentados sugerem uma redução conjunta da deposição das proteínas MAGP-1 (83%), Tropoelastina (87,5%) e Fibilina-1 (86%) na matriz extracelular; aumento na atividade e também dos níveis de expressão gênica relativa das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9, ativação da cascata de sinalização canônica (SMAD-2) e não canônica (ERK1/2 e JNK-1) de TGF-beta e aumento nos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) nas culturas de fibroblastos de derme derivados de camundongos deficientes em fibrilina-1. Ao passo que ao utilizar o princípio ativo losartan (100?M/L) como tratamento para estas células ocorreu um aumento da deposição de MAGP-1 (71,5%) e Tropoelastina (68,5%) na matriz extracelular, redução da atividade e expressão gênica relativa das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9 e inativação da sinalização canônica (SMAD-2) e não canônica (ERK1/2 e JNK-1) de atuação de TGF-beta. De uma maneira geral, nossos dados sugerem um aumento da degradação das moléculas componentes da fibra elástica em cultura de fibroblastos de derme derivados de camundongos deficientes em fibrilina-1 em função do aumento na expressão das MMPs 2 e 9. Este aumento da degradação da matriz extracelular pode ser resultado do menor nível de fibrilina-1 na matriz produzida por estas células, super ativando a sinalização canônica (SMAD-2) e não-canônica (ERK1/2 e JNK-1) de TGF-?, o que reflete na ativação de EROs e consequentemente a ativação das proteases. O tratamento com o losartan provavelmente faz o caminho inverso reduzindo a super ativação da cascata de sinalização de TGF-? bem como a ativação da metaloproteases, aumento indiretamente a deposição de MAGP-1 e Tropoelastina na matriz extracelular destas células / Abstract: Fibrillin-1 is an important component of the microfibrils network present in elastic fibers. Mutations in fibrillin-1 gene imply in the development of Marfan Syndrome. This disease affects elastogenesis in lungs, skin, cardiovascular system and eyes. Recent studies determined that unbalanced TGF-beta activity is an important factor in the symptoms observed this syndrome. These alterations can be reversed by the use of TGF-beta blockers such as the drug losartan. The mechanisms by which the drug losartan act are not described in the literature. Thus, using a model of primary culture cells (dermal fibroblasts) the elastogenic profile by immunofluorescence, zimograph in situ, Real-Time PCR, electronic microscopy and western-blotting of matrix proteins and signal molecules of elastic fiber synthesis and degradation was evaluated. The data presented suggest a joint reduction of the deposition of proteins MAGP-1 (83%), Tropoelastina (87.5%) and Fibilina-1 (86%) in the extracellular matrix; an increase in the activity and also the levels of gene expression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9, activation of the signaling cascade canonical (SMAD-2) and not canonical (ERK1/2 and JNK-1) of TGF-beta and increased levels of reactive oxygen species (ROS) in cultures of fibroblasts in the dermis derived from mice deficient in fibrillin-1. While using the losartan drug (100 ?M/L) to treat these cells it was possible to observe an increase in deposition of MAGP-1 (71.5%) and Tropoelastina (68.5%) in the extracellular matrix, reduction of activity and gene expression of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 and inactivation of canonical signaling (SMAD-2) and not canonical (ERK1/2 and JNK-1) activity of TGF-beta. In general, our data suggest an increase in the degradation of molecules components of elastic fibers in culture of fibroblasts in the dermis derived from mice deficient in fibrillin-1 as a function in the increase in the expression of MMPs 2 and 9. This increase in the degradation of the extracellular matrix may be the result of lower levels of fibrillin-1 in the matrix produced by these cells, super activating the canonical signaling (SMAD-2) and non-canonical (ERK1/2 and JNK-1) of TGF-beta, which reflects the activation of ROS and consequently the activation of proteases The treatment with losartan probably takes the reverse path reducing the super activation of the signaling cascade of TGF-beta as well as the activation of metalloproteinases, indirectly increase in the deposition of MAGP-1 and Tropoelastina in the extracellular matrix of these cells / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A Síndrome de Marfan (SMF) é a enfermidade hereditária mais comum dentre as que afetam o sistema conjuntivo, causada por mutações da glicoproteína fibrilina-1, o principal componente estrutural das microfibrilas elásticas da matriz extracelular. As manifestações fenotípicas da SMF são sistêmicas e acometem tipicamente os sistemas ocular, esquelético e cardiovascular, este uma importante causa de morbi-mortalidade. Entretanto, não está claro como a mutação induz a doença. Estudos anteriores sugerem anomalias morfológicas do retículo endoplasmático (RE) ou retenção intracelular da fibrilina-1 nos estágios avançados da SMF. Entretanto, a contribuição do enovelamento da fibrilina-1 mutada e do estresse do RE na fisiopatologia celular da SMF não é conhecida. Proteínas mal-enoveladas podem levar à retenção intracelular e/ou aumento da degradação através da via de degradação associada ao RE (ERAD), além da indução da resposta a proteínas mal-enoveladas (UPR), ambas com potencial contribuição à fisiopatologia de doenças, incluindo a SMF. Assim, estudamos em fibroblastos embrionários isolados de camundongos (MEFs) com SMF se a fibrilina-1 mutada é reconhecida pelo controle de qualidade do RE pelo seu mal- enovelamento e induz estresse do RE por sua retenção intracelular. Demonstramos que a mutação na fibrilina-1 per se não promoveu chaperonas marcadoras de UPR ou geração de oxidantes. Além disso, não levou a uma maior sensibilização das células à indução exógena de estresse do RE, nem promoveu maior morte celular após inibição do proteassoma. Além disso, não foi observada retenção intracelular da fibrilina-1 nas células SMF, e mesmo após inibição da via secretora ou indução de estresse do RE, a inibição da secreção da fibrilina-1 foi similar nos MEFs SMF e wild-type (WT). A dissulfeto isomerase proteica (PDI), uma importante chaperona redox do RE, interage com fibrilina-1, e seu silenciamento levou a um aumento na secreção da fibrilina-1 pelos MEFs WT, mas não SMF. Além disso, o silenciamento da PDI promoveu a desorganização da matriz extracelular depositada de fibrilina-1 nos MEFs WT, enquanto nos MEFs SMF, a desorganização basal da matriz não foi adicionalmente alterada. Em paralelo, investigações in vivo mostraram que o estresse do RE não é induzido em camundongos SMF com 1 ou 3 meses de idade, apesar de manifestações fenotípicas evidentes. Entretanto, concomitante à progressão da doença, detectamos a ocorrência de estresse do RE nas aortas ascendentes dos camundongos aos 6 meses. Esta detecção foi exclusiva desta região da aorta e não ocorreu em outros órgãos afetados ou não afetados pela SMF. Assim, a manifestação do fenótipo clássico da SMF não requer uma perda da homeostase do RE diretamente induzida pela fibrilina-1 mutada. Ao contrário, esta é capaz de evadir mecanismos de controle de qualidade mediados pela PDI, sendo secretada normalmente. Assim, esta evasão do controle de qualidade pela PDI é uma condição permissiva essencial para o fenótipo da SMF. Por outro lado, o estresse do RE é uma característica evolutiva do aneurisma da aorta ascendente na SMF concomitante ao agravamento do fenótipo neste tecido / Marfan syndrome (MFS) is the most common connective tissue hereditary disease, caused by mutations in the glycoprotein fibrillin-1, the main structural component of extracellular matrix elastic microfibrils. MFS phenotypic manifestations are systemic and typically involve the ocular, skeletal and cardiovascular systems, the latter a major cause of morbidity/mortality. However, how gene mutation induxes disease is yet unclear. Previous studies suggest endoplasmic reticulum (ER) morphological abnormalities or fibrillin-1 intracellular retention in advanced MFS stages. However, the contribution of mutated fibrillin-1 folding and ER stress to MFS cellular pathophysiology is unknown. Un/misfolded proteins may associate with their intracellular retention and/or increased degradation through ER-associated degradation (ERAD), in addition to inducing the unfolded protein response (UPR), both sharing potential contributions to disease pathophysiology, including MFS. Thus, we studied in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from WT and MFS mice, if mutated fibrillin-1 can be recognized by ER quality control as a misfolded protein, able to induce ER stress due to its intracellular retention. We showed that fibrillin-1 mutation by itself did not promote UPR chaperone markers or oxidant generation. Moreover, it did not sensitize cells to exogenous ER stress nor affected cell survival curves after proteasome inhibition. Furthermore, no intracellular retention of fibrillin-1 was observed in MFS cells, and even after secretory pathway inhibition or ER stress induction, fibrillin-1 secretion inhibition was similar in MFS and wild-type (WT) MEFs. Protein disulfide isomerase (PDI), an important ER redox chaperone, interacts with fibrillin-1 and its silencing induced an increased fibrillin-1 secretion in WT, but not MFS MEFs. Besides, PDI silencing promoted fibrillin-1 extracellular matrix disorganization in WT MEFs, whereas in MFS MEFs, the basal matrix disorganization was not further modified. Parallel in vivo evaluations demonstrated that ER stress is also not induced in 1 and 3 month-old mice MFS, despite evident phenotypical manifestations. However, concomitant to accelerated disease progression at 6 months, ER stress was detectable in ascendant aorta, but not in other disease-affected or unaffected organs. Thus, classic MFS phenotype manifestations do not require loss of ER homeostasis directly induced by mutated fibrillin-1. Contrarily, the latter can evade a PDI-mediated quality control mechanism to be normally secreted. Therefore, evading such PDI-mediated quality control is an essential permissive condition for enabling the MFS phenotype. On the other hand, ER stress is an evolutive feature of MFS ascendant aorta aneurysm concomitant to phenotype progression in this tissue

Morphology change analysis of aorta images acquired from biological experiments plays a critical role in exploring the relationship between lamina thickness (LT), interlamellar distance (ILD) and fragmentation (furcation points) with respect to pathological conditions. An automated software tool now is available to extract elastic laminae (EL) and measure LT, ILD and fragmentation along their ridge lines in a fine detailed aspect. A statistical randomized complete block design (RCBD) and F-test were used to assess potential (non)-uniformity of LT and ILD along both radial and circumferential directions. Illustrative results for both normotensive and hypertensive thoracic porcine aorta revealed marked heterogeneity along the radial direction in nearly stress-free samples. Quantifying furcation point densities were also found that can offer new information about potential elastin fragmentation, particularly in response to increased loading due to hypertension. Furthermore, when biological scientists analyze the elastic lamina structure, how to automatically generate a macro-level geometric parameter mapping might greatly help them understand the over-all morphology changes of blood vessel cross section. In this dissertation, another automated system is designed to quickly locate more pronounced EL branches to construct layer level abstraction of LT/ILD measurements and transform the sparse pixel level information to dense normalized Virtual Layer Matrix (VLM). The system can automatically compute the EL orientations, identify pronounced ELs, transform the denoised LT measurement points onto a VLM and then provide statistics/segmentation analysis. By applying the k-means segmentation technique to VLMs of LT-ILD, one can easily delineate regions of normal vs. hypertrophic and/or hyperplasia LT-ILD measurements for cross-image references.