O número total de nevos melanocíticos (NM) é um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento do melanoma cutâneo (MC); além disso, em uma significativa fração dos casos os NM podem ser também precursores desta neoplasia. CDKN2A é o gene supressor tumoral mais implicado na gênese do melanoma. As mutações desse gene ocorrem em aproximadamente 40% dos casos de melanoma familiar, enquanto o silenciamento não mutacional ocorre em até 75% dos melanomas esporádicos. Ele codifica a proteína p16, que tem sua expressão progressivamente diminuída com a evolução do melanoma, sendo bem expressa nos NM e pouco expressa nos melanomas avançados. O presente estudo avaliou as alterações na expressão imunoistoquímica (IHQ) da proteína p16 nos melanócitos dos NM expostos a duas doses eritematosas mínimas (DEM) de radiação ultravioleta B (RUVB), ou a trauma mecânico controlado. Trinta e sete NM tiveram metade de sua superfície exposta à RUVB enquanto 44 NM foram parcialmente dermoabradidos. A expressão IHQ da p16 estava significativamente diminuída no lado irradiado dos NM, comparada com o lado controle. Não houve diferença estatisticamente significativa na expressão IHQ da proteína p16 nos NM dermoabradidos.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Introdução: O prognóstico do paciente com melanoma cutâneo está associado ao diagnóstico precoce seguido de excisão correta da lesão, tornando essencial sua detecção em estágio inicial. A espectroscopia Raman é uma técnica óptica que fornece informações sobre as vibrações moleculares de uma amostra. Essa técnica utiliza a luz laser que pode ser conduzida por fibras ópticas, como instrumento para investigação não destrutível de tecidos biológicos possibilitando uma análise não invasiva da lesão, em tempo real. Objetivo: O objetivo deste estudo foi qualificar os dados espectrais FT-Raman de melanoma cutâneo primário e metastático, visando o diagnóstico diferencial. Métodos: Foram utilizadas amostras de 10 fragmentos de pele sem alterações clínicas e histopatológicas, 10 de melanomas cutâneos e 9 de metástases linfonodais. Após o procedimento cirúrgico, as amostras foram identificadas e armazenadas individualmente em tubos e conservadas em nitrogênio liquido. As amostras foram descongeladas em solução fisiológica a 0,9 %. Cada amostra foi dividida em 2 ou 3 frações de 2 mm3 e colocada no porta-amostra e posicionados para obtenção do espectro Raman, fazendo-se a luz monocromática do laser de Nd:YAG de 1064 nm incidir sobre a amostra. Eletronicamente, com auxílio do OPUS® foram variados cinco pontos de coleta por amostra FT-Raman, em uma distância de 250 µ m. O registro total de coleta foi realizado em um período de tempo menor que 10 minutos. A luz espalhada das amostras chega ao detetor, que converte a intensidade da luz em sinais elétricos, que são interpretados no computador na forma de espectro Raman. Resultados: A análise visual dos espectros mostraram diferenças entre os grupos estudados, principalmente nas bandas e picos do espectro Raman correspondentes a proteínas. Para diferenciar os três grupos formados de acordo com as características extraídas dos espectros, realizou-se uma análise discriminante dos dados. As variáveis Fenilalanina, DNA e Amido-I destacaram-se na diferenciação dos três grupos. A porcentagem de indivíduos corretamente classificados com este critério foi de 93,1%; o que mostra a eficiência da análise realizada. Conclusão: A espectroscopia FTRaman é capaz de diferenciar o melanoma de sua metástase, assim como da pele normal. / Introduction: The prognostic of a patient with cutaneous melanoma is linked to an early diagnosis followed by the excision of the lesion; thus, an early detection is essential. The Raman spectroscopy is an optical technique which supplies information about the molecular vibrations of a sample. This technique uses a laser light, which is conducted through optical fibers, as a tool to investigate in a non-destructive way the biological tissues and, thus; it makes it possible to carry out a non-invasive analysis of the lesion in real time. Objective: The objective of this study was to qualify the FT-Raman spectral data of primary and metastatic cutaneous melanoma in order to obtain a differential diagnosis. Methods: Samples of 10 skin fragments without clinical alterations or histopathology were used, as well as 10 cutaneous melanomas and 9 lymphonodal metastasis samples. After the surgical procedure, the samples were identified and individually stored in tubes and were conserved in liquid nitrogen. The samples were thawed in a physiological solution at 0,9%. Each sample was divided in 2 or 3 fractions of 2 mm3 each and placed and positioned at the sample carrier in order to obtain the Raman spectrum; a monochrome laser light Nd:YAG of 1064 nm was applied to the sample. With aid of the OPUS, five different collection points for sample FTRaman were electronically selected, at a distance of 250 m. The entire collection was accomplished in less than 10 minutes. The dispersed light of the samples arrives at the detector, which converts the light in electric signs, and then these signs are read by computer in the Raman spectrum form. Results: The visual analysis of the spectra showed differences among the studied groups, mainly in the bands and picks of the Raman spectrum which corresponded to the proteins. To differentiate the three groups formed according to the characteristics extracted from the spectra, we made a discriminative analysis of the data. The phenylalanine, DNA and Starch-I variables stood out in the differentiation of the three groups. The percentages of correctly classified items with this criterion was of 93,1%; what comes to show the efficiency of the analysis. Conclusion: The FT-Raman spectroscopy is capable of differentiating the melanoma from its metastasis, as well as from normal skin. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Objetivo: Qualificar os dados espectrais de modo a diferenciar o melanoma cutâneo do nevo pigmentado. Metodologia. Foram obtidas lesões de melanoma cutâneo, de nevo pigmentado e de pele normal, de peças que estavam acondicionadas no Laboratório de Espectroscopia Vibracional do Instituto de Pesquisa e desenvolvimento da UNIVAP. A peça cirúrgica principal foi encaminhada para exame anatomopatológico de rotina. As amostras das três variáveis foram descongeladas em solução fisiológica a 0,9%. Cada amostra foi dividida em 3,4 ou 5 frações de 2mm3 . Antes de iniciar a coleta dos espectros de melanoma e nevo pigmentado utilizou-se amostra de pele normal para alinhar o sistema conforme os parâmetros referendados na literatura. Foram utilizadas 250 varreduras para todas as amostras, com potência de 300mW, resolução espectral de 4cm-1 e 7mm de abertura do feixe do laser. No total, foram coletados 105 espectros de tecido normal, 140 de tecido neoplásico e 126 de nevo pigmentado. Resultados: Os espectros FT-Raman de cada grupo diagnóstico apresentaram alta correlação entre os elementos do mesmo grupo, favorecendo a realização das médias espectrais. Boxplot foi construído a partir dos espectros de cada grupo estudado: pele normal, nevo pigmentado e melanoma cutâneo – a linha base corrigida na região espectral de 800 a 1800cm-1 e, posteriormente, foram normalizados vetorialmente. Os gráficos das médias e percentis 25 e 75 das variáveis espectrais foram feitos para observar a existência de um padrão espectral para cada grupo. No grupo de pele normal pôde-se notar que não houve grande variação entre os espectros; no grupo de nevo pigmentado existe variação notável devido à variedade histológica e, no terceiro grupo, Melanoma Primário, há uma variação espectral que, semelhantemente ao grupo Nevo Pigmentado, é evidente. Na Análise Univariada, usando os gráficos das médias e percentis 25 e 75, foram identificadas bandas específicas para cada modo vibracional conhecido. O último passo do estudo estatístico foi a Análise Discriminante aos Dados cujos resultados mostraram importante diferenciação entre os três grupos estudados, tratando-se das variáveis (modos vibracionais) Polissacarídeos (Banda I), Tirosina (Banda 6) e Amida I (Banda 10). A porcentagem de indivíduos corretamente classificados com esse critério foi de 75,3%, obtida por meio de Análise Discriminante, mostra a eficiência da análise empreendida. Conclusão: Os dados espectrais FT-Raman foram qualificados e as variáveis: Polissacarídeos, Tirosina e Amida-I permitiram a diferenciação entre melanoma cutâneo e nevo pigmentado. / Objective: Qualify spectral data in order to differentiate the Pigmented Nevus from cutaneous melanoma. Method. Tissue samples were obtained from cutaneous melanoma, from Pigmented Nevus and from normal skin, from parts that were stored in the Laboratory of Vibration Spectroscopy of the Institute for Research and Development of UNIVAP. The main surgical piece was referred for a routine anatomical pathological examination. Samples of the three variables were thawed in a physiological solution at 0.9%. Each sample was divided in 3.4 or 5 fractions of 2mm3. Before starting the collection of spectra of melanoma and Pigmented Nevus, a sample of normal skin was used to align the system in agreement with the parameters referred in literature. A 250 scan sequence was used for all samples, with a power of 300mW, spectral resolution of 4cm- ¹ and an opening of 7mm for the laser beam. Altogether, 105 spectra of normal tissue, 140 of neoplastic tissue and 126 of pigmented nevus were collected. Results: The FT-Raman spectra of each group diagnosis showed high correlation between the elements of the same group, encouraging the implementation of spectral averages. A boxplot was built from the spectra of each group studied: normal skin, Pigmented Nevus and cutaneous melanoma - the baseline corrected in the spectral region from 800 to 1800cm- ¹ and later were standardized by vectors. The graphics of the averages and percentages of the 25 and 75 of the spectral variables have been made to observe the existence of a spectral pattern for each group. In the group of normal skin it could be observed that there was no great variation between the spectra; in the Pigmented Nevus group, there is a remarkable variation due to the histological variety, and in the third group, Primary Melanoma, a spectral variation, which, similar to the Nevus Pigmented group is very clear. In the Single Variable Analysis, using the graphics of the averages and percentages, 25 and 75, specific bands were identified for each vibrational mode known. The last step of the statistical study was the Discriminatory Analysis of data, the results of which showed significant differentiation between the three groups studied, in the case of the variables (variable forms) Polysaccharides (Band I), Tyrosine (Band 6) and Amide I (Band 10 ). The percentage of individuals classified correctly with this criterion was 75.3%, reached through Discriminatory Analysis, which shows the efficiency of the analysis undertaken. Conclusion: The FT-Raman spectral data were qualified and the variables: Polysaccharides, Tyrosine and Amide-I, to allow the differentiation between cutaneous melanoma and Pigmented Nevus. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora a resistência ao anoikis seja considerada um importante processo envolvido no fenótipo maligno, a relação causal entre transformação neoplásica e crescimento independente de ancoragem continua indefinida. Para estudar essa correlação, foi desenvolvido em nosso laboratório um modelo experimental de transformação maligna de melanócitos murinos, em que melanócitos melan-a foram submetidos a ciclos seqüenciais de bloqueio de ancoragem. Ao longo deste processo, foram estabelecidas tanto linhagens celulares correspondendo a fases intermediárias da progressão tumoral como linhagens de melanoma, as quais são progressivamente resistentes ao anoikis e representam fases distintas da progressão tumoral. Análises de expressão gênica mostraram aumento da expressão de Timp1 nas linhagens de melanoma quando comparadas à linhagem parental de melanócitos. Ainda que descrita como inibidora de MMPs, essa proteína foi recentemente associada à resistência ao anoikis em células epiteliais de mama humana. Deste modo foram analisadas neste trabalho: 1) a relação entre expressão de Timp1 e aquisição do fenótipo resistente ao anoikis e 2) a possível regulação epigenética da expressão de Timp1 por metilação de DNA neste modelo. Enquanto células melan-a expressam baixos níveis de Timp1, todas as linhagens derivadas desta expressam níveis elevados desta proteína. O tratamento dos melanócitos melan-a com o agente desmetilante 5-aza-2’-deoxicitidina resultou em aumento significativo da expressão de Timp1. De fato, a análise pelo ensaio Methylation sensitive-Single Nucleotide Primer Extension (Ms-SNuPE) mostrou aumento progressivo na desmetilação do gene Timp1 em paralelo a sua crescente expressão ao longo da transformação maligna. A superexpressão de Timp1 em células melan-a resultou no aumento da sobrevivência das mesmas em condições independentes de ancoragem, mas foi incapaz de transformá-las. Além disso, o tempo de latência para o aparecimento de tumores foi menor para células de melanoma transfectadas com Timp1, indicando que esta molécula pode estar associada com a agressividade do tumor. Esses resultados mostram aumento da expressão de Timp1 durante a transformação maligna, em decorrência da desmetilação gênica progressiva, associado ao aumento da resistência ao anoikis, mas não à aquisição de um fenótipo maligno transformado. / Although anoikis resistance has been considered a hallmark of malignant phenotype, the causal relation between neoplastic transformation and anchorageindependent growth remains undefined. We developed an experimental model of murine melanocyte malignant transformation, where a murine melanocyte lineage (melan-a) was submitted to sequential cycles of substrate adhesion blockade. Cells corresponding to intermediate phases of tumor progression and melanoma cell lines were established and show progressive anoikis-resistance. Gene expression analysis showed up-regulation of Timp1 in all melan-a-derived lineages. Treatment with a demethylating agent resulted in marked expression of Timp1 in melan-a melanocytes. In fact, Ms-SNuPE analysis showed increased demethylation in Timp1 gene in parallel with its expression along malignant transformation. Although described as a MMP inhibitor, this protein has been recently associated with apoptosis resistance in human breast epithelial cells. Melan-a cells overexpressing the Timp1 gene showed increased survival in anchorage-independent conditions, but were unable to form tumors in vivo, whereas Timp1-overexpressing melanoma cells showed reduced latency time for tumor appearance. Our results show an increment in Timp1 expression along carcinogenesis, possibly associated to a progressive gene demethylation, which is causally related with an increase in anoikis-resistance but not with the acquisition, by itself, of a fully transformed malignant phenotype. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / É freqüente em determinadas doenças, e inclusive no câncer, uma resposta imune que leva a formação de interleucinas imunossupressoras cujo efeito principal é a paralisação de macrófagos e inversão do perfil em geral protetor (Th-1) para outro não protetor ou predominantemente Th-2. A resposta imune polarizada tipo 2 tem sido associada à progressão tumoral e metástase. A interleucina 13 atualmente é considerada um mediador de resposta imune tipo 2, pois apresenta inúmeras atividades imunoregulatórias em muitas doenças, incluindo no câncer. Do ponto de vista celular, o papel protetor ou supressor das células NKT restritas a CD1d na imunidade tumoral tem sido bastante explorado. Enquanto IL-12 pode ativar células NKT tipo I produtoras de IFN-γ, as células NKT tipo 2 têm sido descritas como principal fonte de IL-13 e esse mecanismo foi o responsável pela inibição da imunovigilância em alguns modelos tumorais. Uma das cadeias do receptor, IL-13Rα2, possui alta afinidade pela IL-13 e pode atuar como um inibidor dominante negativo ou “receptor decoy”, suprimindo a ação da IL-13 e assim contribuindo para a manutenção da imunovigilância tumoral. No presente trabalho, construímos uma quimera IL-13Rα2-Fc no vetor de expressão eucariótica VR1012 e confirmamos a identidade da proteína recombinante por immunoblotting. Através do ensaio de ELISA quimioluminescente, observamos que a atividade biológica da quimera produzida, ou seja, a sua alta afinidade pela IL-13, estava preservada. Esta vacina de DNA foi então testada no modelo singênico de melanoma murino B16F10-Nex2, isoladamente ou em associações com um plasmídeo contendo o gene da IL-12. Um protocolo de bioquimioterapia foi então construido com o composto ciclopaladado 7A. Experimentos in vivo mostraram um efeito protetor mediado pela alta produção de IFN-γ e “down-regulation” de interleucinas antiinflamatórias. A bioquimioterapia in vivo com ambos os plasmídeos em associação com a droga 7A foi o melhor protocolo terapêutico o qual levou a uma redução significativa na evolução tumoral, protegendo 30% dos animais, que permaneceram livres de tumor. Demonstramos que a primeira administração do plasmídeo expressando IL-12, seguida de contínuas doses do plasmídeo expressando IL-13Rα2-Fc juntamente com a droga 7A resultou em uma atividade anti-tumoral mediada pela alta produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição ou controle de mecanismos imunossupressores, principalmente recrutamento de células T NK1.1+ produzindo IL-10 e IL-13. / Interleukin 13 has emerged as a central mediator of a Th 2-dominant immune response and it has immunoregulatory activities in many diseases, including cancer. The protective or suppressive role of CD1d-restricted NKT cells in tumor immunity has been well documented. Whereas IL-12 can activate type I IFN-γ−producing NKT cells, type II NKT cells have been reported to produce IL-13 and this mechanism was responsible for immunosurveillance suppression in some tumor models. The high affinity chain of the receptor, IL-13Rα2, may act as a dominant negative inhibitor or “decoy receptor” suppressing the action of interleukin 13 then helping the maintenance of tumor immunosurveillance. Here, we constructed an IL- 13Rα2-Fc chimera in an expression vector VR1012 and confirmed the identity of our recombinant protein by immunoblotting analysis and its bioactivity (binding to IL-13) in an ELISA chemiluminescent assay. Such DNA vaccine was tested against syngeneic B16F10- NEX2 murine melanoma. Experiments in vivo were carried out and the results showed a protective effect mediated by high production of IFN-γ and down-regulation of the antiinflammatory interleukins. Biochemotherapy in vivo with plasmid containing the gene for IL- 13Rα2-Fc in association with plasmid that encodes the gene for IL-12 combined with treatment with the 7A cyclopalladated compound led to a significant reduction of tumor evolution and complete protection of 30% of mice that remained tumor free. We conclude that IL-12 gene therapy, followed by continuous doses of IL-13Rα2-Fc gene associated with 7A chemotherapy resulted in anti-tumor activity owing to the high production of pro-inflammatory cytokines and down regulation of immune suppression mechanisms, specifically involving the recruitment of NK1.1+ T cells producing IL-10 and IL-13. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O melanoma cutaneo e um tumor originado a partir da proliferacao descontrolada de melanocitos. A incidencia do melanoma maligno tem aumentado significativamente nas ultimas decadas e se tornado um problema de saude publica em muitos paises. Na imunoterapia contra o cancer, anticorpos monoclonais (mAbs) sao utilizados como ferramentas para diagnostico, monitoramento e tratamento da doenca. A descoberta de novos alvos terapeuticos para mAbs em celulas tumorais, e a determinacao dos mecanismos de citotoxicidade gerados pelos mesmos pode ampliar significativamente as possibilidades e o sucesso dos tratamentos. Anteriormente em nosso laboratorio, Dobroff e colaboradores (2002) isolaram um mAb (mAb A4) que foi citotoxico in vitro sobre celulas de melanoma murino B16F10-Nex2 e sobre algumas celulas tumorais humanas, efeito independente do complemento, mas aumentado por este. O mAb A4 reduziu o desenvolvimento do melanoma murino B16F10-Nex2 in vivo, aumentando a sobrevida dos animais. O alvo do mAb A4 na superficie celular e a proteina Protocaderina ƒÀ13 (PCDHƒÀ13), membro da superfamilia das caderinas. A interacao entre ambos levou as celulas tumorais a morte, em processo sugestivo de apoptose (Dobroff et. al., 2010, em publicacao). Neste trabalho, verificamos a reatividade do mAb A4 com celulas do melanoma murino e com algumas outras linhagens tumorais humanas atraves de ELISAQuimioluminescente e Imunofluorescencia Indireta. A expressao do gene PcdhƒÀ13 foi verificada por RT-PCR nao quantitativo e a expressao da proteina PCDHƒÀ13, por Immunoblotting. Verificou-se que, somente celulas que expressam a proteina PCDHƒÀ13 na membrana plasmatica sao suscetiveis a acao do mAb A4. O mAb A4 foi citotoxico in vitro contra o melanoma murino e contra linhagens tumorais humanas, incluindo melanoma, carcinoma de colon, carcinoma de cervice uterino e glioblastoma. O mAb A4 nao foi citotoxico contra linhagens humanas de carcinoma de mama e contra a linhagem de melanocitos murinos imortalizados melan A, que nao expressam a PCDHƒÀ13. A interacao do mAb A4 com celulas B16F10-Nex2.1 in vitro ocasionou a endocitose do mAb A4 em vesiculas, rapida reducao nos niveis de ƒÀ-catenina livre no citoplasma e do fator de transcricao TCF-4, redistribuicao da ƒÀ-catenina para a periferia celular, ativacao das caspases-9, -3 e -6, exposicao de fosfatidilserina na membrana plasmatica, condensacao da cromatina e degradacao internucleossomal do DNA, corroborando a inducao de um processo de morte por apoptose pela via intrinseca nessa celula tumoral. Adicionalmente, observou-se o aumento da producao de especies reativas de oxigenio, que podem amplificar o processo apoptotico. A inibicao da via de sinalizacao da ƒÀ-catenina sugere que vias de sinalizacao intracelular que regulam o crescimento e a sobrevivencia foram inibidas pela interacao entre o mAb A4 e seu alvo na celula. A presenca de vesiculas sugestivas de autofagossomos nas imagens de microscopia de transmissao eletronica pode indicar a inducao de um processo de autofagia em paralelo ao processo apoptotico. Concluimos que o mAb A4 demonstrou ser um potencial agente anti-tumoral com atividade contra diversos tipos de tumores murinos e humanos. A proteina PCDHƒÀ13 pode ser um potencial marcador de malignidade para o melanoma. A interacao entre o mAb A4 e a PCDHƒÀ13 levou a celula de melanoma a morte atraves da inibicao da via de sinalizacao intracelular b-catenina/TCF-4 e da inducao de apoptose pela via intrinseca. O processo de autofagia pode ter uma possivel participacao no efeito anti-tumoral induzido pelo mAb A4. / Malignant melanoma is a highly metastatic skin cancer which arises from malignant transformation of melanocytes. Incidence of melanoma has been increasing in the last decades, becoming a major public health problem in many countries. Monoclonal antibodies (mAbs) have been used in cancer immunotherapy as tools for diagnosis, monitoring and treatment of tumors. The discovery of new therapeutic targets for mAbs in tumor cells, and the establishment of their cytotoxic mechanisms might significantly improve the possibilities and efficacy of cancer treatments. Previously in our research group, Dobroff and collaborators (2002) produced a mAb, named A4, which was cytotoxicity in vitro against B16F10-Nex2 murine melanoma cells and some human tumor cell lines. This effect was independent of complement, although enhanced by it. MAb A4 decreased B16F10-Nex2 murine melanoma development in vivo, significantly increasing animal survival. This mAb recognizes Protocadherin â13 (PCDHâ13) at tumor cell surface, a protein that belongs to the cadherin superfamily, and preliminary results suggested that mAb A4/PCDHâ13 interaction leads tumor cell to apoptosis (Dobroff et. al., 2010, in press). In the present work, mAb A4 reactivity with murine melanoma cells and several human tumor cell lines was verified by Chemoluminescent ELISA and Indirect Immunofluorescence assays. Pcdhâ13 mRNA expression was detected by nonquantitative RT-PCR and PCDHâ13 protein expression by Immunoblotting assay. Only PCDHâ13-expressing tumor cells were susceptible to mAb A4 cytotoxicity. MAb A4 was cytotoxic in vitro to murine melanoma and to human tumor cell lines, including melanoma, colon carcinoma, cervical uterine epithelioid carcinoma and glioblastoma. MAb A4 had no activity against breast carcinoma cell lines and murine immortalized melanocytes melan A, which do not express PCDHâ13. MAb A4 interaction with B16F10-Nex2.1 cells in vitro triggered mAb A4 endocytosis, rapid reduction of free cytoplasmic â-catenin and TCF-4 concentrations, redistribution of â-catenin to cell periphery, caspases-9, -3, and -6 activation, phosphatidilserine translocation to cell membrane, chromatin condensation and internucleossomal DNA fragmentation, confirming the induction of mitochondrialdependent apoptosis in that tumor cell line. Additionally, mAb A4 induced overproduction of oxygen reactive species, which can amplify the apoptotic process. The inhibition of â-catenin signaling suggests that signaling pathways that regulate cell survival and growth were inhibited by mAb A4 interaction with its target on the cell surface. Transmission electron microscopy images revealed the presence of autophagosomes, suggesting the simultaneous induction of autophagy and apoptosis by mAb A4. We conclude that mAb A4 may represent a new therapeutic agent with antitumor activity against murine and human tumors. PCDHâ13 is a potential melanoma marker. MAb A4 interaction with PCDHâ13 induced cell death through inhibition of b-catenin/TCF-4 signaling pathway and induction of the apoptosis intrinsic pathway. The autophagic process might be also implicated in mAb A4 cytotoxic effect. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-10-31 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Evidências indicam que tumores necessitam constante influxo de células mielo- monocíticas para sustentar seu comportamento maligno. Esse fato é devido a fatores derivados do tumor, os quais recrutam e induzem diferenciação funcional de células mielo-monocíticas, das quais a maioria são macrófagos. Embora os precursores clássicos de macrófagos sejam linhagens mielóides, linhagens linfóides como células B-1, subtipo de linfócitos B encontrados predominantemente nas cavidades pleural e peritoneal são também capazes de migrar para focos inflamatórios e se diferenciar em fagócitos mononucleares apresentando fenótipo semelhante ao dos macrófagos. No presente trabalho foi avaliada a interação entre células B16 de melanoma murino e células B-1 durante o co-cultivo e se esta interação influencia ativação de vias de transdução de sinal envolvidas com progressão e metástases. Utilizando sistema de co-cultura in vitro, foi mostrado que células B16 e células B-1 interagem fisicamente após 48 horas de co-cultura. Além disso, esta interação resulta em aumento da expressão de genes associados com metástases como MMP-9 e CXCR4 nas células B16 que favorecem o aumento na capacidade metastática destas células, como revelado por ensaios experimentais de metástases in vivo. Este trabalho também revela evidências de que células B16 apresentam marcado aumento na fosforilação da quinase regulada por sinais extracelulares (ERK) após contato com células B-1. A inibição da fosforilação de ERK com inibidor farmacológico da quinase ascendente de ERK, MEK1/2, suprime fortemente a expressão de MMP-9 e CXCR4 e inibe o aumento da capacidade metastática das células B16 induzido por contato com xxi células B-1. Adicionalmente, níveis constitutivos de ERK fosforilado nas células B- 1 são necessários para que estas células sejam capazes de induzir aumento no potencial metastático das células B16. Nossos resultados em conjunto mostram que células B-1 podem contribuir na aquisição de um fenótipo mais agressivo das células tumorais. / Increasing evidence indicates that tumors require a constant influx of myelomonocytic cells to support their malignant behavior. This is caused by tumor- derived factors, which recruit and induce functional differentiation of myelomonocytic cells, most of which are macrophages. Although myeloid lineages are the classical precursors of macrophages, B lymphoid lineages such as B-1 cells, a subset of B lymphocytes found predominantly in pleural and peritoneal cavities, are also able to migrate to inflammatory sites and differentiate into mononuclear phagocytes exhibiting macrophage-like phenotype. Here we examined the interplay of B-1 cells and tumor cells and checked whether this interaction provides signals to influence melanoma cells metastases. Using in vitro coculture experiments we showed that B16, a murine melanoma cell line, and B-1 cells physically interact. Moreover, interaction of B16 with B-1 cells leads to upregulation of metastasis-related genes expression (MMP-9 and CXCR-4), increasing its metastatic potential, as revealed by experimental metastases assays in vivo. We also provide evidences that B16 cells exhibit markedly upregulated phosphorylation of the extracellular signalregulated kinase (ERK) when co-cultured with B-1 cells. Inhibition of ERK phosphorylation induced by B-1 cells with an inhibitor of MEK1/2 strongly suppressed the induction of MMP-9 and CXCR-4 mRNA expression and impaired the increased metastatic behavior of B16. In addition, constitutive levels of ERK1/2 phosphorylation in B-1 cells are necessary for their commitment to affect the metastatic potential of B16 cells. Our findings show for the first time, that B-1 80 lymphocytes can contribute to tumor cell properties required for invasiveness during metastatic spread. / FAPESP: 03/05176-8 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-03-18T20:58:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 326398.pdf: 2203594 bytes, checksum: 02a8feb377591d0e8b2f986df8ea13c0 (MD5) Previous issue date: 2014 / O câncer é considerado um problema de saúde pública mundial, sendo caracterizado pelo crescimento descontrolado das células. A incidência de tumores como leucemias, melanoma e câncer de mama vem aumentando a cada ano e a capacidade metastática das células tumorais é a principal causa de mortalidade por câncer. O início da formação de metástases é caracterizado pelo aumento da motilidade das células neoplásicas e por sua capacidade de invadir tecidos e órgãos adjacentes ao tumor primário. As metaloproteinases (MMPs) são enzimas que degradam vários componentes da MEC, desempenhando um papel importante em vários processos fisiológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento metastático. Alterações no ciclo celular e nas vias de apoptose ou nos respectivos mecanismos regulatórios também estão envolvidas nas malignidades humanas. Nesse contexto, novos medicamentos antitumorais e antimetastáticos devem ser desenvolvidos levando em consideração os princípios básicos da carcinogênese. O ácido gálico (AG) e seus derivados ésteres vêm apresentando diversas atividades biológicas. O galato de dodecila (G12) é bastante estudado como potencial agente antitumoral, no entanto, o composto é solúvel somente em solventes orgânicos. Para evitar a adição de solvente orgânico em ensaios biológicos foram sintetizados três sais do G12. Assim, este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos citotóxicos e os mecanismos de ação antitumoral do G12 e os derivados sais monossódico (GS12A), dissódico (GS12B) e trissódico (GS12C) em linhagens celulares de leucemia linfoblástica aguda murina (L1210), leucemia promielocítica aguda humana (HL-60), melanoma murino (B16-F10), melanoma humano (SK-mel-28) e câncer de mama humano (MDA-MB-231). A citotoxicidade dos compostos foi avaliada por citometria de fluxo, pela verificação da integridade da membrana celular em linhagens tumorais de leucemia, melanoma e câncer de mama e em linhagens não tumorais de fibroblasto e melanócito humanos (MRC-5e NGM, respectivamente). Os compostos apresentaram seletividade para as células tumorais em comparação com linhagens não tumorais em um tempo de tratamento de 48 horas. Verificou-se uma CC50 menor que 10 µM para o G12 e entre 100 e 200 µM para os sais em linhagens de L1210, B16-F10 e SK-mel-28, sendo que o sal GS12A apresentou maior citotoxicidade. Na avaliação do ciclo celular, não foi verificada a parada ou alteração no ciclo, mas aumento de morte celular, com elevação do número de células em Sub/G1, o que corresponde à fragmentação de DNA, nas linhagens testadas. Ainda, a capacidade de formar colônias foi inibida nas linhagens B16-F10 e SK-mel-28 em doses subtóxicas. A morte celular por apoptose foi confirmada por citometria de fluxo, após coloração com anexina V-FITC e iodeto de propídeo. Em linhagem L1210, foram observadas alterações morfológicas típicas de apoptose e ativação da caspase-3. A possível ação antimetastática do G12 e do GS12A foi avaliada verificando-se a capacidade invasiva das células de melanona após o tratamento. Os compostos promoveram a inibição da migração e da invasão celular em linhagens B16-F10 e SK-mel-28. Nessas mesmas linhagens avaliou-se o efeito dos compostos sobre a atividade enzimática e expressão de MMP-2 e MMP-9. Sugere-se um potencial efeito antimetastáticos do G12 e do GS12A na inibição principalmente da expressão de MMPs, já que parecem não atuar diretamente na atividade das enzimas. Em conclusão, o presente estudo mostra que, apesar de apresentarem uma citotoxicidade mais baixa que seu precursor, os sais do G12 são potenciais agentes antitumorais e antimetastáticos, e apresentam seletividade, com destaque para o GS12A. Testes in vivo estão sendo realizados com o G12 e o sal monossódico, a fim de demonstrar a real importância da solubilidade dos compostos avaliados.<br> / Abstract : Cancer is considered a public health problem worldwide and is characterized by the uncontrolled cell growth and the incidence tumor such as leukemia, melanoma and breast cancer are increasing worldwide. The metastatic ability of tumor cells is the leading cause of cancer mortality. The early formation of metastases is characterized by increased motility of neoplastic cells and their ability to invade tissues and organs adjacent to the primary tumor. Metalloproteinases (MMPs) are enzymes that degrade various components of the ECM, playing an important role in various physiological and pathological processes, including metastatic development. Changes in cell cycle and apoptosis pathways or its regulatory mechanisms are involved in human malignancies. In this context, new antitumor and antimetastatic drugs should be developed taking into consideration the basic principles of carcinogenesis. Gallic acid (GA) and its ester derivatives have been presenting several biological activities including antitumor activity. Dodecyl gallate (G12) is extensively studied as potential antitumor agent, although the compound is only soluble in organic solvents. To avoid addition of organic solvent in biological assays G12Â s salts were synthesized. Thus, this study aims to evaluate the cytotoxic effects and the mechanisms of antitumor action of G12 and its monosodium (GS12A), disodium (GS12B) and trisodium (GS12C) salts in cell lines of murine acute lymphoblastic leukemia (L1210), promyelocytic leukemia human acute (HL-60), murine melanoma (B16-F10), human melanoma (SK-MEL-28) and human breast cancer (MDA-MB-231). Cytotoxicity was evaluated by flow cytometry analysis of cell membrane integrity in leukemia, melanoma and breast cancer cells and non-tumoral cell lines fibroblasts and human melanocyte (MRC-5 and NGM, respectively). G12 salts presented selectivity for tumor cells when compared to non-tumoral lines after 48 hour of incubation. On L1210, B16-F10 and SK-MEL-28 cell the CC50 was less than 10 µM for G12 and longed between 100 and 200 µM for G12 salt derivates. The GS12A presented the greatest cytotoxicity. No alterations in cell cycle were observed, however, an increased percentage of cells in Sub/G1 for both cell lines tested were observed indicating DNA fragmentation consequently cell apoptosis. Furthermore, the ability to form colonies was inhibited in B16-F10 and SK-MEL-28 cells with subtoxic doses. After, double staining with annexin V-FITC and propidium iodide was performed using flow cytometry and the apoptosis process was confirmed in both leukemia and melanoma cell lines. In L1210 cells, typical morphological changes of apoptosis and also activation of caspase-3 were observed. The possible antimetastatic action of G12 and GS12A was evaluated by checking the invasive capacity of melanoma cells after treatment. The compounds promoted the inhibition of cell migration and invasion in B16-F10 and SK-mel-28 cells. In these same cell line it was evaluated the effect of compounds on enzyme activity and expression of MMP-2 and MMP-9. We suggest a potential antimetastatic effect of G12 and GS12A in inhibiting mainly the expression of MMPs, as they seem not act directly on the enzyme activity. In conclusion, G12 salts demonstrated lower cytotoxicity to non-tumoral cells and potential antitumor and antimetastatic activity against leukemia and melanoma cells lines. The higher selectivity was observed especially for salt A. In vivo tests are being performed with G12 and the salt A in order to evaluate if the higher solubility will maintain or improve the antitumoral properties of G12.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:08:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346010.pdf: 2085302 bytes, checksum: 99549ec52928f201e606c2cf4121f97b (MD5) Previous issue date: 2016 / Diversas culturas se baseiam na utilização de plantas para o tratamento de doenças. Plantas do gênero Aloe vem sendo utilizadas a séculos na medicina tradicional para cicatrização de feridas, como agente antibacteriano, como laxante e até mesmo para o tratamento do câncer. O extrato do parênquima clorofiliano (EPC) da Aloe barbadensis Miller é excretado quando a folha é cortada ou quebrada, este líquido de cor amarelada é rico em antronas, cromonas e seus derivados. Estudos com compostos isolados do EPC, aloína e Aloe emodina, mostram uma promissora atividade antitumoral dos mesmos. A incidência do melanoma cutâneo vem aumentando nos últimos anos, o que gera uma grande preocupação, uma vez que esse câncer é altamente agressivo apresentando alta possibilidade de metástase. Neste trabalho o EPC foi padronizado por HPLC, apresentando 5,6% em massa seca do isômero aloína B. A citotoxicidade foi avaliada do EPC em linhagens de fibroblastos L-929, assim como o efeito do EPC sobre a viabilidade, proliferação, morfologia e migração de duas linhagens de melanoma (SK-MEL-28 e B16-F10). De acordo com a ISO 10993-5, concentrações superiores a 185 µg·mL-1 de EPC são citotóxicas (decréscimo na viabilidade maior que 30%), sendo esse valor maior que o valor de IC50 de ambas as linhagens de melanoma, 125 e 165 µg·mL-1 para a SK-MEL-28 e B16-F10, respectivamente. Análise morfológica mostrou ponto de alta fluorescência, indicando uma reorganização dos filamentos de actina presentes no citoesqueleto. O resultado do ensaio de migração para ambas linhagens de melanoma mostrou que o EPC é mais eficaz em inibir a migração do melanoma humano SK-MEL-28. Células endoteliais (HUVEC) foram expostas ao EPC e os parâmetros de viabilidade celular, proliferação, morfologia, migração e formação de tubos foram avaliados. O EPC inibiu a migração de HUVECs mesmo em concentrações que não apresentaram efeito de decréscimo na atividade metabólica e proliferação celular. Pôde-se observar a retração das fibras de estresse em células tratadas com as concentrações de 10 e 100 µg·mL-1 de EPC. A formação de tubos em células endoteliais foi inibida na maior concentração testada (100 µg·mL-1), contudo ainda se observa a formação de brotos vasculares. Em suma o EPC proveniente de Aloe barbadensis Miller causou um decréscimo na viabilidade e proliferação celular assim como uma diminuição da capacidade de migração e alterações morfológicas de células de melanoma e endoteliais, influenciando também na formação de tubos vasculares por células endoteliais. / Abstract : Several cultures are based on the use of plants for the treatment of diseases. Plants of the genus Aloe has been used for centuries in traditional medicine, in wound healing, such as antibacterial agent, laxative and even for the treatment of cancer. The chlorophyll parenchyma extract (EPC) from Aloe barbadensis Miller is excreted when the sheet is cut or broken, this yellowish liquid is rich in anthrones, chromones and their derivatives. Studies on compounds isolated EPC, aloin and Aloe emodin, showed promising antitumor activity. The incidence of melanoma has increased in recent years, creating a great concern, since this cancer is highly aggressive and presents high possibility of metastasis. In this work the EPC was standardized by HPLC, showing 5.6% of dry weight of aloin B isomer. The EPC cytotoxicity was evaluated on fibroblast L-929 cell line, as well as the effect of EPC in cell viability, proliferation, morphology alterations and migration on two melanoma cell lines (SK-MEL-28 and B16-F10). According to ISO 10993-5, concentrations higher than 185 µg·mL-1 EPC are cytotoxic (decrease in viability was greater than 30%), this value being higher than the IC50 value of both melanoma cell lines, 125 and 165 µg·mL- 1 to SK-MEL-28 and B16-F10, respectively. Morphological analysis showed high fluorescence spots, indicating a reorganization of actin filaments present in the cytoskeleton. The result of the migration test for both melanoma cell lines showed that the EPC is more effective to inhibit the migration of human melanoma SK-MEL-28. Endothelial cells (HUVEC) were exposed to the EPC and parameters of cell viability, proliferation, morphology alterations, migration and tube formation was evaluated. The EPC inhibited HUVEC migration even at concentrations that has not shown effect in decrease of metabolic activity and cellular proliferation. It was observed the decrease of stress fibers in cells after treated with concentrations of 10 and 100 µg·mL-1of EPC. The tube formation on endothelial cells was inhibited at the highest concentration tested (100 µg·mL-1), however it was still possible to observe the formation of vascular sprouts. In short, the EPC from Aloe barbadensis Miller caused a decrease in cell viability and proliferation as well as reduced migration ability and morphological changes on melanoma and endothelial cells, also influencing the vascular tube formation by endothelial cells.

Introdução: A incidência do melanoma cutâneo (MC) está crescendo mais rapidamente que a de qualquer outro câncer. Devido ao seu potencial para metástases e à falta de terapias efetivas para a maioria dos pacientes em estágio avançado, o diagnóstico precoce do MC é crucial. Alguns dos fatores prognósticos mais importantes no MC são a espessura de Breslow e a presença de metástase linfonodal. O Tecnécio-99m-sestamibi (MIBI) é um radiofármaco usado rotineiramente em cintilografias miocárdicas e tem conhecidas propriedades para detecção de tumores malignos, incluindo câncer de mama, tumores cerebrais e melanomas primários e metastáticos. Objetivo: Avaliar a correlação entre a espessura de Breslow e a intensidade da captação de MIBI (IC-MIBI) em lesões primárias de MC. Métodos: Foram selecionados pacientes com lesões clinica e dermatoscopicamente suspeitas de MC. Os pacientes receberam uma injeção intravenosa de 740 – 1110 MBq (20 mCi) de MIBI. Após 10 minutos, o equipamento gamma-probe foi usado para detectar a IC-MIBI na lesão cutânea e em 2 pontos equidistantes na pele normal. A razão entre as contagens radioativas na lesão e a média da pele normal foi considerada a IC-MIBI. A seguir, pacientes realizaram SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography) do local da lesão e da região linfonodal correspondente. Exérese da lesão cutânea e exame anatomopatológico foram então realizados. Pacientes portadores de lesões com Breslow > 1 mm ou < 1mm com ulceração/regressão espontânea realizaram biópsia do linfonodo sentinela. Resultados: Dezesseis pacientes com 20 lesões foram estudados (8 homens, 8 mulheres, de 34 – 81 anos, média 61 anos). Quatorze lesões eram melanomas e 6 eram nevos melanocíticos (NM). Cinco lesões eram melanomas in situ. A média da espessura de Breslow foi de 0,45 mm (variação: 0,30 – 14,90 mm). A média da IC-MIBI foi 1,54 (±0.58) contagens radioativas nos MC e 1,04 (±0.10) nos NM (P = 0.007). Houve forte correlação positiva entre a IC-MIBI e a espessura de Breslow (rs = 0.74, P= 0.003). Analisando as lesões em categorias de Breslow, houve diferença estatisticamente significativa (P < 0.001) entre as lesões com Breslow < 1mm (IC-MIBI = 1.23 ± 0.28 contagens radioativas) e Breslow > 1 mm (IC-MIBI = 2.32 ± 0.32 contagens radioativas). Nenhum dos NM apareceu nas imagens de SPECT. Dos MC, 4 lesões, que apresentavam Breslow > 1mm, apareceram nas imagens de SPECT. Conclusão: Neste estudo, embora tenha demonstrado uma diferença significativa entre melanomas finos (< 1mm) e espessos (> 1mm), a IC-MIBI no local da lesão não foi diferente entre NM e melanomas finos ou in situ. Por isso, MIBI parece ser útil principalmente em melanomas espessos, o que também foi confirmado pela positividade do SPECT apenas nestes casos. Entretanto, a possibilidade de correlacionar a IC-MIBI com categorias de Breslow pode facilitar os procedimentos cirúrgicos, permitindo a remoção de melanomas com margens cirúrgicas adequadas e a realização ou não de biópsia de linfonodo sentinela em um mesmo momento cirúrgico, reduzindo morbidade e custos. / Introduction: Given its propensity to metastasize, and lack of effective therapies for most patients with advanced disease, early detection of melanoma is a clinical imperative. The most important prognostic factors are Breslow thickness and nodal metastases. Technetium-99m-sestamibi (MIBI) is a radiopharmaceutical used routinely for cardiologic scintigraphy and has also well-known tumor-seeking properties. It has been used successfully to detect various tumors, including breast cancer, brain tumors, and primary and metastatic melanoma. Objetive: This study has been designed in order to evaluate the correlation between Breslow thickness and MIBI uptake by primary CM lesions. Methods: Patients were recruited by a dermatologist on the grounds of a clinically and dermoscopically suspicious melanocytic lesion. Patients received intravenous injection of 740 – 1110 MBq (20 mCi) of MIBI. After 10 minutes, gamma-probe was used to detect the intensity of MIBI uptake by the cutaneous lesion and at two equidistant points on normal skin. The ratio number of radioactive counts at cutaneous lesion / mean of radioactive counts at normal skin was considered to determinate the MIBI uptake intensity (MIBI-UI). Then, SPECT imaging of the lesion site and respective lymph node region was obtained. After scintigraphy, exeresis of the cutaneous lesion and histological analysis were performed. Lesions with Breslow thickness > 1 mm or < 1 mm with ulceration/spontaneous regression underwent sentinel lymph node biopsy. Results: Sixteen patients with 20 lesions were investigated (8 males, 8 females, age range 34 – 81 years, mean 61 years). Fourteen lesions were CM and 6 were melanocytic nevi (MN). Five lesions were melanoma in situ. Breslow thickness median was 0.45 mm (range 0.30 - 14,9 mm). The mean MIBI-UI was 1.54 (±0.58) radioactive counts in CM and 1.04 (±0.10) radioactive counts in MN (P = 0.007). There was strong positive correlation between MIBI-UI and Breslow thickness (rs = 0.74, P= 0.003). Grouping the lesions on Breslow categories, there was a statistically significant difference (P < 0.001) between lesions with Breslow thickness < 1 mm (MIBI-UI = 1.23 ± 0.28 radioactive counts) and Breslow thickness > 1 mm (MIBI-UI = 2.32 ± 0.32 radioactive counts). None of the MN appeared at SPECT images. Of melanomas, 4 (28,6%) were SPECT positive at cutaneous site. All those were Breslow thickness > 1 mm. Conclusion: On this study, although there is a significant difference between thin (< 1 mm) and thick (> 1 mm) melanomas, MIBI intensity at the lesion site is not different between benign nevus and in situ or thin melanomas. Then, MIBI seems to be useful mainly in thick melanomas, as also confirmed by the positivity of the SPECT image only in these cases. However, the possibility of correlating MIBI uptake intensity with Breslow categories may facilitate surgical procedures, allowing to remove melanomas with appropriated surgical margins and to perform or not sentinel lymph node biopsy in the same surgical time, reducing morbidity and cost.