Class of 2015 Abstract / Objectives: The aim of this study was to develop a computational process capable of hypothesizing potential chemotherapeutic agents for the treatment of skin cutaneous melanoma given an annotated chemotherapy molecular target database and patient-specific genetic tumor profiles. Methods: Aberrational profiles for a total of 246 melanoma patients indexed by the Cancer Genome Atlas (TCGA) for whom complete somatic mutational, mRNA expression, and protein expression data was available were queried against an annotated targeted therapy database using Visual Basic for Applications and Python in conjunction with Microsoft Excel. Identities of positively and negatively associated therapy-profile matches were collected and ranked. Results: Subjects included in the analysis were predominantly Caucasian (93%), non-Hispanic (95.9%), female (59%), and characterized as having stage III clinical disease (37.4%). The most frequently occurring positive and negative therapy associations were determined to be 17-AAG (tanespimycin; 42.3%) and sorafenib (41.9%), respectively. Mean total therapy hypotheses per patient did not differ significantly with regard to either positive or negative associations (p=0.1951 and 0.4739 by one-way ANOVA, respectively) when stratified by clinical melanoma stage. Conclusions: The developed process does not appear to offer discernably different therapy hypotheses amongst clinical stages of cutaneous melanoma based upon genetic data alone. The therapy-matching algorithm may be useful in quickly retrieving potential therapy hypotheses based upon the genetic characteristics of one or many subjects specified by the user.

Class of 2013 Abstract / Specific Aims: To determine if melanoma cells are more vulnerable to Amodiaquine (AQ) or Lumefantrine (LF)-based artemisinin combination therapy compared to artemisinin monotherapy. Methods: Tested anti-malarials in vitro for anti-melanoma activity, which contained 100,000 of the A375 human metastatic melanoma cells that were repeatedly treated independently three times. Main Results: Dihydroartemisinin (DHA) monotherapy induced significant cell death in melanoma cells. However, artemisinin combination therapy (ACT) did not enhance DHA-induced cell death. AQ protected against DHA-induced cell death causing morphological changes detected by electron microscopy. As for LF, it did not affect DHA-induced cell death. Conclusion: The results demonstrated that ACT does not display enhanced anti-melanoma activity compared to artemisinin monotherapy. It suggests that AQ may have anti-oxidant properties, but would need to be explored further in the context of anti-oxidant cyto-protection.

Bien que le mélanome malin cutané (MMC) ne représente que 10% des cancers cutanés, il en est la forme la plus agressive et est responsable de 90% des décès dus aux cancers de la peau. Son incidence ne cesse d'augmenter ces dernières années et atteint 10.8 cas pour 100 000 habitants chez les hommes et 11 chez les femmes. La survie médiane des patients atteint de mélanome à un stade avancé est de 6.2 mois et seulement 1 patient sur 4 est encore en vie à 1an. Le diagnostic du mélanome est uniquement histopathologique et seul l'examen de la biopsie permet de le poser définitivement. De la même façon, il n'existe pas de marqueurs pronostiques associés au mélanome malin cutané. Seuls des facteurs histologiques tels que l'épaisseur de la tumeur, le degré d'invasion ou encore l'envahissement ganglionnaire ont été validés par l'American Joint Committee on Cancer et servent de facteurs pronostiques. Cependant, bien qu'ils permettent d'évaluer le risque métastatique, leur valeur pronostique est encore très insuffisante. L'objectif de ma thèse est d'identifier et de caractériser les protéines associées à la progression tumorale du MMC. Grâce à une approche protéomique quantitative de type iTRAQ par nanoLC MS/MS, j'ai pu identifier et caractériser 2242 protéines dans un modèle cellulaire de progression tumorale du mélanome. La surexpression de huit de ces protéines dans les lignées tumorales par rapport à la lignée normale a été validée par western blot. Deux d'entre elles, TRAP1 et PDIA4 ont ensuite été validées en immunohistochimie comme marqueurs associés à la progression tumorale dans le MMC. Dans un second temps, l'implication de ces deux protéines dans les mécanismes de carcinogénèse du mélanome a été étudiée. L'inhibition de TRAP1 et de PDIA4 induit une diminution de la migration et de la viabilité de la lignée cellulaire métastatique de mélanome 1676. Enfin, la sous-expression dePDIA4 induit une inhibition du complexe Cycline D/CDK4 provoquant un blocage des cellules en phase G0/G1. Ce blocage passerait par la voie PERK liées au stress du réticulum endoplasmique. / Although cutaneous malignant melanoma (CMM) represents only 10% of skin cancers, it is the most aggressive form with 90% of deaths from skin cancer. The Incidence rate is increasing in recent years to 10.8 cases and 11 cases per 100000, in men and women respectively. The prognosis of metastatic melanoma is poor, with a median survival of only 6.2 months. Histopathologic examination remains the gold standard for melanoma diagnosis. There are no prognostic markers associated with CMM. Only histological factors such as tumor thickness, level of invasion, or lymph node involvement have been validated by the American Joint Committee on Cancer and are currently used as prognostic factors. However, although these histological factors are used to assess the risk of metastasis development, their prognostic value is still very low. The aim of my PhD work is to identify and characterize biomarkers associated with tumor progression of CMM. Using a quantitative proteomics approach (iTRAQ and nanoLCMS/MS), I was able to identify and characterize 2242 proteins in a cellular model of melanoma tumor progression. The overexpression of eight proteins in tumor cell lines compared to the normal cell line was validated by immunoblotting. Among these proteins, TRAP1 and PDIA4 were then validated by immunohistochemistry as markers associated with tumor progression in the CMM. Secondly, the involvement of these two proteins in the mechanisms of melanoma carcinogenesis has been studied. The inhibition of TRAP1 and PDIA4 induces a decrease in migration and viability of the metastatic melanoma cell line. Finally, PDIA4 under expression induce an inhibition of cyclin D/Cdk4 complex leading to G0/G1 cell-cycle arrest dependant of endoplasmic reticulum stress by the PERK pathway.

Nous avons cherché à caractériser le phénotype de deux lignées de souris transgéniques pour lesquelles le lignage mélanocytaire est affecté.La lignée Tyr ::NRASQ61K ; Ink4a-/- est un modèle murin de mélanome cutané. Nous avons montré qu'il existait dans ce modèle un développement séquentiel avec au moins quatre types de lésions mélanocytaires cutanées. Nous avons également caractérisé des lésions mélanocytaires primitives dans des organes autres que la peau. Sur le plan morphologique, nous avons enfin montré que les lésions cutanées se rapprochaient plus de la famille des naevi bleus que des naevi et mélanomes conventionnels.La lignée Dct::Sbno2 surexprime le gène Strawberry Notch homolog 2 (Sbno2) sous contrôle du promoteur du gène de la Dopachrome tautomérase (Dct), spécifique du lignage mélanocytaire. Ces souris ont les extrémités des pattes et de la queue blanches, le ventre blanc et le reste de leur pelage blanchit prématurément, traduisant un défaut d'expansion du lignage mélanocytaire pendant l'embryogenèse et un défaut de maintien des cellules souches de mélanocytes en période postnatale. En outre, ces souris présentent des lésions histologiques des nerfs périphériques associant diminution du nombre d'axones et fibrose endoneurale. Cliniquement, elles montrent une hyperactivité locomotrice spontanée. Nos données expérimentales sont en faveur d'un biais de différenciation des cellules dérivées des crêtes neurales chez les souris Dct ::Sbno2, au détriment des mélanoblastes et en faveur des neurones et précurseurs gliaux pendant l'embryogenèse ; au détriment des neurones et en faveur des fibroblastes endoneuraux dans les nerfs périphériques en période postnatale. / In this work, we characterized the phenotype of two transgenic mouse strains for which the melanocytic lineage is affected. The Tyr ::NRASQ61K, Ink4a-/- strain is a murine model for cutaneous melanoma. We showed that, in this model, there was a sequential development with at least four types of melanocytic lesions. We also characterized primitive melanocytic lesions at extracutaneous sites. Finally, we showed that cutaneous lesions were, morphologically, closer to the blue naevi family than to the conventional naevi and melanoma. The Dct::Sbno2 strain overexpresses the Strawberry Notch homolog 2 (Sbno2) gene under control of the Dopachrome tautomerase (Dct) gene which is specific for the melanocytic lineage. These mice have white limb and tail extremities, a white belly, and the rest of the coat exhibits premature graying. These findings are related to defects in expansion of the melanocytic lineage during embryogenesis and maintenance of melanocyte stem cells post-natally. Furthermore, these mice have peripheral nerve lesions associating reduced number of axons and endoneural fibrosis. Clinically, they show spontaneous locomotor hyperactivity. Our data suggest an abnormal differentiation of neural crests-derived cells in Dct::Sbno2 mice: at the expanse of melanoblasts during and in favor of neurons and glial precursors during embryogenesis, at the expanse of neurons and in favor of endoneural fibroblasts in peripheral nerves post-natally.

Le mélanome, la tumeur cutanée la plus agressive, est devenu un problème majeur de santé publique dans de nombreux pays. Diagnostiqué précocement, il peut être traité par excision chirurgicale, mais le pronostic pour les mélanomes plus avancés est très mauvais car cette tumeur est résistante à toutes les thérapies utilisées à ce jour. Dans le but de développer de nouvelles thérapies pour traiter cette tumeur, nous étudions les voies de signalisation qui jouent un rôle prépondérant dans la prolifération, la survie et la différenciation des mélanocytes et des mélanomes. Il s’agit de la voie des MAPK, la voie PI3K et la voie de l’AMP cyclique (AMPc). Nous avons tout d’abord démontré que certaines phosphodiestérases (PDE ; les inhibiteurs physiologiques de la voie de l’AMPc) sont surexprimées dans les lignées de mélanomes et inhibent ainsi la différenciation de ces cellules. La surexpression des PDEs est nécessaire à la transformation des mélanocytes par l’oncogène Ras alors que la réactivation de la voie de l’AMPc dans les lignées de mélanome inhibe leur prolifération. Ces données suggèrent qu’une stratégie thérapeutique qui aurait pour objectif de stimuler la différenciation des mélanomes en réactivant la voie de l’AMPc pourrait permettre d’inhiber leur prolifération. Nous avons par ailleurs montré que la protéine kinase B-Raf, qui est fréquemment mutée dans les mélanomes, était cependant inactivée dans les mélanomes contenant une mutation de Ras. Nous avons démontré que cette inhibition était due à une régulation négative de B-Raf par son substrat Erk. En effet, Erk phosphoryle B-Raf sur sa partie amino-terminale pour empêcher son interaction avec Ras. Ce mécanisme de régulation négative de B-Raf force ces lignées de mélanomes à utiliser l’isoforme C-Raf. Ce travail a des conséquences sur le traitement du mélanome. En effet, si B-Raf n’est pas utilisé pour l’activation de la voie des MAPK dans les mélanomes mutés N-Ras, les inhibiteurs de B-Raf en développement clinique seront inefficaces dans ces cancers. Nous avons par ailleurs démontré qu‘un inhibiteur des kinases B-Raf et C-Raf, en développement clinique (Sorafenib), induisait l’activation de ces kinases par hétérodimérisation en régulant leur phosphorylation. Ces résultats mettent en évidence de nouveaux mécanismes de régulation des proto-oncogènes B-Raf et C-Raf qui pourraient jouer un rôle important dans la résistance des mélanomes aux inhibiteurs de Raf qui sont actuellement en développement clinique. / Melanoma, the most aggressive skin tumor, has become a major public health problem in many countries. Diagnosed early, it can be treated by surgical excision, but the prognosis for advanced melanoma is very poor because the tumor is resistant to all therapies used today. In order to develop new therapies to treat this tumor, we study the signaling pathways that play a major role in the proliferation, survival and differentiation of melanocytes and melanoma. These are the MAPK, PI3K pathway and the cyclic AMP (cAMP). We first demonstrated that some phosphodiesterases (PDEs; physiological inhibitors of cAMP pathway) are overexpressed in melanoma lines and thus inhibit the differentiation of these cells. Overexpression of PDEs is necessary for melanocyte transformation by oncogenic Ras when the reactivation of the cAMP pathway in melanoma lines inhibits their proliferation. These data suggest a therapeutic strategy that would aim to stimulate the differentiation of melanoma by reactivating the cAMP pathway could help to inhibit their proliferation. We have also shown that the protein kinase B-Raf, which is frequently mutated in melanoma, however, was inactivated in melanomas containing a mutation of Ras. We demonstrated that this inhibition was due to a downregulation of B-Raf by Erk substrate. Indeed, Erk phosphorylates B-Raf on its amino-terminal to prevent its interaction with Ras. This negative regulatory mechanism of B-Raf melanoma is forcing these lines to use isoform C-Raf. This work has implications for the treatment of melanoma. Indeed, if B-Raf is not used for the activation of MAPK in N-Ras mutated melanoma, the B-Raf inhibitors in clinical development will be ineffective in these cancers. We also demonstrated that a kinase inhibitor of B-Raf and C-Raf, which is in clinical development (Sorafenib), induces the activation of these kinases by heterodimerization in regulating their phosphorylation. These results reveal new mechanisms of regulation of proto-oncogene B-Raf and C-Raf, which could play an important role in the resistance of melanoma to Raf inhibitors, which are currently in clinical development.

La progression tumorale en cancer métastatique implique la perte de fonctions oncosuppressives, comme c'est le cas dans le mélanome. Une migration cellulaire aberrante est caractéristique de la progression du mélanome. SYK (Spleen tyrosine kinase) est une tyrosine kinase cytoplasmique impliquée dans la suppression tumorale du cancer du sein et du mélanome. Dans la peau, SYK est exprimée dans les mélanocytes mais est fréquemment réprimée épigénétiquement dans le mélanome. Nous avions pu montré que cette perte était associée à un échappement de la sénescence. Qu'elle puisse réguler la migration des cellules tumorales et la formation des métastases reste peu connu. Dans mes travaux j'ai utilisé des approches gain et perte de fonction pour analyser l'effet de SYK sur les mélanomes humains et murins. Respectivement, la réexpression et l'extinction de SYK diminue et augmente la migration, l'invasion et les métastases des cellules de mélanome. L'extinction de SYK induit notamment un phénotype et une signature mésenchymateuse. Notre étude dévoile ce rôle pour SYK dans la répression d'une adhérence dépendante des intégrines, points de tractions et plateforme de signalisation de la migration, et souligne l'importance la perte de SYK dans la formation de métastases. Pour clarifier le rôle de SYK dans la progression du mélanome, j'ai généré un modèle murin de KO conditionnel de SYK spécifique des mélanocytes concomitants à une perte de Pten et de l'activation de BrafV600E. Des résultats préliminaires suggèrent que la perte de SYK n'accélère pas la formation de mélanome dans ce contexte mutationnel mais mène à une invasion plus profonde des cellules tumorales dans le derme. / The progression of tumors to metastatic disease involves the loss of metastatic suppressor functions, as it is the case in melanoma. Thus, aberrant cell migration is a key feature of melanoma progression, and is required for metastasis. SYK (Spleen tyrosine kinase) is a cytoplasmic tyrosine kinase that has been implicated in tumor suppression of breast cancer and melanoma. In skin cells, SYK is found expressed in melanocytes but SYK is frequently downregulated in melanoma by epigenetic silencing. We showed previously that its loss has been associated with senescence escape. Whether it also regulates tumor cell migration and subsequent metastasis remains poorly understood. In this work we used gain- and loss-of-function approaches to analyze SYK’s effects on metastatic abilities of human and murine melanoma cells. Respectively, the reexpression or knockdown of SYK results in decreased or increased migration, invasion and metastasis of melanoma cells. Notably, SYK knockdown cells displayed a mesenchymal-like phenotype with upregulation of mesenchymal markers. Our study unveils a novel role for SYK in suppressing integrin-mediated adhesion, both a points of traction and a signaling platform during cell migration, and outlines the importance of SYK inactivation in acquisition of a metastatic phenotype. To clarify the role of SYK in melanoma formation and progression, we have generated a conditional Syk KO mouse model in melanoma based on melanocyte-specific Pten loss and BrafV600E activating mutation. Preliminary results suggest that Syk loss does not accelerate Pten/Braf-driven melanoma formation but leads to deep invasion of Braf/Pten tumor cells into the dermis.

Le mélanome cutané est le cancer de la peau le plus agressif. Il représente moins de 5% des cancers de la peau mais sa forme métastatique est responsable de 60 à 80% des décès. La médiane de survie des patients atteints d’un mélanome métastatique n’est que de 6 à 9 mois avec les chimiothérapies classiques ou ciblées. L’immunothérapie a été un grand progrès thérapeutique, néanmoins la prise en charge du mélanome métastatique souffre encore de trois points négatifs, tous les patients ne répondent pas aux différents traitements, l’efficacité des chimiothérapies ciblées est limitée par l’apparition rapide de résistances, les cliniciens manquent de marqueurs prédictifs de l’évolution dès les stades précoces pour la prise en charge. Dans ce contexte, notre groupe s’intéresse à la méthylation de l’ADN associées à l’agressivité du mélanome. La méthylation est catalysée par les méthyltransférases de l’ADN (DNMTs). Lorsque celle-ci est présente au niveau d’îlots CpGs localisés dans les promoteurs des gènes, elle empêche la machinerie transcriptionnelle de se mettre en place et inhibe l’expression du gène correspondant. Le profil de méthylation globale de l’ADN étant altéré dans le cancer, elle a donc un rôle fonctionnel dans le processus tumoral mais peut aussi être utilisée en tant que biomarqueur, chaque cancer ayant un profil de méthylation différent. De plus, au sein d’un même cancer, ce profil évolue avec la progression de la tumeur. Au cours de cette thèse, j’ai identifié des modifications du profil de méthylation de l’ADN associées à l’agressivité du mélanome et j'ai sélectionné 9 loci hyperméthylés candidats biomarqueurs. J’ai d’abord comparé les profils de méthylation au niveau du génome entier de lignées cellulaires de mélanome correspondant à des stades d’agressivité différents. À partir de ces informations, des loci candidats ont été choisis par une analyse de la répartition de ces loci hyperméthylés sur le génome couplée à une analyse bioinformatique des fonctions et interactions des gènes associés. Ensuite, leur statut de méthylation a été validé par une technique différente (collaboration avec le Dr. J. Tost, CNG, Evry). Une fois leur hyperméthylation confirmée, j’ai entrepris l’analyse de la méthylation de l’ADN au niveau de ces gènes dans des échantillons de tumeurs primaires issues de patients montrant des survies différentes (Collaboration : L. Lamant, N. Meyer, IUCT, Toulouse, France; L. Lanfrancone IFOM, Milan, Italie). Notre étude confirme le statut hyperméthylé des gènes retenus dans les échantillons métastatiques par rapport aux échantillons de tumeurs primaires. De plus il apparaît un lien entre le niveau de méthylation de la tumeur primaire et le délai d’apparition de métastases ainsi que la survie globale des patients. Parmi les loci sélectionnés, j’ai déterminé si le statut hyperméthylé de ces loci est corrélé à leur sous- expression dans le but d’étudier leur rôle dans l’agressivité du mélanome, et si ces loci peuvent être déméthylés et ré-exprimés par un inhibiteur de DNMTs. Cela a amené à l’identification d’un gène et d'un miR peu décrits dans la littérature, dont les expressions sont corrélées au statut de méthylation et modulées par un traitement déméthylant l'ADN. J’ai entrepris de comprendre leur rôle dans l’agressivité du mélanome et évaluer leur intérêt potentiel en tant que cibles anti-tumorales. Pour cela, j’ai utilisé des tests fonctionnels pour étudier les conséquences de la surexpression dans la lignée métastatique ou de l’inhibition dans la lignée primaire. Les résultats suggèrent une régulation épigénétique fine de ce miR et de ce gène pendant la progression du mélanome, retrouvée indépendamment par notre analyse des tumeurs de patients de la banque TCGA. / Cutaneous melanoma is the most aggressive skin cancer and represents less than 5% of skin cancers but its metastatic form is responsible for 60-80% of the deaths. The median survival for patients with metastatic melanoma is only 6 to 9 months with conventional chemotherapy or targeted therapy. Despite recent therapeutic advances with the immune-therapies, the treatment of metastatic melanoma still suffers from three negatives drawbacks: 1) All patients do not respond to the different treatments. 2) The effectiveness of the targeted chemotherapy is limited by the rapid emergence of resistance. 3) Predictive biomarkers of the evolution of the disease are lacking for the clinicians. In this context, we studied the epigenetic regulations associated with the aggressiveness of melanoma, particularly in DNA methylation. DNA methylation is catalyzed by DNA methyltransferases (DNMTs). When CpGs islands are methylated and located in the promoters of genes, expression of the corresponding gene is inhibited. Commonly, DNA methylation profile is altered in cancer and plays a role in tumorigenesis and tumor maintenance. In addition, the alterations of the DNA methylation profile can be used as biomarkers for prognostic and diagnostic. Here, I identified changes in the DNA methylation profile associated with the aggressiveness of melanoma and selected 9 candidates loci that are hypermethylated in the most aggressive forms of melanoma. First, I compared the methylation patterns genome-wide (450K BeadChip methylation) of melanoma cell lines bearing different aggressiveness. The loci biomarker candidates were selected by combining an analysis of the distribution of these hypermethylated loci on the genome and a bioinformatic analysis of the functions and interactions of the associated genes. Their methylation status was validated by a different technique in collaboration with Dr. J. Tost, CNG, Evry. Once confirmed their hypermethylation, I started to analyze the DNA methylation of the selected genes in the pairs of cell lines of different aggressiveness, such as the primary tumor compared to the metastasis from the same patient, and in patients samples of primary tumors (Collaboration L. Lamant, N. Meyer, iUCT, Toulouse, France; L. Lanfrancone IFOM, Milan, Italy). A total of twenty samples were analyzed. Our study confirms the status of selected hypermethylated genes in metastatic samples compared to primary tumors. Moreover there is a link between the level of methylation of the primary tumor and the overall survival. A patent is being filed in and new samples are collected in order to extend the patient cohort to validate the biomarkers in prognosis of the evolution of the disease. Among the selected loci, I determined whether their hypermethylated status is correlated with their under-expression. For this, I measured their level of expression in a couple of cell lines WM115 / WM266-4 by RT-PCR and RT-qPCR. Then, I chose the loci for which I observed a correlation between methylation and expression. In addition, I studied whether these loci can be demethylated and re-expressed by a DNMTs inhibitor. This led to the identification of a microRNA and gene not fully described in the literature, of which the expression is correlated to DNA methylation status and are reactivated upon treatment with demethylating agents. I explored the role of the microRNA and the gene in the aggressive features of the metastatic melanoma suggesting a tumor suppressive function. These data were further comforted by the data analysis of patient samples.

La protéine SHP2 est une tyrosine phosphatase cytosolique impliquée dans la régulation des phénomènes de prolifération, migration et survie cellulaire. Elle contrôle l'état d'activation des voies de signalisation des récepteurs à tyrosine kinase faisant intervenir en particulier les protéines kinases MAPK/ERK, PI3K/AKT. Des mutations germinales et somatiques de SHP2 sont à l'origine de syndromes et de néoplasies. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence une nouveau partenaire pour SHP2: la protéine CDCP1. CDCP1 est une protéine transmembranaire dont la surexpression et la tyrosine phosphorylation par les kinases de la famille de SRC dans de nombreux carcinomes permet une augmentation des propriétés métastatiques des cellules. Nous avons de plus mis en évidence la régulation de la phosphorylation de CDCP1 et sa présence à la membrane cellulaire par SHP2. Dans une seconde partie de ce travail de thèse, notre attention s'est portée sur la protéine adaptatrice GAB2, partenaire et substrat principal de SHP2, dont la surexpression dans les mélanomes primaires et métastatiques commence à être décrite. Nous mettons en évidence la présence d'une boucle de régulation entre GAB2, dont l'expression est régulée par le facteur de transcription MITF et le récepteur KIT, dont l'activation, dépendante de l'expression de GAB2 régule l'activation de MITF et la motilité des cellules de mélanome.L'ensemble de ce travail met ainsi en évidence la présence d'un nouvel interacteur de SHP2, et d'une nouvelle boucle de régulation dans les cellules de mélanome. / SHP2 is a protein tyrosine phosphtase which regulates cell proliferation, mirgration and survival. It controls MAPK/AKT and PI3K/AKT signaling pathways activated by tyrosine kinase receptors. Germinal and somatic mutations in SHP2 lead to syndromes and neoplasia. We show a novel interaction between SHP2 and the protéine CDCP1. CDCP1 is a transmembrane protein which overexpression and tyrosine phosphorylation by SRC family kinases in carcinomas lead to an increase of the tumor cells metastatic properties. We also demonstrated that SHP2 regulates CDCP1 tyrosine phosphorylation level and its presence at the cell membrane.In a second part of this work, we focused on GAB2 anchor protein, which is one of the most important partner and substrate for SHP2. GAB2 is overexpressed in primary and metastatic melanoma. We show the presence of a regulation loop, involving GAB2 regulation by the transcription factor MITF, KIT receptor and its activation depending on GAB2, which controls MITF activation and melanoma cell motility.This thesis work demonstrate the presence of a novel partner for the protein SHP2 and of a new regulation pathway in melanoma cells.

Le mélanome cutané est un cancer très agressif, responsable de 80% des décès liés aux cancers de la peau. Le mélanome métastatique (MM) est souvent résistant à la radiothérapie et aux chimiothérapies. Sa progression est majoritairement initiée par des mutations oncogéniques des gènes BRAF et NRAS activant la voie de prolifération MEK/ERK. Le MM est difficile à traiter malgré le succès de nouveaux traitements (thérapies ciblant l’oncogène BRAFV600E et immunothérapies), qui sont cependant limités à certains patients. De plus l'émergence de résistances ne permet pas d’obtenir une réponse durable, ce qui incite à rechercher de nouvelles cibles tumorales. Dans les cellules cancéreuses, l’accumulation d’altérations génétiques et le fort index prolifératif accroissent leur addiction aux mécanismes de contrôle de la qualité du protéome, comme le système ubiquitine-protéasome (UPS). L’UPS comprend une machinerie protéolytique (le protéasome 26S) et un réseau d’enzymes régulant l’ubiquitination de protéines cibles. La réaction enzymatique de retrait de l’ubiquitine est la déubiquitination, réalisés par de protéases spécifiques appelées DéUBiquitinases (DUBs). Malgré l’importance des DUBs dans de nombreuses situations pathologiques comme le cancer, leur implication dans la physiopathologie du mélanome est mal connue. Afin d’identifier des DUBs dont l’activité est modulée dans le mélanome, nous avons utilisé une méthode d’étiquettage biochimique in vitro des DUBs actives (‘’DUB trap assay’’) qui nous a permis d’identifier USP14 (Ubiquitin Specific Protease 14) dont l’activité est augmentée dans nos lignées de mélanome par rapport aux mélanocytes. USP14 est associée physiquement au protéasome, avec un rôle important sur la protéostasie cellulaire en général. L’analyse de données bioinformatiques publiques confirme l’importance de USP14 dans le mélanome en associant l’expression du gène USP14 à la progression du mélanome et à un mauvais pronostic. Nous avons ensuite montré que cibler USP14 par des approches génétique (siRNA) ou pharmacologique (inhibiteurs de l’activité) a un effet anti-mélanome in vitro et in vivo, associé à une accumulation de protéines polyubiquitinées, générant un stress du réticulum endoplasmique, la dépolarisation de la mitochondrie et une production de ROS, aboutissant à une mort indépendante des caspases. Cet effet cytotoxique est obtenu indépendamment du statut mutationnel des protéines oncogéniques (BRAFV600E, NRAS, NF1), des suppresseurs de tumeurs (TP53, PTEN), du niveau de résistance aux thérapies ciblées ou du statut phénotypique des mélanomes. Ces résultats indiquent que USP14 représente une nouvelle cible thérapeutique pertinente dans le mélanome. Dans la continuité de ces travaux, j’ai cherché à identifier d'autres DUBs pouvant jouer un rôle dans la prolifération et la survie des cellules de mélanome en réalisant le criblage d'une banque de siRNA ciblant 90 DUBs sur une lignée de cellules de mélanome. Outre le fait de confirmer l’implication de USP14 dans la prolifération du mélanome, ce criblage génétique révèle que la déplétion d’une autre DUB associée au protéasome a un puissant effet antiprolifératif sur les cellules de mélanome. Nos travaux préliminaires montrent que le ciblage de cette nouvelle DUB se traduit par un arrêt de prolifération suivi d’une mort cellulaire associée à des dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Dans l’ensemble, mes travaux de thèse révèlent un rôle essentiel des DUBs associées au protéasome dans la prolifération et la survie du mélanome, et ouvrent la piste à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les mécanismes aberrants de la protéostasie tumorale de ce cancer. / Non communiqué

The final publication is available at http://dx.doi.org/10.1111/pcmr.12297. Natsuko Okamoto et al. A melanocyte–melanoma precursor niche in sweat glands of volar skin. Pigment Cell & Melanoma Research. Volume 27, Issue 6, pages 1039–1050, November 2014 / 京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第12890号 / 論医博第2090号 / 新制||医||1007(附属図書館) / 31644 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 野田 亮, 教授 羽賀 博典, 教授 鈴木 茂彦 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM