There have been dramatic advances in melanoma therapy in the last 10 years, yet there is still a demand for effective and affordable therapies. To identify novel therapeutic pathways a transcriptome analysis was performed on zebrafish melanoma models representing the different stages of melanoma progression. Transcriptomic differences between pre-malignant and malignant conditions highlighted lipid metabolism as a potential mediator of progression. A mass spectrometry analysis confirmed multiple changes in lipid composition between wild type fish, pre-malignant and advanced melanoma models. To better investigate metabolism a positron emission tomography (PET) technique was developed in zebrafish. Tumours in the zebrafish were successfully scanned with FDG used to detect human tumours. A novel tracer of unconjugated FA was then developed and, consistent with inferences from the transcriptome and mass spectrometry, was shown to be incorporated into tumours. Demonstrating the feasibility of PET in zebrafish now opens the way to systematic use of this organism in tracer development with potential time-saving and cost benefits. One of the most significantly up-regulated genes exclusive to the malignant state encodes lipoprotein lipase (LPL). LPL is involved in the release and uptake of FA from circulating triglyceride. LPL was found to increase the rate of tumour appearance and tumour growth in a zebrafish tumour assay. LPL was expressed in human tumours and expression correlated with progression. Melanoma cell lines expressed LPL and knocking-down LPL resulted in reduced cell numbers. The effect was most dramatic in WM852 cells. A novel role for LPL in autophagy was identified. WM852 cells treated with LPL siRNA showed a stabilisation of p62/SQSTM and induction of LC3B II. Electron microscopy revealed large autolysosomal vacuoles in the cytoplasm. Additionally many cells showed damaged mitochondria with absent cristae. The dependency of cells on LPL seemed to be modified by the co-expression of fatty acid synthase (FASN) required for de novo FA synthesis, as the magnitude of the effect of LPL-knockdown was dependent on the levels of FASN expressed in melanoma cell lines. Moreover, combining LPL and FASN inhibitors synergised to kill cells previously less sensitive to LPL inhibitor. FASN and LPL co-inhibition could provide a unique combinatorial therapeutic strategy.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Larissa Nogueira Bello (larissabello@bce.unb.br) on 2016-06-27T13:39:47Z No. of bitstreams: 1 2016_FredericoHillesheimHorst.pdf: 2915734 bytes, checksum: 8743a756aa551871c3f303311b25c566 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-06-28T13:56:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FredericoHillesheimHorst.pdf: 2915734 bytes, checksum: 8743a756aa551871c3f303311b25c566 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T13:56:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FredericoHillesheimHorst.pdf: 2915734 bytes, checksum: 8743a756aa551871c3f303311b25c566 (MD5) / O melanoma é um tipo de câncer de pele que tem origem nos melanócitos. Apesar de somente 0,96% dos novos casos de câncer no Brasil para 2016 serem de melanoma, ele é extremamente agressivo, sendo que possui alto potencial metastático o que leva muitos pacientes aóbito. Uma forma de evitar essa alta mortalidade é a realização de um diagnóstico precoce. Estudos propõem a utilização de substâncias ou partículas fluorescentes para identificar focos de câncer, e entre essas partículas carbon dotstem apresentado um grande potencial de marcação de células cancerosas por apresentarem fluorescência. Tendo em vista essa propriedade de carbon dots, este estudo teve o objetivo de realizar a caracterização fotofísicaeavaliar a toxicidade in vitroe in vivode carbondotsrecobertos com boronato (C-DotB) em camundongos com ou sem melanoma. C-DotB apresentaram absorbância na faixa do ultravioleta (abaixo de 400 nm) e quando excitadas a 360 nm apresentaram pico de emissão em 460 nm. Os testes de toxicidade in vitroforam realizados com as linhagens celulares NIH/3T3 (fibroblasto murino) e B16F10 (melanoma murino). Somente a exposição a 0,1 mg/mL de C-DotB ocasionou morte celular significativa de 60 e 70% de fibroblastos e melanoma, respectivamente. Nos experimentos in vivoforam utilizados 66 camundongos C57BL/6. Nas avaliações do peso corporal, da ração consumida e da ingestão de água por animais sem tumor e com a aplicação de C-DotB não mostraram diferenças significativas quando comparados com animais que não receberam o nanomaterial, em um períodode 30 dias. Os exames hematológicosrealizados após 2 e 30 dias da aplicação de C-DotB, mostraram que C-DotB causouum leve aumento na quantidade de células do sistema imunedos animais que receberam C-DotB na concentração de 0,31 mg/mL e que foram monitorados por 30 dias. Os exames bioquímicos mostraram que só ocorreu aumento significativona fosfatase alcalina dos animais que receberam C-DotB na concentração de 0,16 mg/mL e monitorados por 30 dias, o qual pode estar relacionado com algum problema ósseo. As imagens obtidas das lâminas coradas com hematoxilina e eosina mostraram modificações em alguns órgãos, principalmente no pulmão onde é possível ver focos de fibrose e alvéolos coalescidos. No fígado foram encontrados focos de necrose e de inflamação. A única alteração encontrada no baço foi hiperplasia da polpa branca. Tanto no cérebro quanto nos rins não foram encontradas anormalidades. Nos tumores foi possível observado necrose e focos inflamatórios. Para observara deposição de C-DotB nos tecidos analisados, as lâminas histológicas foram analisadas em microscopia de fluorescência. Contudo, não foi possível observar nenhuma fluorescência de C-DotB, provavelmente por não ter mais partícula no animal no momento da coleta do órgão (2 e 30 dias). Com base nesses dados, C-DotB pode ser utilizado na biomedicina por ser biocompatível, possuir baixa toxicidade e ser eliminado rapidamente pelo organismo. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Melanoma it is a skin cancer, which has its origins in melanocytes. Even though melanoma represents only 0.96% of new cancer cases for 2016 in Brazil, it is extremely aggressive, and because it has a high metastatic potential, it leads many patients to death. One way to avoid this high mortality is achieving an early diagnosis. Studies suggests use substances or fluorescent particles to identify cancer foci. Within these particles, carbon dots has shown a great potential for targeting cancer cells because of its fluorescence. Owing to this propriety of carbon dots, this study has the purpose to perform photophysical characterization, evaluates in vitrotoxicity and biodistribution of carbon dotscovered with boronate (C-DotB) in mices with or without melanoma. C-DotB has absorbance at ultraviolet range (above 400 nm) and emission at 460 nm when excited at 360 nm. In vitro toxicity assays were done with cell lines NIH/3T3 (murine fibroblast) and B16F10 (murine melanoma). Only exposure of 0.1 mg/mL of C-DotB resulted in significant cell death of 40 and 30% of fibroblast and melanoma. For in vivoexperiments, it was used 66 female mice C57BL/6. Body weight, food and water intake evaluations by tumor free mice and that has been applied C-DotB, did not shown significant differences with mice that did not received nanomaterial by a period of 30 days. Hematologic exams shown that C-DotB induce a slight increase in white blood cellsfor animals that received C-DotB (0.31 mg/mL) and monitored for 30 days. Biochemistry assays shown slight increaseonly in alkaline phosphatase of animals that received C-DotB (0.16 mg/mL) and monitored for 30 days, which can be correlated with bone disturbance. Images obtained from histological slices stained by hematoxylin and eosin shown alterations in some organs, mainly in lungs where it is possibly to see fibrosis focus and coalesced alveoli. Inflammatory and necrosis foci could be found at liver. The only alteration found in spleen was whit pulp hyperplasia. There were no abnormalitiesin both brain and kidney. Necrosis and inflammatory focus where found at tumors slices. To confirm C-DotB deposition at the analyzed tissues, histological slices were analyzed by fluorescence microscopy. However, it was not possibly to observe C-DotB fluorescence, probably because there were no more particles in the animals at the time of organ collected (2 and 30 days). Based on this data, C-DotB can be used in biomedicine to be biocompatible, have low toxicity and be cleared rapidly by the body.

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Orientadora : Profa. Glaucia Regina Martines / Co-orientadora : Profa. Sheila M.B. Winnischofer / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 24/02/2010 / Bibliografia: fls. 92-102 / As radiações ultravioleta (UV), infravermelha (IR) e visível (Vis) estão presentes na luz solar. Sabe-se que a radiação UV-A (320 – 400 nm) promove a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem gerar danos ao DNA das células da pele. A radiação IR também causa alterações na pele, como o envelhecimento precoce e hiperpigmentação, além disso, tem potencial fotocarcinogênico e estimula a geração de ROS. Estudos mostram que a melanina da pele do ser humano, produzida nos melanócitos e transferida para os queratinócitos, absorve as radiações solares e protege o DNA da luz solar. O uso do laser infravermelho 780nm na pele, como instrumento de tratamento, não está totalmente esclarecido em relação aos seus efeitos sobre células normais e/ou tumorais. Foi mostrado que a radiação IR incidente na pele gera ROS. O principal alvo deste trabalho foi a análise dos efeitos da radiação IR proveniente de um laser 780nm sobre células Melan-a (melanócito murino imortalizado) e B16-F10 (melanoma murino), avaliando parâmetros de morte celular e estresse oxidativo. As células B16-F10 tiveram a melanogênese modulada antes da irradiação. Não foram observadas grandes alterações de viabilidade em função das doses, quantidade de melanina endógena ou dos tempos de recuperação, exceto em duas condições: na linhagem B16-F10 sem estímulo e irradiadas com laser infravermelho de 780nm, 70mW, dose 538,2 J/cm², houve aumento de 38,9% na percentagem das células viáveis em relação ao controle após 24 h e na linhagem Melan-a sem estímulo e irradiadas com laser infravermelho de 780nm, 70mW, dose 89,7 J/cm², que tiveram diminuição de 23% na percentagem das células viáveis em relação ao controle após 48 h. Não foi observada alteração da lipoperoxidação ou fragmentação de DNA em nenhuma das linhagens celulares após irradiação. Usando a sonda DCF-DA, não foi observada a geração de ROS intracelular nas células B16-F10 e Melan-a. A melanina de Sepia officinalis irradiada com Laser IR 780nm em solução aquosa de dimetilsulfóxido promoveu a geração de ROS de forma dependente do pH do meio em que se encontrava no momento da irradiação. Os resultados em conjunto mostraram que não houve uma resposta biológica agressiva para as células B16-F10 e Melan-a quando submetidas a apenas uma aplicação para irradiação nas doses de laser IR 780mn de 89,7 a 538,2 J/cm², e, além disso, a quantidade de melanina endógena não afeta os parâmetros de morte celular e geração de ROS. / Ultraviolet (UV), infrared (IR) and visible (Vis) radiation are present in solar light. It is known that UV-A (320 – 400 nm) promotes the formation of reactive oxygen species (ROS) that can cause DNA damage in skin cells. IR radiation causes skin changes such as premature aging, and hyperpigmetation; furthermore, it has potencial for photocarcinogenicity and stimulates the generation of ROS. Studies show that melanin produced in melanocytes and transferred to keratinocytes in human skin absorbs solar radiation and protects DNA from solar light. The use of 780nm infrared laser on the skin, as a means of treatment, is not fully understood in relation to their effect on normal and/or tumor cells. Several studies show that the IR radiation on skin generates ROS. The main aim of this work was the analysis of IR radiation effects from a 780nm laser on Melan-a (immortalized murine melanocyte) and B16-F10 (murine melanoma) by evaluating cell death and oxidative stress parameters. The B16- F10 cells had the melanogenesis modulated before irradiation. Results did not show any major changes in viability in function of treatments, amount of endogenous melanin or recovery times, except for two conditions: B16-F10 without stimulation and irradiated with infrared laser 780 nm, 70 mW, dose 538,2 J/cm², that had an increase of 38.9% in the percentage of viable cells compared to control after 24h and Melan-a cell line irradiated with infrared laser 780 mn, 70 mW, dose 89,7 J/cm², that had a 23% decrease in the percentage of viable cells compared to control after 48 h. There were no changes in lipid peroxidation or DNA fragmentation in any of the cell lines after irradiation. Using the probe DCF-DA in cells B16-F10 and Melan-a, it was not observed the generation of intracellular ROS. Melanin from Sepia officinalis, irradiated with 780nm IR Laser in aqueous dimethylsulfoxide, promoted the generation of ROS, which was dependent of the pH of the medium at the time of irradiation. The overall results showed that there was not an aggressive biological response in B16-F10 cells and Melan-a when exposed to only one application of irradiation at doses of 780 nm IR laser from 89,7 a 538,2 J/cm² and, moreover, the amount of endogenous melanin did not affect the parameters of cell death and generation of ROS.

Diversos fatores de risco ambientais, fenotípicos e genéticos estão associados ao desenvolvimento do melanoma cutâneo. CDKN2A é considerado o principal gene de susceptibilidade para esta neoplasia. O polimorfismo p.A148T do gene CDKN2A parece ser um indicador de risco para o melanoma em determinadas populações. No presente estudo, a frequência de p.A148T foi estudada em 127 casos de melanoma e 128 controles por PCR-RFLP. Nos casos, a sua frequência foi significativamente superior do que em controles (0,126 x 0,039, p=0,009), demonstrando que esta variante deve ser considerada associada ao desenvolvimento do melanoma cutâneo no nosso meio como fator de risco genético para a doença. Além de identificar indivíduos geneticamente mais predispostos ao melanoma, grandes esforços têm sido empregados para o melhor entendimento dos eventos moleculares envolvidos na sua gênese. Recentemente, a teoria de que uma subpopulação de células seria responsável pela manutenção e proliferação dos tumores tem sido estudada. A presença em subgrupos de células de melanoma de uma série de marcadores, que existem em células multipotentes neurais no período embrionário e que são perdidos durante a diferenciação, seria um indício do retorno desta multipotencialidade. Reconhecer este subgrupo de células fenotipicamente distinto e estudar a sua via de ativação seria de extrema importância para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para casos avançados. A expressão imunoistoquímica da nestina, uma proteína freqüente na embriogênese neural, e de fatores de transcrição da família POU e SOX, envolvidos na sua ativação, foi estudada. Expressões aumentadas das proteínas foram encontradas nos tecidos de melanoma em relação a nevos. Além disso, observou-se coexpressão de nestina com SOX9 e SOX10, mostrando seu papel principal na ativação. A associação da nestina com ulceração e de SOX9 com tumores mais avançados pode indicar que o perfil de expressão destas proteínas seja um biomarcador de valor prognóstico.

Diversos fatores de risco ambientais, fenotípicos e genéticos estão associados ao desenvolvimento do melanoma cutâneo. CDKN2A é considerado o principal gene de susceptibilidade para esta neoplasia. O polimorfismo p.A148T do gene CDKN2A parece ser um indicador de risco para o melanoma em determinadas populações. No presente estudo, a frequência de p.A148T foi estudada em 127 casos de melanoma e 128 controles por PCR-RFLP. Nos casos, a sua frequência foi significativamente superior do que em controles (0,126 x 0,039, p=0,009), demonstrando que esta variante deve ser considerada associada ao desenvolvimento do melanoma cutâneo no nosso meio como fator de risco genético para a doença. Além de identificar indivíduos geneticamente mais predispostos ao melanoma, grandes esforços têm sido empregados para o melhor entendimento dos eventos moleculares envolvidos na sua gênese. Recentemente, a teoria de que uma subpopulação de células seria responsável pela manutenção e proliferação dos tumores tem sido estudada. A presença em subgrupos de células de melanoma de uma série de marcadores, que existem em células multipotentes neurais no período embrionário e que são perdidos durante a diferenciação, seria um indício do retorno desta multipotencialidade. Reconhecer este subgrupo de células fenotipicamente distinto e estudar a sua via de ativação seria de extrema importância para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para casos avançados. A expressão imunoistoquímica da nestina, uma proteína freqüente na embriogênese neural, e de fatores de transcrição da família POU e SOX, envolvidos na sua ativação, foi estudada. Expressões aumentadas das proteínas foram encontradas nos tecidos de melanoma em relação a nevos. Além disso, observou-se coexpressão de nestina com SOX9 e SOX10, mostrando seu papel principal na ativação. A associação da nestina com ulceração e de SOX9 com tumores mais avançados pode indicar que o perfil de expressão destas proteínas seja um biomarcador de valor prognóstico.

Orientador: Edgard Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-14T03:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Seguin_Fabiana_M.pdf: 3111522 bytes, checksum: 0ecd0d27711d3b04c7d5e9c386bea758 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A enzima ácido graxo sintase (FASN), cuja expressão e atividade estão elevadas em várias neoplasias malignas humanas, é responsável pela síntese endógena de ácidos graxos saturados de cadeia longa e consequentemente para a síntese de fosfolipídios de membrana. A inibição de FASN por orlistat (Xenical), uma droga anti-obesidade, é descrita como tendo propriedades anti-neoplásicas no câncer de próstata e mama e no melanoma, além de desempenhar um provável papel anti-angiogênico, uma vez que também inibe a proliferação de células endoteliais e a neovascularização em ensaio ex vivo. Em trabalho recente realizado por nosso grupo de pesquisa, foi demonstrado que o tratamento de camundongos portadores de melanomas intraperitoneais com orlistat reduziu em cerca de 50% o número de metástases para linfonodos mediastínicos. Em outro estudo, também realizado por nosso grupo, foi observado que a inibição da atividade de FASN pode ter um papel sobre a linfangiogênese induzida por melanomas experimentais, pois a densidade de vasos linfáticos ao redor destes tumores foi significantemente aumentada pelo tratamento com orlistat. Considerando o papel biológico aparentemente relevante da FASN na disseminação metastática de melanomas, o presente trabalho teve como objetivo principal investigar, em ensaio in vivo, o papel desta enzima no processo de angiogênese induzida por implantes intradérmicos de células de melanoma (B16F10) em camundongos (C57Bl6). Através de um microscópio de dissecção e da obtenção de imagens dos vasos sanguíneos peritumorais, a rede vascular foi avaliada com o auxílio do programa Scion Image. Foi observado que a densidade de vasos sanguíneos ao redor dos tumores tratados com orlistat foi significantemente reduzida em relação aos grupos controle (p=0,024; teste de Mann-Whitney). Além disso, os tumores foram medidos e seus volumes calculados, verificamos que o tratamento com orlistat não alterou significativamente o seu crescimento. Através de reações de RT-PCR semiquantitativo em amostras de RNA total extraído dos tumores, foi observado que a expressão dos mensageiros de FASN não foi alterada pelo tratamento com orlistat. Por outro lado, houve aumento da quantidade dos mensageiros para VEGFA nos tumores dos grupos tratados com orlistat. Através da construção de curvas de proliferação e de experimentos de citometria de fluxo, foram avaliados os efeitos do tratamento da linhagem celular derivada de endotélio de aorta de coelho (RAEC) com cerulenina e orlistat. A adição de cerulenina (0,70 µg/ml) e orlistat (100 µM) ao meio de cultura das células RAEC provocou significativa inibição do crescimento celular, em comparação com as células controle. Finalmente, a incubação das células RAEC com meio previamente condicionado pelas células de melanoma B16F10 provocou aumento na taxa de crescimento, confirmando o potencial angiogênico destas últimas. Em conjunto, estes achados sugerem que a inibição da atividade de FASN pode ter um papel na redução da angiogênese induzida por melanomas experimentais, sugerindo que o bloqueio de FASN possa ser um alvo em potencial para a terapia anti-angiogênica. / Abstract: The metabolic enzyme fatty acid synthase (FASN) is over expressed in many human malignancies, being responsible for the endogenous synthesis of longchain saturated fatty acids and consequently for the production of cell membrane phospholipids. Inhibition of FASN by orlistat (Xenical), an anti-obesity drug, has anti-neoplastic properties in prostate and breast cancer as well as in melanoma. In addition, FASN seems to participate in angiogenesis, since its blockage inhibits the proliferation of endothelial cells and neovascularization in an ex vivo assay. In a recent study conducted by our group, it was demonstrated that the treatment of mice bearing melanoma with orlistat was able to reduce by 50% the number of metastases to the mediastinal lymph nodes. We also observed that the inhibition of FASN activity may have a role in the melanoma-induced lymphangiogenesis, since the extension of lymphatic vessels around the tumors was significantly increased by the treatment with orlistat. Considering that the biological role of FASN is relevant in the metastatic spread of melanoma, the main goal of this study was to investigate the role of this enzyme in the angiogenesis process induced by intradermal implantation of melanoma cells (B16F10) in mice (C57Bl6). By using a microscope for dissection, we analyzed the images of the peritumoral blood vessels and the vascular network with the aid the Scion Image software. The blood vessel density around the tumors mice treated with orlistat decreased in comparison with the control group. Moreover, the tumors were measured and their volumes calculated. And no statistically significant changes observed. The effect of orlistat or cerulenin on the proliferation of a cell line derived from the rabbit aorta endothelium (RAEC) was analyzed by the construction of growth curves and flow cytometry. The addition of cerulenin (0.70 µg/ml) or orlistat (100 µM) to the culture medium of RAEC cells caused significant inhibition of cell growth compared with the non-treated cells. Taken together, these findings suggest that inhibition of FASN activity may have a role in the reduction of angiogenesis induced by experimental melanomas, suggesting that FASN could be a potential target for the anti-angiogenic therapy. / Mestrado / Patologia / Mestre em Estomatopatologia

Melanoma is the leading cause of skin cancer-related death. The STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) and TLR4 (toll-like receptor 4) signaling pathways have been shown to be activated in melanoma. Activation of each of the two pathways can promote melanoma growth, angiogenesis and metastasis. Suppressing TLR4 signaling or STAT3 signaling has been proposed as an approach for melanoma management although the TLR4/STAT3 pathway has not yet been established in melanoma. Atractylodis Macrocephalae Rhizoma (Baizhu in Chinese), a Qi-tonifying Chinese medicinal herb, is commonly prescribed by Chinese medicine doctors for treating melanoma. Our previous studies demonstrated that atractylenolide II (AT-II), isolated from Atractylodis Macrocephalae Rhizoma, could induce apoptosis, and inhibit proliferation and migration in B16 melanoma cells. However, the antimelanoma properties of AT-II and the underlying molecular mechanisms have not been fully understood. In this study, we further investigated the antimelanoma effects of AT-II in vivo and in vitro, and explored the TLR4/STAT3 signaling-related mechanism of action of AT-II. In conclusion, we established the TLR4/STAT3 pathway in melanoma, which provides novel insight into melanoma pathophysiology. We demonstrated that AT-II exerted antimelanoma effects in vivo and in vitro, and inhibition of TLR4/STAT3 signaling contributed to these effects. These findings advanced our understanding of the antimelanoma properties and the underlying mechanism of action of AT-II, and provided a chemical and pharmacological justification for the clinical application of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma in melanoma management. This contribution is significant because it is one step in a continuum of research that is expected to lead to future clinical trials of AT-II as a novel antimelanoma agent. Results showed that AT-II induced apoptosis, and inhibited proliferation, migration and invasion in multiple melanoma cells, and significantly inhibited melanoma growth, angiogenesis and metastasis in mice. AT-II suppressed the activation of STAT3 and Src (a STAT3 upstream tyrosine kinase) in mouse melanoma tissues and inhibited the EGFR/Src/STAT3 signaling in cultured melanoma cells. The free binding energy of AT-II with EGFR (an upstream receptor tyrosine kinase of STAT3) was relatively low in molecular docking assays, suggesting that AT-II might inhibit EGFR activation via other molecules. We found that activation of TLR4 enhanced EGFR/Src/STAT3 signaling in melanoma cells, and activation of the TLR4/STAT3 pathway contributed to melanoma progression in vivo and in vitro. These observations suggested that the TLR4/STAT3 pathway was established in melanoma. Molecular docking showed that AT-II could bind to the TLR4/MD-2 receptor complex. AT-II reduced the binding of LPS (a TLR4 ligand) to TLR4, and inhibited LPS-triggered activation of EGFR/Src/STAT3 signaling as well as LPS or MPLAs (synthetic monophosphoryl lipid A, a TLR4 agonist) induced invasion in melanoma cells. Overexpression of a constitutively active variant of STAT3 (STAT3C) in A375 cells diminished anti-proliferative, apoptotic and anti-invasive effects of AT-II; and overexpression of an active form of TLR4 in A375 cells diminished AT-II-exerted anti-invasive effects in cultured cells, and attenuated the inhibitory effects of AT-II on tumor growth and angiogenesis in mice. These suggested that suppression of TLR4/STAT3 signaling contributed to the antimelanoma effects of AT-II.

The present study was carried out to determine the effects and possible mechanisms of action of the essential fatty acids (EFAs) (linoleic acid (LA), gamma-linolenic acid (GLA) and arachidonic acid (AA)) and ascorbic acid (Asc) on BL6 murine melanoma growth in cell culture and in mice. Interactions between the nutrients in influencing melanoma growth as well as possible mechanisms of the interactions were also examined in the above systems. Cell culture studies revealed that all three EFAs (0-SOμg/ml) and Asc (0-200μg/ml) significantly inhibited melanoma growth at the concentrations used. The EF As were also found to significantly inhibit growth, although to a lesser extent than BL6 cells, of monkey kidney (LLCMK) cells which were used as a non-malignant control cell line. Asc in contrast was found not to inhibit growth of these cells. Supplementation of Asc (lOO)μg/ml) to EFA containing (0-50μg/ml) medium was found to significantly increase inhibition of cell growth in both cell lines, and in the BL6 cells in particular, after taking into account the growth inhibitory effects of Asc in the absence of EFAs. The mechanism of cell growth inhibition by the EF As appeared to involve lipid peroxidation but not enhanced prostaglandin (PG) or leukotriene (LT) synthesis. While Asc was found to increase both lipid peroxidation and PG synthesis in the cells, these mechanisms and enhanced LT synthesis did not appear to have played a role in the inhibition of cell growth by Asc or in the growth inhibitory interaction between Asc and the EF As. In vivo studies revealed that diets containing essential or polyunsaturated fatty acids (EFAs/PUFAs) in the form of vegetable oils, and in particular GLA in the form of evening primrose oil, significantly promoted melanoma growth in mice when compared with an EFA/PUFA free diet containing predominantly saturated fats (SF). Supplementary dietary Asc in contrast was found to significantly inhibit melanoma growth in mice fed EFA/PUFA, and in particular GLA, containing diets but not in mice fed SF cont~g diets. This result appears to indicate the occurrence of an interaction between the two nutrients. Ul The mechanism of tumour promotion by the EP As/PUP As did not appear to have involved enhanced PG or LT synthesis or lipid peroxidation. Since dietary EPA/PUPA manipulation was found to significantly alter the EPA content of tissues, including the melanomas, the mechanism of tumour promotion may have involved changes in the EPA composition of the tumour cells. While supplementary Asc was found to significantly increase the Asc content of certain tissues, including the melanomas, which may have played a role in tumour growth inhibition by Asc, it was found not to affect the EPA content of tissues. Enhanced PG or LT synthesis and lipid perox:idation did not appear to have been involved in the tumour growth inhibitory interaction between Asc and the EP As/PUP As. THe activity of the enzyme delta-6-desaturase, a key enzyme in EF A metabolism which catalyses the desaturation of LA to GLA, and the influence of Asc on activity of the enzyme were also examined. The cultured cells, and BL6 cells in particular, were found to contain significant activity of the enzyme. Whereas murine liver microsomal fractions were found to contain delta-6-desaturase activity, microsomes from melanomas grown in mice were found to lack activity of the enzyme. The significant tumour promoting effects of the GLA containing EPO diet may have been the result of the lack of delta-6-desaturase activity in tumour cells grown in mice. Asc was found to stimulate activity of the enzyme in cultured BL6 cells but not in LLCM.K cells, while dietary Asc and EF A/PUP A manipulation did not influence activity of the enzyme in microsomal fractions. This study has confirmed previous reports of the in vivo tumour promoting effects of dietary EP As/PUP As and the tumour growth inhibitory effects of Asc. The in vitro cell growth inhibitory effects of Asc and the EP As also confirm the results of previous reports. Previous studies investigating possible interactions between Asc and EP As/PUP As in influencing tumour cell growth could not be located in the relevant literature. This study may therefore be one of the first investigations of any such interaction between these nutrients in tumour cells. While this study was not able to identify the mechanisms involved in the different tumour promoting or tumour growth inhibitory effects of the two nutrients in the two systems, it did eliminate a number of potential mechanisms. The results of this study also emphasise the difficulty of attempting to compare the results of in vitro and in vivo studies.

The aim of the work presented in this thesis was to develop vectors for gene transfer, that are based on herpes simplex virus type 1, for possible application in the field of surgery.