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Investigação do refluxo vésico-ureteral por abordagens metabolômicas alvo e global em urina utilizando como plataformas analíticas CE-MS, CESI-MS, RPLC-MS e HILIC-MS / Investigation of vesicoureteral reflux by target and untargeted metabolomic approaches in urine using CE-MS, CESI-MS, RPLC-MS and HILIC-MS as analytical platforms

Rodrigues, Karina Trevisan 14 September 2017 (has links)
O refluxo vésico-ureteral (RVU) é uma das condições urológicas comumente diagnosticada entre crianças. Altos graus dessa condição podem causar cicatrização renal, insuficiência renal e hipertensão arterial. A uretrocistografia miccional é o método mais comumente utilizado para o diagnóstico, no entanto, esse procedimento envolve sedação, cateterismo vesical e expõe a criança a uma quantidade significativa de radiação. A investigação metabolômica pode fornecer novos entendimentos sobre a doença e visa a descoberta de metabólitos específicos associados a ela. Assim, existe um potencial considerável para a implementação de perfil metabólico em análises clínicas. Dessa forma, buscou-se estabelecer uma alternativa não invasiva para identificar crianças com o RVU através da metabolômica. Para a investigação metabolômica alvo um método por eletroforese capilar acoplada ao espectrômetro de massas (CE-MS) com analisador to tipo ion trap foi desenvolvido e validado para a determinação de 27 aminoácidos em urina. Os parâmetros experimentais relacionados às configurações da interface CE-MS, eletrólito (BGE) e espectrômetro de de massas (MS) foram otimizados, proporcionando uma boa separação dos 27 aminoácidos, incluindo os isômeros L-leucina, L-isoleucina e L-alloisoleucina, em menos de 30 min. O líquido auxiliar (SHL) foi composto de 0,5% (v/v) ácido fórmico em 60% (v/v) água/metanol à uma vazão de 5 µL min-1. O BGE consistiu de 0,80 mol L-1 de ácido fórmico e 15% (v/v) de metanol. Um procedimento de stacking por pH foi implementado para aumentar a detectabilidade (uma solução de NH4OH a 12,5% (v/v) foi injetada a 0,5 psi/9 s antes das amostras). O método foi validado de acordo com os protocolos FDA e ICH, exibindo parâmetros aceitáveis. A quantificação bem sucedida dos aminoácidos em amostras de urina de um estudo piloto do RVU foi alcançada. A avaliação estatística dos resultados mostrou que alguns dos aminoácidos avaliados podem carregar informações que possibilitam discriminar as amostras de urina entre os grupos teste e controle. Para a análise metabolômica global urinária, métodos por RPLC-MS e HILIC-MS foram otimizados. Cinco colunas com diferentes propriedades foram investigadas para RPLC e quatro colunas para HILIC; adicionalmente, foram investigados a influência dos aditivos e pH da fase móvel. As condições ótimas foram determinadas avaliando o formato de pico, a relação sinal-ruído, o tempo de retenção, o número de molecular features detectados e sua distribuição durante o gradiente de eluição. A melhor condição obtida para RPLC utiliza a coluna CSH C18 e fase móvel composta por 0,1% (v/v) ácido fórmico em água (A) e 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila (B). Para HILIC, o melhor desempenho foi obtido com a coluna zwitteriônica ZIC-HILIC e fase móvel composta por 10 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (B) e 95% (v/v) acetonitrila e 5% 200 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (A). As amostras de urina dos grupos controle e teste foram submetidas à análise metabolômica global por RPLC-MS usando o método otimizado e por CESI-MS. Os resultados indicaram que diversas rotas metabólicas podem ter sido alteradas pelo RVU. Alteração dos níveis de carnitinas e acilcarnitinas, aminoácidos e derivados, purinas e outros foi observada. Ainda, a presença de acilcarnitinas na urina podem indicar danos mitocondriais e a diminuição de triptofano e aumento do ácido quinurênico indicam uma alteração no metabolismo do triptofano. / Vesicoureteral reflux (VUR) is one of the most commonly urologic conditions diagnosed among children. A high degree of this condition can cause kidney scarring, kidney failure and high blood pressure. Voiding cystourethrography is the standard method for diagnosis; however, this procedure involves sedation, bladder catheterization and exposes the child to a significant amount of radiation. Metabolomics has provided new insights about the disease and aims to discover specific metabolites associated with it. Thus, there is a considerable potential for the implementation of metabolic profile in clinical analyses. Thus, we attempted to establish a noninvasive alternative to identify children with VUR through metabolomics approach. For target metabolomics, a CE-MS method was developed and validated for the separation and quantitative analysis of 27 amino acids in urine. Experimental parameters related to the CE-MS interface (based on co-axial sheath liquid, SHL), background electrolyte (BGE) and mass spectrometer (MS) settings were optimized providing a good separation of 27 amino acids, including the isomers L-leucine, L-isoleucine and L-alloisoleucine, in less than 30 min. The SHL was composed of 0.50% (v/v) formic acid in 60% (v/v) methanol-water delivered at a flow rate of 5 µL min-1. The BGE consisted of 0.80 mol L-1 formic acid and 15% (v/v) methanol. A pH stacking procedure was implemented to enhance sensitivity (a 12.5% (v/v) NH4OH solution was injected at 0.5 psi/9 s prior to samples). The proposed method was thoroughly validated according to FDA and ICH protocols exhibiting acceptable parameters. A successful quantification of amino acids in urine samples from the VUR cohort was achieved. The statistical evaluation of the results showed that some of the amino acids may carry information for the discrimination of the urine samples between the test and control groups. For untargeted metabolomics analysis, methods by RPLC-MS and HILIC-MS were optimized. Five columns with different properties were investigated for RPLC and four columns for HILIC; additionally, the influence of additives and pH of the mobile phase were investigated. The optimum conditions were determined assessing the peak shape, signal-to-noise ratio, retention time, number of molecular features detected and their distribution during the elution gradient. The best condition obtained for RPLC uses CSH C18 column and mobile phase composed by 0.1% (v/v) formic acid in water (A) and 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile (B). For HILIC, the best performance was obtained with the zwitterionic ZIC-HILIC column and mobile phase composed by 10 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (B) and 95% (v/v) acetonitrile and 5% (v/v) 200 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (A). Urine samples from the control and test groups were submitted to global metabolomics analysis by RPLC-MS using the optimized method and by CESI-MS. The results indicated that several metabolic pathways may have been altered by VUR. Changes of carnitine and acylcarnitine levels, amino acids and derivatives, purines and others was observed. Furthermore, the presence of acylcarnitines in the urine may indicate mitochondrial damage and the decrease of tryptophan and increase of the kynurenic acid indicate a change in the metabolism of tryptophan.
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Metabolômica como ferramenta na análise quimiotaxonômica do gênero Catasetum (ORCHIDACEAE) / Metabolomics as a tool for chemotaxonomic analysis of the genus Catasetum (Orchidaceae)

Bandeira, Karen Dayane de Oliveira 31 March 2017 (has links)
A família Orchidaceae é a maior família entre as monocotiledôneas e representa uma das maiores famílias de plantas floríferas com um número estimado de cerca de 30 mil espécies. A complexidade taxonômica de um dos gêneros dentro dessa família, o Catasetum, tem despertado muito interesse por parte dos cultivadores e pesquisadores em Orchidaceae, especialmente devido aos novos táxons que estão sendo descobertos no gênero. Visando aprimorar a classificação de espécies do gênero, uma ferramenta a ser utilizada é a análise dos constituintes químicos do metabolismo dessas plantas, onde fica evidenciada a necessidade de estudos utilizando métodos analíticos mais sensíveis, rápidas e seletivas, como a análise metabolômica. A obtenção da impressão digital metabólica é a obtenção detalhada dos metabólitos do organismo sob determinada condição, produzindo um cromatograma que é característico daquela planta, como uma impressão digital. Através disso, é possível determinar diferenças metabólicas em amostras, por meio de ferramentas estatísticas. Para o refinamento dos dados, é necessário o uso de softwares específicos que extraem as informações úteis para as análises. Foram analisadas 42 espécies distintas do gênero Catasetum e algumas duplicatas, totalizando 51 amostras por GC-MS e UHPLC-MS(ESI-Orbitrap). As \"impressões digitais\" metabólicas foram processadas nos softwares MetAlignTM e MSClust, e as matrizes geradas foram analisadas por análise de componentes principais (PCA), análise de cluster hierárquico (HCA) e análise discriminante ortogonal por mínimos quadrados parciais (OPLS-DA). Os métodos utilizados para as análises tanto por GC-MS quanto por UHPLC-MS resultaram em dados satisfatórios para análise metabolômica, gerando 57 substâncias voláteis identificadas a partir da fragrância das flores, sendo acetato de nerila, sabineno, ?-mirceno, ?-pineno e ?-pineno as mais frequentes. Os resultados das análises metabolômicas apresentaram proximidade com a filogenia, principalmente em níveis mais específicos. Os grupos gerados pelas análises, de modo geral, foram coerentes quanto à semelhança metabólica entre as espécies que os compõem, sugerindo a possibilidade do uso de impressões digitais metabólicas como uma boa ferramenta para análise quimiotaxonômica / The Orchidaceae family is the largest family among monocotyledons and represents one of the largest families of flowering plants with an estimated 30,000 species. The taxonomic complexity of one of the genera within this family, the Catasetum, has aroused much interest from growers and researchers in Orchidaceae, especially due to the new taxa being discovered in the genus. Aiming to improve the classification of species of the genus, a tool to be used is the analysis of the chemical constituents of the metabolism of these plants, where it is evidenced the need for studies using analytical methodologies more sensitive, fast and effective, such as the metabolomics analysis. Obtaining the metabolic fingerprint is the detailed obtaining of the metabolites of the organism under certain condition, producing a chromatogram that is characteristic of that plant, like a fingerprint. Through this, it is possible to determine metabolic differences in samples, through statistical tools. For the refinement of the data, it is necessary to use specific softwares that extract the useful information from analyzes data. The information generated can be used with different applications. A total of 51 samples were analyzed by GC-MS and UHPLC-MS (ESI-Orbitrap), 42 different species of the genus Catasetum and some duplicates. Metabolic \"fingerprints\" were processed in the MetAlignTM and MSClust softwares, and the generated matrices were analyzed by Principal Component Analysis (PCA), hierarchical cluster analysis (HCA) and partial least squares orthogonal discriminant analysis (OPLS-DA). The methods used for analysis by both GC-MS and UHPLC-MS resulted in satisfactory data for metabolomics analysis, generating 57 volatile substances identified from the flower fragrance, being neryl acetate, sabinene, ?-myrcene, ?-pinene and ?-pinene the most frequent. The results of the metabolic analyzes showed proximity to the phylogeny, mainly in more specific levels. The groups generated by the analyzes, in general, were coherent regarding the metabolic similarity between the species that compose them, suggesting the possibility of the use of metabolic fingerprints as a good tool for chemotaxonomic analysis
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Triagem de inibidores da enzima DHODH de Leishmania major em Asteraceae: estudos metabolômicos e da relação estrutura-atividade quantitativa (QSAR) / Screening of inhibitors of Leishmania major DHODH in Asteraceae: metabolomic studies and Quantitative Structure-Activity Relationships (QSAR).

Chibli, Lucas Apolinário 05 July 2018 (has links)
A flavoenzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) catalisa a quarta reação da via de novo de biossíntese de pirimidinas, se destacando como alvo molecular chave para parasitos causadores de Doenças Negligenciadas (DNs). Tendo em vista a demanda por novas alternativas terapêuticas para estas doenças, o objetivo deste trabalho foi a triagem in vitro de inibidores da enzima DHODH de Leishmania major (LmDHODH) em Asteraceae. Esta triagem foi acompanhada por abordagem metabolômica em UHPLC-ESI-HRFTMS para os extratos vegetais e estudos de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) para as substâncias isoladas. As etapas experimentais realizadas e os resultados obtidos foram: 1) Ensaios enzimáticos: os valores de IC50 foram determinados para 59 extratos (?IC50: 148,0 ?g.mL-1 a 9,4 mg.mL-1) e 57 substâncias isoladas (?IC50: 27,0 ?M a 2,6 mM). As substâncias mais ativas frente à LmDHODH apresentaram seletividade, ao exercer inibição irrelevante sobre DHODH humana. Adicionalmente, estudos de termoestabilidade confirmaram que as lactonas sesquiterpênicas (STLs) são, de fato, capazes de se ligar a esta enzima; 2) Estudos metabolômicos: as impressões digitais metabólicas por LC-MS foram obtidas com sucesso para os 59 extratos e o processamento dos dados forneceu 3.694 substâncias. A desreplicação por meio de uma biblioteca de padrões identificou com segurança 49 metabólitos secundários. Por meio da correlação in silico com os dados de inibição enzimática, foram determinados com êxito os principais biomarcadores dos extratos e obteve-se um modelo de regressão confiável para predição do potencial de inibição de novos extratos provindos de espécies ainda não testadas frente à LmDHODH, classificando-os como ativos ou inativos com base exclusivamente na sua impressão digital por UHPLC-ESI-HRFTMS; 3) Estudos de QSAR com 21 STLs: o modelo de QSAR baseado em descritores moleculares apresentou robustez e confiabilidade (R2 / Q2 / P2 > 0,6 e RMSE < 0,3), revelando que uma maior inibição desta enzima requer a distribuição balanceada das regiões hidrofóbicas através da superfície molecular, maior largura das moléculas e menor hidrofobicidade. O modelo 3D baseado em descritores farmacofóricos também foi útil (R2: 0,79; Q2: 0,55) e confirmou a importância da orientação adequada dos ligantes, propriedades superficiais e formato das moléculas, refletindo propriedades de um possível sítio de ligação para as STLs na enzima. Portanto, alguns dos produtos naturais testados nesta triagem in vitro são, de fato, capazes de inibir seletivamente a enzima LmDHODH, tratando-se de uma descoberta relevante, visto que uma infinidade de metabólitos secundários leishmanicidas já foram descritos, porém, para a maioria deles, o mecanismo de ação segue desconhecido. Os resultados evidenciaram (1) as espécies de Asteraceae como importante fonte na busca por novos inibidores desta enzima e (2) as substâncias mais ativas como ponto de partida para novas estruturas guias (lead compounds) visando novos fármacos antiparasitários para o tratamento de DNs, especialmente a leishmaniose. / The flavoenzyme dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) catalyzes the fourth reaction of the de novo pyrimidine biosynthetic pathway, standing out as a key molecular target for trypanosomatid parasites causing Neglected Diseases (NDs). In view of the global demand for new therapies for such diseases, this study aimed for the in vitro screening of inhibitors of Leishmania major DHODH (LmDHODH) in Asteraceae, accompanied by metabolomic approach with UHPLC-ESI-HRFTMS for plant extracts and QSAR studies (Quantitative Structure-Activity Relationships) for isolated compounds. The experimental steps performed and the results obtained were: 1) Enzymatic assays: the IC50 values were determined for 59 plant extracts (?IC50: 148.0 ?g.mL-1 a 9.4 mg.mL-1) and 57 natural compounds (?IC50: 27.0 ?M a 2.6 mM). The most active compounds showed selectivity against LmDHODH by exercising irrelevant inhibition of human DHODH. In addition, thermostability studies have confirmed that sesquiterpene lactones (STLs) are indeed capable of binding to this enzyme; 2) Metabolomic studies: the metabolic fingerprints by LC-MS were successfully obtained for the 59 extracts and 3,694 peaks/compounds were provided after data processing. The dereplication using a library of natural compounds has safely identified 49 secondary metabolites. By means of in silico correlation with the enzymatic inhibition data, the main biomarkers of the extracts were successfully determined and a reliable regression model was obtained to predict the inhibition potential of new extracts from species not yet tested against LmDHODH, classifying it as active or inactive based solely on their fingerprint by UHPLC-ESI-HRFTMS; 3) QSAR studies with 21 STLs: a reliable QSAR model based on molecular descriptors was obtained (R2 / Q2 / P2 > 0.6 and RMSE < 0.3), which indicated that stronger inhibition requires a balanced distribution of the hydrophobic regions across the molecular surface, as well as higher width and lower hydrophobicity of the molecules. A pharmacophore-based 3D-QSAR approach also afforded a useful model (R2: 0.79; Q2: 0.55), which confirmed the importance of proper orientation of the ligands, molecular surface features and shape for stronger inhibition, reflecting properties of a putative common binding site. Thus, some of the natural products tested in this in vitro screening are actually capable of selectively inhibiting LmDHODH. This constitutes a relevant finding, since an infinity of leishmanicidal compounds have been described, however, for most of them, the mechanism of action remains unknown. The results highlighted (1) Asteraceae species as important sources of new LmDHODH inhibitors and (2) the most active metabolites as promising starting points for new led compounds aiming new antiparasitc drugs for treatment of NDs caused by trypanosomatids, especially leishmaniasis.
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Quimiometria aplicada à metabolômica de Aldama La Llave: contribuições quimiotaxonômicas e fitoquímica direcionada baseada em inibição de cicloxigease-1 e 5-lipoxigease / Chemometrics applied to metabolomics of Aldama La Llave: chemotaxonomic contributions and targeted phytochemistry based on cyclooxygenase-1 and 5-lipoxygenase inhibition

Santos, Felipe Antunes dos 26 January 2015 (has links)
As espécies do gênero Viguiera Kunth, recentemente transferidas para Aldama La Llave (Asteraceae, Heliantheae), ainda possuem problemas de delimitação taxonômica. Tal gênero possui 35 espécies distribuídas por todo o território brasileiro, principalmente no cerrado. Análises químicas têm demonstrado seu potencial em auxiliar na resolução de problemas em vários níveis taxonômicos com base em grupos químicos de metabólitos secundários. Além disso, análises fitoquímicas tem revelado que determinadas substâncias de Aldama possuem potencial para serem estudadas tendo vista a investigação de mecanismos moleculares anti-inflamatórios. Desta forma, foi proposto neste trabalho realizar a abordagem da metabolômica não-direcionada auxiliada por quimiometria, visando-se fornecer dados químicos tanto para contribuições quimiotaxonômicas quanto para encontrar substâncias bioativas. Por meio de tal abordagem, análises multivariadas não supervisionadas (PCA e HCA), bem como supervisionadas (OPLS-DA), com dados provenientes de UHPLC-DAD-Orbitrap, demonstraram que o gênero Aldama é quimioconsistente e, deste modo, determinadas substâncias químicas discriminantes foram sugeridas. Além disso, espécies que apresentam problemas taxonômicos tiveram os seus posicionamentos infragenéricos explicado do ponto de vista quimiotaxonômico. Quanto às análises para encontrar substâncias bioativas (fitoquímica direcionada), os alvos inflamatórios pesquisados foram as enzimas pró-inflamatórias COX-1 e 5-LOX, com as quais se realizou ensaios in vitro verificando-se a atividade positiva de extratos de espécies de Aldama. A. trichophylla foi a espécie selecionada para realizar a fitoquímica direcionada, uma vez que apresentou inibição dupla contra as enzimas e por se tratar de uma espécie muito pouco estudada do ponto de vista fitoquímico. Os melhores modelos de inibição de COX-1 e 5-LOX criados com dados químicos de Aldama foram selecionados a partir de diversas combinações de algoritmos, softwares de processamento (MZmine, MetAlign e MSClust) e técnicas-hifenadas, tais como UHPLC-Orbitrap e HPLC-TOF. Deste modo, determinados picos de íons foram apontados pela quimiometria como sendo discriminantes para a atividade de inibição dupla. Tais picos foram desreplicados com base em seus perfis de UV e padrões de fragmentação via HCD-Orbitrap e Ion-Trap. Deste modo, foi possível desreplicar três prováveis substâncias químicas inibidoras de COX-1 e 5-LOX: kaempferol-3-O-glucuronideo, quercetina-3-O-metil-7-glucuronideo e kaempferol-3-O-(6\"-malonil-glucosideo). Por fim, foi realizada a fitoquímica direcionada. O fracionamento cromatográfico permitiu isolar tais substâncias e uma análise preliminar de RMN 1H foi realizada com o intuito de realizar a identificação estrutural. Tais substâncias terão a suas atividades confirmadas na inibição das duas enzimas em um futuro próximo. / The species of the genus Viguiera Kunth, recently transferred to the genus Aldama La Llave (Asteraceae, Heliantheae), still show problems of taxonomic boundaries. This genus has 35 species distributed throughout the Brazilian territory, mostly in the cerrado. Chemical analyses has demonstrated its potential to help in the solution of problems at various taxonomic levels based on chemical groups of secondary metabolites. Furthermore, phytochemical analyses have shown that certain compounds from Aldama have the potential to be studied aiming to investigate anti-inflammatory molecular mechanisms. Thus, in this work it was proposed to carry out the untargeted metabolomic approach aided by chemometrics, aiming to provide chemical data either for chemotaxonomic contributions and to find bioactive compounds. Through this approach, both unsupervised (PCA and HCA) and supervised multivariate analysis (OPLS-DA) combined with data from UHPLC-DAD-Orbitrap analyses showed that the genus Aldama is \"chemoconsistent\" and thus certain discriminant compounds were suggested. Additionally, some species with taxonomic problems had their infrageneric positioning explained from the chemotaxonomic point of view of. With regards to the analyses carried out to find bioactive compounds (targeted phytochemistry), the inflammatory targets investigated in this study were the COX-1 and LOX-5 pro-inflammatory enzymes with which in vitro assays were made and positive activity of extracts from species of Aldama was observed. A. trichophylla was the selected species for the targeted phytochemistry because it showed dual inhibition activity against both enzymes and it is still little investigated from the chemical point of view. The best models for inhibition of COX-1 and 5-LOX obtained with chemical data of Aldama were selected by means of various combinations of algorithms, processing software (MZmine, MetAlign and MSClust) and hyphenated techniques, such as HPLC-TOF and UHPLC-Orbitrap. Thus, certain peak ions were appointed by chemometrics as discriminant for the dual inhibition activity. These peaks were dereplicated based on their UV profiles and fragmentation patterns via HCD-Orbitrap and Ion-Trap. Thus, it was possible to dereplicate three probable chemical inhibitors of COX-1 and 5-LOX: kaempferol-3-O-glucuronide, quercetin-3-O-methyl-7-glucuronide and kaempferol-3-O-(6\"-malonyl-glucoside). Finally, the targeted phytochemistry was carried out. The chromatographic fractionation allowed us to isolate these three compounds and a preliminary 1H NMR analysis was performed in order to conclude their structural identification. In the near future, these substances will have their activity evaluated by the inhibition of the two enzymes.
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Migração interna para São Paulo: relações com dieta e risco cardiovascular / Internal migration to São Paulo: relationships with diet and cardiovascular risk

Carioca, Antonio Augusto Ferreira 13 September 2017 (has links)
Introdução: Estudos observacionais têm contribuído para consolidar a ideia de que os imigrantes geralmente apresentam taxas de morbidade e mortalidade diferentes dos nativos. Estudos com imigrantes podem melhorar a compreensão da influência ambiental no risco de doenças crônicas. A maioria dos estudos têm sido centrado sobre os efeitos da migração internacional, uma vez que os fatores de risco tendem a ser mais uniformemente distribuídos dentro de um único país. No entanto, o Brasil se destaca por possuir extenso território, com regiões com marcadas diferenças geográficas, sociais e culturais. Em países com dimensões continentais (p.ex. Índia e China), a migração interna foi associada com modificações na dieta e status de saúde. Objetivos: Avaliar diferenças no padrão alimentar e risco cardiometabólico entre migrantes internos e nativos e avaliar a associação entre metabolômica plasmática e síndrome metabólica. Métodos: Trata-se de um estudo transversal de base populacional no município de São Paulo. Considerou-se migrantes internos, indivíduos que não nasceram na cidade de São Paulo e que apresentassem tempo de residência no município igual ou superior a dez anos. A população final (n=999) foi dividida em três grupos: nativos (n=354), migrantes do Sudeste (n=349) e do Nordeste (n=296). Para diagnóstico de síndrome metabólica foi utilizado critério harmonizado pelo International Diabetes Federation. Os padrões da dieta foram obtidos por análise fatorial por componentes principais. A quantificação absoluta (?mol/L) de metabólitos no sangue foi realizada por espectrometria de massa no plasma. As análises foram realizadas por meio de modelos lineares generalizados ajustados por fatores de confusão. Resultados: Em comparação aos nativos, os migrantes do Sudeste tiveram adesão inversamente proporcional ao padrão moderno e os migrantes do Nordeste tiveram associação inversa com o padrão prudente e moderno e positiva com o tradicional. Migrantes do Nordeste com mais de 60 anos tiveram maior chance de apresentar síndrome metabólica em comparação com nascidos em São Paulo da mesma faixa etária. Os perfis metabolômicos plasmáticos foram associados com a síndrome metabólica, destacando alguns aminoácidos e classes lipídicas. Conclusão: Nativos e migrantes internos do Brasil apresentam consumo, padrão alimentar e fatores de risco cardiovascular distintos e a metabolômica identificou modificações metabólicas em decorrência da síndrome metabólica. / Introduction: Observational studies have helped consolidate the notion that immigrants generally exhibit different morbidity and mortality rates to those of natives. Studies involving immigrants can broaden understanding of the environmental influence on risk of chronic diseases. The majority of studies have focused on the effects of international migration, considering that risk factors tend to be uniformly distributed within a country. However, Brazil differs for its large territory comprising regions with marked geographic, social and cultural disparities. In countries of continental size (e.g. India and China), internal migration has been associated with changes in diet and health status. Objectives: To assess differences in dietary patterns and cardiometabolic risk among internal migrants and natives, and also to assess the association between plasma metabolomics and metabolic syndrome. Methods: A cross-sectional, population-based study was conducted in the city of São Paulo. The study involved internal migrants, defined as individuals born outside São Paulo city who had lived in the city for ten years or longer. The final population (n=999) was divided into three groups: natives of São Paulo (n=354), migrants from the Southeast (n=349) and from the Northeast (n=296). The harmonized criteria of the International Diabetes Federation were employed for metabolic syndrome diagnosis. Dietary patterns were derived by factor and principal component analysis. Absolute quantification (?mol/L) of blood metabolites was performed by mass spectrometry in plasma. Analyses were carried out based on generalized linear models adjusted for confounding factors. Results: Compared to locals, migrants from the Southeast had an inversely proportional adherence to the modern pattern whereas migrants from the Northeast had an inverse association with the prudent and modern patterns and a positive association with the traditional pattern. Northeastern migrants older than 60 years had greater odds of having the metabolic syndrome compared to São Paulo-born individuals of the same age. The plasma metabolomic profiles were associated with the metabolic syndrome, particularly for some aminoacids and lipid classes. Conclusion: São Paulo natives and internal migrants in Brazil have different consumption, dietary patterns and cardiovascular risk. Metabolomics detected metabolic changes secondary to metabolic syndrome.
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Investigação do refluxo vésico-ureteral por abordagens metabolômicas alvo e global em urina utilizando como plataformas analíticas CE-MS, CESI-MS, RPLC-MS e HILIC-MS / Investigation of vesicoureteral reflux by target and untargeted metabolomic approaches in urine using CE-MS, CESI-MS, RPLC-MS and HILIC-MS as analytical platforms

Karina Trevisan Rodrigues 14 September 2017 (has links)
O refluxo vésico-ureteral (RVU) é uma das condições urológicas comumente diagnosticada entre crianças. Altos graus dessa condição podem causar cicatrização renal, insuficiência renal e hipertensão arterial. A uretrocistografia miccional é o método mais comumente utilizado para o diagnóstico, no entanto, esse procedimento envolve sedação, cateterismo vesical e expõe a criança a uma quantidade significativa de radiação. A investigação metabolômica pode fornecer novos entendimentos sobre a doença e visa a descoberta de metabólitos específicos associados a ela. Assim, existe um potencial considerável para a implementação de perfil metabólico em análises clínicas. Dessa forma, buscou-se estabelecer uma alternativa não invasiva para identificar crianças com o RVU através da metabolômica. Para a investigação metabolômica alvo um método por eletroforese capilar acoplada ao espectrômetro de massas (CE-MS) com analisador to tipo ion trap foi desenvolvido e validado para a determinação de 27 aminoácidos em urina. Os parâmetros experimentais relacionados às configurações da interface CE-MS, eletrólito (BGE) e espectrômetro de de massas (MS) foram otimizados, proporcionando uma boa separação dos 27 aminoácidos, incluindo os isômeros L-leucina, L-isoleucina e L-alloisoleucina, em menos de 30 min. O líquido auxiliar (SHL) foi composto de 0,5% (v/v) ácido fórmico em 60% (v/v) água/metanol à uma vazão de 5 &#181;L min-1. O BGE consistiu de 0,80 mol L-1 de ácido fórmico e 15% (v/v) de metanol. Um procedimento de stacking por pH foi implementado para aumentar a detectabilidade (uma solução de NH4OH a 12,5% (v/v) foi injetada a 0,5 psi/9 s antes das amostras). O método foi validado de acordo com os protocolos FDA e ICH, exibindo parâmetros aceitáveis. A quantificação bem sucedida dos aminoácidos em amostras de urina de um estudo piloto do RVU foi alcançada. A avaliação estatística dos resultados mostrou que alguns dos aminoácidos avaliados podem carregar informações que possibilitam discriminar as amostras de urina entre os grupos teste e controle. Para a análise metabolômica global urinária, métodos por RPLC-MS e HILIC-MS foram otimizados. Cinco colunas com diferentes propriedades foram investigadas para RPLC e quatro colunas para HILIC; adicionalmente, foram investigados a influência dos aditivos e pH da fase móvel. As condições ótimas foram determinadas avaliando o formato de pico, a relação sinal-ruído, o tempo de retenção, o número de molecular features detectados e sua distribuição durante o gradiente de eluição. A melhor condição obtida para RPLC utiliza a coluna CSH C18 e fase móvel composta por 0,1% (v/v) ácido fórmico em água (A) e 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila (B). Para HILIC, o melhor desempenho foi obtido com a coluna zwitteriônica ZIC-HILIC e fase móvel composta por 10 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (B) e 95% (v/v) acetonitrila e 5% 200 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (A). As amostras de urina dos grupos controle e teste foram submetidas à análise metabolômica global por RPLC-MS usando o método otimizado e por CESI-MS. Os resultados indicaram que diversas rotas metabólicas podem ter sido alteradas pelo RVU. Alteração dos níveis de carnitinas e acilcarnitinas, aminoácidos e derivados, purinas e outros foi observada. Ainda, a presença de acilcarnitinas na urina podem indicar danos mitocondriais e a diminuição de triptofano e aumento do ácido quinurênico indicam uma alteração no metabolismo do triptofano. / Vesicoureteral reflux (VUR) is one of the most commonly urologic conditions diagnosed among children. A high degree of this condition can cause kidney scarring, kidney failure and high blood pressure. Voiding cystourethrography is the standard method for diagnosis; however, this procedure involves sedation, bladder catheterization and exposes the child to a significant amount of radiation. Metabolomics has provided new insights about the disease and aims to discover specific metabolites associated with it. Thus, there is a considerable potential for the implementation of metabolic profile in clinical analyses. Thus, we attempted to establish a noninvasive alternative to identify children with VUR through metabolomics approach. For target metabolomics, a CE-MS method was developed and validated for the separation and quantitative analysis of 27 amino acids in urine. Experimental parameters related to the CE-MS interface (based on co-axial sheath liquid, SHL), background electrolyte (BGE) and mass spectrometer (MS) settings were optimized providing a good separation of 27 amino acids, including the isomers L-leucine, L-isoleucine and L-alloisoleucine, in less than 30 min. The SHL was composed of 0.50% (v/v) formic acid in 60% (v/v) methanol-water delivered at a flow rate of 5 &#181;L min-1. The BGE consisted of 0.80 mol L-1 formic acid and 15% (v/v) methanol. A pH stacking procedure was implemented to enhance sensitivity (a 12.5% (v/v) NH4OH solution was injected at 0.5 psi/9 s prior to samples). The proposed method was thoroughly validated according to FDA and ICH protocols exhibiting acceptable parameters. A successful quantification of amino acids in urine samples from the VUR cohort was achieved. The statistical evaluation of the results showed that some of the amino acids may carry information for the discrimination of the urine samples between the test and control groups. For untargeted metabolomics analysis, methods by RPLC-MS and HILIC-MS were optimized. Five columns with different properties were investigated for RPLC and four columns for HILIC; additionally, the influence of additives and pH of the mobile phase were investigated. The optimum conditions were determined assessing the peak shape, signal-to-noise ratio, retention time, number of molecular features detected and their distribution during the elution gradient. The best condition obtained for RPLC uses CSH C18 column and mobile phase composed by 0.1% (v/v) formic acid in water (A) and 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile (B). For HILIC, the best performance was obtained with the zwitterionic ZIC-HILIC column and mobile phase composed by 10 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (B) and 95% (v/v) acetonitrile and 5% (v/v) 200 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (A). Urine samples from the control and test groups were submitted to global metabolomics analysis by RPLC-MS using the optimized method and by CESI-MS. The results indicated that several metabolic pathways may have been altered by VUR. Changes of carnitine and acylcarnitine levels, amino acids and derivatives, purines and others was observed. Furthermore, the presence of acylcarnitines in the urine may indicate mitochondrial damage and the decrease of tryptophan and increase of the kynurenic acid indicate a change in the metabolism of tryptophan.
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Análise metabolômica da bioatividade em vias COX e LOX-dependentes de plantas da subtribo Lychnophorinae / Metabolomic analysis of the bioactivity in COX and LOX pathways-dependent of plants from subtribe Lychnophorinae

Godinho, Camila Capel 29 July 2016 (has links)
Muitas substâncias das espécies de Lychnophorinae (Asteraceae) são relatadas como inibidoras da síntese de mediadores da cascata do processo inflamatório. Nesse processo, duas enzimas são essenciais e atuam no metabolismo do ácido araquidônico, formado em processos inflamatórios: ciclooxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX). A análise de impressões digitais metabólicas é um método capaz de fornecer informações sobre o objeto de estudo através da utilização de ferramentas estatísticas, além de possibilitar a correlação desses dados com outros utilizando métodos in silico. O objetivo deste estudo foi analisar 26 espécies da subtribo Lychnophorinae quanto à atividade inibitória in vitro das vias COX- e LOX-dependentes e identificar as substâncias responsáveis por essa atividade através de análises in silico de correlação entre bioatividade e impressão digital metabólica. As impressões digitais metabólicas dos extratos hidrometanólicos das espécies de Lychnophorinae foram obtidas utilizando UHPLC-UV-(DAD)-MS (OrbitrapTM). Os ensaios de triagem de inibição das vias COX-1 e 5-LOX-dependentes revelaram que 20 espécies possuem atividade inibitória dupla para ambas as vias com valores de IC50 menores que 100 ?g.mL-1. Dentre essas, 11 espécies apresentaram valores de IC50 menores que 40 ?g.mL-1, e cinco apresentaram valores de IC50 menores que 10 ?g.mL-1. Utilizando-se as impressões digitais metabólicas e os resultados de inibição enzimática foram realizadas análises estatísticas multivariadas supervisionadas e não supervisionadas (PCA, PLS e OPLS) visando à identificação de substâncias discriminantes (ativas). Através das análises de correlação, obtiveram-se as prováveis substâncias que detém o potencial inibitório. As cinco substâncias com maior potencial discriminante foram identificadas por técnicas de desreplicação e são: a lactona sesquiterpênica (4,5-diidro-15-desoxigoyazensolido), dois flavonóides glicosilados (3-O-(acetil-hexosídeo)-quercetina e 7-O-(cumaroil-hexosídeo)-apigenina), e um hidroxinerolidol. Assim, este estudo revelou o ótimo potencial inibidor das enzimas COX-1 e 5-LOX dos extratos hidrometanólicos das espécies de Lychnophorinae. Além disso, indicou as substâncias mais discriminantes responsáveis por essa atividade, sendo as substâncias acima mencionadas as propostas como as principais responsáveis pela atividade inibidora das enzimas COX e LOX / Several compounds from Lychnophorinae species (Asteraceae) are reported as inhibitors of cascade mediators that elicits the inflammatory process. During this process, two enzymes are essential in the metabolism of the arachidonic acid: cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX). The analysis of metabolic fingerprinting is a method that provides information about the object of study by using statistical tools, and enables the correlation of these data with others using in silico methods. This work therefore aimed to analyze 26 species of the Lychnophorinae subtribe for in vitro inhibition of COX-1 and 5-LOX and (to) identify the bioactive compounds responsible for this activity by in silico correlation analysis between bioactivity and metabolic fingerprint. The metabolomic analysis was carried out using UHPLC-DAD-ESI-Orbitrap and a metabolic fingerprint for each extract was obtained. The in vitro inhibition screening assays of COX-1 and 5-LOX revealed that 20 extracts presented dual inhibitory activity on both enzymes with IC50 values lower than 100 ?g.mL-1. Among them, 11 species showed IC50 values lower than 40 ?g.mL-1 and five lower than 10 ?g.mL-1. In order to identify discriminant substances (active), supervised and non-supervised multivariate statistical analysis (PCA, PLS e OPLS) were performed using the metabolic fingerprints and the results of enzyme inhibition. Through correlation analysis, it was possible to locate the substances most likely to be responsible for the pharmacological activity in both enzymes simultaneously; among them, five were chosen as the most likely. The substances were identified by dereplication as: a sesquiterpene lactone (4,5-dihydro-15-desoxygoyazensolide), two flavonoids (3-O-(acetil-hexoside)-quercetin and 7-O-(cumaroil-hexoside)-apigenine), and a hidroxynerolidol. In summary, in this work it was possible to reveal crude extracts with outstanding inhibitory potential of both, COX-1 and 5-LOX, enzymes as well as to propose the most probable compounds responsible for this action, and the compounds mentioned above were proposed as the main responsible for the inhibitory activity.
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Estudos metabolômicos da subfamília Barnadesioideae (Asteraceae) / Metabolomics studies of the subfamily Barnadesioideae (Asteraceae)

Ccapatinta, Gari Vidal Ccana 12 June 2018 (has links)
A metabolômica vem se tornando uma abordagem eficaz para a avaliação abrangente de plantas medicinais, classificação de matérias-primas, além de estudos quimiotaxonômicos. Este trabalho demonstra a aplicabilidade da metabolômica, utilizando a subfamília Barnadesioideae (Asteraceae) como modelo de estudo, na avaliação da qualidade e classificação de espécies medicinais (espécies de Chuquiraga) e no estudo quimiotaxonômico dos principais gêneros de Barnadesioideae (Arnaldoa, Barnadesia, Chuquiraga, Dasyphyllum, Fulcaldea e Schlechtendalia). Em primeiro lugar, a análise dos perfis metabólicos por LC-MS dos membros de Barnadesioideae demonstrou que esta subfamília constitui um grupo quimicamente não explorado com uma diversidade complexa de substancias fenólicas, fenilpropanoides, alquilglicósidos e glicosídeos triterpenoides. As relações intergenéricas dentro da subfamília Barnadesioideae, baseadas na comparação dos seus perfis metabólicos por análises estatísticas multivariadas, mostraram semelhanças com as relações intergenéricas propostas pelo mais recente estudo filogenético com base em marcadores morfológicos e moleculares. Em segundo lugar, a aquisição dos perfis metabólicos de espécies de Chuquiraga (C. jussieui, C. spinosa e C. weberbaueri) por analises de LC-MS, levaram à identificação de uma variedade significativa de compostos fenólicos, fenilpropanoides, alquilglicosídeos e glicosídeos triterpenoides, assim como o estabelecimento de modelos de classificação geográfica e de espécies, além da identificação de metabólitos discriminantes por meio de análises estatísticas multivariadas exploratórias e supervisionadas. Terceiro, uma abordagem clássica foi realizada através da aquisição dos perfis cromatográficos por HPLC de espécies de Chuquiraga para o perfilhamento de compostos fenólicos e a classificação das espécies por meio de análises estatísticas multivariadas exploratórias e supervisionadas. Logo, os resultados revelam a metabolômica como uma valiosa ferramenta auxiliar no controle de qualidade e classificação de plantas medicinais, bem como em estudos de quimiotaxonômia / Metabolomics is emerging as an effective approach for the comprehensive evaluation of medicinal plants, classification of raw material, as well as chemotaxonomic studies. This work demonstrates the applicability of metabolomics, using the subfamily Barnadesioideae (Asteraceae) as a study model, for quality assessment and classification purposes of medicinal species (Chuquiraga genus) and a chemotaxonomy study of six Barnadesioideae genera (Arnaldoa, Barnadesia, Chuquiraga, Dasyphyllum, Fulcaldea and Schlechtendalia). First, the LC-MS metabolic profiles of Barnadesioideae demonstrated that this subfamily constitutes a chemically underinvestigated taxa with a complex diversity of phenolic compounds, phenylpropanoid derivatives, alkyl glycosides, and triterpenoid glycosides. The intergeneric relationships within Barnadesioideae genera, based on the comparison of their LC-MS metabolic profiles by exploratory and supervised analyses, displayed similarities to those of the intergeneric relationships obtained by the most recent phylogenetic study based on morphological and molecular markers. Second, the LC-MS metabolic profiles of three Chuquiraga species (C. jussieui, C. spinosa and C. weberbaueri) lead to the identification of a significant variety of phenolic compounds, phenylpropanoid derivatives, alkyl glycosides, and triterpenoid glycosides, as well as the establishment of prediction models for geographical origin and species classification, as well as the identification of discriminating metabolites by exploratory and supervised multivariate statistical analysis. Third, a classical approach was carried out by acquiring HPLC chromatographic profiles of three Chuquiraga species (C. jussieui, C. spinosa and C. weberbaueri) for profiling phenolic compounds and comparison by exploratory and supervised multivariate statistical analysis. Therefore, our results support metabolomics as a valuable tool in the quality control and classification of medicinal plants as well as in chemotaxonomy studies.
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Bioinformática aplicada à biologia sistêmica para a identificação dos fatores regulatórios do acúmulo de sacarose no colmo da cana-de-açúcar / Bioinformatics applied to systems biology for regulatory factors identification of the sucrose accumulation in sugarcane stalk

Moraes, Fabricio Edgar de 15 July 2016 (has links)
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma das principais gramíneas cultivadas do mundo e o Brasil é seu maior produtor, ela se tornou uma importante cultura devido às altas taxas de assimilação de carbono permitindo a síntese e acumulação de grandes quantidades de sacarose em seus entrenós. Com isso, faz-se necessário uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o acúmulo de sacarose nesta planta. Tais mecanismos têm sido estudados em vários níveis, tais como, identificação e localização de genes, identificação de lócus controladores de características quantitativas, transcriptoma, proteôma, caracterização e identificação de metabólitos. Com todos esses estudos é evidente a necessidade de uma abordagem holística para o entendimento global da planta durante o acúmulo de sacarose. Assim este trabalho teve por objetivo integrar dados de metabolômica e proteômica de tecidos da cana-de-açúcar da variedade SP80-3280 durante o desenvolvimento e o acúmulo de sacarose, utilizando a bioinformática para unir esses resultados por meio da análise de correlação canônica regularizada em uma abordagem de biologia sistêmica. Os resultados obtidos indicam diferenças no perfil metabólico e proteico da cana-açúcar durante o desenvolvimento e acúmulo de sacarose. Foram propostas classes de metabólitos que podem estar relacionados com o acúmulo de sacarose na cana-de-açúcar tais como glicerolipídeos, glicerofosfolipídeos, cumarinas e derivados, esteroides e derivados de esteroides e acil graxos. Também foram propostas proteínas que podem estar relacionadas com o acúmulo de sacarose, onde as histonas foram as que mais se destacaram. Nas redes biológicas de correlações também foram observadas correlações entre possíveis metabólitos e proteínas que podem estar correlacionadas com o acúmulo de sacarose na cana-de-açúcar / Sugarcane (Saccharum spp.) is one of the most important cultivated grasses of the world and Brazil is the largest producer, it has become an important crop due to high carbon assimilation rates allowing the synthesis and accumulation of large amounts of sucrose in their internodes. Thus, it is necessary a high understanding of the molecular mechanisms involved in the regulation of sucrose accumulation in this plant. These mechanisms have been studied at various levels, such as gene identification and localization, identification of quantitative trait locus controlling, transcriptome, proteome, characterization and metabolites identification. With all these studies is evident the necessity for a holistic approach to global understanding of the plant during the sucrose accumulation. Thus, this work aims to integrate metabolomics and proteomics data from tissues of sugarcane variety SP80-3280, during plant development and sucrose accumulation, using bioinformatics to link these results by regularized canonical correlation analysis in a systems biology approach. The results indicate differences in the metabolic and protein profile of sugarcane during development and sucrose accumulation. Metabolites classes have been proposed that may be related to sugarcane sucrose accumulation as glycerolipids, glycerophospholipids, coumarins and derivatives, steroids and steroid derivatives and fatty acyl. In addition, some proteins have been proposed that may be related to sucrose accumulation, where the most highlighted were the histones. In the biological correlations networks, have been also observed correlations between possible metabolites and proteins that can be correlated with the accumulation of sucrose in sugarcane
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Avaliação do metabolismo primário da região cambial e casca de Eucalyptus grandis / Evaluation of the primary metabolism of Eucalyptus grandis cambial region and bark

Budzinski, Ilara Gabriela Frasson 29 November 2012 (has links)
O gênero Eucalyptus é uma das principais espécies arbóreas comercialmente plantadas em todo o mundo. Apresenta inúmeras características favoráveis para a produção e comercialização de sua madeira, tais como o rápido crescimento, rotação de ciclo curto e produção de biomassa renovável, com potencial para geração de biocombustível. Apesar de sua grande importância econômica, pouco é conhecido sobre os processos moleculares que envolvem a formação da madeira e casca, principalmente no que diz respeito ao metabolismo primário. Ademais, não se têm muitas informações sobre mudanças moleculares que ocorrem durante a formação desses tecidos em resposta a variações sazonais. Sabe-se que a região cambial das árvores apresenta maior atividade metabólica durante o verão, quando comparada ao inverno. Deste modo, visando compreender mudanças dinâmicas ao nível transcricional, protéico e metabólico, principalmente em relação ao metabolismo primário, o presente trabalho teve por objetivo comparar os tecidos da região cambial e casca, coletados em diferentes períodos climáticos (verão e inverno). A expressão do padrão transcricional foi analisada por PCR em tempo real, seguido de normalização e análise estatística, usando os programas NormFinder e Rest, respectivamente. O perfil protéico foi obtido por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), seguido de análise por espectrometria de massas associada a cromatografia líquida (LC-MS/MS) e posterior identificação das proteínas pelo programa Mascot Daemon. Já o perfil metabólico foi obtido por espectrometria de massas associada à cromatografia gasosa (GC/MS), com posterior análise dos picos identificados pelo programa MatLab. Em seguida, as análises estatísticas foram geradas pelo programa SIMCA P+ e \"R\". Para os transcritos, foi possível observar tanto para a região cambial quanto para a casca padrão diferencial na expressão dos genes analisados, principalmente aqueles atuantes na glicólise, durante os dois períodos sazonais. Quanto ao perfil protéico, foram identificadas um total de 77 e 75 proteínas estatisticamente significativas na região cambial e casca, respectivamente. Proteínas pertencentes ao metabolismo primário foram identificadas em ambos os tecidos. Metabólitos relacionados ao metabolismo de açúcares também foram encontrados. / Eucalyptus genus is the most widely planted hardwood crop in the world because of its superior growth, broad adaptability and multipurpose wood properties. In today\'s \"new carbon economy\", eucalypts are receiving attention as fast-growing, short-rotation, renewable biomass crop for energy production. In spite of its economical importance, little information is available about the molecular changes that occur in primary metabolism in the wood and bark forming tissues. Furthermore, there is less information about molecular changes that occur during wood and bark formation in response to seasonal variation. It\'s known that Eucalyptus cambial region presents higher metabolic activity in summer than in winter. Thus, in order to observe the dynamic changes in transcript, protein and metabolite levels, mainly related to primary metabolism, we compared cambial tissue and bark collected in two different seasons (summer high temp + high rainfall) and winter (lower temp and little rainfall). Transcript expression patterns were analyzed by Real-Time PCR, normalization chosen by NormFinder and statistical analysis carried out using REST. The protein profile was obtained by bidimensional electrophoresis (2D-PAGE) followed by liquid chromatography associated with mass spectrometry (LC-MS/MS) and analyzed by Mascot Daemon. Metabolite profile was obtained by GC-TOF/MS, peaks were analyzed in MatLab and statistical analyses were done using SIMCA and \"R\". The results obtained with transcripts indicate differential gene expression in the cambial region and bark during summer and winter. A total of 77 and 75 proteins in cambium and bark, respectively, presented statistically significant alterations and were identified and classified into functional categories. We identified many proteins from primary metabolism. Metabolites from carbohydrate metabolism were also identified.

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