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Aplicação da espectrometria de massas na derreplicação de extratos brutos produzidos por actinobactérias isoladas da rizosfera do milho (Zea mays L.) / Mass spectrometry applied to the dereplication of crude extracts from rhizosphere actinomycetesAna Flávia Canovas Martinez 15 April 2009 (has links)
O objetivo deste trabalho é isolar e identificar os compostos que apresentem atividade fitotóxica presente nos extratos produzidos por actinobactérias isoladas da rizosfera do milho. Para isso foram realizados estudos de derreplicação, baseados nas informações estruturais obtidas por diversas técnicas analíticas. Em especial foi aplicada a espectrometria de massas acoplada a técnicas de purificação, como HPLC e UPLC, com a finalidade de acelerar as análises dos estudos de caracterização estrutural. Com os resultados obtidos foi possível concluir que os extratos oriundos de processos fermentativos apresentam potencial aplicação herbicida, uma vez que mais de 60% das amostras ensaiadas apresentaram atividade fitotóxica. Além disso, foi possível identificar nestes extratos vários compostos com atividades biológicas e estruturas diversas, já descritos na literatura. No extrato da actinobactéria 36 (50 PL) foram encontradas as leucinostatinas que apresentam diversas atividades biológicas como antiviral e antitumoral, além da atividade fitotóxica. Já no extrato da actinobactéria 17 (39 PL) foram encontradas as julicromas, descritas como pigmentos intensos e em geral amarelos, com atividade antibiótica, porém não apresentaram atividade fitotóxica. O composto ativo presente neste extrato pertence à classe das luminacinas, que inibem a formação de tubos capilares, interrompendo o ciclo celular, podendo ser utilizada no tratamento de angiogêneses. A luminacina C, composta por dois epímeros (C1 e C2), apresentou excelente atividade fitotóxica que foi verificada nos bioensaios de fitotoxicidade realizados com Lemna minnor. / Microorganisms, in particular actinomycetes are known to produce a vast number of bioactive secondary metabolites of interesting pharmaceuticals and agrochemical industry. Bioherbicides, especially the micoherbicides, which are highly effective on weed control and are environmentally friendly as well, are very attractive for research and application. This means that direct metabolite profiling techniques such as direct injection mass spectrometry or LC-MS/MS can easily be used for chemotyping/metabolomics of strains from culture collections. In this report we discuss metabolomics as part of intelligent screening for the discovery of phytotoxic compounds when used in combination with modern methods for dereplication. As result, two microorganisms were studied and 23 metabolite peaks were identified. The metabolite profiling was then conducted using the m/z value, and MS/MS fragmentation pattern analyses. Among the peaks, one unknown compound peak was identified and it was analogous to the Luminacins series. In order to render this approach in a more rapid and efficient way, the dereplication of crude microbial extracts with LC-hyphenated techniques (LC/UV-DAD and LC/MS) represented a strategic element to avoid finding known constituents and to target the isolation of new bioactive compounds. The development of simple and rapid phytotoxic bioassays which employed Lemna minor was also crucial to find the active principles efficiently.
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Caracterização eletroforética e espectrométrica de extratos de Cinchona de uso fitoterápico e cosmético / Eletrophoretic and spectrometric characterization of Cinchona extracts of use phytoterapic and cosmeticViviane do Nascimento 15 January 2010 (has links)
A cada ano a malária mata cerca de um milhão de pessoas. Segundo a OMS, 3,3 bilhões de pessoas, metade da população mundial, estão expostas à doença, principalmente em países subdesenvolvidos. Os fármacos utilizados no tratamento da malária incluem: cloroquina, primaquina, quinina, mefloquina, doxiclina, clindamicina e artemisina. A extensa resistência do parasita Plasmodium falciparum ao medicamento sintético cloroquina re-estabeleceu a quinina, um alcalóide encontrado na planta do gênero Cinchona, como droga antimalarial. A quinidina, o diastereoisômero da quinina, é usada como droga antiarrítmica e no tratamento de fibrilação arterial. Os estereoisômeros, cinchonina e cinchonidina, não são usados como medicamentos, embora mostrem efeitos similares àqueles da quinina e da quinidina. Os efeitos cardíacos da quinidina impossibilita seu uso como antimalarial. Outro alcalóide presente na espécie Cinchona é a hidroquinidina, que assim como a quinidina também apresenta atividade antiarrítmica. Os extratos vegetais são base para a produção de fitoterápicos, porém sem padronização o produto perde qualidade e a indústria não pode garantir a eficácia apregoada já que desconhece a concentração do princípio ativo no produto à venda. A portaria RDC 48/04 de 16.03.04 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) estabeleceu uma legislação específica, que se baseia na “garantia da qualidade”, exigindo a reprodutibilidade dos fitoterápicos produzidos, que só pode ser garantida com a utilização de extratos padronizados. De acordo com essa tendência, o objetivo do presente trabalho é o desenvolvimento de métodos de análise para os principais alcalóides da Cinchona por eletroforese capilar, podendo ser usada em caracterização de drogas vegetais, no controle de qualidade de extratos, bem como em possíveis adulterações. As determinações dos cinco principais alcalóides da Cinchona foram realizadas por eletroforese capilar de zona (CZE), utilizando como eletrólito TEA (1,1% v/v) com pH ajustado para 2,5 com ácido fosfórico e 20 mmol L-1 de α-ciclodextrina, com tempo total de análise inferior a 12 minutos. A otimização das condições de análise foi realizada através da realização de experimentos de planejamento fatorial 32+1, sendo as variáveis do estudo a concentração de TEA e de α-ciclodextrina. Com o uso de seletores quirais também foi desenvolvido um método para análise confirmatória dos alcalóides através do acoplamento de eletroforese capilar à espectrometria de massas, utilizando a estratégia de “partial filling”. Com objetivo de verificar o efeito do solvente na separação dos presentes alcalóides foi realizado um estudo do mecanismo de separação modulada por solvente em meio micelar (MEKC) e em meio não-aquoso (NACE). / Every year, malaria kills about one million people. According to OMS, 3.3 billion people, half of the world population, are exposed to the disease, mostly in underdeveloped countries. The pharmaceuticals used in the treatment of malaria include: chloroquine, primaquine, quinine, mefloquine, doxyclyne, clindamicina and artemisin. The increased resistance of the parasite Plasmodium falciparum to the synthetic pharmaceutical chloroquine reestablished quinine, an alkaloid found in the genus Cinchona, as antimalarial drug. Quinidine, the diasteroisomer of quinine, is used as antiarrhythmic drug in the treatment of arterial fibrillation. The diastereoisomers cinchonine and cinchonidine are not employed as pharmaceuticals although present similar effects to quinine and quinidine. The cardiac effects of quinidine hinders its use as antimalarial. Another alkaloid found in Cinchona is hydroquinidine, which similarly to quinidine also presents antiarrhythmic activity. Herbal extracts are the basis of phytotherapic production, however, with no standardization, the product lacks quality and the industry cannot guarantee its alleged efficacy, since there is no knowledge of the active principle concentration in the product put to sale. The ANVISA protocol (RDC 48/04 published on March16, 2004) established a specific legislation based on the “guarantee of quality”, which demands the reprodutibility of the produced phytotherapic, only achievable with standardized extracts. Following this tendency, the aim of this work was to develop methods of analysis for the main alkaloids of Cinchona using capillary electrophoresis, to apply in the characterization of herbal drugs, in the quality control of extracts as well as in the searching of possible adulterations. The determinations of five main alkaloids of Cinchona were carried out by capillary zone electrophoresis (CZE) using an electrolyte composed of 1.1% (v,v) TEA adjusted to pH 2.5 with phosphoric acid containing 20 mmol L-1 α-cyclodextrin, providing a less than 12 min total analysis time. The optimization of analytical conditions was conducted experimentally by a 32+1 factorial design where the studied variables were TEA and α-cyclodextrin concentrations. With the use of chiral selectors a confirmatory analytical method for alkaloids was also developed with the coupling of capillary electrophoresis and mass spectrometry employing a strategy called “partial filling”. With the purpose of verifying solvent effects on the separation of the alkaloids under investigation, studies of the separation mechanism as modulated by solvent in micelar medium (MEKC), and non aqueous medium (NACE) were conducted.
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Elementos potencialmente tóxicos em caldo de cana-de-açúcar cultivada em solo tratado com lodo de esgoto / Potencial toxic elements in sugarcane juice cultivated in soil treated with sewadge sludgeAna Carolina Ribeiro Granja 21 September 2009 (has links)
Não obstante aos benefícios evidentes da aplicação do lodo de esgoto na cultura da cana-deaçúcar, conforme a norma No 375 do CONAMA, há ausência de informações sobre os elementos Be, Cd, Co, Cr, Ni, Pb, Tl e V que estão presentes lodo. Estes elementos podem contaminar o solo e a planta. Todavia, eles têm sido muito pouco avaliados, principalmente pelos baixos teores no solo e na planta, assim como pela baixa sensibilidade das técnicas convencionais de análise. O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da aplicação de lodo de esgoto na cana-planta sobre os teores de Be, Cd, Co, Cr, Ni, Pb, Tl e V no caldo. Foram aplicadas quatro doses de lodo (0; 3,6; 7,2 e 10,8 t ha-1, base seca) em experimento de campo, com cana-planta. Para obtenção do caldo de cana, os colmos foram colhidos, após 12 meses de cultivo da cana, e prensados. Inicialmente, verificou-se a viabilidade da decomposição assistida por radiação micro-ondas, utilizando-se de 5 mL de amostras de caldo, com ácido nítrico e ácido clorídrico concentrado. Este procedimento mostrou-se inadequado, pois a pressão interna gerada no tubo reacional foi superior ao limite máximo de 3.500 kPa (35 bar), com temperatura na faixa de 140oC, gerando extrato com material orgânico residual. Em novo teste, utilizando-se de 2,5 mL de amostras de caldo, com ácido nítrico, ácido clorídrico concentrados e peróxido de hidrogênio, obteve-se sucesso na decomposição da amostra, pois a pressão interna gerada no tubo reacional foi inferior ao limite máximo de 3.500 kPa (35 bar), com temperatura na faixa de 185oC, gerando extrato límpido, sem material orgânico residual. A partir de digeridos obtidos com o segundo protocolo, os teores Be, Cd, Co, Cr, Ni, Pb, Tl e V foram determinados por espectrometria de massa com plasma (ICP-MS). Os teores Be, Co, Cr, Ni, Pb, Tl e V no caldo de cana-de-açúcar não foram alterados pela aplicação do lodo de esgoto, cujos valores variaram de 1,1 a 36,4 \'mü\'g kg-1. Na dose 10,8 t ha-1, os teores de Cr e Pb no caldo foram menores e os de Cd, maiores, em relação às demais doses de lodo. Todos os teores observados foram muito abaixo dos limites máximos permitidos em alimentos, exceto o Tl, que foi o elemento que, independentemente da dose de lodo, mais limitou o consumo do caldo, em 0,6 kg dia / Despite the obvious benefits of sludge application in the sugarcane crop, as the CONAMA no 375 resolution, there is a lack of information about Be, Cd, Co, Cr, Ni, Pb, Tl and V elements present in the sewage sludge, which can contaminate soil and plant. However, they have been poorly evaluated, especially by the low contents in soil and plant, as the low sensitivity of conventional techniques. This study aimed to evaluate the effects of the sewage sludge application on the cane-plant, on the Be, Cd, Co, Cr, Ni, Pb, Tl and V contents in the juice. Four sewage sludge doses were applied (0, 3.6, 7.2 and 10.8 t ha-1, dry basis) in Field experiment with cane-plant. To obtain the sugarcane juice, the stalks were harvested after 12 months of sugarcane cultivation, and pressed. Initially, there was the feasibility of decomposition assisted by microwave radiation, using 5 mL juice samples, with nitric acid and concentrated hydrochloric acid. This procedure was inadequate because the internal pressure generated in the reaction tube was above the limit of 3,500 kPa (35 bar), with temperatures from 140 o C, leading to extract with residual organic material.In a new test, using 2.5-mL samples of juice, with nitric acid, hydrochloric acid and concentrated hydrogen peroxide, were successful in decomposing the sample, because the internal pressure generated in the reaction tube was below the limit maximum of 3500 kPa (35 bar), with temperatures in the range of 1850C, generating clear extract, without residual organic material. From digested obtained with the second protocol, the concentration of Be, Cd, Co, Cr, Ni, Pb, Tl and V were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry. The Be, Co, Cr, Ni, Pb, Tl and V concentration in sugarcane juice were not affected by the application of sewage sludge, with values ranging from to 1.1 a 36.4 \'mü\'g kg-1. In dose 10.8 t ha-1, the Cr and Pd concentration in the juice were lower and Cd contents were higher compared to other doses of sludge. All concentration observed were below the maximum allowed levels in food, except for Tl, which was the element that, regardless of sludge dose, limited the consumption of juice, at 0.6 kg day-1
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Determinação do perfil lipídico por espectrometria de massas de oócitos bovinos maturados em meio suplementados com fosfolipídio: uma nova estratégia para modular a criotolerância oocitária / Determination of the lipid profile by mass spectrometry of oocytes Bovine animals matured in medium supplemented with phospholipid: a new Strategy to modulate oocyte cryotoleranceCaroline Palmieri Pitangui 29 November 2012 (has links)
O interesse em criopreservar tecido ovariano, embriões e oócitos, principalmente quando se trata de pacientes oncológicas que irão ser submetidas a tratamentos potencialmente esterilizantes, vem crescendo nas últimas duas décadas. Uma das técnicas propostas para se preservar a fertilidade destas pacientes é o congelamento de oócitos, podendo estes ser obtidos já maturados in vivo após a hiperestimulação ovariana controlada ou na forma de oócitos imaturos na ausência de estimulação, nestes casos procede-se a maturação in vitro (MIV) de oócitos pré congelamento. No entanto sabe-se que a criopreservação causa danos de viabilidade e perda do potencial reprodutivo destes oócitos. Alguns autores têm demonstrado que esses danos podem ser reduzidos por meio de cultivos que modulam o perfil lipídico tanto de oócitos como embriões, fazendo com que estes sejam menos susceptíveis ao congelamento. Uma das técnicas que permite a verificação da composição lipídica de células e outras estruturas é a espectrometria de massas. Os objetivos deste estudo foram comparar o perfil lipídico de oócitos maturados in vitro na presença ou ausência de PL e correlacionar com o perfil lipídico e desenvolvimento embrionário dos embriões produzidos in vitro. Além disso, avaliamos o perfil lipídico dos meios de maturação usando oócitos bovinos como modelo experimental. CCOs foram maturados em meio TCM ou TCM + PL, contendo 10% de soro fetal bovino, 0,5 µg/ml de FSH, 5 ng/ml de LH e 1 mg/mL de 17?-estradiol em atmosfera úmida, com 5% de CO2 durante 24 horas. Após a MIV, os oócitos foram desnudados mecanicamente, lavados em PBS e armazenados a -80 ° C, até a análise de perfil lipídico. Oócitos, meios de maturação e blastocistos foram submetidos à técnica de MALDI-MS (ionização e dessorção a laser assistida por matriz /espectrometria de massas). Diferenças no perfil lipídico foram identificadas por PCA (análise de componentes principais). O perfil lipídico dos meios de maturação determinado por MALDI-MS permitiu a diferenciação entre TCM e TCM + PL. No entanto, a análise dos oócitos maturados in vitro demonstrou que o perfil lipídico dos grupos controle ou suplementado com PL não foram diferentes. Da mesma forma, não foram observadas diferenças no perfil lipídico e na embriogênese dos embriões resultantes. No entanto, diferenças no perfil lipídico entre COC e oócitos desnudos (ODs) maturados in vitro foram detectadas. Oócitos maturados com as células do cumulus contêm íons PC com maiores graus de insaturação dos resíduos de ácidos graxos, enquanto ODs contêm espécies de PC com ácidos graxos insaturados (18:0) ou monoinsaturados (18:1). O MALDI-MS permite a obtenção de perfis lipídicos informativos para meios de cultura e oócitos maturados in vitro. A identificação de mudanças no metabolismo lipídico de oócitos durante a MIV pode contribuir para determinar a suplementação lipídica adequada dos meios de MIV e soluções de vitrificação, contribuindo para otimizar os protocolos de criopreservação de oócitos humanos. / The interest in ovarian tissue, embryos and oocytes cryopreservation has been growing in the last two decades, especially in patients who are faced with potentially sterilizing treatments. One of the techniques proposed to preserve the fertility of these patients is the oocyte cryopreservation. The oocytes can be obtained matured in vivo after controlled ovarian hyperstimulation or as immature oocytes, in the absence of stimulation. In these cases, an option is to proceed the in vitro maturation (IVM) of oocytes before cryopreservation. However, it is known that damage induced by cryopreservation is associated with loss of viability and reproductive potential of oocytes. Some authors have demonstrated that such damage can be reduced by culture media that modulate lipid profile in both oocytes and embryos, making them less susceptible to freezing. One technique that enables the determination of the lipid composition of cells and other structures is mass spectrometry. The objectives of this study were to compare lipid profiles of oocytes matured in vitro in the presence or absence of PL and relate this information to lipid profile and preimplantational development of IVM-derived embryos. Also, we evaluated the lipid profiles of culture media using bovine oocytes as an experimental model. COCs were matured in TCM or TCM + PL, both containing 10% fetal calf serum, 0,5µg/ml FSH, 5 µg/mL LH, and 1 µg/mL 17?-estradiol, with 5% CO2 for 24 h. After IVM, oocytes were mechanically denuded, washed in PBS and stored at -80°C, until lipid analysis. Oocytes, maturation media and blastocysts were submitted to the MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry). Differences in lipid profile were addressed by principal component analysis. Maturation media lipid fingerprint by MALDI-MS allows differentiation among TCM and TCM+PL. However, the MALDI-MS of the in vitro matured oocytes demonstrated that lipid profile of control or PL-supplemented groups were not different. Similarly, no differences were observed in the lipid profile and embryogenesis of resulting embryos. Nevertheless, differences in lipid profiles between COCs and denuded oocytes (DOs) matured in vitro were indicated to occur. The former contain PC ions with higher degrees of unsaturation in the fatty acid residues, while DOs contain PC ions with unsaturated (18:0) or monoenoic (18:1) fatty acids. The MALDI-MS has allowed obtaining informative lipid profiles for culture media and IVM-oocytes. Identification of lipid changes during IVM may contribute to determine appropriate lipid supplementation of IVM/vitrification media and to improve cryopreservation of human oocytes.
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Determinação da bioequivalência do metronidazol a partir de comprimidos revestidos / Bioequivalence determination of metronidazole from coated tabletsMarina de Freitas Silva 20 August 2009 (has links)
O metronidazol é usado no tratamento de infecções causadas por protozoários e naquelas causadas por microrganismos anaeróbicos, no tratamento das formas intestinais e extra-intestinais de amebíase, em tricomoníase e em infecções bacterianas aeróbicas graves. Após administração oral, a absorção é rápida e completa sendo amplamente distribuído, atinge concentração plasmática máxima em 1-2 horas. A meia-vida de eliminação do metronidazol é de 6-12 horas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a equivalência terapêutica por meio da bioequivalêmcia entre duas formulações de comprimidos revestidos contendo metronidazol, produzidos por dois fabricantes distintos, permitindo assim a intercambiabilidade entre as formulações. O ensaio de bioequivalência entre o produto teste (FUNED metronidazol) e o produto referência (Flagyl® - Aventis Pharma Ltda.) foi do tipo randomizado, cruzado e aberto. O medicamento foi administrado em dose única de 250 mg de metronidazol aos 24 voluntários sadios. Amostras de sangue foram coletadas até 48 horas após a administração e analisadas por método, desenvolvido e validado, de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (CLAE- MS/MS). As curvas de decaimento plasmático obtidas para o produto teste (FUNED metronidazol) e para o produto referência (Flagyl® - Aventis Pharma Ltda.) foram semelhantes, assim como os parâmetros farmacocinéticos Cmax (teste: 6,66 µg/mL; referência: 6,77 µg/mL), tmax (teste: 1,26 h; referência: 1,90 h), ASC0-t (teste: 73,42 µgxh/mL; referência: 73,56 µgxh/mL), ASC0-∞ (teste: 75,15 µgxh/mL; referência: 75,23 µgxh/mL) e t½el (teste: 8,00 h; referência: 7,76 h). Os intervalos de confiança 90% para a razão de Cmax (92,2 - 106,4 %), ASC0-t (97,2 - 102,5 %) e ASC0-∞ (97,1 - 102,8 %) encontram-se entre 80 e 125 %, intervalo proposto pela ANVISA e FDA para a bioequivalência. A comparação estatística por meio de análise de variância (ANOVA) dos parâmetros Cmax, ASC0-t e ASC0-∞ indica claramente não haver diferença significativa entre os dois produtos contendo 250 mg de metronidazol. Baseado nos resultados farmacocinéticos e estatísticos, conclui-se que os dois produtos são bioequivalentes e, podem ser considerados intercambiáveis na terapêutica. / Metronidazole is used to treat infections caused by protozoa and those caused by anaerobic microorganisms. It is the drug of choice for the treatment of amebiasis in the intestinal and extra-intestinal forms, trichomoniasis and bacterial aerobic diseases. After oral administration, its absorption is rapid, complete and widely distributed, reaching maximum plasma concentration in 1 to 2 hours. The half-life of elimination of metronidazole is 6 to 12 hours. The objective of this study was to evaluate the therapeutic equivalence through bioavalability between two formulations of tablets containing metronidazole, produced by two different manufacturers, thus allowing the interchangeability between the formulations. The bioequivalence assay between the test product (FUNED Metronidazole) and reference product (Flagyl® - Aventis Pharma Ltda.) was a randomized, crossover and open study. The drug was given at a 250 mg metronidazole single dose to 24 healthy volunteers. Blood samples were collected until 48 hours after administration and analyzed by method, developed and validated in high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC - MS / MS). The plasma decay curves obtained for the product test (FUNED metronidazole) and the reference product (Flagyl® - Aventis Pharma Ltda.) were statistically similar in the same way as the pharmacokinetic parameters Cmax (test: 6.66 µg/mL, reference: 6.77 µg/mL), tmax (test: 1.26 h; reference: 1.90 h), AUC0-t (test: 73.42 µgxh/mL, reference: 73.56 µgxh/mL) AUC0-∞ (test: 75.15 µgxh/mL, reference: 75.23). The 90% confidence intervals for the ratio of Cmax (92.2 - 106.4%), AUC0-t (97.2 - 102.5%) and AUC0-∞ (97.1 - 102.8%) are between 80 and 125%, range proposed by ANVISA and FDA for bioequivalence assays. This statistical parameters comparison using analysis of variance (ANOVA) Cmax, AUC0-t and AUC0-∞ clearly indicate no significant difference between the two products containing 250 mg of metronidazole. Based on the pharmacokinetic and statistical results, it is possible to conclude that the two products are bioequivalent and could be considered interchangeable in therapy.
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Estudos oxidativos biomiméticos com os produtos naturais piperina e piplartina / Biomimetic oxidative studies with the natural products piperine and piplartine.Estela Hanauer Schaab 16 May 2008 (has links)
A piperina e a piplartina são alcalóides isolados de espécies do gênero Piper. A escolha destas moléculas para este estudo foi baseada em suas atividades biológicas, em especial pelo seu potencial antitumoral. Tendo em vista a procura de meios alternativos para o estudo do metabolismo de novos fármacos, especialmente aqueles provenientes de produtos naturais, este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil oxidativo da piperina e da piplartina através de diferentes metaloporfirinas, que biomimetizam o metabolismo do citocromo P450. Para a realização deste trabalho, a piperina e a piplartina foram expostas à oxidação em meio homogêneo, utilizando o iodosilbenzeno (PhIO) como doador de oxigênio e metaloporfirinas sintéticas de primeira e segunda geração como catalisadores da reação, que foram [Fe(TPP)]Cl, [Mn(TPP)]Cl, [Fe(TFPP)]Cl e [Mn(TFPP)]Cl. Como solvente para os meios reacionais foram utilizados 1,2-dicloroetano e acetonitrila. Os padrões e os meios reacionais contendo os produtos de oxidação foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) com ionização por elétrons (IE), e por espectrometria de massas tandem com ionização por electrospray em modo positivo. Através das análises dos espectros obtidos por CG-EM e IES-EM, foi possível observar a presença de produtos de oxidação, formados com todas as metaloporfirinas testadas, especialmente as fluoradas. Apesar de ter sido detectada pequena formação de produto oxidado na piperina, este foi praticamente insignificante. A piplartina mostrou-se um substrato mais reativo frente aos catalisadores testados. Na piperina foi verificada a presença do produto hidroxilado. Na piplartina os produtos de oxidação observados foram as substâncias desmetoxilada, monohidroxilada e dihidroxiladada, sendo os dois últimos observados apenas através da técnica de electrospray. As estruturas foram propostas baseadas nas vias de fragmentação apresentadas nos espectros de IE-EM de baixa resolução, e também através de IES-EM/EM de alta resolução em modo positivo. Os resultados deste trabalho são promissores para a obtenção de derivados oxidados de piperina e piplartina através das metaloporfirinas. / Piperine and piplartine are alkaloids isolated from species of Piper genus. The choice of these molecules for this study was based on the promising biological activities presented by these substances, especially for their antitumoral potential. Based on the research of alternative ways for studying the metabolism of new drugs, especially from natural products, the goal of this study was to investigate the oxidative profile of piperine and piplartine through different metalloporhyrins, which biomimic the metabolism of cytochrome P450. For doing this research, piperine and piplartine were exposed to oxidation in homogeneous media, using iodosilbenzene (PhIO) as oxygen donor and synthetic metalloporphyrins of first and second generations as catalysts for the reaction, that were [Fe(TPP)]Cl, [Mn(TPP)]Cl, [Fe(TFPP)]Cl and [Mn(TFPP)]Cl. The solvents used for the reaction media were 1, 2- dichloroetane and acetonitrile. The standards and reaction media containing the oxidation products were analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) with electron ionization (EI), and by mass spectrometry and mass spectrometry tandem with electrospray ionization (ESI-EM and ESI-EM/EM), in positive mode. Through the analysis of spectra obtained by GC-MS and ESI-MS, it was possible to observe the presence of the oxidation products, formed with all the metalloporphyrins tested, especially the fluoreted ones from the second generation. Despite having been detected small formation of oxidized product on piperine, this was practically insignificant. Piplartine shown to be a more reactive substrate in front of the catalysts tested. In piperine, it was possible to verify the presence of the hydroxylated product. In piplartine, the oxidized products observed were the demetoxilated, monohydroxilated and dihydroxilated, the last two being verified only through the technique of electrospray. The structures were proposed based on their fragment patterns presented on spectra of EI-MS (low resolution) an ESI-MS with high resolution in positive mode. The results of this work are promising to obtain oxidized derivatives of piperine and piplartine through synthetic metalloporphyrins.
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Análise proteômica da região cambial de árvores adultas de Eucalyptus grandis / Proteomic analysis of the cambial region from mature Eucalyptus grandis treesEduardo Leal Oliveira Camargo 15 February 2008 (has links)
O gênero Eucalyptus é a fonte principal de madeira para a indústria de papel e celulose de países tropicais e subtropicais e tem sido extensivamente estudado. Apesar de sua importância econômica, muito pouco é conhecido sobre o controle genético da formação da madeira (xilogênese) no eucalipto. Diferentes propriedades da madeira são observadas durante o desenvolvimento das árvores e a madeira é classificada como madeira juvenil e adulta. A madeira juvenil comparada à adulta apresenta células com paredes delgadas, alta concentração de lignina e baixa densidade; características indesejáveis para a indústria florestal. A identificação de proteínas e genes que regulam os processos genéticos de formação da madeira juvenil e adulta é, portanto, alvo potencial para estudos relacionados a modificações específicas visando melhorar a qualidade da madeira. O objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas da região cambial de árvores de Eucalyptus grandis envolvidas no processo de formação da madeira adulta. A proteína total foi extraída de árvores com 22 anos e submetida à eletroforese bidimensional. Os spots foram isolados de cada uma das repetições do gel e após digestão tríptica, submetidos ao sequenciamento por cromatografia líquida associada ao espectrômetro de massas Q-TOF Ultima API (Waters, UK). Os espectros foram analisados pelo programa MASCOT MS/MS Ion Search, utilizando o banco de dados MSDB. Um total de 82 proteínas foram identificadas e classificadas em seis categorias funcionais: metabolismo e energia (36%), processos celulares (11%), transporte (2%), estrutura e organização da estrutura (11%), vias de informação (30%) e sem função definida (10%). Muitas das proteínas identificadas participam dos mecanismos de controle da biossíntese da parede celular e, conseqüentemente, da formação da madeira. Os dados gerados irão facilitar uma futura comparação e seleção de proteínas diferencialmente expressas em árvores juvenis e adultas durante xilogênese. / The Eucalyptus genus is the main source of hardwood for the pulp and paper industry in tropical and subtropical countries and is being extensively studied. Despite its economical importance, very little is known about the genetic control of wood formation (xylogenesis) in eucalypts. Different wood properties are observed during tree development and the wood is classified as juvenile and mature. The juvenile wood is characterized by cells with large lumen and thinner walls, lower density, higher lignin content and poor quality for pulp production, when compared to mature wood. The identification of proteins and genes that regulate the process in both mature and juvenile wood formation is, therefore, a potential target for studies related to specific modifications to alter wood quality. The aim of this work was to identify proteins which participate in the process involved in mature wood formation by isolating proteins from the cambial region of Eucalyptus grandis. The total protein was extracted from 22 year-old trees and two-dimensional gel electrophoresis was carried out. Proteins were excised from the gels and after tryptic digestion, MS analysis was conducted by on line chromatography using a Cap-LC coupled to a Q-TOF Ultima API mass spectrometer (Waters, UK). The spectra were processed using MASCOT MS/MS Ion Search (www.matrixscience.com), and the sequences searched against MSDB database. A total of 82 proteins were identified and classified into six main functional categories: metabolism and energy (36%), cellular processes (11%), transport (2%), structure and structural organization (11%), information pathways (30%), non defined function (10%). Many of the identified proteins play a role in the mechanisms involved in the control of cell wall biosynthesis, and consequently in wood formation. The generated data will facilitate a further comparison and selection of proteins differentially expressed in mature and juvenile trees during xylogenesis.
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Análise proteômica de Synechococcus leopoliensis PCC7942 em resposta ao cádmio. / Proteomic analysis of Synechococcus leopoliensis PCC7942 in response to cadmium.Yasmin Grummt Naddaf 26 July 2004 (has links)
As cianobactérias são procariotos fotossintetizantes capazes de sobreviver em ambientes com condições adversas, inclusive na presença de metais pesados tal como o cádmio (Cd). Alguns mecanismos celulares de tolerância a metais pesados são o efluxo de íons e destoxificação intracelular. A proteína metalotioneína, a qual foi purificada e seqüenciada na cianobactéria Synechococcus sp. PCC7942, possui a capacidade de quelar alguns metais. A análise do produto gênico (RNAm e/ou proteínas) têm trazido informações interessantes sobre o metabolismo de células submetidas a situações estresse. Esse estudo teve como objetivo analisar as respostas das células da cianobactéria Synechococcus leopoliensis PCC7942 ao Cd. Para isto, foi analisado o padrão de crescimento das culturas, o acúmulo de Cd e a expressão de proteínas da cianobactéria na presença do metal. A concentração máxima de Cd tolerável pela cianobactéria de 3 µM foi determinada através do monitoramento do crescimento de culturas submetidas a diferentes concentrações do metal através da análise de DO750nm. As culturas crescidas nessa concentração do Cd apresentaram um prolongamento na fase de adaptação e maior tempo de duplicação comparando-se as culturas controles (sem metal). O cádmio acumulado pelas células analisado usando GFAAS apresentou valores variando entre 1,0 e 95 µg Cdg-1 massa fresca, dependendo da fase de crescimento. A análise da especiação do Cd no meio de cultura BG-11 mostrou que havia disponível para as células 0,69 µM de Cd+2 quanto se utilizava a quantidade máxima tolerável (3 µM). A análise de expressão diferencial de proteínas foi feita em culturas expostas a duas concentrações do metal, 3 µM (tolerável) e 100 µM (letal), durante 1 hora, as quais mostraram acúmulo de 15 e 30 µg Cdg-1 massa fresca, respectivamente. A maioria das proteínas da cianobactéria separadas por eletroforese bidimensional (pH 3-10 e 4,5-5,5) mostrou pontos isoelétricos ácidos, entre a faixa de pH 4 e 6, e a presença de várias isoformas. Trinta proteínas foram expressas diferencialmente, sendo que no tratamento com 3 µM de Cd, duas proteínas foram induzidas e 11 reprimidas, e no tratamento com 100 µM, duas proteínas foram induzidas e 20 reprimidas. Entre as proteínas reprimidas, duas foram comuns em ambos os tratamentos, enquanto que as duas proteínas induzidas em cada tratamento foram diferentes. Algumas dessas proteínas identificadas através de MALDI-TOF foram a rubisco, a qual foi reprimida em 3 µM de Cd; uma proteína da capa do carboxissoma, a qual foi induzida na presença de 100 µM de Cd; a proteína ligadora a DNA (Dpsa) e a isoleucil t-RNA sintetase, ambas induzidas em 3 µM de Cd e reprimidas em 100 µM de Cd. Dessa forma, esses dados mostraram que duas das proteínas afetadas pelo Cd são componentes do sistema fotossintetizante (rubisco e capa protéica do carboxissoma), uma é expressa em condições de estresse oxidativo (Dpsa) e a outra está relacionada com a síntese de proteínas contendo isoleucina (isoleucil-tRNA sintetase). / Cyanobacteria are photosynthetic prokaryotes capable of surviving in adverse environmental conditions, including the presence of heavy metals such as cadmium (Cd). Some cellular mechanisms of heavy metal tolerance are ion efflux and intracellular detoxification. The metallothionein protein, which was purified and sequenced in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942, possesses the ability to bind some metals. The analysis of gene products (mRNA and/or proteins) has provided interesting information about cell metabolism under stress conditions. The aim of this study was to analyze the Cd response of the cyanobacterium S. leooliensis PCC7942 cells. For this purpose, the pattern of culture growth, cadmium accumulation, and cyanobacterial protein expression in the presence of the metal was analyzed. The maximum tolerable Cd concentration of 3 µM by the cyanobacterium was determined by monitoring culture growth submitted to different concentrations of the metal using OD750nm analysis. The cultures grown in this Cd concentration had an extended lag phase and a higher doubling time compared to the control cultures (without metal). Cadmium accumulated by the cells analyzed using GFAAS showed values varying between 1.0 and 95 µg Cdg-1 fresh matter, depending on the growth phase. Speciation analysis of Cd in the growth medium BG-11 showed that 0.69 µM of Cd2+ was available to the cells when the maximum tolerable amount was used (3 µM). Analysis of the proteins with differential expression was done using cultures exposed for 1 hour to two metal concentrations, 3 µM (non-lethal) and 100 µM (lethal), which showed accumulation of 15 and 30 µg Cdg-1 fresh matter, respectively. The majority of the cyanobacterial proteins separated by two-dimensional electrophoresis (pH 3-10 and 4,5-5,5) showed pI between pH 4 and 6, and the presence of several isoforms. Thirty proteins were differentially expressed, where two proteins were up-regulated and 11 down-regulated in the treatment with 3 µM of Cd and two proteins were up-regulated and 20 down-regulated in the treatment with100 µM of Cd. Among the down-regulated proteins, two were common in both treatments while the two up-regulated proteins from each treatment were different. Some of the proteins identified by MALDI-TOF were rubisco, which was down-regulated in 3 µM of Cd; a carboxysome shell protein, which was up-regulated in100 µM of Cd; the DNA-binding protein, Dpsa, and a isoleucyl-tRNA sinthetase, both up-regulated in 3 µM of Cd and down-regulated in100 µM of Cd. Thus, these data showed that the two proteins affected by Cd are components of the photosynthetic system (rubisco and carboxysome shell protein), one is expressed under oxidative stress condition (Dpsa) and the other one is related to protein synthesis containing isoleucine (isoleucyl-tRNA sinthetase).
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Cianobactérias e cianotoxinas em áreas recreacionais do Reservatório de Salto Grande, Americana - SP / Cyanobacteria and Cyanotoxins in Recreational Areas of the Salto Grande Reservoir, Americana - SPAndresa Maíra da Fonseca 27 June 2014 (has links)
As cianobactérias produzem substâncias tóxicas que são conhecidas como cianotoxinas. Inúmeros casos de intoxicações em humanos e animais têm sido reportados nos mais diversos países. Várias cianobactérias tóxicas são planctônicas e desenvolvem-se em ambientes de água doce formando florações intensas sob condições favoráveis. Florações de cianobactérias têm sido observadas durante todo o ano no reservatório Salto Grande (Americana, SP) que possui intenso uso recreacional, além de servir para abastecimento público de água, pesca e irrigação de culturas. Portanto, avaliar a comunidade de cianobactérias e identificar a presença de genes de cianotoxinas, bem como detectar a produção de toxinas em florações do reservatório de Salto Grande é de fundamental importância para os órgãos de saúde pública para permitir a utilização segura desses corpos d\'água. Neste estudo, três amostras de água com florações de cianobactérias foram analisadas, as quais foram coletadas em diferentes períodos, em dois locais com intenso uso recreacional. As investigações sob microscópio óptico das amostras preservadas com solução de lugol identificaram quinze gêneros cianobacterianos, sendo dois deles até então desconhecidos para o local (Plantothrix e Komvophorum). As contagens de células usando a técnica de Utermöl realizadas para duas das amostras de água mostraram valores que excedem os recomendados pela Portaria Nº 2914 do Ministério da Saúde, a qual estabelece análises e coletas semanais da água acima de 20.000 células/mL. O potencial genético para produção das toxinas cilindrospermopsina, saxitoxina e microcistina foi avaliado a partir da extração do DNA genômico total das amostras ambientais e observou-se amplificação por PCR dos genes cyrJ, sxtA, sxtI, mcyE e mcyG. Os produtos da PCR foram sequenciados e as análises filogenéticas das sequências de aminoácidos mostraram que elas se agruparam com sequências homólogas de cianobactérias conhecidas como produtoras das respectivas toxinas. No entanto, as análises químicas de LC-MS/MS das amostras ambientais buscando as três referidas toxinas detectaram a presença somente de microcistina. As variantes de microcistinas encontradas foram as MC-LR e MC-RR. Os resultados deste estudo contribuem para o aumento de informações sobre o reservatório Salto Grande, e mais uma vez alertam para a preocupante situação deste reservatório em relação à saúde pública. / Cyanobacteria produce toxic substances which are known as cyanotoxins. Numerous cases of poisoning in humans and animals have been reported in several countries. Several toxic cyanobacteria are planktonic and develop in freshwater environments forming intense blooms under favorable conditions. Cyanobacterial blooms have been observed throughout the year in the Salto Grande reservoir (Americana, SP) that has intense recreational use, besides serves to public water supply, fisheries and crop irrigation. Therefore, evaluate cyanobacterial community and identify the presence of cyanotoxin genes as well as assess the production of toxins in blooms from the Salto Grande reservoir is of fundamental importance to public health agencies to allow safe uses of these water bodies. In this study, three water samples with cyanobacterial bloom were analyzed, which were collected at different periods, in two locations with intense recreational use. Investigations under optical microscope of the samples preserved with Lugol\'s iodine solution identified fifteen cyanobacterial genera, being two of them hitherto unknown to the location (Plantothrix and Komvophorum). Cell counts using the Utermöl technique performed for two water samples showed values exceeding those recommended by the Regulation Nº 2.914 of the Brazilian Ministry of Health, which establish weekly analyzes and sampling of water above 20,000 cells/mL. The genetic potential for production of the toxins cylindrospermopsin, saxitoxin and microcystin was evaluated using total genomic DNA from the environment samples and it was observed PCR amplification of the genes cyrJ, sxtA, sxtI, mcyE and mcyG. The PCR products were sequenced and phylogenetic analyses of amino acid sequences showed that they grouped with homologous sequences of known cyanobacterial producers of the respective toxins. However, the chemical analyzes of LC-MS/MS of the environmental samples searching for the three referred toxins detected only the presence of microcystin. The microcystin variants found were MC-LR and MC-RR. The results of this study contribute to the increase of information on the Salto Grande reservoir, and once again warming to the alarming situation of this reservoir related to public health.
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Mapeamento de adutos de DNA e investigação de possíveis biomarcadores de poluição urbana / DNA adducts mapping and investigation of possible biomarkers of urban pollution exposureAngélica Bianchini Sanchez 13 April 2017 (has links)
Globalmente, os problemas de poluição são mais severos em regiões densamente povoadas ou industrializadas. A Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) é um exemplo de megalópole com um conjunto único de emissões, insolação e condições meteorológicas que determinam sua elevada poluição atmosférica. Entre os compostos mais tóxicos presentes nesta atmosfera estão os aldeídos, moléculas de grande potencial mutagênico e carcinogênico que podem ser originados da oxidação de combustíveis fósseis e etanol, além de possuir fontes endógenas. Sua adição covalente em biomoléculas como DNA e proteínas é estudada como mecanismo de sua ação mutagênica e carcinogênica. Desenvolvemos um método ultrassensível de HPLC acoplado à espectrometria de massas para análise simultânea de vários adutos de DNA com aldeídos presentes na atmosfera urbana como formaldeído, acetaldeído, crotonaldeído e acroleína, além de modificações oxidativas. Foram utilizados para validação da metodologia células modelo de Anemia Fanconi e tecido de músculo de ratos modelo para ELA (Esclerose Lateral Amiotrófica), os quais apresentaram níveis basais dos adutos de formaldeído, acetaldeído, acroleína e crotonaldeído. Outros modelos de exposição aos aldeídos foram utilizados na validação desta metodologia, como a fumaça de cigarro de tabaco e de cannabis sendo que a formação desses adutos também foi verificada em DNA de timo de bezerro. Pela primeira vez, foi mostrada a formação inequívoca do aduto de acetaldeído (1,N2-propanodGuo) em pulmões e cérebros de ratos Wistar expostos à 10 ppb de acetaldeído isotopicamente marcado e sua estrutura confirmada por espectrometria de massas de alta resolução. Esse resultado comprova o mecanismo de formação do aduto por meio da adição de duas moléculas de acetaldeído in vivo por inalação e em baixa concentração, sendo crucial para formulação de políticas públicas por agências ambientais. / Globally, air pollution problems are more severe in densely populated or industrialized regions. The Metropolitan Region of São Paulo (RMSP) is an example of a megalopolis with a unique set of emissions, insolation and meteorological conditions that determinates its high atmospheric pollution. Among the most toxic compounds present in this atmosphere are aldehydes, molecules of great mutagenic and carcinogenic potential that can be originated from the oxidation of fossil fuels and ethanol, besides having endogenous sources. Its covalent addition in biomolecules like DNA and proteins is studied as a mechanism of its mutagenic and carcinogenic action. We developed an ultra-sensitive HPLC method coupled with mass spectrometry for the simultaneous analysis of several DNA adducts with aldehydes present in the urban atmosphere as formaldehyde, acetaldehyde, crotonaldehyde and acrolein and oxidative lesions as well. To validate the method, we used a cell model of Fanconi Anemia and muscle tissue from a rat model for ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) which presented basal levels of the adducts of formaldehyde, acetaldehyde, acrolein and crotonaldehyde. Other models of exposure to aldehydes were used to validate the method, such as tobacco and cannabis smoke and the formation of these adducts was also verified in Calf Thymus DNA. For the first time, the unequivocal formation of the acetaldehyde (1, N2-propanodGuo) adduct was shown in lungs and brains of Wistar rats exposed to 10 ppb of isotopically labeled acetaldehyde and its structure was confirmed by high resolution mass spectrometry. This result confirms the mechanism of adduct formation by the addition of two molecules of acetaldehyde in vivo by inhalation of a low concentration of acetaldehyde, being crucial for the formulation of public policies by environmental agencies.
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