Orientador: Ricardo Della Coletta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:48:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bersaneti_JoseliAssem_D.pdf: 811147 bytes, checksum: f8bb5e097207f57ec74bd4e214234d0b (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O aumento gengival induzido por ciclosporina A (CsA) é causado por um acúmulo excessivo de matriz extracelular, resultado da ação do fator de crescimento transformante-beta 1 (TGF-ß1) sobre a atividade dos fibroblastos gengivais. O presente estudo investigou in vitro os efeitos da superexpressão de Smad7, um inibidor da sinalização de TGF-ß1, nos eventos biológicos associados ao acúmulo de matriz extracelular induzido por CsA. Para verificar os efeitos inibitórios de Smad7, nós superexpressamos Smad7 em fibroblastos de gengiva normal (GN) de uma maneira estável. Células superexpressando Smad7 e células controle foram incubadas com CsA e a síntese de colágeno tipo I, produção e atividade de metaloproteinase de matriz 2 (MMP-2) e proliferação celular foram analisadas por ELISA, zimografia, curva de crescimento, método de incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) e análise do ciclo celular. Os efeitos de CsA na viabilidade celular e apoptose dos fibroblastos de GN também foram avaliados. Análises de western blot e imunofluorescência para fosforo-Smad2 foram realizados para verificar a ativação da cascata de sinalização de TGF-ß1. Apesar do tratamento com CsA estimular a produção de TGF-ß1 tanto nas células controle quanto nos fibroblastos superexpressando Smad7, a via de sinalização de TGF-ß1 foi marcantemente inibida nas células superexpressando Smad7, como revelado pelos níveis reduzidos de fosforilação de Smad2. Nas células superexpressando Smad7, os efeitos de CsA na proliferação, síntese de colageno tipo I e produção e atividade de MMP-2 foram significativamente bloqueados. A superexpressão de Smad7 bloqueou a proliferação dos fibroblastos gengivais induzida por CsA via regulação de p27. CsA e a superexpressão de Smad7 não induziram morte celular. Os resultados deste estudo confirmaram que a expressão de TGF-ß1 é correlacionada com os eventos moleculares associados ao aumento gengival induzido por CsA, e sugerem que a superexpressão de Smad7 é efetiva no bloqueio de tais eventos, incluindo proliferação, síntese de colágeno tipo I e atividade de MMP-2 / Abstract: Cyclosporin A (CsA)-induced gingival overgrowth is attributed to an exaggerated accumulation of extracellular matrix, which is mainly due to an increased expression of transforming growth factor-beta1 (TGF-ß1). Herein the in vitro investigation of effects of overexpression of Smad7, a TGF-ß1 signaling inhibitor, in the events associated with CsA-induced extracellular matrix accumulation was performed. To assess the inhibitory effects of Smad7, we stably overexpressed Smad7 in fibroblasts from normal gingiva (NG). Smad7 overexpressing cells and controls were incubated with CsA and type I collagen synthesis, matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) production and activity, and cellular proliferation were evaluated by ELISA, zymography, growth curve, BrdUincorporation assay and cell cycle analysis. CsA effects on cell viability and apoptosis of NG fibroblasts were also evaluated. Western blot and immunofluorescence for phospho-Smad2 were performed to measure the activation of TGF-ß1 signaling. Although the treatment with CsA stimulated TGF-ß1 production in both control and Smad7 overexpressing fibroblasts, its signaling was marked inhibited in Smad7 overexpressing cells as revealed by low levels of Smad2 phosphorylation. In Smad7 overexpressed cells, the effects of CsA on proliferation, synthesis of type I collagen and MMP-2 production and activity were significantly blocked. Smad7 overexpression blocked CsA-induced fibroblast proliferation via p27 regulation. Neither CsA nor Smad7 overexpression induced cell death. The data presented here confirm that TGF-ß1 expression is related to the molecular events associated with CsA-induced gingival overgrowth, and suggest that Smad7 overexpression is effective in the blockage of those events, including proliferation, type I collagen synthesis and MMP-2 activity / Doutorado / Estomatologia / Doutor em Estomatopatologia

Orientador: José Eduardo Tanus dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T15:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraz_KarinaCoutinho_D.pdf: 4092717 bytes, checksum: 304af959216055cd75432ac292abc300 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Evidências clínicas e experimentais indicam o envolvimento de metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) na patogênese de diversas doenças, incluindo as doenças cardiovasculares. Particularmente, alterações na atividade da MMP-2 parecem desempenhar um importante papel na hipertensão, na insuficiência cardíaca e em outras alterações do sistema cardiovascular. Diversos estudos mostram vários alvos não relacionados à matriz extracelular para a MMP-2, incluindo proteínas intracelulares e mediadores vasoativos. Adicionalmente, diversos trabalhos indicam o envolvimento desta enzima na clivagem proteolítica de receptores ?1- e ?2-adrenérgicos. Embora alguns estudos tenham sugerido que a MMP-2 possa afetar o tônus vascular e prejudicar a função dos ?-adrenoreceptores, nenhum estudo prévio examinou os efeitos hemodinâmicos agudos desta enzima. Nós verificamos os efeitos da MMP-2 recombinante humana (rhMMP-2), administrada por via intravenosa (i.v.), a carneiros anestesiados sob condições basais e durante estimulação ?-adrenérgica com dobutamina. Vinte e seis carneiros machos anestesiados foram utilizados em dois protocolos experimentais. Primeiramente, rhMMP-2 (220 ng.kg-1.min-1 durante 60 min) ou salina foi infundida e nenhuma alteração hemodinâmica foi encontrada. No segundo protocolo, infundiu-se dobutamina (5 ?g.kg-1.min-1, i.v., durante 180 min) ou salina em carneiros que haviam recebido a mesma infusão descrita acima de rhMMP-2 ou salina precedida pelo tratamento com doxiciclina (10 mg.kg-1, i.v., durante 15 min) ou salina. Os níveis plasmáticos e cardíacos de MMP-2 foram avaliados por zimografia e a atividade gelatinolítica foi analisada por espectrofluorimetria. Nós observamos que, enquanto a infusão de rhMMP-2 não aumentou os níveis plasmáticos e cardíacos de MMP-2, produziu um aumento na atividade gelatinolítica do coração, e a doxiciclina preveniu este efeito. A dobutamina reduziu o índice de resistência vascular sistêmico (IRVS) e aumentou o índice cardíaco (IC) e a dP/dtmax no ventrículo esquerdo. Entretanto, a co-infusão de rhMMP-2 e dobutamina foi associada com uma menor redução no IRVS e com menores aumentos no IC e na dP/dtmax induzidos pela dobutamina. O pré-tratamento com doxiciclina impediu estas alterações induzidas pela rhMMP-2 na resposta à dobutamina. Adicionalmente, verificou-se que a rhMMP-2 reduziu a formação de AMP cíclico em cardiomiócitos e que os inibidores de MMPs doxiciclina e ONO-4817 impediram esta redução. Nossos resultados mostram que a rhMMP-2, sob condições basais, não exerce efeitos hemodinâmicos em carneiros. Entretanto, a rhMMP-2, sob estimulação cardíaca, prejudica a resposta cardiovascular induzida pela ativação de receptores ?-adrenérgicos / Abstract: Experimental and clinical evidence indicate the involvement of matrix metalloproteinases (MMPs) in the pathogenesis of many disease conditions, including cardiovascular diseases. Particularly, imbalanced MMP-2 activity apparently plays a critical role in hypertension, heart failure and in other alterations of the cardiovascular system. Various studies show many targets unrelated to the extracellular matrix for MMP-2, including intracellular proteins and vasoactive mediators. Additionally, recent studies indicate the involvement of this enzyme in proteolytic cleavage of 'beta'1- and 'beta'2-adrenoreceptors. Although some studies have suggested that MMP-2 may affect the vascular tone and impair 'beta'-adrenoreceptor function, no previous study has examined the acute hemodynamic effects of this enzyme. We examined the effects of recombinant human MMP-2 (rhMMP-2) administered intravenously (i.v.) to anesthetized lambs at baseline conditions and during ?-adrenergic stimulation with dobutamine. Twenty-six anesthetized male lambs were used in two study protocols. Firstly, rhMMP-2 (220 ng.kg-1.min-1 over 60 min) or vehicle was infused and no significant hemodynamic changes were found. In the second protocol, we infused dobutamine (5 ug.kg-1.min-1, i.v., over 180 min) or saline in lambs that had received the same rhMMP-2 infusion preceded by treatment with doxycycline (10 mg.kg-1, i.v., during 15 min) or saline. Plasma and cardiac MMP-2 levels were assessed by gelatin zymography and gelatinolytic activity was assessed by spectrofluorimetry. We found that, while the infusion of rhMMP-2 did not increase plasma and cardiac MMP-2 levels, it increased cardiac gelatinolytic activity, and doxycycline blunted this effect. Dobutamine decreased systemic vascular resistance index (SVRI) and increased the cardiac index (CI) and left ventricular dP/dtmax. However, co-infusion of rhMMP-2 and dobutamine was associated with lower dobutamine-induced decrease in SVRI and with lower dobutamine-induced increase in CI and dP/dtmax. Pre-treatment with doxyxycline blunted rhMMP-2-induced changes in dobutamine responses. Additionally, we found that rhMMP-2 decreased cyclic AMP levels in cardiomyocytes and that tne inhibitors of MMPs doxyxycline and ONO-4817 prevented this reduction. Our findings show that rhMMP-2, at baseline conditions, exerts no major hemodynamic effects in lambs. However, rhMMP-2, during cardiac stimulation, impairs the responses elicited by activation of 'beta'-adrenoreceptors / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-07-07T22:04:42Z No. of bitstreams: 1 B_Ana Carolina Araruna Alves.pdf: 2976771 bytes, checksum: 6037ca4948dccfe79d9bf9acc7627451 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-07T22:04:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 B_Ana Carolina Araruna Alves.pdf: 2976771 bytes, checksum: 6037ca4948dccfe79d9bf9acc7627451 (MD5) Previous issue date: 2012-12-11 / The cartilage damage and destruction are common in osteoarthritis (OA) and are associated with elevated levels of matrix metalloproteinases (MMPs), proteinases that can degrade all components of the extracellular matrix (ECM). The objective was to study the effect of low level laser therapy (LLLT) at 50mW and 100mW in joint damage evaluated by histopathological analysis, and protein expression of metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 in the articular lavage. We used 60 male Wistar rats randomly divided into 4 groups of 15 animals each: a control group, an injury group, and two treated groups, one with LLLT 50mW and other with 100mW. The animals underwent OA induction (papain solution 4%) and, on the euthanasia day was collected the articular lavage, which was immediately centrifuged and the supernatant saved for analysis of protein expression by Western blot. The material was stained with hematoxylin and eosin for histopathologic description and Picrosirius Red, to estimate the percentage of collagen fibers. As a result, it was observed that both laser groups were efficient on tissue repair, decreasing the expression of collagen type III and increasing type I at all the experimental times, however, the group LLLT 50mW was better in reducing MMP - 9 in relation to the LLLT 100mW group in 21 days. In conclusion, LLLT 50 mW was more efficient on modulating matrix metalloproteinases and repair of the cartilaginous tissue. / A lesão da cartilagem e a sua destruição são comuns em osteoartrite (OA) e estão associadas com níveis elevados de metaloproteinases de matriz (MMPs), proteinases que podem degradar todos os componentes da matriz extracelular (ECM). O objetivo foi estudar o efeito do laser de baixa intensidade (LBI) com 50mW e 100mW em lesões articulares por meio da análise histopatológica, bem como pela expressão proteíca de metaloproteinases 2 e 9 no lavado articular. Utilizou-se 60 ratos Wistar machos, distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 15 animais, sendo: um grupo controle; um grupo lesão, e dois grupos tratados, um com LBI de 50mW, e outro com LBI de 100mW. Os animais foram submetidos a OA (solução de papaína a 4%) e, no dia da eutanásia, coletou-se o lavado articular, que foi imediatamente centrifugado e o sobrenadante armazenado para análise de expressão protéica por Western Blot. O material foi corado com HE para a descrição histopatológica e Picrosirius Red, para estimar o percentual de fibras colágenas. Como resultado, observou-se que os dois grupos laser foram eficientes na reparação tecidual, diminuindo a expressão de colágeno tipo III e aumentando a do tipo I em todos os tempos experimentais, no entanto, o grupo LBI 50mW foi melhor em relação à redução da metaloproteinase 9 em relação ao grupo LBPI 100mW em 21 dias. Podemos concluir que o LBI 50 mW foi mais eficiente na modulação de metaloproteinases de matriz e reparação do tecido cartilaginoso.

Deux complexes de gallium solubles dans l'eau de formule [Ga(III)LCl], où L est la forme déprotonée de dérivés d'acide N-2-hydroxybenzyl-aspartique ont été synthétisés et caractérisés par RMN 1H et 13C, FT-IR, spectrométrie de masse et analyse élémentaire. Les données analytiques obtenues sont cohérentes avec une structure mononucléaire dans laquelle le cation gallium (III) est ligandé par l'un des deux groupes acide carboxylique, l'oxygène phénolique et l’atome d'azote du groupe 2-hydroxybenzylamino. Dans une telle structure, le ligand tridendate assure la liaison de l'ion métallique tandis que l'appendice carboxylique fournit la solubilité dans l'eau. La cytotoxicité du complexe gallium de l'acide (R)-2-(5-chloro-2-hydroxybenzylamino)succinique (GS2) a été évaluée contre les lignées cellulaires de cancer du sein humain MDA-MB231 et de fibrosarcome HT-1080. Nous avons établi que GS2 est plus cytotoxique que le dérivé dépourvu de chlore aromatique et que le chlorure de gallium. GS2 est capable d'induire l'apoptose par la régulation négative de la phosphorylation de l'AKT et l’arrêt du cycle cellulaire en G2M via l’activation de la voie des caspases 3/7. Bien que de nombreux effets moléculaires et cellulaires du Ga aient été décrits, y compris l'inhibition du protéasome et les activités ostéoclastiques, le complexe GS2 apparaît comme le premier complexe de gallium capable de réduire la phosphorylation d'AKT dans les cellules cancéreuses. L'activité de GS2 sur l'invasion cellulaire et sur l'expression et l'activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) a été étudiée en utilisant une chambre de Boyden revêtue de collagène de type I. Nous avons analysé l'activité sur les MMPs par zymographie et dosage enzymatique en utilisant des substrats fluorogènes à haute affinité. Une inhibition sélective de MMP-14 a été observée pour bloquer la migration et l'invasion de cellules tumorales. L'expression de l'ARNm des MMP a été analysée par qRT-PCR. GS2 induit une diminution de l'invasion cellulaire. Un effet d'inhibition dose-dépendante a été observé sur les activités de MMP-2, MMP-9 et MMP-14. Une diminution de l'expression de l'ARNm de MMP-14 a été observée dans les deux lignées cellulaires, tandis que l'expression des ARNm de MMP-2 et de MMP-9 ne décroit que dans les cellules tumorales MDA-MB231. Les données obtenues sur l'expression de l'ARNm de MMP-14 ont été confirmées par analyse Western Blot. GS2 semble être une molécule capable de réduire l'activité de MMP-14 dans des maladies métastatiques cancéreuses présentant un niveau élevé d'expression et d'activité de MMP-14. En conclusion, ces données montrent que le complexe GS2, en combinaison avec une chimiothérapie cytotoxique, est un composé prometteur pour la thérapie anti-invasive et anticancéreuse. / Two water soluble gallium complexes with formula [Ga(III)LCl], where L is the deprotonated form of N-2-hydroxybenzyl aspartic acid derivatives were synthesized and characterized by 1H NMR, 13C NMR, FT-IR, mass spectrometry and elemental analysis. The analytical data are consistent with a mononuclear structure in which the gallium (III) cation is liganded by one of the two carboxylic acid groups, the phenol oxygen and the nitrogen atom of the 2-hydroxybenzylamino group. In such a structure, the tridendate ligand secures the binding of the metal ion whereas the carboxylic appendage provides the water solubility. The cytotoxicity of the gallium complex of (R)-2-(5-chloro-2-hydroxybenzylamino) succinic acid (GS2) was evaluated against human breast carcinoma MDA-MB231 and fibrosarcoma HT-1080 cell lines. The 5-chloro derivative GS2 was found to be more cytotoxic than the unsubstituted derivative and GaCl3. GS2 induces apoptosis through down-regulation of AKT phosphorylation, G2M arrest in cell cycle via activation of the caspase3/7 pathway. Although, many molecular and cell effects of Ga have been described, including proteasome inhibition and osteoclastic activities, GS2 appears as the first Ga compounds able to decrease AKT phosphorylation in cancer cells. The activity of GS2 on cell invasion and on the expression and activity of Matrix Metalloproteinases (MMPs) have been investigated using modified Boyden chamber coated with type I collagen. We analyzed the activity on MMPs by zymography and enzymatic assay using high affinity fluorogenic substrates. A selective inhibition of MMP-14 has been reported to blocks tumor cell migration and invasion. The expression of MMPs mRNA was analyzed by qRT-PCR. GS2 induces a decrease in cell invasion. A dose dependent inhibition effect was observed on MMP-2, MMP-9 and MMP-14 activities. A decrease in MMP-14 mRNA expression was observed in both cell lines, whereas MMP-2 and MMP-9 mRNA expression was decreased only in MDA-MB231 cells. Thus, we propose that GS2 compound may be a potential candidate to decrease the MMP-14 activity in cancer metastatic diseases presenting high level of MMP-14 expression and activity. Taken together, these data show that GS2, in combination with cytotoxic chemotherapy a is a promising compound for anti-invasive and anticancer therapy.

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24497号 / 医博第4939号 / 新制||医||1064(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 中島 貴子, 教授 永井 純正, 教授 寺田 智祐 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Patients on peritoneal dialysis (PD) are reliant on the peritoneum to provide a semi-permeable barrier to allow for dialysis (solute clearance), salt and water removal (ultrafiltration). PD patients are at risk of developing peritoneal fibrosis and angiogenesis which can lead to a decline in peritoneal membrane function. Specifically, PD patients develop increased solute transport and decreased osmotic conductance leading to ultrafiltration failure. Peritoneal angiogenesis is the leading factor that results in augmented peritoneal membrane solute transport which is associated with worse outcomes – increased risk of mortality and PD technique failure. Transforming growth factor beta (TGFB) is one of the primary cytokines involved in inducing epithelial to mesenchymal transition (EMT) and fibrosis. We hypothesize that PD leads to injury of the epithelial lining of the peritoneum – the mesothelial cells. These cells undergo a transition process and transitioned mesothelium are a source for angiogenic and fibrogenic growth factors. Matrix Metalloproteinase (MMP) 9 is an angiogeneic factor and has been observed to correlate with increased expression of vascular endothelial growth factor (VEGF). MMP9 has the ability to cleave and activate membrane bound factors such as E-cadherin and b-catenin respectively. There is substantial evidence that the canonical WNT/b-catenin pathway is active during fibrosis, and angiogenesis in different biological contexts. Thus, we investigated the role of MMP9 and WNT signaling in peritoneal angiogenesis. Limited evidence exists describing the role of noncanonical WNT signaling but some reports suggest that non-canonical WNT signaling inhibits WNT/b-catenin signaling. Non-canonical WNT5A has differential effects based on receptor context and has been shown to block WNT/b-catenin signaling in the presence of Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 2 (Ror2). The overall hypothesis of this PhD thesis is that MMP9 and WNT signaling play a key role in inducing peritoneal angiogenesis and are associated with changes in peritoneal membrane function. We expect WNT5A and Ror2 to protect against peritoneal membrane injury. From the overnight effluent of stable PD patients, we cultured mesothelial cells and assayed these for expression of MMP and WNT related genes. MMP9 and WNT1 gene expression were observed to be strongly correlated with peritoneal membrane solute transport in patients on PD. WNT2 mRNA was also positively correlated with peritoneal solute transport. We overexpressed MMP9 in the mouse peritoneum to demonstrate its role in angiogenesis and confirmed these findings using MMP9 -/- mice. In addition to this, we have shown a novel mechanism by which MMP9 induces angiogenesis by E-cadherin cleavage and b-catenin mediated signaling. The observed cross-talk between MMP9 and b-catenin prompted investigation of the activation of canonical WNT/b-catenin signaling in development of peritoneal membrane injury. In an experimental model of TGFB induced pertioneal injury, we confirmed the activation of WNT/b-catenin signaling. In addition to this we, we blocked the WNT pathway and observed that WNT/b-catenin signaling is required to induce peritoneal angiogenesis. WNT5A mRNA was downregulated during TGFB induced injury suggesting a more protective role. Furthermore, several studies have demonstrated its ability to antagonize the WNT/b-catenin signaling pathway. We demonstrated that WNT5A protected against angiogenesis by blocking the canonical WNT pathway. WNT5A is thought to antagonize the WNT/b-catenin signaling pathway by signaling through receptor Ror2. In cell culture, we overexpressed TGFB and blocked Ror2. This resulted in elevated levels of VEGF and fibronectin suggesting that Ror2 is involved in mediating protection. Therefore, Ror2 possesses the ability to regulate VEGF and may be a potential candidate by which WNT5A mediates its protective effects. In conclusion, our findings identified MMP9 and WNT1 as potential biomarkers of increased peritoneal solute transport in patients that are on PD. We have also found a novel mechanism by which MMP9 interacts with b-catenin to induce peritoneal angiogenesis and have provided a first look at WNT/b-catenin signaling in peritoneal angiogenesis. Lastly, we have shown WNT5A to protect against peritoneal angiogenesis. Taken together, our findings are not only significant to the realm of PD research but hold wide applicability to research in the biomedical sciences. / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

A diminuição da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) e o aumento na atividade das metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) são alguns dos principais mecanismos fisiopatogênicos envolvidos nas doenças cardiovasculares (DCV). Foi demonstrado que o NO pode reduzir a expressão e atividade de MMPs em células musculares lisas vasculares, células mesangiais, entre outras. Em outro estudo, foi mostrado que drogas inibidoras da NO sintase (NOS) podem aumentar a expressão de MMPs. Apesar de o NO apresentar-se diminuído e as MMPs aumentadas durante as DCV, não há evidência clara de que os níveis de NO possam modular diretamente a atividade de MMPs no aparelho cardiovascular. Também não se sabe se este possível efeito seria mediado pelo NFB, nem se este possível efeito é dependente da ativação da guanilato ciclase [que promove a formação de GMP cíclico (GMPc)]. Desta maneira, este estudo teve como objetivos: A) investigar os efeitos de drogas ativadoras da via NO-GMP sobre os aumentos da atividade e expressão de MMP-9 em células endoteliais que acontecem sob efeito de phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA, droga indutora da expressão de MMP-9); e B) determinar se a inibição de NOS em células endoteliais é acompanhada por aumento da atividade e expressão de MMPs, e C) determinar se estes efeitos são dependentes da ativação de NFB ou da formação de GMPc. Células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas em DMEM e tratadas por 24 horas com 10 nmol/L de PMA ou diferentes concentrações de drogas ativadoras da via NO-GMP ou de inibidor da NOS. Meio de cultura condicionado ou lisado celular foram coletados e submentidos aos ensaios de zimografia, ELISA, immunoblotting ou análise da concentração de nitrito. Os tratamentos com detanonoato, SNAP, atorvastatina e nitrito de sódio diminuíram os aumentos da atividade gelatinolítica e expressão de MMP-9 estimulados por PMA sem afetar as concentrações do inibidor tecidual da metaloproteinase da matriz-1 (TIMP-1). Esses efeitos não foram modificados pelos tratamentos com ODQ (inibidor da guanilato ciclase solúvel) ou 8- bromo-cGMP (um análogo de GMPc) ou hemoglobina (um sequestrador de NO). Enquanto o PMA aumentou a concentração de fosfo-NFB p65, os tratamentos com SNAP, atorvastatina ou nitrito não apresentaram influência sobre esse efeito. O tratamento com L-NAME, um inibidor da NOS, não apresentou efeito sobre a atividade gelatinolítica de MMP-9. Em conclusão, foram demonstrados que os efeitos inibitórios de drogas ativadoras da via NO-GMPc sobre a produção estimulada de MMP-9 em células endoteliais são independentes de mecanismos mediados por GMPc e NFB, e a inibição da NOS não altera a atividade de MMP-9. / Impaired nitric oxide (NO) bioavailability and imbalanced matrix metalloproteinases (MMPs) activity have important roles in the pathophysiological mechanisms involved in cardiovascular disease (CVD). It was shown that NO can reduce MMPs expression and activity in vascular smooth muscle cells, mesangial cells, and others. In another study, a NO synthase (NOS) inhibitor has increased MMPs expression. Although NO was decreased and MMPs was increased during CVD, there is clear evidence that NO levels can directly modulate MMPs activity in the cardiovascular system. Also, it is not known whether this effect would be mediated by NFB, nor whether this effect is dependent on guanylate cyclase activity (which promotes the formation of cyclic GMP). Thus, this project aims to study whether A) the effect of NO donors might decrease MMP-9 activity and expression in endothelial cells stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (a well-known inducer of MMP-9), and B) the effect of NOS inhibitors might increase MMPs activity and expression in endothelial cells, and C) to determine whether those effects are mediated by the NFB activation or cGMP levels. Endothelial cells from human umbilical vein (HUVECs) were grown in modified DMEM and were treated for 24 hours with 10 nmol/L PMA or different concentrations of NO-GMPc pathway stimulating drugs or NOS inhibitor. Conditioned medium or cell lysate were collected after treatments and analyzed by zymography, ELISA, immunoblotting or to determine nitrite concentration. Detanonoate, SNAP, atorvastatin or sodium nitrite treatments attenuated PMA-induced increases in MMP- 9 gelatinolytic activity and expression, but they had no effect on tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1) concentrations. These effects were not modified by ODQ (a soluble guanylate cyclase inhibitor), or 8-bromo-cGMP (cGMP analogue), or hemoglobin (a NO scavenger). While PMA increased phospho-NFB p65 concentration, SNAP, atorvastatin or nitrite had no influence on this effect. The treatment with L-Name, a NOS inhibitor, had no effect on MMP-9 activity. In conclusion, this study shows that the inhibitory effects of NO-GMPc pathway stimulating drugs on MMP-9 production by endothelial cells are independent of cGMP- and NFB-mediated mechanisms, and NOS inhibitor had no effect on MMP-9 levels

INTRODUÇÃO: O aneurisma da aorta abdominal (AAA) tem grande importância clínica em função de sua incidência e das complicações que pode acarretar, entretanto sua etiopatogenia não está completamente esclarecida. A associação entre tabagismo e desenvolvimento de AAA tem sido repetidamente confirmada. Apesar de o AAA ter sido inicialmente atribuído à aterosclerose, observou-se associação negativa entre diabetes (um dos principais fatores de risco para aterosclerose) e doença vascular aneurismática. O estudo biomecânico e histológico da parede aórtica pode contribuir para a elucidação da etiopatogenia dos aneurismas. OBJETIVOS: Avaliar as propriedades biomecânicas e histológicas da aorta abdominal de ratos em três situações: exposição à fumaça do cigarro, induzidos ao desenvolvimento do diabetes mellitus e com a associação desses dois fatores. MÉTODOS: Setenta e cinco ratos Wistar foram distribuídos em quatro grupos: controle (GC), tabagista (GT), diabético (GD), diabético e tabagista (GDT). Os ratos dos GT e GDT foram expostos à fumaça de cigarro por 30 minutos ao dia, 5 dias por semana. O diabetes foi induzido por injeção endovenosa de estreptozotocina. Após 16 semanas, os animais foram sacrificados para a coleta da aorta abdominal. Testes de tração uniaxiais destrutivos foram realizados para a obtenção das seguintes propriedades biomecânicas: força, tensão, estresse, deformação e energia de deformação. A análise histológica desses fragmentos consistiu na avaliação das fibras colágenas e elásticas e verificação da deposição de elementos da matriz extracelular na túnica média e avaliação da sua composição. Através da zimografia foi quantificada a atividade da metaloproteinase-2 nos espécimes aórticos obtidos. RESULTADOS: Foram analisados os testes biomecânicos válidos de 52 espécimes, sendo que 11 pertenciam ao GC, 10 ao GD, 16 ao GT e 15 ao GTD. A análise biomecânica dos fragmentos não revelou diferença entre os grupos controle, GD, GT e GDT. A deposição de colágeno também não apresentou diferença estatística significativa entre os grupos estudados. A contagem total de lâminas elásticas foi maior nos ratos diabéticos (GD e GDT) quando comparados aos do GT. Foi observada resposta inflamatória mais intensa, com significância estatística, em todos os grupos estudados quando comparados ao GC. A atividade da MMP-2 apresentou diminuição no GD em relação ao GDT, com significância estatística. CONCLUSÕES: As propriedades biomecânicas da parede da aorta de ratos relacionadas à resistência e elasticidade não apresenta diferença entre o GC e os GD, GT e GDT. As alterações histológicas relacionadas à contagem total e fragmentação das lâminas elásticas, deposição de matriz pericelular e perda/substituição celular na túnica média são significativas na parede da aorta do GD, GT e GDT em relação ao GC. A atividade da MMP-2 na aorta do GD é menor que na aorta do GDT / INTRODUCTION: Abdominal aortic aneurysm (AAA) is of great clinical importance due to its incidence and complications, but its etiopathogenesis is not fully understood. The association between smoking and AAA development has been repeatedly confirmed. Although AAA was initially attributed to atherosclerosis, there was a negative association between diabetes (a major risk factor for atherosclerosis) and aneurysmal vascular disease. The biomechanical and histological study of the aortic wall may contribute to the elucidation of the etiopathogeny of the aneurysms. OBJECTIVES: To evaluate the biomechanical and histological properties of the abdominal aorta of rats in three situations: exposed to cigarette smoke, induced to the development of diabetes mellitus, and the association of these two factors. METHODS: Seventy-Five Wistar rats were divided into four groups: control (CG), smoker (GT), diabetic (GD), diabetic and smoker (GDT. The GT and GDT rats were exposed to cigarette smoke for 30 minutes a day, 5 days a week. Diabetes was induced by intravenous injection of streptozotocin. After sixteen weeks, the animals were sacrificed for collection of the abdominal aorta. Uniaxial destructive tensile tests were performed to obtain the following biomechanical properties: maximal force, failure stress, failure tension, failure strain and failure strain energy. The histological analysis of these fragments consisted in the evaluation of the collagen and elastin and verification of the deposition of elements of the extracellular matrix in the tunica media and evaluation of its composition. The activity of metalloproteinase-2 in the aortic specimens obtained was quantified by zymography. RESULTS: A total of 52 strips were studied (11 from GC, 10 from GD, 16 from GT and 15 from GDT. The biomechanical analysis of the fragments was not different between the control group and the GD, GT and GDT groups. Collagen deposition also did not present a statistically significant difference between the studied groups. The total of elastic fibers was higher in diabetic rats (GD and GDT) when compared to GT. A higher inflammatory response was observed, with statistical significance, in all groups studied when compared to CG. The activity of MMP-2 showed a decrease in GD in relation to GDT, with statistical significance. CONCLUSIONS: The biomechanical properties of the aortic wall of rats related to resistance and elasticity do not present a difference between GC and GD, GT and GDT. Histological changes related to total count and fragmentation of the elastic lamina, pericellular matrix deposition, and cell loss / substitution in the tunica media are significant in the aorta wall of GD, GT and GDT in relation to GC. The activity of MMP-2 in the GD aorta is smaller than in the GDT aorta

O tratamento radioterápico para pacientes com neoplasias de cabeça e pescoço pode trazer consequências secundárias graves como alterações da estrutura dental, com conseguinte prejuízo da função oral, a qual influencia negativamente a qualidade de vida. Recentemente trabalhos de pesquisa tem demonstrado que a radiação induz a expressão e ativação das metaloproteinases da matriz (MMPs), consideradas as principais enzimas responsáveis pela remodelação da matriz orgânica, incluindo os componentes e estruturas da junção amelodentinária (JAD). Questiona-se então se as alterações dentais observadas em pacientes pós-radioterapia poderiam ser causadas também pela ativação das MMPs que se encontram na JAD. O presente estudo apresentou três avaliações: a ativação e expressão das MMPs, a implementação de inibidores de proteases como método de inibição das MMPs e a ativação das MMPs devido a um desafio ácido. Para as medições foram utilizados 178 fragmentos dentais de molares, divididos aleatoriamente em 2 grupos (decíduos e permanentes) / 4 subgrupos experimentais (irradiados e não-irradiados). Os fragmentos foram expostos à radiacao com Co-60, com fracao de dose de 2 Gy, 5 dias consecutivos, ate atingirem a dose total de 60 Gy, com um total de 30 ciclos, durante 6 semanas. Com o objetivo de determinar a expressão e atividade das MMPs, foram realizados os ensaios de imunofluorescência e zimografia in situ, nos fragmentos dentais de 0,6mm, analisando os tecidos duros do esmalte, dentina e JAD. Para avaliar se produtos odontológicos inativam as MMPs, os dentes foram imersos em 0,5ml de digluconato de clorexidina a 0,12%, fluoreto de sódio a 0,05%, polifenol epigalocatequina 3-galato 400μM e água destilada (grupo controle), por 1 hora. Assim também com objetivo de avaliar se em um ambiente ácido, as MMPs apresentariam maior atividade, os dentes foram colocados em contato com 20μl de solucao desmineralizadora com pH de 4,8, por um minuto, e posteriormente lavados com 20μl de água deionizada, por um minuto. De maneira geral pudemos observar que a irradiação ativa as MMPs na JAD e estes efeitos foram mais evidentes nos dentes permanentes que nos decíduos. Com relação à expressão das diferentes MMPs, foi observada uma maior expressão das MMPs-9 e -20 para dentes decíduos, e para dentes permanentes as MMPs-2, -9 e -20 apresentaram expressão semelhante. Tendo em vista que a irradiação foi capaz de ativar as MMPs expressas na JAD de dentes permanentes, e em busca de soluções capazes de inibi-las, observamos que o Digluconato de Clorexidina, o Fluoreto de Sódio e o Polifenol Epigalocatequina 3-galato inibiram a atividade das MMPs na JAD em dentes permanentes. Por último ao investigar o efeito de um desafio ácido, na atividade das MMPs, observamos que a desmineralização não aumentou a atividade das MMPs em dentes não irradiados, porém aumentou a atividade das MMPs em dentes irradiados. Comparando dentes irradiados submetidos ou não à desmineralização, observou-se que a desmineralização incrementou a atividade das MMPs, já induzida pela irradiação. / Radiotherapy for patients with head and neck cancer can have serious secondary consequences such as changes in tooth structure, with consequent loss of oral function which negatively influences an individual\'s quality of life. Recently research work has shown that radiation induces the expression and activation of matrix metalloproteinases (MMPs) which are considered the major enzymes responsible for the remodeling of the organic matrix, including the components and structures of the dentinoenamel junction (DEJ). It is questionable if the dental changes observed in post-radiotherapy patients could also be caused by the activation of MMPs that are in the DEJ. The present study has three assessments: the activation and expression of MMPs, the implementation of protease inhibitors such as method of inactivating MMPs and the activation of MMPs due to an acid challenge. The measurements that were used were 178 molar dental fragments randomly divided into 2 groups (deciduous and permanent) / 4 experimental subgroups (irradiated and non-irradiated). The samples were exposed to radiation using Co-60 at a cumulative dose of 2 Gy fraction, 5 consecutive days, until they reached a total dose of 60 Gy, with a total of 30 cycles for 6 weeks. In order to determine the expression and activity of MMPs immunofluorescence assays were performed and in situ zymography, the dental fragments of 0.6mm, analyzing the DEJ in three areas of the tooth (cervical, cuspal and groove of pit). To assess whether MMPs inactivate dental products, the teeth were immersed in 0.5 ml of chlorhexidine digluconate at 0.12%, sodium fluoride 0.05%, polyphenol epigallocatechin-3 gallate 400μM and distilled water (control group) for 1 hour. To evaluate effects in an acidic environment, MMPs have higher activity, the teeth were put in contact with 20μl of demineralizing solution with pH 4.8, for a minute, and then washed with 20μl of deionized water, one minute. In general we observed that the radiation active MMPs in DEJ and these effects were more evident in the permanent teeth than in the primary teeth. Regarding the expression of different MMPs, showed the greatest expression of MMP-9 and -20 for deciduous teeth, and permanent teeth MMPs-2, -9 and -20 showed similar expression. Given that the irradiation was able to activate MMPs expressed in the DEJ permanent teeth, and looking for solutions that inactive them, we observed that the digluconate Chlorhexidine, the Sodium Fluoride and Polyphenol Epigallocatechin-3-gallate inhibited activity of MMPs in the DEJ in permanent teeth. Finally, to investigate the effect of an acid challenge, in the activity of MMPs, we observed that the demineralization did not increase the activity of MMPs in non-irradiated teeth but increased the activity of MMPs in irradiated teeth. Comparing irradiated whether subjected to demineralization teeth or not, it was found that demineralization increased activity of MMPs, induced by the radiation.