Objetivo: Avaliar a relação do turno escolar e o ritmo circadiano de crianças e adolescentes sob a expressão de sintomas comportamentais e de níveis de cortisol e melatonina. Métodos: Estudo transversal envolvendo 639 estudantes do ensino fundamental e médio (idade média de 13,03 anos, variando de 8–18; 58,5% meninas) recrutados em cidades localizadas na região do Vale do Taquari, Rio Grande do Sul, Brasil. Na segunda fase, 80 participantes foram selecionados aleatoriamente para coleta de saliva para análise de melatonina e cortisol. Os parâmetros circadianos do sono foram acessados pelo auto-relato de duração do sono nos dias de semana e fins de semana, diferenças no horário de acordar e dormir, déficit de sono, ponto médio do sono nos dias de semana e fins de semana, jetlag social e pela versão em português do Morningness-Eveningness Questionnaire (MEQ) para avaliação do cronotipo. Os desfechos, níveis de melatonina e cortisol salivares, foram medidos através de amostras de saliva pela manhã, tarde e noite, e problemas de comportamento (sintomas psiquiátricos), foram avaliados usando a Lista de verificação comportamental para crianças e adolescentes (em inglês, Child Behavior Checklist, CBCL). O estudo foi realizado de acordo com as diretrizes éticas internacionais (número de aprovação no comitê de ética: 12-0386 GPPG/HCPA). Resultados: No primeiro artigo, estudantes do turno da manhã eram significativamente mais velhos, apresentavam maior diferença entre os horários de acordar e dormir, maior déficit de sono e jetlag social. O déficit de sono apresentado por meninas foi maior do que o observado em meninos da mesma idade. regressão multivariada, utilizando o método passo-a-passo, identificou jetlag social, diferença nos horários de acordar nos dias de semana e fins de semana e ponto médio nos fins de semana como preditores significativos de déficit de sono. O segundo artigo demonstrou que o turno escolar influenciou a secreção de melatonina, a qual se correlacionou com os parâmetros do sono circadianos, diferentemente para o grupo não-clínico e clínico. Os níveis de melatonina foram positivamente correlacionados com ponto médio do sono em estudantes do turno da manhã, e negativamente correlacionados com ponto médio do sono em estudantes do turno da tarde. No terceiro artigo, identificou-se idade, horário de início da escola, ponto médio de sono e duração do sono nos dias de semana como preditores de sintomas psiquiátricos, avaliados pelo CBCL. Os estudantes do turno da manhã, classificados como cronotipo do tipo vespertino, apresentaram menor duração do sono durante a semana e maior jetlag social do que estudantes do tipo matutino. Além disso, os alunos do turno da manhã com sintomas psiquiátricos apresentaram menor duração do sono e padrão circadiano de sono mais cedo. Conclusões: Os achados do presente estudo mostram que o turno escolar influencia os parâmetros circadianos de sono, fatores fisiológicos e sintomas psiquiátricos em crianças e adolescentes. Nossos resultados reforçam a importância de redirecionar crianças e adolescentes para um turno escolar que contemple as preferências individuais de sono, prevenindo as consequências negativas à saúde, tanto no sono quanto em sintomas psiquiátricos. / Objective: To evaluate the relationship of the school schedules and the circadian rhythm of children and adolescents under the expression of behavioral symptoms and cortisol and melatonin levels. Methods: This cross-sectional study involved 639 elementary and high school students (mean age 13.03 years, range 8–18, 58.5% female) recruited from the cities located in the Vale do Taquari region, Rio Grande do Sul, Brazil. In the second phase, 80 participants were randomly selected for saliva collection to analyze melatonin and cortisol. Circadian sleep parameters were assessed by self-reported sleep duration on weekdays and weekends, bedtime and wake time differences, sleep deficit, midpoint of sleep on weekdays and weekends, social jetlag, and the Portuguese version of Morningness-Eveningness Questionnaire (MEQ) for assessment of chronotype. The outcomes, salivary melatonin and cortisol levels, were measured in morning, afternoon, and night saliva samples, and behavior problems (psychiatric symptoms) were assessed using the Child Behavior Checklist (CBCL). This study was performed according to international ethical guidelines (ethics committee approval number: 12–0386 GPPG/HCPA). Results: In the first article, the morning-school-time students presented significantly higher age, bedtime and wake up differences, sleep deficits, and social jetlag. The sleep deficit presented by girls was greater than that observed in boys of the same age. A step-by-step multivariate logistic regression identified social jetlag, the difference between waking times on weekdays and weekends, and the mid-point of sleep on weekends as significant predictors of sleep deficit. In the second article, school start time influenced the melatonin secretion, which correlated with circadian sleep parameters, although differently for non-clinical and clinical groups. Melatonin levels were positively correlated with sleep midpoint in morning students, and negatively correlated with sleep midpoint in afternoon students. In the third article, we identified age, school start time, midpoint of sleep on weekdays, and sleep duration on weekdays as predictors of psychiatric symptoms, as evaluated by the CBCL. Students with a morning school start time whose chronotype was classified as evening had shorter sleep duration on weekdays and higher social jetlag than morning-type participants. Moreover, students with a morning school start time and psychiatric symptoms had shorter duration of sleep and earlier circadian sleep patterns. Conclusion: The findings of the present study showed that school start time influences on the circadian sleep patterns, physiological factors and psychiatric symptoms in children and adolescents. Our findings emphasize the importance to redirect children and adolescents for a school start time that includes the individual preferences of sleep, preventing the negative health consequences, both in sleep and in psychiatric symptoms.

Objetivo: Investigar os padrões de produção de melatonina, sono e metabolismo de trabalhadoras gestantes e não gestantes, diurnas e noturnas. Também se constituiu como objetivo do presente estudo, analisar parâmetros de saúde dos recém-nascidos e dos filhos das trabalhadoras estudadas, segundo o turno de trabalho materno. Métodos: Foram realizados dois estudos paralelos em um hospital público da cidade de São Paulo. No primeiro estudo foram investigados os padrões de produção de melatonina, sono, antropometria, parâmetros metabólicos, hábitos de vida e alimentares de gestantes trabalhadoras diurnas e noturnas e alguns parâmetros metabólicos dos recém-nascidos. No segundo estudo, foram analisados os padrões de produção de melatonina, sono, antropometria, parâmetros metabólicos, hábitos de vida e alimentares de trabalhadoras diurnas e noturnas e alguns parâmetros metabólicos e alimentares entre os filhos das trabalhadoras, de acordo com o turno de trabalho. Resultados: Os produtos deste estudo estão descritos sob a forma de três manuscritos. O primeiro refere-se à hipótese principal do estudo, na qual trabalhadoras sujeitas a alterações dos níveis de melatonina, a qual é reduzida mediante a exposição à luz durante a noite, são mais propensas a desenvolver problemas de saúde, os quais podem ser ocasionados pelo trabalho noturno e comprometem, inclusive, os descendentes das trabalhadoras. O segundo manuscrito apresenta o estudo com as gestantes, e analisa o perfil de produção de melatonina ao longo da gestação, segundo os turnos de trabalho, discutindo-se adicionalmente, os reflexos na saúde dos recémnascidos. O terceiro manuscrito apresenta o estudo realizado com mães e filhos, sob a ótica da influência da exposição à luz à noite durante gestação, e a consequente redução da melatonina com possíveis repercussões no metabolismo dos filhos que já estão na primeira infância ou adolescência. Conclusão: A hipótese apresentada no primeiro artigo foi testada nos estudos subsequentes. Em relação ao estudo com gestantes, apresentado no segundo artigo, destaca-se a redução da produção de melatonina nas trabalhadoras noturnas quando comparadas às diurnas, além do escore de Apgar mais baixo entre os recém-nascidos das noturnas. O terceiro artigo, o qual apresenta estudo realizado com as trabalhadoras não gestantes e seus filhos, não verificou diferenças significantes nos parâmetros metabólicos dos filhos, segundo o turno de trabalho materno. A produção de melatonina das trabalhadoras noturnas parece ter sido afetada pela exposição ao trabalho noturno. Também parece que a melatonina pode ter um efeito positivo na manutenção de boas condições de saúde ao longo da gestação. Não é possível afirmar que as repercussões da exposição ao trabalho noturno, incluindo a redução de melatonina, possam apresentar efeitos no decorrer da vida dos filhos das trabalhadoras noturnas. / Aim: To investigate the patterns of melatonin production, sleep and metabolism of pregnant and non-pregnant, day and night workers. The purpose of the present study was also to analyze some of health parameters of newborns and the offspring from women workers, according to the maternal shift work. Methods: Two parallel studies were performed in a public hospital in the São Paulo city. In the first study, the patterns of melatonin production, sleep, anthropometry, metabolic parameters, and eating habits of day and night pregnant workers and some metabolic parameters of the newborn were investigated. The second study investigated the production patterns of melatonin, sleep, anthropometry, metabolic parameters, life and eating habits of day and night workers and some metabolic and eating habits among the offspring according to the mother\'s shift work. Results: The products of this study are described in the form of three manuscripts. The first refers to the main hypothesis of the study, in which workers who are subject to changes in melatonin levels, reduced by exposure to light at night, are more likely to develop health problems, even compromising the descendants of women workers. The second manuscript presents the study with the pregnant women, and analyzes the profile of melatonin production during the gestation, according to the work shifts, discussing additionally, the reflexes in the health of the newborns. The third manuscript describes the study carried out with mothers and children, considering the influence of exposure to light at night during gestation, and the consequent reduction of melatonin with possible repercussions on the metabolism of children who are already in their infancy or adolescence. Conclusion: The hypothesis presented in the first study was tested in subsequent studies. Regarding the investigation with pregnant women, presented in the second study, we highlight the reduction of melatonin production in night workers when compared to day workers, in addition to the lower Apgar score among offspring from mother\'s night workers. The third study, which was carried out with nonpregnant women and their offsprings, did not verify significant differences in the metabolic parameters of the offspring, according to the maternal shift work. The melatonin production of night workers seems to have been affected by exposure to night work. It also appears that melatonin may have a positive effect on maintaining good health throughout pregnancy. It is not possible to state that the repercussions of exposure to night work, including the reduction of melatonin, may have effects over the lives of the night worker\'s offspring.

Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que a melatonina (MLT) age em monócitos aumentando sua sensibilidade à IL-4 e, consequentemente, levando estas células a se diferenciarem em células dendríticas - quando in vitro e estimulados com IL-4 e GM-CSF (mo-DCs) com um perfil fenotípico e funcional mais ativado. Outros estudos do nosso grupo mostraram que mo-DCs de pacientes portadoras de câncer apresentam desvios funcionais capazes de comprometer a ativação de linfócitos por este tipo celular. Um outro apontamento de nosso grupo foi para o fato de que, muito provavelmente relacionado a estes desvios, está um comprometimento da via IL-4/STAT-6/SOCS-5, que se mostrou alterada em pacientes com leucemia linfóide crônica. Baseado nestes resultados, o presente trabalho objetivou investigar os efeitos da MLT na diferenciação in vitro de mo-DCs de doadoras saudáveis e de pacientes portadoras de câncer de mama, sob a hipótese de que este hormônio poderia agir na via IL-4/STAT-6/SOCS-5 de modo a gerar mo-DCs com fenótipo e função relacionados à maior ativação. Para tanto, monócitos provenientes do sangue periférico de indivíduos saudáveis e de pacientes foram tratados com MLT (2,5 nM 2 horas) e induzidos à diferenciação em mo-DCs; no quinto dia as células foram ativadas com LPS (100 ng/ml 24 horas). As análises, por citometria de fluxo, do fenótipo e das citocinas ao longo da diferenciação de mo-DCs não apontou efeitos consistentes acerca do tratamento com MLT, mas indicou maior expressão de CD83+ nos monócitos das pacientes (p=0,014) e maior concentração da citocina IL-12p70 no sobrenadante das culturas de mo-DCs destes indivíduos, ao final da diferenciação (p=0,02). Para a análise da capacidade linfoestimuladora das mo-DCs foi realizada co-cultura destas células com linfócitos T (LT) alogeneicos (1 DC: 30 LT) por 5 dias. Não houve diferença na indução de proliferação de LT estimulados por mo-DCs de saudáveis nem de pacientes. A MLT mostrou efeito apenas nas co-culturas com células saudáveis aumentando as concentrações de TNF, IFN-γ e IL-2 nos sobrenadantes. Nas co-culturas com células de pacientes sem tratamento, houve maior nível de IL-2 e IL-10, se comparadas com saudáveis. Os monócitos foram também tratados com MLT (2.5 nM) ou IL-4 (50 ng/mL) por 15 minutos, para avaliação da expressão de STAT-6, pSTAT-6 e SOCS-5. Não foi constatado efeito da MLT nesse caso, mas os monócitos de pacientes apresentaram maior expressão de STAT-6, porém menor de pSTAT-6, comparados com saudáveis. Tomados em conjunto, os resultados globais indicam algumas diferenças fenotípicas e funcionais entre monócitos de pacientes e controles, mas não entre suas mo-DCs. Quanto à MLT, os resultados apontam para o fato de que o hormônio gera alterações apenas em células provenientes de indivíduos saudáveis e somente com relação às citocinas encontradas nos sobrenadantes das co-culturas. / Previous studies at our lab have shown that melatonin (MLT) acts on monocytes increasing their sensitivity to Interleukin-4 (IL-4) and, consequently, generating dendritic cells (DCs) when in vitro and treated with IL-4 and GM-CSF (mo-DCs) phenotically and functionally more activated. Other studies from our group have shown that mo-DCs obtained from cancer patients have functional biases capable of compromising the activation of T lymphocytes. Another result from our group pointed to the fact that part of the mo-DCs\' functional bias in cancer patients could be attributed to the decrease in STAT-6 signaling, a pathway that is activated by IL-4 and down regulated by SOCS-5, whose levels, in turn, were found elevated in cancer patients\' monocytes. Based on these results, the present work aimed to investigate the effects of MLT on the in vitro differentiation of healthy donors and breast cancer patients mo-DCs, under the hypothesis that this hormone could act on the IL-4/STAT-6/SOCS-5 axis generating better activated mo-DCs. Peripheral blood monocytes from healthy donors and breast cancer patients were treated with MLT (2,5 nM 2 hours) and induced to differentiate into mo-DCs; on the fifth day cells were activated with LPS (100 ng/ml 24 hours). Flow cytometry analysis of phenotype and cytokines in supernatants during mo-DCs differentiation didnt show MLT effects, but indicated higher frequency of CD83+ (p=0,014) monocytes among mononuclear cells of the patients, when compared with healthy donors. In addition, higher concentration of IL-12p70 was found in mo-DCs cultures (sixth day - p=0,02). The capacity to stimulate allogeneic T lymphocytes was assessed by co-cultures (1DC : 30LT), maintained for 5 days. Results indicate an effect of MLT only in order to increase the TNF, IFN-γ and IL-2 concentrations in supernatants of co-cultures with healthy donors mo-DCs. Patients cells showed differences only when there was no hormone treatment, showing higher levels of IL-10 in the co-culture supernatants, when compared to healthy controls. Monocytes were also treated with MLT (2,5 nM) or IL-4 (50 ng/mL) for 15 minutes to evaluate STAT-6, pSTAT-6 and SOCS-5 expression. Results showed an increase of STAT-6 in patients monocytes and a lower capacity of these cells to phosphorylate this molecule, even when in presence of IL-4. Together, the results point to some phenotypic and functional differences between patients and healthy donors monocytes, but it was not shown in their mo-DCs. Results also point to the fact that MLT generates changes only in healthy donors cells and those effects were only seen with cytokines found in cultures supernatants.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O oxigênio é fundamental para os vertebrados. No entanto, variações dos níveis de oxigênio na água podem provocar estresse oxidante em peixes porque privação de oxigênio seguida de reoxigenação forma espécies reativas de oxigênio (ERO) em células. Níveis intracelulares de ERO aumentados favorecem que moléculas de proteínas, fosfolipídios e ácidos nucleicos sofram alterações, vindo a prejudicar muitas funções celulares. No Pantanal, habitat do pacu, o nível de oxigênio varia circadianamente na água das lagoas rasas que acabam isoladas dos rios na seca. O pacu evoluiu sob a pressão contínua da exposição aos efeitos prejudiciais das ERO causados pelos pulsos de inundação. A melatonina, uma indolamina produzida na glândula pineal, influencia os níveis de atividade de enzimas antioxidantes que reduzem ERO, além de ser capaz de doar elétrons ou captar radicais livres de forma não enzimática. Os níveis de melatonina no pacu são mais altos no verão e menores no inverno. Isoenzimas de glutationa S-transferases que conjugam o tripetídeo glutationa com o 4-hidroxinonenal, aldeído derivado da peroxidação de ácidos graxos por ERO, são importantes para evitar alteração funcional de proteínas por ligação do 4-hidroxinonenal à sua estrutura. Neste trabalho procuramos relação entre estresse oxidante, níveis de atividades de glutationa S-transferase e melatonina, para estabelecer se a melatonina ajudaria pacus a superar os efeitos deletérios das espécies reativas de oxigênio. Ensaiamos atividades de isoenzimas de glutationa S-transferases no citosol de fígado de pacus mantidos em normoxia, hipoxia, reoxigenação e hiperoxia no inverno e no verão. Medimos o efeito da melatonina in vitro e in vivo sobre as atividades de isoenzimas de glutationa S-transferase. Medimos os efeitos do estresse oxidante sobre a ligação do 4-hidroxinonenal com proteínas nos fígados de pacus tratados com melatonina. Somente as isoenzimas que conjugam 4-hidroxinonenal com glutationa mostraram menor atividade no inverno em relação ao verão; outras isoenzimas de glutationa S-transferases não alteram suas atividades sazonalmente. In vitro a melatonina não alterou a atividade de isoenzimas de glutationa S-transferase que conjugam o 4-hidroxinonenal, mas inibiu outras isoenzimas de glutationa S-transferase. In vivo a melatonina aumentou a atividade encontrada no inverno das isoenzimas que conjugam o 4-hidroxinonenal para os níveis do verão. A ligação de 4-hidroxinonenal com proteínas foi menor em pacus inoculados com melatonina. Nossos resultados mostram que a melatonina pode influenciar os efeitos de ERO em fígado de pacus. Ficou claro que a melatonina do plasma mantém os níveis de atividade conjugadora de 4-hidroxinonenal do fígado em pacus e que a baixa produção de melatonina no inverno não é adequada para a conjugação do 4-hidroxinonenal em fígado de pacus. / Oxygen is vital for vertebrates. However, changes in the levels of dissolved oxygen in water might cause oxidative stress in fishes because the shortage of oxygen followed by reoxygenation originates reactive oxygen species (ROS) inside cells. Higher intracellular levels of ROS favor alterations of proteins, phospholipids and nucleic acid molecules, which result in impairment of many cell functions. In Pantanal, the pacus habitat, circadian variation of the oxygen levels occurs in water of the shallow lagoons that ended up isolated from the rivers along the dry season. Pacu has evolved under the pressure of continuous exposition to harmful effects of ROS caused by the annual inundation pulses. Melatonin, an indolamine produced by the pineal gland, influences the levels of activity of antioxidant enzymes that reduce ROS, and is capable of donating electrons or scavenge free radicals nonenzymatically. Pacus melatonin levels are higher during summer than in winter. Glutathione S-transferases isoenzymes that catalyze the conjugation of the tripeptide glutathione with 4-hydroxynonenal, an aldehyde derived from peroxidation of fat acids by ROS, are important to avoid functional alterations of proteins consequential to the binding of 4-hydroxynonenal to their structures. In this work, we searched for facts that linked oxidative stress, levels of activity of glutathione S-transferase and melatonin, in order to establish whether melatonin could help pacus to overcome the pernicious effects of reactive oxygen species. We carried out assays of glutathione S-transferases in liver cytosol of pacus kept under normoxia, hypoxia, reoxygenation and hyperoxia, in the summer and in the winter. We measured the effect of melatonin in vitro and in vivo on isoenzymes of glutathione S-transferases. We measured the effects of oxidative stress on the binding of 4-hydroxynonenal to proteins in liver of pacu treated with melatonin. Only isoenzymes that conjugate 4-hydroxynonenal with glutathione showed less activity during the winter in comparison to the summer; other isoenzymes did not have their activities changed seasonally. In vitro, melatonin did not change the activity of glutathione S-transferases isoenzymes that conjugate 4-hydroxynonenal, but inhibited other isoenzymes of glutathione S-transferase. In vivo, melatonin enhanced the liver activity of the glutathione S-transferase that conjugate 4-hydroxynonenal found in winter up to the levels found in summer. The binding of 4-hydroxynonenal to proteins was lower in liver cytosol from pacus injected with melatonin. Our findings show that melatonin can influence the effects of ROS in liver of pacu. It became evident that plasma melatonin maintains the liver levels of the conjugating activity of 4-hydroxynonenal and that the lower production of melatonin during winter is not adequate to the conjugation of 4-hydroxynonenal.

Orientador: Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari / Banca: Bruno Cogliati / Banca: Claudia Regina Bonini Domingos / Resumo: Câncer de mama representa a mais comum das neoplasias no sexo feminino, respondendo por 22% dos novos casos de câncer a cada ano. As neoplasias mamárias são ainda mais freqüentes na espécie canina, representando aproximadamente 52% de todas as neoplasias nas cadelas. A identificação de agentes terapêuticos que possam ser utilizados no tratamento alternativo para este tipo tumoral têm se revelado extremamente útil. A melatonina, um hormônio natural, parece exercer efeito oncostático em diferentes tipos de neoplasias. Considera-se como provável mecanismo de ação, sua interação com receptores estrogênicos e com os receptores MT1 e MT2 das células epiteliais, inibindo a proliferação das células neoplásicas. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial valor terapêutico da melatonina em linhagens de câncer de mama e em tumores mamários caninos estrógeno-positivo e estrógeno-negativo, além de relacionar sua ação com a expressão dos receptores MT1 e MT2. A identificação de tumores mamários estrógeno-positivo e negativo foi realizada por meio de imuno-histoquímica e a expressão dos genes MT1 e MT2 nas amostras foi analisada por PCR em tempo real. As células cultivadas, provenientes dos tumores e das linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 foram tratadas com melatonina e a viabilidade celular foi analisada pelo ensaio MTT. Observou-se 40% de redução na viabilidade celular nos tumores RE+ e RE- quando tratados, respectivamente, com 1mM e 10mM de melatonina (p<0,05). Além disso, os tumores RE+ apresentaram alta expressão dos receptores de melatonina MT1 e MT2 quando comparados aos tumores RE-. Com relação às linhagens, a linhagem MCF-7 (RE+) reduziu em 63% a viabilidade celular quando tratada com 10mM de melatonina (p<0,05) e para a linhagem MDA-MB-23 (RE-), esta mesma... (Resumo completo, clicar acesso eletrONico abaixo) / Abstract: Breast cancer is the most common cancer in women, accounting for 22% of new cancer cases each year. The mammary neoplasias are also common in canine species, representing about 52% of all cancers in female dogs. The identification of therapeutic agents that can be used as an alternative treatment for this tumor type has proven to be extremely useful. Melatonin, a natural hormone, can exercise oncostatic effects in several types of neoplasias. It is considered as a probable mechanism of action, their interaction with estrogenic receptors and with MT1 and MT2 receptors of the epithelial cells by inhibiting the proliferation of neoplastic cells. In this context, the objective of this study was to evaluate the potential therapeutic value of melatonin in breast cancer cell lines and canine mammary tumors estrogen-positive and estrogen-negative, also establishing relationship of its action to the MT1 and MT2 receptor. Identification of canine mammary tumors ER+ and negative was performed by immunohistochemistry and gene expression MT1 and MT2 in the samples was analyzed by real-time PCR. Cells cultured from the tumors and cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 were treated with melatonin and cell viability was analyzed by MTT assay. We observed 40% reduction in cell viability in ER+ tumors and ER- when treated, respectively, with 1mM and 10mM melatonin (p <0.05). Furthermore, the ER+ tumors showed high expression of melatonin receptors MT1 and MT2 when compared to ER- tumors. Regarding cell lines, the cell line MCF-7 (ER+) showed 63% reduction in cell viability when treated with 10mM of melatonin (p <0.05) for the cell line MDA-MB-23 (ER-), this same concentration reduced 50% cell viability (p <0.05). The results suggest that melatonin decreases the viability of neoplastic cells, being more effective for RE-positive tumors... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Objetivo Investigar a associação dos horários de trabalho e padrões de exposição à luz com ciclo vigília-sono e secreção de melatonina em trabalhadores da Reserva Extrativista Chico Mendes. Método Estudo transversal realizado no município de Xapuri, Acre, com 340 seringueiros e 148 trabalhadores uma fábrica de preservativos (46 trabalhadores administrativos e 102 operários). Na primeira etapa do estudo foram coletados, por meio de questionários, dados sociodemográficos, hábitos de vida, condições de trabalho, padrões de sono, preferência diurna, perfil cronobiológico (cronotipo), morbidades referidas e relato de dores musculoesqueléticas. Na segunda etapa do estudo, observando critérios de exclusão, foram selecionados 62 trabalhadores (42 seringueiros e 20 operários). Nesta etapa, seringueiros e operários foram acompanhados por 21 dias e 10 dias, respectivamente, nos quais foram coletados dados referentes ao padrão de atividade/repouso (actimetria), exposição à luz e melatonina salivar. Resultados Os resultados da primeira etapa mostraram que os dias de trabalho e folga dos seringueiros são diferentes em relação aos horários de início, fim e duração de sono (p<0,01). Similarmente aos seringueiros, também foram observadas diferenças relativas aos padrões de sono (horários de início e fim), entre os operários, em todos os turnos estudados (matutino, vespertino e noturno), segundo dia de trabalho e dia de folga. A segunda etapa da pesquisa evidenciou que a presença de energia elétrica na residência teve efeito significativo no horário de início e duração de sono e no horário de início da secreção de melatonina dos seringueiros (p<0,01). Os seringueiros mostraram um adiantamento do horário de início da secreção de melatonina, padrão semelhante ao encontrado em parte dos operários, o que pode estar relacionado a uma maior tendência à matutinidade. Além disso, os seringueiros foram expostos à intensidade e período de luz (natural e artificial) maiores quando comparados aos trabalhadores da fábrica. Os operários apresentaram maiores escores de sonolência nos turnos matutino e noturno, sendo este último associado à ocorrência de distúrbios de sono e fadiga ao acordar. Conclusão A distinção observada entre os padrões de sono dos trabalhadores, segundo dias de trabalho e folga, tanto para seringueiros quanto trabalhadores da fábrica, sugere a relevância dos horários de trabalho no ciclo vigília-sono da população estudada. A presença de energia elétrica, assim como a exposição à luz (natural e artificial), revelaram papel significativo na expressão do sistema de temporização circadiana dos trabalhadores estudados. / Aim To investigate the association of working hours and light exposure patterns with the wake-sleep cycle and melatonin secretion of workers from the Chico Mendes Extractivist Reserve. Method A cross-sectional study was conducted in the city of Xapuri, Acre, involving 340 rubber tappers and 148 condom factory workers (46 administrative workers and 102 shop-floor operatives). The first stage of the study entailed collection, by questionnaire, of data on sociodemographic, life-style, working conditions, sleep patterns, daily preference, chronobiological profile (chronotype), and morbidities and musculoskeletal pains reported. In the second stage of the study, after applying exclusion criteria, a total of 62 workers (42 rubber tappers and 20 factory workers) were selected. In this stage, rubber tapper and factory workers were followed up for 21 days and 10 days, respectively. During the follow-up period, data was collected on activity/rest patterns (actimetry), light exposure, and melatonin levels in saliva. Results The results of the first stage revealed that the work days and days off of rubber tappers differed with regard to start, end and duration of sleep time (p<0.01). Akin to rubber tappers, differences in sleep patterns (start and end times) were also noted among the factory workers, across all shifts studied (morning, evening and night) for work days and days off. The second stage of the study found that having electricity available in the home had a significant effect on the start time and duration of sleep and on the start time of melatonin secretion of the rubber tappers (p<0.01). The rubber tappers exhibited an earlier start time for melatonin secretion, having a similar pattern to that found in some of the factory workers, possibly related to a greater tendency for morningness. In addition, rubber tappers were exposed to greater intensity and periods of light (natural and artificial) compared to the factory workers. The factory workers had higher sleepiness scores during morning and night shifts, with night shifts associated with the occurrence of sleep disturbance and fatigue at waking. Conclusion The differences in the workers´ sleep patterns between work days and days off observed for both rubber tappers and factory workers suggest an influence of working hours on the wake-sleep cycle of the population studied. Presence of electricity, as well as exposure to light (natural and artificial), had an important role in the expression of the circadian rhythm/timing system of the workers studied.

Introdução. Embora necessário ao desenvolvimento econômico e bastante disseminado na sociedade atual, o trabalho em turnos noturnos fixos contribui para consequências sociais negativas e prejuízos à saúde dos trabalhadores deste turno de trabalho. Objetivo. Investigar possíveis efeitos do trabalho em turnos fixos noturnos sobre o sono e biomarcadores hormonais e inflamatórios selecionados. Métodos. Estudo transversal em indústria de metais sanitários da cidade de São Paulo, de que participaram 17 trabalhadores do sexo masculino do turno noturno (das 21h às 6h) e 21 trabalhadores de um dos turnos diurnos (das 7h às 17 h). Dados sociodemográficos, de saúde e de condições de trabalho e sobre fadiga, sonolência, estresse e matutinidade-vespertinidade foram obtidos por questionário. O ciclo atividade/repouso foi avaliado por actimetria e por protocolo diário de atividades durante 10 dias consecutivos, abrangendo ao menos um ciclo de turnos completo. Amostras de saliva coletadas em momentos diferentes durante três dias de trabalho foram analisadas por ELISA para determinação das concentrações dos cinco biomarcadores. Todos os dados obtidos foram então submetidos às análises matemáticas e estatísticas mais adequadas a cada caso. Resultados. O trabalho noturno foi associado a uma diminuição na secreção da melatonina e a alterações em seu ritmo de secreção. Foram observadas também alterações no ritmo de secreção do cortisol e no padrão de variação diário das citocinas salivares TNF, IL-1 e IL-6. Nos trabalhadores diurnos, a privação parcial do sono foi associada a aumento significativo da concentração da IL-6 na saliva. Um maior grau de dessincronização crônica entre os trabalhadores noturnos estaria associado a um maior encurtamento do sono diurno em dias de trabalho, a uma grande variabilidade no ritmo circadiano de secreção do cortisol e a uma maior variabilidade no padrão de variação diário da produção da IL-1 salivar. Conclusões. Os resultados indicam que o trabalho noturno em turnos fixos pode vir a ocasionar prejuízos à saúde dos trabalhadores deste esquema de turnos, tornando-o desaconselhável desse ponto de vista. Diferentes graus de sincronização do sistema de temporização endógeno estariam associados a maior ou menor adaptação ao trabalho em turnos noturnos fixos, com possíveis reflexos, em médio e longo prazos, sobre a tolerância ao trabalho em turnos e os efeitos à saúde nesses trabalhadores. Turnos diurnos com um horário de início associados à privação parcial do sono também poderiam acarretar prejuízos futuros à saúde desses trabalhadores / Introduction. Despite its relevance for the economic development and widespread employment in modern societies, night work contributes to social distress and health injuries of workers. Aim. Assess the effects of permanent night work on sleep and selected hormonal and inflammatory biomarkers. Methods. This cross-sectional study in a sanitary metals industry in São Paulo, Brazil, included only male workers. Demographic, health and working conditions data were obtained for seventeen permanent night workers (shift hours: 21:00 to 6:00) and twenty one permanent day workers (shift hours: 7:00 to 17:00). They also answered questionnaires about fatigue, sleepiness, stress and morningness-eveningness. Activity/rest cycle was evaluated by actimetry and activity protocols for ten consecutive days, thus covering at least an entire shift work cycle. Saliva samples collected in different moments for three workdays were submitted to ELISA analysis for the assessment of the salivary levels of the five biomarkers. All data were further submitted to the appropriate mathematical and statistical analyzes. Results. Night work was associated with lower levels of salivary melatonin and with a disturbed rhythm of secretion. It was also associated with disturbances in the cortisol rhythm and in the daily variation pattern of salivary cytokines TNF, IL-1, and IL-6. Partial sleep deprivation was associated with significant elevated levels of salivary IL-6. Higher levels of chronic dessinchronization among night workers were associated with a shorter day sleep during workdays, great variability in the cortisol rhythm and to more variability in the daily variation pattern of salivary IL-1. Conclusions. Permanent night work might cause health injuries and should be avoided. Distinct levels of desynchronization seem to be associated with a better or worse adaptation to permanent night work, which could be later reflected in the tolerance to shift work and general health of night workers. An early morning start of day shifts is associated with partial sleep deprivation and could cause later health injuries; for this reason, they should also be avoided

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-05T15:27:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PolimorfismosRegiaoPromotora.pdf: 1207589 bytes, checksum: 89710385da588ac529aef5a628bb1770 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-10T13:29:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PolimorfismosRegiaoPromotora.pdf: 1207589 bytes, checksum: 89710385da588ac529aef5a628bb1770 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T13:29:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_PolimorfismosRegiaoPromotora.pdf: 1207589 bytes, checksum: 89710385da588ac529aef5a628bb1770 (MD5) Previous issue date: 2015-06-18 / A produção de bubalinos no Estado do Pará é uma atividade de alta representatividade para a economia regional e produção de carne, leite e derivados. Portanto, é necessário desenvolver novas tecnologias que aumente o desfrute da produção e reprodução de bubalinos na região Amazônica. Sendo assim, os objetivos desta tese de pesquisa foram caracterizar a região promotora do gene do receptor da melatonina 1 A (MTRN1A) e identificar polimorfismos nos éxons I e II do referido gene e associá-los a características reprodutivas de relevância econômica em búfalas na região Amazônica. Foram coletados amostras de pelos de 400 búfalas e foram usados 60 animais para caracterização da região promotora, 140 para detectar o polimorfismo (SNPs) no éxon II e 77 para detectar o polimorfismo no éxon I. Foi realizada a extração de DNA pelo método fenólico. Em seguida selecionaram-se os diferentes iniciadores para realizar as reações em cadeia da polimerase (PCR). A região promotora do MTRN1A foi sequenciada em um total de 1621 pares de base pelo método de Sanger, o polimorfismo no éxon II foi detectado através da técnica de PCR-RFLP (Polimorfismo de restrição de comprimento de fragmentos) com a enzima HpaI e o polimorfismo no éxon I foi detectado através do sequenciamento de DNA pelo método Sanger. Foram avaliadas as frequências alélicas e genotípicas de todos os SNPs, os coeficientes de endocruzamento (Fis) e as probabilidades de Hardy-Weinberg. Os SNPs da região promotora e do éxon I foram associados com características reprodutivas das búfalas pelo ANOVA, ou teste t de Student e/ou teste qui-quadrado. O nível de significância foi de 0,05. Foram detectados 26 SNPs na região promotora nas posições -1511 (C→T), -1465 (G→T), -1422 (A→G), -1411 (G→A), - 1395 (G→T), -1298 (A→G), -1295(G→A), -1242 (A→C), -1150 (C→T), -1147 (G→C), - 1136(A→G), -911 (G→A), -909 (A→G), -724 (C→G), -656 (A→C), -649 (T→C), -644 (G→A), -511 (A→C), -481 (G→A), -425 (C→T), -395 (G→A), -383 (G→T), -254 (C→T), - 206 (T→C), -133 (T→G) e -94 (C→T) e um bloco de deleção (ACAA) na posição -1483. Do total de SNPs detectados, 75% dos alelos selvagens tiveral frequências maiores que 0,5. Para a característica Intervalo entre Parto (IEP), somente cinco SNPs (-1298, -1136, -911, -724 e - 656) foram significativamente associados (P<0,05) e outros três SNPs (-1395, -724 e -94) foram associados significativamente (P<0,05) com a característica Idade ao Primeiro Parto (IPP) e nenhum para a característica concentração de partos (P>0,05). Um total de 11 SNPs foi fortemente associado a fatores de ligação para a regulação gênica. O SNP no éxon II por PCR-RFLP (HpaI) na posição 306 de (T→C), sendo o alelo T mais frequente nos animais de Terra Firme (0,529) e o C em animais de Várzea, as duas populações apresentaram coeficientes de endocruzamento Fis (0,040 e 0,091, respectivamente) e fortes desvios de Hardy-Weinberg (P>0,05). A mutação ocorre no 106° codon e é do tipo sinonímio sem alteração da estrutura de alças do RNA mensageiro. O SNP no éxon I foi detectado na posição 62 (T→C) e do tipo não sinonímio, trocando de Leucina para Prolina. O alelo mutante C foi o mais frequente (0,623), coeficiente de endocruzamento Fis=0,397 e desvios de Hardy- Weinberg (P<0,05). Nenhum dos genótipos foram associados ao interval entre partos e a idade do primeiro parto (P>0,05). Portanto, os SNPs são fortes candidatos para seleção, mas seria interessante avaliá-los em outros rebanhos na região Amazônica e/ou em outras regiões do Brasil e/ou em outros países para efetivá-los como excelentes marcadores moleculares para características reprodutivas de bubalinas. / The buffaloes production in the Pará state have is a high representative activity to the regional economy and production of meat, milk and dairy products. Therefore, it is necessary to develop new technologies that increase the enjoyment of the production and reproduction of buffaloes in the Amazon region. Thus, the objectives of this research thesis was to characterize the promoter region of the melatonin receptor gene 1 (MTRN1A) and identify polymorphisms in exons I and II of that gene and link them to reproductive traits that have economic importance in buffaloes in the region Amazon. Were collected 400 buffaloes samples and 60 animals were used to characterize the promoter region, 140 to detect the polymorphism (SNPs) in exon II and 77 to detect the polymorphism in exon I. DNA extraction was peformed by phenol method. Then were selected different primers to make Polymerase Chain Reaction (PCR). The promoter region was sequenced MTRN1A a total of 1621 base pairs by the Sanger method, polymorphism in exon II was detected by PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) with HpaI enzyme and the polymorphism exon I was found by sequencing DNA by Sanger method. Allele and genotype frequencies of all SNPs were evaluated, the inbreeding coefficient (Fis) and the likelihood of Hardy-Weinberg equilibrium. SNPs in the promoter region and exon I have been associated with reproductive traits of buffaloes by ANOVA or Student's t test and / or chisquare test. The significance level was 0,05. 26 SNPs were detected in the promoter region at positions -1511 (C → T), -1465 (G → T), -1422 (A → G), -1411 (G → A), -1395 (G → T), - 1298 (A → G) -1295 (G → A) -1242 (C → A) -1150 (C → T), -1 147 (G → C) -1136 (A → G) -911 ( G → A), -909 (A → G) -724 (C → G) -656 (A → C) -649 (C → T), -644 (G → A), -511 (A → C) -481 (G → A), -425 (C → T) -395 (G → A), -383 (G → T), -254 (C → T) -206 (T → C) , -133 (T → G) and -94 (C → T) and a deletion unit (ACAA) at position -1483. Of the total detected SNPs, 75% of the wild alleles tiveral frequencies greater than 0,5. For the characteristic interval between calving (IEP), only five SNPs (-1298, -1136, -911, -724 and - 656) were significantly associated (P <0.05) and three SNPs (-1395, -724 and -94) were significantly associated (P <0.05) with the characteristic age at first calving (IPP) and none for the characteristic concentration of deliveries (P> 0.05). A total of 11 SNPs was strongly associated with binding factors in gene regulation. The SNP in exon II by PCR-RFLP (HpaI) at position 306 (T → C), the most frequent allele T in Upland animals (0,529) and C in lowland animals, the two populations showed coefficients Fis inbreeding (0,040 and 0,091, respectively) and strong deviations from Hardy-Weinberg equilibrium (P> 0.05). The mutation occurs at codon 106 and is the sinonímio type without changing the messenger RNA handles structure. The SNP in exon I was detected at position 62 (T → C) and of the non sinonímio, exchanging of Leucine to Proline. The mutant allele was the most frequent C (0,623) inbreeding coefficient Fis = 0.397 and Hardy-Weinberg deviations (P <0.05). None of the genotypes were associated with calving interval and age at first birth (P> 0.05). Therefore, SNPs are strong candidates for selection, but it would be interesting to evaluate them in other herds in the Amazon region and / or in other regions of Brazil and / or other countries to effect them as excellent molecular markers for reproductive traits of buffalo.

Orientador: Daniel Galera Bernabé / Resumo: Estudos sugerem que a supressão de melatonina e disfunção circadiana em trabalhadores noturnos podem estar relacionadas ao desenvolvimento e à progressão do câncer. Pesquisas têm mostrado também que a incidência tumoral pode ser aumentada pela pinealectomia. Entretanto, nenhum estudo avaliou a influência da cirurgia de pinealectomia sobre o desenvolvimento e a progressão do câncer de boca. No presente estudo, nós investigamos os efeitos da supressão de melatonina sobre a ocorrência e a progressão tumoral um modelo pré-clínico de câncer de boca induzido quimicamente. Nós demonstramos, pela primeira vez, que ratos pinealectomizados tiveram maior ocorrência de carcinoma espinocelular de boca, comparado aos animais controle. Ratos pinealectomizados também exibiram volume e espessura tumorais cerca de 3 e 2 vezes maior que animais sham, respectivamente. Além disso, pinealectomia induziu atrofia do epitélio não-tumoral adjacente às lesões bucais. Os ratos pinealectomizados apresentaram maior resposta inflamatória no front de invasão tumoral, caracterizada principalmente pelo aumento do número de eosinófilos e macrófagos associados ao tumor. Tumores de ratos submetidos à pinealectomia exibiram maior imunoexpressão de ERK1/2 e p53 no microambiente tumoral. Estes resultados revelam que a supressão de melatonina acelera o desenvolvimento e a progressão do câncer de boca associado ao aumento de eosinófilos e macrófagos no front de invasão tumoral e maior expressão de ERK1/2 e p53 no mic... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Studies suggest that melatonin suppression and circadian dysfunction in shift workers can be related to cancer risk. Furthermore, investigations have shown that pinealectomy promotes higher tumor incidence in rats. However, no study evaluated the influence of pinealectomy surgery on oral cancer onset and progression. In the current study, we investigated the effects of melatonin suppression on tumor occurrence and progression in a preclinical model of oral cancer. We demonstrated for the first time that pinealectomized rats had higher oral squamous cell carcinoma occurrence than sham animals. Furthermore, pinealectomized animals displayed tumor volume and thickness about 3 times and twice higher than sham-operated rats, respectively. Moreover, pinealectomy induced atrophy of non-tumor epithelium adjacent to the oral lesions. Pinealectomized rats showed higher mean number of tumor-associated macrophages and eosinophils in the carcinoma invasion front. In addition, tumors from pinealectomized rats displayed increased immunoexpression of ERK1/2 and p53 in the tumor microenvironment. These results reveal that melatonin suppression promotes higher oral cancer occurrence and progression associated with increasing of inflammatory cells and ERK1/2 and p53 expressions in the tumor microenvironment. / Mestre

Submitted by MARIANA LOPES BENITES null (mariana_benites@hotmail.com) on 2017-12-20T14:12:16Z No. of bitstreams: 1 repositório Mariana Benites.pdf: 2711972 bytes, checksum: 006ba62977278dd8c58404bd766be56d (MD5) / Submitted by MARIANA LOPES BENITES null (mariana_benites@hotmail.com) on 2017-12-21T12:31:27Z No. of bitstreams: 1 repositório Mariana Benites.pdf: 2711972 bytes, checksum: 006ba62977278dd8c58404bd766be56d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Rimoli de Oliveira null (anapaula@foa.unesp.br) on 2017-12-22T13:19:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 benites_ml_dr_araca_int.pdf: 2616549 bytes, checksum: 09a481f5e45b2906fb14687e39c41b08 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-22T13:19:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 benites_ml_dr_araca_int.pdf: 2616549 bytes, checksum: 09a481f5e45b2906fb14687e39c41b08 (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Produzida pela glândula pineal exclusivamente em período noturno e na escuridão, a melatonina apresenta papel fundamental na sincronização dos ritmos circadianos com o ciclo claro-escuro do meio ambiente. A exposição à luz suprime a síntese e secreção de melatonina pela glândula pineal, podendo prejudicar a ação insulínica em células do músculo esquelético. O transporte ineficiente de glicose no músculo esquelético pode promover atrofia, geralmente acompanhada por perda de massa óssea. Resistência à insulina, atrofia muscular esquelética e perda de massa óssea são efeitos patológicos que podem ser prevenidos ou atenuados pela prática regular de exercícios físicos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do exercício resistido (ER) sobre a sensibilidade à insulina e manutenção da musculatura esquelética e tecido ósseo em ratos pinealectomizados. 40 ratos Wistar machos foram distribuídos, aleatória e igualmente, em 4 grupos: 1) controle (CNS); 2) exercitado (CNEX); 3) pinealectomizado (PNX) e 4) pinealectomizado exercitado (PNXEX). O ER foi realizado em escada, durante 8 semanas, 3 sessões semanais (em dias não consecutivos), 9 repetições por sessão e intervalo de tempo de 2 minutos entre as repetições. O teste de força máxima foi realizado a cada 2 semanas e a intensidade selecionada foi 60% de 1 repetição máxima (1RM). Após o período de treinamento, os animais foram submetidos ao teste de tolerância à insulina. Após o sacrifício, amostras de sangue foram coletadas para fosforilação da glicemia e insulinemia. A partir destes valores, a resistência à insulina foi calculada pelo índice HOMA-IR. O cálculo da área de secção transversa do extensor digitorum longus (EDL) foi realizado a partir da análise histológica, utilizando o software IMAGEJ. Também foram avaliadas a expressão gênica e fosforilação de proteínas presentes nas vias de manutenção do músculo esquelético: GLUT4, TNF-α, atrogin-1, MuRF1, IGF-1, Akt1, miostatina e SMAD2/3. O cálculo da área do trabeculado ósseo esponjoso inferiormente à linha epifisial da tíbia foi realizado a partir da análise histológica em cortes longitudinais, utilizando o software IMAGEJ. Os parâmetros morfológicos do tecido ósseo foram avaliados por micro-CT; a análise mineral óssea foi avaliada pelo Dual-energy X-ray absorptiometry – DEXA e análise mecânica foi avaliada pelo teste de três pontos. As análises estatísticas foram realizadas por análise de variância com 2 fatores - ANOVA two way, seguida pelo teste de Bonferroni, ao nível de significância de 5%. A pinealectomia promoveu resistência à insulina e aumento na expressão de TNF-α em animais PNX. A prática de exercícios resistidos atuou na prevenção da resistência à insulina pelo aumento na expressão de GLUT4 em animais PNXEX. A pinealectomia também promoveu atrofia muscular esquelética nos grupos PNX e PNXEX. A prática de exercícios resistidos, realizada pelo período de tempo, frequência e intensidade selecionados, não foi suficiente para promover hipertrofia muscular no grupo CNEX ou prevenir a atrofia muscular no grupo PNXEX. Os grupos PNX e PNXEX apresentaram aumento da expressão gênica de miostatina e fosforilação proteica de SMAD2/3 em relação aos grupos CNS e CNEX. Não houve diferença na expressão gênica e fosforilação das demais proteínas analisadas entre os grupos estudados. Os resultados sugerem que a atrofia muscular esquelética, observada nos grupos PNX e PNXEX, está relacionada ao aumento na ativação da via da miostatina e, quem sabe, ao aumento de TNF-α em músculo esquelético. O aumento da DMO em animais PNX foi tomado como um mecanismo protetivo do osso. O exercício resistido promoveu melhora da qualidade óssea em animais pinealectomizados ou não. O presente estudo demonstrou que a prática regular de exercícios resistidos (60% de 1 RM) preveniu a resistência à insulina em animais pinealectomizados e melhorou a qualidade óssea em animais com e sem pineal. A partir desses resultados podemos aventar que o exercício físico, em trabalhadores noturnos, pode melhorar a sensibilidade à insulina e auxiliar na manutenção do tecido ósseo. / 99999.006989/2015-02