Trypanosoma cruzi é capaz de incorporar histidina, um aminoácido essencial, através de um sistema de transporte saturável, de alta especificidade e dependente de ATP. Uma vez no citoplasma, a histidina amônio-liase (TcHAL), catalisa a deaminação não oxidativa da His a urocanato, quem é convertido pela urocanato hidratase (TcUH) ao intermediário 4-imidazolona-5-propionato. Posteriormente, duas enzimas (imidazolona propionase e formiminoglutamase) atúam para gerar glutamato. TcHAL e TcUH foram caracterizadas cinetica e bioquímicamente. O α-cetoglutarato, produto da deaminação do Glu gerado na degradação de His, ingressa ao ciclo de Krebs e os electrons gerados são capazes de restabelecer o potencial de membrana mitocondrial, promover a síntese de ATP e consumo de oxigênio na mitocôndria. Além disso, His é capaz de estimular a metaciclogênese: estudos metabolômicos mostraram que His é utilizada como fonte energética principalmente no inicio da diferenciação. Nossos dados mostram a relevância da His na bioenergética de T. cruzi, nos estágios presentes no inseto vetor. / Trypanosoma cruzi incorporates histidine, an essential amino acid, through a saturable, highly specific and ATP dependent transport system. Once in the cytoplasm, a histidine ammonia-lyase (TcHAL) catalyzes the non-oxidative deamination of His to urocanate, which is converted by an urocanate hydratase (TcUH) to the intermediate 4-imidazolone-5-propionate. Afterwards, two enzymes (imidazolonepropionase and fomiminoglutamase) complete the glutamate formation. Kinetic and biochemical parameters of TcHAL and TcUH were determined. We observe that His degradation can feed Krebs cycle, and the electrons produced are able to restore the mitochondrial inner membrane potential, promote ATP biosynthesis and oxygen consumption at the mitochondrion. Furthermore, His was able to stimulate metacyclogenesis: a metabolomics approach shows that His is used as an energy source, mainly, in early stages of differentiation. Our data shows the relevance of His in T. cruzi bioenergetics, mainly in insect vector stages.

Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2016-03-29T14:36:11Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5620328 bytes, checksum: cc12fb802b3be6b2f1e66e8519ace0cf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T14:36:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5620328 bytes, checksum: cc12fb802b3be6b2f1e66e8519ace0cf (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / The species Peperomia obtusifolia (L.) A. Dietr, which belongs to the Piperaceae family, is a well-known plant, distributed from Mexico to South America. Previous phytochemical studies demonstrated the presence of compounds from several classes, such as: lignans, flavonoids, amides, phenolic compounds and chromenes, which demonstrated interesting biological activities. This work describes the metabolomic analysis of Peperomia obtusifolia, which study in real time, the metabolism of this species in many kinds of scenarios. However, to accomplish this study, firstly it was developed a standard protocol, capable of preparing the samples in a reproducible way, enabling the following metabolomic studies to generate reliable results. Later, it was conducted the metabolomic study of Peperomia obtusifolia and its varieties, by fingerprinting analysis, in order to characterize the metabolomic profiles of each one of them. Furthermore, it was also evaluated the behavior of the species against the stress induced by the herbivory of Monoplatus sp. In general, the analyzes were conducted by NMR of 1H (which the data was interpreted by PCA), mass spectrometry, HPLC, GC and its hyphenated techniques. As a result, it was found that, despite the fact that the Peperomia obtusifolia varieties belong to the same species, they had different metabolomes. Regarding the study of the biotic stress against the plant, changes were detected on the metabolomic profile of the attacked plants, indicating a response against the herbivore attack. As a major result of this research, it can be highlighted the fact that the same changes were also detected on the metabolome of the intact plants closed to the attacked ones, indicating a sort of interplant communication by volatile compounds, capable to induce the neighborhood yet not attacked, to be prepared for an imminent attack, giving them a better chance of survival. / A espécie Peperomia obtusifolia (L.) A. Dietr, pertencente à família Piperaceae, é uma planta amplamente conhecida, cuja ocorrência vai desde o México até a América do Sul. Estudos fitoquímicos anteriores revelaram a presença de compostos de diversas classes, como: lignanas, flavonoides, amidas, compostos fenólicos e cromenos, os quais demonstraram atividade biológica bastante promissora. Este trabalho aborda a análise metabolômica de Peperomia obtusifolia, que visa estudar em tempo real o metabolismo desta espécie em diversos tipos de cenários. Entretanto, para que este estudo fosse realizado, primeiramente foi desenvolvido um protocolo padrão, capaz de preparar amostras de maneira reprodutível, possibilitando assim uma análise metabolômica que gerasse resultados fidedignos. Posteriormente foi realizado o estudo metabolômico de Peperomia obtusifolia e suas variedades, por análise de fingerprinting, que visa caracterizar os perfis metabólicos de cada organismo. Além disso, também foi avaliado o metaboloma da espécie frente ao estresse biótico provocado pela herbivoria do besouro Monoplatus sp. As análises das amostras foram realizadas por meio de RMN de 1H (cujos dados foram interpretados por PCA), espectrometria de massas, CLAE, CG e técnicas hifenadas. Como resultado, descobriu-se que apesar das variedades de Peperomia obtusifolia pertencerem à mesma espécie, elas possuíam metabolomas diferentes. Já em relação ao estudo de estresse biótico aplicado à planta, foram detectadas nas plantas predadas, alterações nos perfis metabolômicos, configurando-se uma resposta contra o ataque provocado. Considera-se um resultado de maior importância, o fato de que plantas intactas que estavam próximas às predadas, responderam ao ataque de maneira semelhante, indicando assim, uma comunicação inter-plantas por meio de compostos voláteis, capaz de induzir a vizinhança ainda não atacada a se preparar para reagir ao ataque, possibilitando assim, maior chance de sobrevivência.

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-04-06T17:53:33Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jorge Candido Rodrigues Neto - 2017.pdf: 4621226 bytes, checksum: 93409e3a28aced62d8c3f5dab02c58a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-04-07T11:07:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jorge Candido Rodrigues Neto - 2017.pdf: 4621226 bytes, checksum: 93409e3a28aced62d8c3f5dab02c58a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-07T11:07:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jorge Candido Rodrigues Neto - 2017.pdf: 4621226 bytes, checksum: 93409e3a28aced62d8c3f5dab02c58a7 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Oil palm (Elaeis guineensis) is the world’s major source of vegetable oil and it has been able to adapt to the Brazilian subtropical area. Its growth, largely done in Para, is affected by Fatal Yellowing (FY), a condition that can cause plant’s death and has unknown cause. The aim for this master’s project was to prospect and identify, using a metabolomics approach, possible biomarkers of FY. To accomplish this study, for the first time different transport and extraction methods were evaluated in order to verify the metabolic profile stability in this species. Significant differences were noted and described using a metabolic fingerprinting approach, with ultra high precision liquid chromatography – mass spectrometry (UHPLC-MS) as the chemical analysis and ANOVA simultaneous component analysis (ASCA) as the multivariate statistic tool. After this study, leaves with and without FY symptoms were transported using the previously optimizes protocol, analyzed and five potential biomarkers were identified and related to their metabolic pathways, using PCA as the chemometric tool. Finally, for the first time, the use of advanced analytical techniques as MALDI imaging, which has been highlighted as a powerful tool for identification of chemical compounds present on tissue surface with spatial localization, has been applied to oil palm leaves in order to perform a metabolic screening and search for the previously identified biomarkers. An analytical protocol was established for analysis with and without matrix application, for a wide range mass coverage and one of the possible biomarkers was detected using the matrix-free approach. / O dendê, fruto do dendezeiro (Elaeis guineensis) é a maior fonte de óleo vegetal do mundo e teve boa adaptação ao clima subtropical brasileiro. Seu cultivo no Brasil, que tem maior extensão no Pará, é afetado pelo Amarelecimento Fatal (AF), uma condição que pode provocar a morte da planta e tem causa desconhecida. O objetivo deste projeto de mestrado foi prospectar e identificar marcadores químicos relacionados ao AF utilizando uma abordagem metabolômica. Para que o estudo dessa causa fosse realizado, pela primeira vez foram avaliados diferentes métodos de transporte e extração de folhas para verificar a estabilidade do perfil metabólico desta espécie. Diferenças significativas foram observadas utilizando a estratégia de metabolic fingerprinting, com análise dos metabólitos por cromatografia de ultra alta eficiência – espectrometria de massas (UHPLC-MS) e análise quimiométrica dos dados por análise de componente simultâneo e análise de variância (ASCA). Após este estudo, folhas com e sem sintomas de AF foram transportadas utilizando protocolo otimizado anteriormente, analisadas e cinco potenciais biomarcadores foram identificados e relacionados as suas respectivas vias metabólicas, utilizando a análise de componentes principais (PCA) como ferramenta quimiométrica. Por fim, fez-se uso da recente e avançada técnica de imagem química em espectrometria de massas, com ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MS Imaging), que vem se destacando como uma poderosa ferramenta para a identificação de compostos químicos presentes na superfície de um tecido com localização espacial e foi utilizada pela primeira vez em um screening de metabólitos em folhas de dendê na busca dos marcadores previamente identificados. Um protocolo analítico foi desenvolvido para análise com aplicação de matriz e sem aplicação de matriz, com o intuito de abranger uma maior faixa de massas e um dos possíveis marcadores foi detectado utilizando a técnica de imagem sem matriz.

Muitas substâncias das espécies de Lychnophorinae (Asteraceae) são relatadas como inibidoras da síntese de mediadores da cascata do processo inflamatório. Nesse processo, duas enzimas são essenciais e atuam no metabolismo do ácido araquidônico, formado em processos inflamatórios: ciclooxigenase (COX) e lipoxigenase (LOX). A análise de impressões digitais metabólicas é um método capaz de fornecer informações sobre o objeto de estudo através da utilização de ferramentas estatísticas, além de possibilitar a correlação desses dados com outros utilizando métodos in silico. O objetivo deste estudo foi analisar 26 espécies da subtribo Lychnophorinae quanto à atividade inibitória in vitro das vias COX- e LOX-dependentes e identificar as substâncias responsáveis por essa atividade através de análises in silico de correlação entre bioatividade e impressão digital metabólica. As impressões digitais metabólicas dos extratos hidrometanólicos das espécies de Lychnophorinae foram obtidas utilizando UHPLC-UV-(DAD)-MS (OrbitrapTM). Os ensaios de triagem de inibição das vias COX-1 e 5-LOX-dependentes revelaram que 20 espécies possuem atividade inibitória dupla para ambas as vias com valores de IC50 menores que 100 ?g.mL-1. Dentre essas, 11 espécies apresentaram valores de IC50 menores que 40 ?g.mL-1, e cinco apresentaram valores de IC50 menores que 10 ?g.mL-1. Utilizando-se as impressões digitais metabólicas e os resultados de inibição enzimática foram realizadas análises estatísticas multivariadas supervisionadas e não supervisionadas (PCA, PLS e OPLS) visando à identificação de substâncias discriminantes (ativas). Através das análises de correlação, obtiveram-se as prováveis substâncias que detém o potencial inibitório. As cinco substâncias com maior potencial discriminante foram identificadas por técnicas de desreplicação e são: a lactona sesquiterpênica (4,5-diidro-15-desoxigoyazensolido), dois flavonóides glicosilados (3-O-(acetil-hexosídeo)-quercetina e 7-O-(cumaroil-hexosídeo)-apigenina), e um hidroxinerolidol. Assim, este estudo revelou o ótimo potencial inibidor das enzimas COX-1 e 5-LOX dos extratos hidrometanólicos das espécies de Lychnophorinae. Além disso, indicou as substâncias mais discriminantes responsáveis por essa atividade, sendo as substâncias acima mencionadas as propostas como as principais responsáveis pela atividade inibidora das enzimas COX e LOX / Several compounds from Lychnophorinae species (Asteraceae) are reported as inhibitors of cascade mediators that elicits the inflammatory process. During this process, two enzymes are essential in the metabolism of the arachidonic acid: cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (LOX). The analysis of metabolic fingerprinting is a method that provides information about the object of study by using statistical tools, and enables the correlation of these data with others using in silico methods. This work therefore aimed to analyze 26 species of the Lychnophorinae subtribe for in vitro inhibition of COX-1 and 5-LOX and (to) identify the bioactive compounds responsible for this activity by in silico correlation analysis between bioactivity and metabolic fingerprint. The metabolomic analysis was carried out using UHPLC-DAD-ESI-Orbitrap and a metabolic fingerprint for each extract was obtained. The in vitro inhibition screening assays of COX-1 and 5-LOX revealed that 20 extracts presented dual inhibitory activity on both enzymes with IC50 values lower than 100 ?g.mL-1. Among them, 11 species showed IC50 values lower than 40 ?g.mL-1 and five lower than 10 ?g.mL-1. In order to identify discriminant substances (active), supervised and non-supervised multivariate statistical analysis (PCA, PLS e OPLS) were performed using the metabolic fingerprints and the results of enzyme inhibition. Through correlation analysis, it was possible to locate the substances most likely to be responsible for the pharmacological activity in both enzymes simultaneously; among them, five were chosen as the most likely. The substances were identified by dereplication as: a sesquiterpene lactone (4,5-dihydro-15-desoxygoyazensolide), two flavonoids (3-O-(acetil-hexoside)-quercetin and 7-O-(cumaroil-hexoside)-apigenine), and a hidroxynerolidol. In summary, in this work it was possible to reveal crude extracts with outstanding inhibitory potential of both, COX-1 and 5-LOX, enzymes as well as to propose the most probable compounds responsible for this action, and the compounds mentioned above were proposed as the main responsible for the inhibitory activity.

O gênero Eucalyptus é uma das principais espécies arbóreas comercialmente plantadas em todo o mundo. Apresenta inúmeras características favoráveis para a produção e comercialização de sua madeira, tais como o rápido crescimento, rotação de ciclo curto e produção de biomassa renovável, com potencial para geração de biocombustível. Apesar de sua grande importância econômica, pouco é conhecido sobre os processos moleculares que envolvem a formação da madeira e casca, principalmente no que diz respeito ao metabolismo primário. Ademais, não se têm muitas informações sobre mudanças moleculares que ocorrem durante a formação desses tecidos em resposta a variações sazonais. Sabe-se que a região cambial das árvores apresenta maior atividade metabólica durante o verão, quando comparada ao inverno. Deste modo, visando compreender mudanças dinâmicas ao nível transcricional, protéico e metabólico, principalmente em relação ao metabolismo primário, o presente trabalho teve por objetivo comparar os tecidos da região cambial e casca, coletados em diferentes períodos climáticos (verão e inverno). A expressão do padrão transcricional foi analisada por PCR em tempo real, seguido de normalização e análise estatística, usando os programas NormFinder e Rest, respectivamente. O perfil protéico foi obtido por eletroforese bidimensional (2D-PAGE), seguido de análise por espectrometria de massas associada a cromatografia líquida (LC-MS/MS) e posterior identificação das proteínas pelo programa Mascot Daemon. Já o perfil metabólico foi obtido por espectrometria de massas associada à cromatografia gasosa (GC/MS), com posterior análise dos picos identificados pelo programa MatLab. Em seguida, as análises estatísticas foram geradas pelo programa SIMCA P+ e \"R\". Para os transcritos, foi possível observar tanto para a região cambial quanto para a casca padrão diferencial na expressão dos genes analisados, principalmente aqueles atuantes na glicólise, durante os dois períodos sazonais. Quanto ao perfil protéico, foram identificadas um total de 77 e 75 proteínas estatisticamente significativas na região cambial e casca, respectivamente. Proteínas pertencentes ao metabolismo primário foram identificadas em ambos os tecidos. Metabólitos relacionados ao metabolismo de açúcares também foram encontrados. / Eucalyptus genus is the most widely planted hardwood crop in the world because of its superior growth, broad adaptability and multipurpose wood properties. In today\'s \"new carbon economy\", eucalypts are receiving attention as fast-growing, short-rotation, renewable biomass crop for energy production. In spite of its economical importance, little information is available about the molecular changes that occur in primary metabolism in the wood and bark forming tissues. Furthermore, there is less information about molecular changes that occur during wood and bark formation in response to seasonal variation. It\'s known that Eucalyptus cambial region presents higher metabolic activity in summer than in winter. Thus, in order to observe the dynamic changes in transcript, protein and metabolite levels, mainly related to primary metabolism, we compared cambial tissue and bark collected in two different seasons (summer high temp + high rainfall) and winter (lower temp and little rainfall). Transcript expression patterns were analyzed by Real-Time PCR, normalization chosen by NormFinder and statistical analysis carried out using REST. The protein profile was obtained by bidimensional electrophoresis (2D-PAGE) followed by liquid chromatography associated with mass spectrometry (LC-MS/MS) and analyzed by Mascot Daemon. Metabolite profile was obtained by GC-TOF/MS, peaks were analyzed in MatLab and statistical analyses were done using SIMCA and \"R\". The results obtained with transcripts indicate differential gene expression in the cambial region and bark during summer and winter. A total of 77 and 75 proteins in cambium and bark, respectively, presented statistically significant alterations and were identified and classified into functional categories. We identified many proteins from primary metabolism. Metabolites from carbohydrate metabolism were also identified.

Orientadores: José Andrés Yunes, Ana Carolina de Mattos Zeri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T13:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Canevarolo_RafaelRenatino_M.pdf: 3376497 bytes, checksum: f3e8edf217e0d57089ffcffbe4a8097a (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O uso intensivo e combinado de diferentes quimioterápicos tem permitido a cura de 70-80% das leucemias linfóides agudas (LLA) da infância, sendo que a recaída da doença decorre em grande parte da resistência intrínseca das células leucêmicas à quimioterapia. Alguns dos quimioterápicos utilizados na LLA são inibidores metabólicos, como o metotrexato (MTX), antagonista do ácido fólico, que impede a divisão celular ao inibir a síntese de nucleotídeos. Em uma abordagem metabolômica, foi investigada a associação entre linhagens leucêmicas resistentes ou sensíveis ao MTX e metabólitos biondicadores de cada um destes fenótipos. Seis linhagens celulares B-derivadas e oito T-derivadas foram classificadas como sendo resistentes ou sensíveis ao MTX pelo método do 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) após 48h de co-cultura com diferentes concentrações da droga. Cinco linhagens foram classificadas como resistentes e nove como sensíveis ao MTX. Após 24h de cultura na presença ou ausência de MTX (ambos em triplicata), os metabólitos intracelulares das linhagens foram acessados por ressonância magnética nuclear (RMN) numa abordagem metabolômica. Ao total, oitenta e quatro metabólitos foram quantificados, dos quais 72 foram também identificados. A análise de componentes principais (PCA) não conseguiu segregar as amostras de acordo com sua resistência, ao passo que a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foi efetiva nesta separação. Os metabólitos mais relevantes para a construção dos modelos de classificação quanto à resistência ao MTX, tanto para amostras tratadas quanto controles foram: ATP, dimetilglicina, fosfocolina e sarcosina (associados à resistência); carnitina, CB-09 (composto não identificado), colato, fumarato, glicocolato, lactato, malato e succinato (associados à sensibilidade ao MTX). A capacidade de classificar corretamente as amostras em sensíveis ou resistentes foi obtida com a construção de curvas da característica operativa do receptor (ROC) para os metabólitos individualmente. Os metabólitos com desempenho bom ou excelente na análise ROC (AUC>0,8) foram selecionados para comporem "testes diagnósticos" de classificação de amostras. De todas as combinações possíveis dentre os metabólitos selecionados, o teste que considerou a combinação de carnitina, sarcosina e succinato em amostras não tratadas com MTX apresentou sensibilidade de 100% (identificou todas as 15 amostras resistentes) e especificidade de 92,3% ao classificar corretamente 24 de 26 amostras sensíveis. O melhor teste diagnóstico para amostras tratadas com MTX considerou as concentrações de CB-MTX, glicocolato, sarcosina e succinato; apresentou sensibilidade de 100% (identificou as 15 amostras resistentes) e especificidade de 85,2%, equivocando-se na classificação de 4 dentre 27 amostras sensíveis. As concentrações metabólicas diferenciais apontaram para uma superativação dos metabolismos energético e de lipídeos em linhagens sensíveis ao MTX, ao passo que linhagens resistentes teriam superativado o metabolismo da glicina. As análises metabolômicas e de integração bioquímica dos metabólitos revelaram interações gênicas, enzimáticas e metabólicas que podem estar alteradas em linhagens sensíveis ou resistentes ao MTX, bem como permitiram a especulação sobre possíveis alvos moleculares que poderiam tornar sensíveis células resistentes ao quimioterápico / Abstract: The intensive use of different and combined chemotherapics has allowed curing 70-80% of pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL), and the relapse of the disease stems largely from the intrinsic resistance of leukemic cells to chemotherapy. Some of the chemotherapics used in ALL are metabolic inhibitors such as methotrexate (MTX), a folic acid antagonist, which prevents cell division by inhibiting the synthesis of nucleotides. The association between leukemic strains resistant or sensitive to MTX and the metabolites associated with each of these phenotypes were investigated. Six B- and eight T-derived cell lines were classified as resistant or sensitive to MTX by the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, after 48h in co-culture with different concentrations of the drug. Five lineages were classified as resistant, and nine as sensitive to MTX. After 24 hours of culture in the presence or absence of MTX (both in triplicates), the intracellular metabolites of the lineages were assessed by nuclear magnetic resonance (NMR), in a metabolomic approach. In total, 84 metabolites were quantified, 72 of which were also identified. The principal component analysis (PCA) did not segregate the samples according to their resistance, whereas the supervised partial least square discriminate analysis (PLS-DA) was effective in this separation. ATP, dimethylglycine, sarcosine and phosphocholine were associated with MTX resistance in both models constructed for treated and untreated samples, whereas carnitine, CB-MTX (unidentified compound), cholate, fumarate, glycocholate, lactate, malate and succinate were associated with sensitivity to MTX. The ability to correctly classify the samples into sensitive or resistant groups was checked with the construction of the receiver operating characteristic (ROC) curves for metabolites individually. Metabolites with good or excellent performance in ROC analysis (AUC> 0.8) were selected to compose "diagnostic tests" for classifying samples. Of all the possible combinations among the selected metabolites, the test composed by the comination of carnitine, sarcosine and succinate in untreated samples exhibited sensitivity of 100% (identified all 15 resistant samples) and specificity of 92.3% in classifying correctly 24 of 26 sensitive samples. The best diagnostic test for samples treated with MTX took into consideration concentrations of CB-MTX, glycocholate, sarcosina, succinato. It had a sensitivity of 100% (identified 15 resistant samples) and specificity of 85.2%, classifying incorrectly 4 out of 27 sensitive samples. Differential metabolic concentrations pointed to an over activation of energy and lipids metabolism in MTX-sensitive strains, whereas resistant strains seemed to have overactive the glycine metabolism. Metabolomic and biochemical integration analysis revealed genetic, enzymatic and metabolic interactions that might be altered in strains sensitive or resistant to MTX, as well as allowed speculations about possible molecular targets on which intervention could make resistant cells susceptible to chemotherapy / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma das principais gramíneas cultivadas do mundo e o Brasil é seu maior produtor, ela se tornou uma importante cultura devido às altas taxas de assimilação de carbono permitindo a síntese e acumulação de grandes quantidades de sacarose em seus entrenós. Com isso, faz-se necessário uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o acúmulo de sacarose nesta planta. Tais mecanismos têm sido estudados em vários níveis, tais como, identificação e localização de genes, identificação de lócus controladores de características quantitativas, transcriptoma, proteôma, caracterização e identificação de metabólitos. Com todos esses estudos é evidente a necessidade de uma abordagem holística para o entendimento global da planta durante o acúmulo de sacarose. Assim este trabalho teve por objetivo integrar dados de metabolômica e proteômica de tecidos da cana-de-açúcar da variedade SP80-3280 durante o desenvolvimento e o acúmulo de sacarose, utilizando a bioinformática para unir esses resultados por meio da análise de correlação canônica regularizada em uma abordagem de biologia sistêmica. Os resultados obtidos indicam diferenças no perfil metabólico e proteico da cana-açúcar durante o desenvolvimento e acúmulo de sacarose. Foram propostas classes de metabólitos que podem estar relacionados com o acúmulo de sacarose na cana-de-açúcar tais como glicerolipídeos, glicerofosfolipídeos, cumarinas e derivados, esteroides e derivados de esteroides e acil graxos. Também foram propostas proteínas que podem estar relacionadas com o acúmulo de sacarose, onde as histonas foram as que mais se destacaram. Nas redes biológicas de correlações também foram observadas correlações entre possíveis metabólitos e proteínas que podem estar correlacionadas com o acúmulo de sacarose na cana-de-açúcar / Sugarcane (Saccharum spp.) is one of the most important cultivated grasses of the world and Brazil is the largest producer, it has become an important crop due to high carbon assimilation rates allowing the synthesis and accumulation of large amounts of sucrose in their internodes. Thus, it is necessary a high understanding of the molecular mechanisms involved in the regulation of sucrose accumulation in this plant. These mechanisms have been studied at various levels, such as gene identification and localization, identification of quantitative trait locus controlling, transcriptome, proteome, characterization and metabolites identification. With all these studies is evident the necessity for a holistic approach to global understanding of the plant during the sucrose accumulation. Thus, this work aims to integrate metabolomics and proteomics data from tissues of sugarcane variety SP80-3280, during plant development and sucrose accumulation, using bioinformatics to link these results by regularized canonical correlation analysis in a systems biology approach. The results indicate differences in the metabolic and protein profile of sugarcane during development and sucrose accumulation. Metabolites classes have been proposed that may be related to sugarcane sucrose accumulation as glycerolipids, glycerophospholipids, coumarins and derivatives, steroids and steroid derivatives and fatty acyl. In addition, some proteins have been proposed that may be related to sucrose accumulation, where the most highlighted were the histones. In the biological correlations networks, have been also observed correlations between possible metabolites and proteins that can be correlated with the accumulation of sucrose in sugarcane

As plantas se defendem do ataque de patógenos através de um sistema imune composto por duas fases. A primeira delas é mediada por receptores localizados na membrana celular ou intracelularmente, os quais são conhecidos como receptores de reconhecimento padrão (do inglês, pattern recognition receptors - PRR). Esses receptores reconhecem moléculas derivadas de microrganismos, as quais são conservadas evolutivamente e são chamadas de padrões moleculares associados a patógenos (do inglês, pathogen-associated molecular patterns - PAMPs). Esse reconhecimento dispara uma resposta de defesa conhecida como PTI (do inglês, PAMP-triggerd immunity - PTI). Alguns patógenos foram aptos a sintetizar moléculas capazes de suprimir a PTI e essas moléculas são denominadas de efetores. A resposta que ocorre devido à ação dos efetores é chamada de susceptibilidade disparada por efetores (do inglês, effector-triggered susceptibility - ETS). Entretanto, plantas resistentes podem reconhecer os efetores através de proteínas de resistência localizadas intracelularmente, ativando a imunidade disparada por efetores (do inglês, effector-triggeredimmunity - ETI). De modo geral, as respostas advindas da PTI e da ETI são similares, mas a segunda é ativada mais rapidamente e é mediada por um único gene de resistência R. Por essa razão, a ETI é conhecida como uma resposta à doença qualitativa e as plantas não desenvolvem sintomas, caracterizando a interação incompatível. Por outro lado, a PTI é mediada por diversos genes e as respostas de defesa são tardias, possibilitando a disseminação do patógeno pelas células da planta e a ocorrência da doença, o que caracteriza a interação compatível. Nas respostas de defesa, moléculas como o óxido nítrico, as poliaminas e o ácido salicílico participam do processo de sinalização. O sistema antioxidante da planta é ativado de modo a mitigar os efeitos das espécies reativas de oxigênio e o metabolismo da planta é alterado. Dessa maneira, o estudo das respostas de defesa contra patógenos, pode ser uma ferramenta útil para estabelecer controles efetivos para as doenças de plantas / Plants defend themselves from pathogen attack through an active immunity system composed by two phases. The first is mediated by cell surface and intracellular pattern recognition receptors (PRR), which recognizes conserved molecules derived from microbes known as pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). This recognition triggers a defense response called PAMP-triggered immunity (PTI). Throughout evolution, pathogens were able to synthesize molecules capable of suppressing PTI. These molecules are named effectors and they are responsible for effector-triggered susceptibility (ETS). However, resistant plants can recognize effectors by intracellular resistance (R) proteins, initiating effector-triggered immunity (ETI). In general, responses derived from PTI and ETI are the same, but the latter is activated faster and is mediated by a single R gene. For this reason, ETI-response is also known as qualitative disease response (QDR) and plants do not develop disease symptoms, characterizing the incompatible interaction. On the other hand, PTI is mediated by several genes and the defense response is delayed, enabling the pathogen to spread out and to cause disease. This interaction is known as compatible. In defense responses, molecules like nitric oxide, polyamines and salicylic acid can participate in signaling process. The antioxidant system can be activated to quench the ROS effects and the plant metabolism is altered. In this sense, studying defense responses against pathogens can help to develop tools to establish effective control methods for plant disease

Introdução: A apneia obstrutiva do sono (AOS) é uma condição clínica comum, embora subdiagnosticada na prática clínica, que está associada de forma independente com um aumento na morbimortalidade cardiovascular. Evidências recentes sugerem que o aumento do risco cardiovascular atribuído à AOS pode ser parcialmente explicado pela desregulação metabólica. No entanto, pouco se sabe sobre o perfil metabólico detalhado destes pacientes e se estes metabólitos podem servir como potenciais biomarcadores para a AOS. Objetivos: O objetivo primário do estudo foi avaliar o perfil metabólico de pacientes com AOS por meio de diferentes estratégias metabolômicas. Como objetivo secundário, avaliamos se o painel de metabólitos selecionados poderia agregar valor diagnóstico ao uso de questionários tradicionalmente empregados para a triagem da AOS. Métodos: Participantes do sexo masculino sem doença cardiovascular prévia ou uso de medicamentos foram submetidos à polissonografia noturna e divididos em 2 grupos pareados por idade e índice de massa corpórea (IMC): sem AOS (índice de apneia e hipopneia [IAH] < 15 eventos/h) e com AOS (IAH >= 15 eventos/h). Além da avaliação clínica, foi aplicado dois questionários para triagem da AOS usados na prática clínica (questionário Berlim e o escore NoSAS). A quantificação de aminoácidos (AA) no plasma foi realizada por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-MS²) previamente desenvolvido e validado no Grupo Fleury. Para as análises metabolômicas e lipidômicas foram utilizados cromatografia gasosa acoplado a espectrometria de massas (GC-MS) e cromatografia líquida (LC) off-line com detecção por ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI-MS), respectivamente. Para avaliação dos marcadores que estariam associados à AOS foram utilizados teste t de student (p < 0,05) e VIP score > 2 (predição de variável de importância). A sensibilidade e especificidade foram avaliadas por meio da curva receiver operating characteristic (ROC) e modelos de regressão logística em associação com o melhor questionário de triagem para a AOS. Resultados: 53 participantes foram estudados (16 sem AOS e 37 com AOS). Como proposto, a idade média (36 ± 6 vs. 39 ± 7 anos) e o IMC (30,3 ± 3,5 vs. 30,6 ± 3,4 kg/m2) foram semelhantes entres os grupos sem e com AOS, respectivamente. A quantificação dos AA permitiu observar uma diferença significante nos níveis de ácido glutâmico, que foram maiores nos pacientes com AOS (83,5 ± 22,5 ?M) quando comparados ao grupo sem AOS (66,7 ± 24,5 uM), p=0,023. A avaliação do perfil metabolômico resultou em 28 analitos significantes. Seis desses analitos foram provenientes da análise por GC-MS: pacientes com AOS apresentaram maiores níveis de 6-deoxi-D-glicose; 2,6-difenil-1,7-diidrodipirrolo [2,3-b:3\',2\'-e] piridina, ácido 9 (Z)-hexadecenóico e ácido araquidônico e menores níveis de 5,5\'-bifitalato e glutamina quando comparados ao grupo sem AOS (p < 0,05). A análise lipidômica (LC off-line e MALDI-MS) resultou em 22 lipídios significantes subdivididos nas seguintes classes: ceramidas (Cer), fosfatidiletanolamina (PE), lisofosfatidilcolina (LPC), e esfingomielina (SM) com níveis mais elevados em pacientes com AOS em comparação ao grupo sem AOS (p < 0,05). Diacilglicerol (DAG), fosfatidilcolina (PC) e ácido fosfatídico (PA) tiveram níveis significativamente diminuídos nos pacientes com AOS em comparação aos sem AOS. Em relação ao objetivo secundário, o questionário com melhor desempenho para triar a AOS foi o escore NoSAS com uma área sob a curva (AUC) de 0,724. A combinação dos 4 metabólitos (ácido glutâmico, glutamina, 6-deoxi-D-glicose e ácido araquidônico) ou dos 3 lipídios (LPE 35:1, SM d18:1/12:0 e LPC 27:1) selecionados pelo modelo de regressão logística ao escore NoSAS positivo resultou em uma AUC de 0,917 e 0,951, respectivamente, para a detecção da AOS. Conclusão: A aplicação da metabolômica permitiu a identificação de potenciais biomarcadores precoces para a AOS em homens jovens. Estes achados não são explicados por fatores de confusão como a idade, IMC e composição corporal. Este estudo confirma o achado de que os questionários habitualmente usados para a triagem da AOS não apresentam um bom desempenho. A combinação dos metabólitos selecionados aumentou a sensibilidade e especificidade para detecção da AOS em relação ao questionário isolado. Neste contexto, novos estudos são necessários para avaliar se estes biomarcadores poderão ser úteis para a predição do risco cardiovascular e melhora do diagnóstico da AOS / Introduction: Obstructive sleep apnea (OSA) is a common clinical condition, although frequently underdiagnosed in clinical practice. OSA is independently associated with an increased risk of cardiovascular morbidity and mortality. Recent evidence suggests that the cardiovascular risk attributed to OSA may be partially explained by metabolic dysregulation. However, little is known about the detailed metabolic profile of these patients and whether these metabolites may serve as potential biomarkers for OSA. Objectives: The primary objective of the study was to evaluate the metabolic profile of OSA patients through different metabolomics strategies. As a secondary objective, we evaluated whether the panel of selected metabolites could improve diagnostic value to the use of questionnaires traditionally used for OSA screening. Methods: Male participants with no previous cardiovascular diseases and under no medications were submitted to a nocturnal polysomnography and divided into 2 groups matched by age and body mass index (BMI): no OSA (apnea and hypopnea index [AHI] < 15 events/h) an OSA (AHI >= 15 events/h). In addition to the clinical evaluation, was applied two questionnaires to screening OSA in the clinical practice (Berlin questionnaire and the NoSAS score). The quantification of amino acids (AA) in plasma was performed by liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometry (LC-MS/MS) previously developed and validated in the Fleury Group. To the metabolomics and lipidomics analysis, we used gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and off-line liquid chromatography (LC) with matrix-assisted laser ionization/desorption detection (MALDI-MS), respectively. Student\'s t test (p < 0.05) and VIP score >2 (significance variable prediction) were used to evaluate the markers associated with OSA. Sensitivity and specificity were evaluated using the receiver operating characteristic (ROC) curve and logistic regression models in association with the best screening questionnaire for OSA. Results: 53 participants were studied (16 with no OSA and 37 with OSA). As proposed, mean age (36 ± 6 vs. 39 ± 7 years) and BMI (30.3 ± 3.5 vs. 30.6 ± 3.4 kg/m2) were similar between the groups without and with OSA, respectively. The quantification of AA showed a significant difference in the glutamic acid levels, which were higher in patients with OSA (83.5 ± 22.5 ?M) when compared to the group with no OSA (66.7 ± 24.5 ?M), p=0.023. Metabolomics profile analysis resulted in 28 significant analytes. Six of these analytes came from GC-MS analysis: patients with OSA had higher levels of 6-deoxy-D-glucose, 2,6-diphenyl-1,7-dihydrodipyrrolo [2,3-b:3\',2\'-e] pyridine, 9-hexadecenoic acid (Z) and arachidonic acid and lower levels of 5,5\'-biphthalide and glutamine when compared to the no OSA group (p < 0.05). The lipidomics analysis (LC off-line and MALDI-MS) resulted in 22 significant lipids subdivided into the following classes: glycerophosphoethanolamine (PE), lysophosphosphatidylcholine (LPC), and sphingomyelin (SM) with higher levels in patients with OSA when compared to the no OSA group (p < 0.05). Diaglycerol (DAG), glycerophosphocholine (PC) and phosphatidic acid (PA) had significantly decreased levels in patients with OSA compared to those with no OSA. Regarding to the secondary endpoint, the best performing questionnaire for screening OSA was the NoSAS score with an area under the curve (AUC) of 0.724. The combination of the 4 metabolites (glutamic acid, glutamine, 6-deoxy-D-glucose and arachidonic acid) or the 3 lipids (LPE 35:1, SM d18:1/12:0 and LPC 27:1) previously selected by logistic regression model to the NoSAS positive score resulted in an AUC of 0.917 and 0.951, respectively, for the OSA detection. Conclusion: The application of metabolomics strategies allowed the identification of potential early biomarkers for OSA in young male subjects. These findings are not explained by confounding factors such as age, BMI and body composition. This study confirms previous findings that the questionnaires commonly used for screening OSA do not have a good performance. The combination of the selected metabolites increased the sensitivity and specificity to OSA detection in relation to the use of sleep questionnaire only. In this context, further studies are necessary to assess whether these biomarkers may be useful for predicting cardiovascular risk and improving the OSA diagnosis

Orientador: Guilherme Duarte Rossi / Resumo: As plantas apresentam diversos metabólitos secundários em seus mecanismos de defesa que podem ser produzidos de forma constitutiva ou induzida. Esses metabólitos apresentam propriedades antinutritivas, repelentes ou tóxicas a insetos herbívoros. Plantas de mandioca são conhecidas por sua rusticidade e produção de compostos de defesa contra herbívoros tais como os compostos cianogênicos. Mesmo assim, plantas de mandioca podem ser colonizadas e utilizadas por uma série de insetos específicos. Na busca de formas de reduzir o impacto negativo desses insetos sobre as plantas de mandioca, genótipos que resultam em interferências negativas sobre o desenvolvimento de insetos foram identificados. Porém, pouco se sabe a respeito da composição química das folhas de plantas de mandioca e, sobretudo, dos genótipos com maiores efeitos negativos no desenvolvimento dos insetos. Com isso, o presente trabalho foi realizado para conhecer diferenças químicas entre as folhas de mandioca de genótipos selecionados de forma a esclarecer como a composição química desses genótipos pode ser relacionada com as influências observadas no desenvolvimento de insetos pragas. Foi realizada avaliação do desenvolvimento do herbívoro-modelo Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) alimentado com seis genótipos de mandioca (IAC-14, IAC-90, IAC-12, IAC-Caapora, Baianinha e MEcu 72). A análise da composição química desses genótipos foi realizada pela quantificação de fenóis totais e saponin... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Plants have several secondary metabolites that may be associated with plant-herbivore interactions. Some of these metabolites are antinutrient, repellent or toxic to herbivores. Cassava plants are rustic and produce defense compounds against herbivores such as cyanogenic compounds. Nevertheless, cassava plants can be colonized and used by a number of specific herbivores. In search of ways to reduce the negative impact of these insects on cassava plants, genotypes that result in negative interferences on the development of insects were identified. However, there is a lack of information about the chemical composition of the cassava leaves, mainly, from genotypes with large negative effects on insect development. Thus, the present work was carried out to evaluate the chemical differences between cassava leaves of selected genotypes in order to clarify how the chemical composition of these genotypes can be related to the influences observed in the development of insect pests. The development of the model herbivore Spodoptera frugiperda (JE Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) was assessed by feeding larvae with leaves from six cassava genotypes (IAC-14, IAC-90, IAC-12, IAC-Caapora, Baianinha and MEcu 72). We performed the analysis of the chemical composition of these genotypes by quantification of total phenols and steroidal saponins. Analyzes by GC-MS were performed for the IAC-Caapora, Baianinha and MEcu 72 genotypes. A study was carried out to evaluate if S. frugiperda infes... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor