O mecanismo de ação dos esteróides sexuais sobre a proliferação e diferenciação do endométrio envolve a participação de fatores de crescimento e protooncogenes, cuja regulação é pouco conhecida. O objetivo deste trabalho foi investigar a influência do ciclo menstrual e os efeitos do acetado de medroxiprogesterona (MP A) sobre a expressão de prolactina (PRL), do protooncogene c-los e do fator de crescimento TGF~ no endométrio humano in vivo. Quarenta e seis mulheres com ciclos regulares receberam, de forma randomizada, placebo ou MP A (10mg/ dia, 10 dias). Em seguida foram submetidas a biópsia do endométrio e as amostras foram classificadas em 3 grupos de acordo com a fase do ciclo/tratamento: Proliferativo/Placebo (grupo 1, N=ll), Secretor/Placebo (grupo 2, N=18) e Secretor/MPA (grupo 3, N=8). Parte do material foi fixada em formol e incluída em parafina, sendo posteriormente submetida a coloração por imuno-histoquímica. O restante foi congelado a -70°C para posterior análise do RNA mensageiro (mRNA) pela técnica de RT-PCR. Encontrou-se PRL imunorreativa no epitélio glandular de 9,1% das amostras do grupo 1, em 55,6% das amostras do grupo 2 e em 100% das amostras do grupo 3 (p<0,05; teste de Fisher). No estroma endometriat observou-se imunocoloração para PRL em 9)% , 66,7% e 87,5% das biópsias dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p<0,01). Os níveis médios de mRNA da PRL foram maiores na fase secretora (grupo 2) e significativamente maiores no grupo 3 em relação ao grupo 1 (p<0,05). Observou-se imunocoloração para c-los (predominando no núcleo das células estremais) em 54,5% das biópsias do grupo 1, em 7,1% das do grupo 2 e em nenhuma do grupo 3 (p<0,05, grupo 1 vs 2 e 3). Os níveis de mRNA do c-los foram substancialmente menores nos grupos 2 e 3 comparados ao grupo 1 (p<0,05) e apresentaram correlação direta com os níveis séricos de estradiol (r= 0,56; p<0,02). Não houve diferença entre os grupos quanto à expressão de TGF~l. Entretanto, a freqüência de amostras com imunocoloração positiva para TGFB3 e os níveis de mRNA do TGFB3 foram sucessivamente maiores nos grupos 2 e 3 em comparação com o grupo 1. Os dados demonstram aumento da expressão de PRL e TGF~3 e inibição da expressão de c-los no endométrio durante a fase secretora do ciclo menstrual, bem como no endométrio estimulado por MPA. A inibição de c-los e o aumento na expressão de TGFB3 poderiam participar do mecanismo antiproliferativo da progesterona e dos progestogênios sobre o endométrio humano in vivo. / Growth factors anci protooncogenes are involveci in the mechanism of sex steroicistirnulateci growth anci ciifferentiation of the enciometriurn, but their precise regulation remains unclear. The aim of the present stuciy was to evaluate the influence of menstrual cycle anci the effects of meciroxyprogesterone acetate (MP A) on the expression of prolactin (PRL), c-los anci transforrning growth factor beta (TGFI3) in the hurnan enciometriurn in vivo. Forty-six cycling women were ranciomizeci to receive either 10 mg MPA or placebo, once a ciay ciuring 10 ciays. Enciometrial specirnens were obtaineci about 8-12 hours following the last tablet intake anci patients were classifieci into three groups accorciing to biopsy ciating anci treatment: Proliferative/Placebo (group 1, N=ll), Secretory /Piacebo (group 2, N=18) anci Secretory /MP A (group 3, N=8). Enciometrial sampies were partially snap-frozen in liquici nitrogen anci partially fixeci in formalin, embecicieci in paraffin anci staineci by irnrnunohistochemistry. Messenger ribonucleic acici (rnRNA) leveis were assessed by reverse transcriptidase polymerase chain reaction (RT-PCR). Irnmunoreactive PRL was found in the epithelium of 9.1% of the specirnens from group 1, in 55.6% of group 2, anci in 100% of group 3 (p<0.05, Fisher's exact test). In the enciometrial stroma, immunopositive PRL was present in 9.1%, 66.7% anci 87.5% of the specirnens from groups 1, 2 anci 3, respectively (p<0.01). The average leveis of PRL mRNA were slightiy increaseci in group 2 anci markecily increaseci in group 3 compareci to group 1 (p<0.05). Irnrnunoreactive c-los was concentrateci in the nucleus of stromal cells in 54.5% of the biopsies from group 1, in 7.1% of group 2, and in 0% of group 3 (p<0.05, group 1 vs 2 and 3). The leveis of c-los mRNA were greatly reciuceci in groups 2 anci 3 compareci to group 1 (p<0.05) anci correlateci positiveiy with serum estraciiollevels (r=0.56, p<0.02). There were no ciifferences between groups conceming to the enciometrial expression of TGFI31. However, the frequency of immunopositive samples for TGFB3 anci the leveis of TGFB3 rnRNA were higher in groups 2 anci 3 compareci to group 1. 1t is conclucieci that MP A induces PRL anci TGFB3 and inhibits c-los expression in endometrial cells in vivo, resembling what occurs ciuring the secretory phase of spontaneous ovulatory cycles. The inhibition of c-los and the increase of TGFB3 expression may contribute to the antiproliferative effect of progestins on the endometriurn.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2019-02-25T13:10:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2558399 bytes, checksum: 96210586c5849ab00e1604b080da5bf0 (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-25T13:10:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2558399 bytes, checksum: 96210586c5849ab00e1604b080da5bf0 (MD5) Previous issue date: 2017-02-16 / O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito de uma intervenção nutricional baseada no modelo transteórico sobre os distúrbios metabólicos de indivíduos em hemodiálise (HD). Foi realizado um estudo de intervenção não controlado, em um centro de diálise, com amostragem não probabilística, incluindo 83 (55 homens e 28 mulheres, com idade média de 61±15 anos) indivíduos em HD, durante um período de quatro meses. Inicialmente foi aplicado um questionário sociodemográfico e de condições clínicas. A intervenção nutricional baseada no modelo transteórico foi composta por dois encontros coletivos e três individuais, com entrega de planos alimentares personalizados e atividades de educação nutricional. Foram avaliados marcadores metabólicos (concentrações séricas de cálcio, creatinina, fósforo, glicose, hemácias, hemoglobina, hematócrito, leucócitos, potássio, ureia pré e pós-diálise, ferro, ferritina, albumina, fosfatase alcalina, proteína, globulina, saturação de transferrina, produto cálcio-fósforo e adequação da diálise - Kt/V), indicadores antropométricos (índice de massa corporal – IMC e ganho de peso interdialítico - GPID), consumo alimentar mediante recordatório de ingestão habitual, estágio de mudança do comportamento mediante questionário semi-estruturado e caracterização da sintomatologia intestinal e extra intestinal por meio do questionário de rastreamento metabólico (QRM). Todos os itens avaliados foram analisados ao início e ao final da intervenção nutricional. Como resultados, houve alteração significativa (p<0,001) do estágio de contemplação para o estágio de ação, após os quatro meses de intervenção. Verificou-se redução significativa nas concentrações séricas de creatinina e ureia pré e pós-diálise (p<0,001). A hiperfosfatemia e hipercalemia do grupo também reduziram expressivamente (41,0 vs. 10,8%, p<0,001 e 56,6 vs. 28,9%, p<0,001). Marcadores relacionados ao metabolismo ósseo (produto cálcio-fósforo e fosfatase alcalina) obtiveram redução significativa (p<0,001). Já os marcadores do metabolismo do ferro (hemoglobina, hematócrito e saturação de trasnferrina), proteína e globulina apresentaram aumento significativo após quatro meses de intervenção (p<0,05). Ademais, a ingestão calórica, de proteínas, lipídios (gorduras monoinsaturadas, saturadas e ácido linoleico) e colesterol foram superiores após a intervenção nutricional (p<0,05). Houve ainda menor consumo de carboidratos, gordura poli-insaturada e zinco. Entre os micronutrientes, ferro, fósforo, potássio, cobre e vitamina C apresentaram um aumento significativo. Além disso, foi observado que antes da intervenção nutricional, o aumento das toxinas urêmicas (creatinina sérica e ureia pré-diálise) correlacionou positivamente com aumento das pontuações das sintomatologias dos seguintes órgãos, estruturas físicas e atividades comportamentais: cabeça, emoção, trato gastrointestinal e ouvido. As médias das pontuações das sintomatologias apresentaram redução significativa após a intervenção em relação aos seguintes órgãos, estruturas físicas e atividades comportamentais: ouvido, nariz, boca/garganta, pele, trato gastrointestinal e mente. Os sintomas de maior ocorrência foram: olhos coçando, coceira no ouvido, língua/lábios inchados, feridas que coçam, arrotos e gases, dores articulares e concentração ruim. Estas manifestações clínicas apresentaram redução estatisticamente significante após a intervenção nutricional. Houve uma correlação negativa entre o consumo de gorduras (monoinsaturada, poli-insaturada, ômega-3 e ômega-6) e as pontuações dos seguintes órgãos, estruturas físicas e atividades comportamentais: trato gastrointestinal, boca e emoção. Tais resultados mostram que, o período de quatro meses de intervenção nutricional, promoveu mudança de comportamento dos indivíduos em HD com melhora importante no controle metabólico dos mesmos. Os resultados encontrados podem ser explicados pela mudança significativa na ingestão calórica de macro e micronutrientes apresentada pelos indivíduos em HD, bem como maior conhecimento sobre o adequado uso dos quelantes de fósforo, indicando o papel crucial da nutrição nesse grupo. Além disso, a intervenção nutricional foi efetiva também ao reduzir as pontuações das sintomatologias de seis órgãos, estruturas físicas e atividades comportamentais, mostrando a importância de intervenções nutricionais, como ferramentas de auxílio no tratamento desses sintomas em indivíduos em HD. / The aim of the present study was to evaluate the effect of a nutritional intervention based on the transtheoric model on the metabolic disorders of hemodialysis (HD) subjects. An uncontrolled intervention study was conducted at a dialysis center with non-probabilistic sampling, including 83 (55 men and 28 women, mean age 61 ± 15 years) subjects in HD, over a period of four months. Initially a sociodemographic questionnaire and clinical conditions were applied. The nutritional intervention based on the transtheoric model was composed of two collective and three individual meetings, with delivery of personalized food plans and nutritional education activities. Metabolic markers (serum calcium, creatinine, phosphorus, glucose, red blood cells, hemoglobin, hemoglobin, hematocrit, leukocytes, potassium, pre- and post-dialysis urea, iron, ferritin, albumin, alkaline phosphatase, protein, globulin, transferrin saturation, calcium phosphorus product and adequacy of dialysis - Kt/V), anthropometric indicators (body mass index - BMI and interdialytic weight gain - IWG), dietary intake by means of habitual intake recall, stage of behavior change through semi-structured questionnaire and characterization of intestinal and extraintestinal symptoms using the metabolic screening questionnaire (MSQ). All items evaluated were analyzed at the beginning and at the end of the nutritional intervention. As results, there was a significant change (p <0.001) from the contemplation stage to the action stage, after four months of intervention. There was a significant reduction in serum creatinine and post-dialysis urea concentrations (p <0.001). Hyperphosphatemia and hyperkalemia in the group also significantly reduced (41.0 vs. 10.8%, p <0.001 and 56.6 vs. 28.9%, p <0.001). Markers related to bone metabolism (calcium-phosphorus product and alkaline phosphatase) obtained a significant reduction (p <0.001). On the other hand, markers of iron metabolism (hemoglobin, hematocrit and trasnferrin saturation), protein and globulin showed a significant increase after four months of intervention (p <0.05). In addition, the caloric intake of proteins, lipids (monounsaturated fats, saturated and linoleic acid) and cholesterol were higher after the nutritional intervention (p <0.05). There was even lower consumption of carbohydrates, polyunsaturated fat and zinc. Among the micronutrients, iron, phosphorus, potassium, copper and vitamin C showed a significant increase. In addition, it was observed that prior to nutritional intervention, increased uremic toxins (serum creatinine and pre-dialysis urea) correlated positively with increased symptom scores of the following organs, physical structures and behavioral activities: head, emotion, gastrointestinal tract and heard. The mean symptom scores showed a significant reduction after the intervention in relation to the following organs, physical structures and behavioral activities: ear, nose, mouth/throat, skin, gastrointestinal tract and mind. The most frequent symptoms were: itchy eyes, itchy ear, tongue/swollen lips, itchy wounds, belching and gas, joint pain and poor concentration. These clinical manifestations presented a statistically significant reduction after the nutritional intervention. There was a negative correlation between the consumption of fats (monounsaturated, polyunsaturated, omega-3 and omega-6) and the scores of the following organs, physical structures and behavioral activities: gastrointestinal tract, mouth and emotion. These results show that the four months of nutritional intervention promoted a change in the behavior of individuals in HD, with a significant improvement in their metabolic control. The results obtained can be explained by the significant change in caloric intake of macro and micronutrients presented by individuals in HD, as well as greater knowledge about the adequate use of phosphorus binders, indicating the crucial role of nutrition in this group. In addition, nutritional intervention was also effective in reducing symptom scores of six organs, physical structures and behavioral activities, showing the importance of nutritional interventions as tools to aid in the treatment of these symptoms in individuals with HD.

O exercício físico de intensidade moderada tem apresentado um papel como potencial indutor na modulação da resposta imunológica. Estudos recentes de nosso grupo demonstraram que uma sessão de exercício moderado pode promover um incremento da resposta imunológica de células como monócitos/macrófagos, estimulando uma resposta inflamatória através da ativação do fator nuclear NF-κB. Diante desses resultados, investigamos a possibilidade de o sistema nervoso simpático periférico, através da liberação local de catecolaminas, estar participando desse mecanismo. Para isso, foram utilizados ratos Wistar machos adultos (3/grupo) aos quais foram administrados i.p (100μL/100g) de Salina (PBS), Prazosina (antagonista α1, 2mg/kg), fentolamina (α não seletivo, 10mg/kg), propranolol (β não seletivo, 10mg/kg) e duplo bloqueio, sendo esses subdivididos em grupos controle e exercício (natação por 1 hora com peso equivalente a 5% do peso do animal no peito). Parâmetros como lacticemia, glicemia, triglicerídemia, lipoperóxidos plasmáticos e relação GSSG/GSH em eritrócitos circulantes foram dosados, sendo que houve um aumento dos níveis de lactato e redução da glicemia nos animais com fentolamina. Como o bloqueio α2 promove um aumento da secreção de insulina, gerando um estado de um hipoglicemia e aumento de lactato, que levava os animais a fadiga, a prazosina foi o fármaco de escolha a fim de minimizar os efeitos metabólicos que poderiam influenciar na resposta imunológica. No exercício, os monócitos/macrófagos apresentaram um aumento da capacidade fagocítica, produção de nitritos, que são fatores que demonstram um estado de ativação da resposta imunológica. O mesmo comportamento foi observado quando realizado um bloqueio β. No entanto, os animais com administração de um antagonista α1 demonstraram um aumento expressivo na fagocitose, na produção de nitritos, assim como também a imunodetecção de NOS2 e HSP72 (após 6 horas do exercício). Esses fatores têm sua expressão condicionada à ativação do fator nuclear NF-κB . Da mesma forma, o bloqueio duplo (α1 e β) demonstrou uma resposta de monótos/macrófagos semelhante ao bloqueio por α1. O bloqueio α1 aumentou a fagocitose e a produção de NO, além de comprovar a ativação do NFκB pela expressão da NOS2 e da HSP72, independentemente da realização do exercício, ou seja pela maior disponibilidade de catecolaminas circulantes. Podendo indicar um efeito inibitório tônico produzido por receptores α1 perifericamente, que quando bloqueados gerariam um aumento da responsividade de monócitos/macrófagos. Mecanismos envolvendo a estimulação de α2 e β receptores devem ainda ser investigados. Da mesma forma, podem ser sugeridos outros participantes dessa imunomodulação periférica, como o eixo CRH periférico-histamina e a própria HSP70 extracelular (eHSP70) produzida pelas células imunológicas. / Previous studies from our laboratory have demonstrated that a single session of moderate exercise induces many changes in immune system, such as increased phagocytic capacity, production of nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide, though NFκB pathway. In this work, we investigated the relationship between immune system and peripheral sympathetic nervous system in NFκB activation-related changes, during the exercise. Adults male Wistar rats were i.p. administered (100μl/100g) with specific adrenergic antagonists 30 min before exercise protocol: Saline (PBS), phentolamine (α1,α2 antagonist, 10mg/kg), prazosin (α1 antagonist 2mg/kg), propranolol (β1,β2 antagonist 10mg/kg) and double blockade (α and β). The protocol consisted in a single session of moderate (5% body weight overload on the chest) exercise (swimming) for 60 minutes. We tested blood lactate, glucose, triglycerides, lipoperoxidation and the systemic oxidative stress and the results showed an increase of the lactate levels and glucose reduction in the animals with phentolamine blockade. Since an α2 antagonist promote an increase in the insulin secretion, resulting in hypoglycemic status, increase lactate levels and taking fatigue, we chose prozosin as the pharmacologic α1 blocker, excluding metabolic changes that could influence in the immunological analysis. After exercise, monocytes/macrophages showed an increase in phagocytic capacity and NO production, thus suggesting activation of an immune response. The same behavior was observed after β blockade. However, administration of α1 antagonist prazosin, as well as the double blockade, increased the phagocytic capacity, NO production, and the NOS2 and HSP72 immunodetection (6 hours after exercise session), with suggests some physiological alteration on monocyte/macrophage NFκB activation, exercise independent. We suggested a peripheral α1 adrenoreceptor inhibitory tonus, and that the α1 antagonism could reverse this mechanism, resulting in increase in the monocyte/macrophage responsiveness. However, we need to further investigate α2 and β adrenoreceptors stimulation, as well as CRH-histamine peripheral axis and the endogenous HSP72, other mechanisms that could be involved in the immunological response.

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-11-01T14:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toledo_MerciaTancredo_D.pdf: 3837085 bytes, checksum: 8ec6cd217ab21fa4523eaf5e631553fd (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A placenta provê todas as necessidades para o crescimento e desenvolvimento fetal. Na presença de neoplasia é difícil predizer qual será a duração, evolução e termo da gravidez. O crescimento tumoral é prejudicial à mãe e á unidade materno fetal. O substrato energético fundamental usado pelo feto é a glicose proveniente da placenta, já que o fígado fetal é incapaz de processar a gliconeogênese. A placenta armazena glicogênio para sua própria atividade metabólica e provê lactato para o metabolismo fetal. Em estudos prévios, observamos danos à unidade feto-placentária, através de alterações bioquímicas e morfológicas na placenta, associadas ao crescimento do tumor de Walker ou à inoculação do líquido ascítico. Apoptose placentária pode afetar as funções da placenta e pode estar associada ao retardo de crescimento fetal. Por isto, este trabalho teve por objetivos investigar: 1) Reserva de nutrientes placentários através da análise de armazenamento de glicogênio; 2) Precursores de apoptose placentária possivelmente produzidos em função do crescimento do Carcinossarcoma de Walker 256 ou pela inoculação de líquido ascítico; 3) Envolvimento do sistema ubiqu.itina-proteossomo no processo seletivo de proteínas placentárias. Ratas Wistar grávidas adultas foram distribuídas em três grupos: controle (C); tumor de Walker (W); inoculadas com líquido ascítíco (A); sacrificadas no 16°, 19° e 21 ° dia após a cruza. Os tecidos placentários foram homogenizados e analisados através de: I) ensaios bioquímicos para glicogênio, conteúdo protéico, fosfatase alcalina e atividade glutationa-S-transferase; II) ensaios imunohistoquímicos, contando-se células positivas para P ARP, caspase-3 e citocromo c, e IV) quantificação de precursores apoptóticos (PARP, anti-caspase 3 e citocromo c) e do sistema ubiquitina-proteossomo subunidade 205, P42 e ubiquitina E2 por Westem blotting. Os pesos placentário e fetal foram significativamente reduzidos em ratos implantados com tumor e inoculados com líquido ascítico nos três dias de análise da gravidez. O efeito do crescimento tumoral aumentou os índices de reabsorções fetais que foram semelhantes ao dos grupos inoculados com líquido ascítico. O labirinto trofoblasto apresentou-se reduzido no 210 dia em ambos os grupos W e A. Os estoques de glicogênio e a atividade da fosfatase alcalina foram reduzidos no grupo implantado com tumor. Os efeitos produzidos pelo crescimento tumoral foram semelhantes aos observados nos grupos inoculados com líquido ascítico. Diminuição do conteúdo protéico placentário foi observado nos grupos W e A. Placenta, de ratos implantados com tumor e inoculados com líquido ascítico, apresentaram diminuição na atividade de GST no 190 e 210 dia; paralelamente houve aumento significativo de PARP, caspase-3 e citocromo c placentário tanto na análise imunohistoquímica quanto na análise por Westem blotting. O crescimento do tumor de Walker causou prejuízo ao tecido placentário e, especialmente, promoveu modificações nos precursores da apoptose. Considerando-se que o espongio trofoblasto é um dos responsáveis por manter a função placentária normal, a apoptose descontrolada destas células pode resultar em impacto negativo ao desenvolvimento fetal através de fatores produzido pelas células do tumor, ou, indiretamente, pelos efeitos causados pela inoculação do líquido ascítico aumentando a apoptose. Em animais implantados com tumor e inoculados com líquido ascítico os tecidos placentários não apresentaram dif¿!rença significativa de ubiquitina E2, embora as subunidades proteossômicas 208 e P42 fossem significativamente mais expressivas nos grupos W e A, com relação aos respectivos controles. 0 sistema ubiquitina-proteossomo está envolvido na reorganização e seleção de proteínas nucleares e citoplasmáticas; sendo assim, a presença de tumor ou a inoculação do líquido ascítico promoveu alterações neste sistema comprometendo, provavelmente, a viabilidade dos tecidos placentários e, conseqüentemente, a evolução da gravidez. Esses resultados podem ajudar na compreensão de eventos e identificação de métodos que venham garantir o bem-estar fetal e desenvolvimento da placenta. Assim o crescimento do tumor de Walker, juntamente com a inoculação de líquido ascítico, promovem danos irreversíveisá placenta alterando sua homeostasia assim prejudicando o desenvolvimento e a sobrevida fetal no ambiente uterino / Abstract: The placenta provides ali needs for healthy fetus development. The cancer development difficulties to predict the period, evolution and term of pregnancy. The tumour growth can be prejudicial to mother, foetus and, especially to maternal-fetal unit. The fundamental energy substrate used by fetus and placenta is glucose, although fetalliver is incapable to process gluconeogenesis. The placenta cells mobilise glycogen storage for its own energy activity and provides lactate to earlier fetal metabolism. In previous studies, we observed damage in the maternal-foetal unity, showed by biochemical and morphological alterations in placenta associated to tumour growth or ascitic fluid inoculation. Placental apoptosis may affect a range of placental functions and can be associated foetal growth retardation. For this reason the aim of this work was to analyse the effects of Walker 256 carcinosarcoma growth in pregnant rats studing 1) the nutrient reserves as glycogen storage 2) the effects on placental apoptotic precursors and 3) the involvement of the ubiquitin-proteasome system on the selective process of placental proteins. Adult pregnant Wistar rats were distributed into three groups: control, C; tumour bearing, W; injected ascitic fluid, A, and sacrificed on 16th, 19th or 21 st day after breeding. The placental tissue aliquots were analysed after homogenising and measuring I) placental glycogen, and protein content and alkaline phosphatase and glutathione-8-transferase activity; II) histochemically the glycogenceHs presence; III) Immunohistochemically assays counting [positive cells for P ARP I caspase-3 and cytochrome c, and IV) The apoptotic precursors (PARP, anti-caspase-3 and cytochrome c) and ubiquitin-proteasome proteins (ubiquitin E2, P42 and subunit 208) expression. The placenta and fetal weight were significantly reduced in both tumour bearing and ascitic fluid injected rats since 16th, 19th and 21st day of pregnancy. The effects of tumour growth, inducing high fetal reabsorption sites were similar in ascitic fluid injected group. Labyrinth layer was significantly reduced on 21 st day in both tumour bearing and ascitic fluid injected. The placental glycogen cells andalkaline phosphatase activity were reduced in tumour groups. The effect produced by tumour growth were similar that observed in ascitic ftuid injected group. Decrease in placenta I protein content was observe in both W and A Placental P ARP, caspase-3 and cytochrome c positive cells, analysed by immunohistochemistry and cells and Westem blot, were increased in tumour- bearing and ascitic fluid injection groups, showing that tumour growth clearly produced damage in placental tissue, especially inducing changes in apoptotic precursors. Since the trophoblastic cells are the responsible ones for maintaining normal placental function, the uncontrolled death of this cells could result in a negative impact to foetal development, as many factors either directed produced by tumour cells or indirectly effect produced by ascitic fluid substances, increasing the apoptosis rate. In tumour-bearing and ascitic fluid groups the placenta tissues showed no difference in ubiquitin E2 quantity, although the proteasome subunits 208 and P42 contents were significantly higher in the W and A rats. This results suggest that the ubiquitin proteasome system was involved in placental tissues probably being responsible for organizer and selection of citoplasmatic and nuclear proteins. The presence of tumour or ascitic fluid injected probably promoted alterations in the placenta tissues that committed the pregnancy evolution. The knowledge of this events resulted by tumour effects may help to identify the better way to guarantee the welfare of fetal and placenta development. In conclusion the tumour growth and, especially, ascitic fluid injected promoted irreversible damage in a placenta tissue altering the homeostasis and compromising the foetal development / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Nucleotídeos extracelulares são envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Astrócitos são a maior fonte de nucleotídeos extracelulares da adenina no cérebro e também importantes alvos para as ações desses nucleotídeos via receptores purinérgicos P2. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ecto-nucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase), ecto-5’-nucleotidase (ecto- 5’N) e ecto-adenosina deaminase (ADA). Culturas de astrócitos preparadas de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos foram capazes de rapidamente converter ATP extracelular a ADP, que foi então hidrolizado a AMP. Os nucleosídeos tri-fosfatados foram hidrolisados preferencialmente aos difosfatados em todas as estruturas cerebrais. A análise cinética sugere que varias ecto-nucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Análises preliminares de mRNA por PCR indicaram que astrócitos expressam múltiplos membros da família das NTPDases (NTPDase1 a NTPDase3 e NTPDase5/6). Por RT-PCR quantitativo (Real-time PCR), nós identificamos a NTPDase2 (CD39L1) como a NTPDase predominante expressa por astrócitos de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos. Astrócitos do cerebelo apresentaram um padrão diferente para a hidrólise do AMP, com uma atividade específica 7 vezes maior, quando comparada com astrócitos de hipocampo e córtex. Uma maior expressão da ecto-5’N por RT-PCR foi identificada nessa estrutura. Não houve acúmulo de adenosina extracelular em todas as estruturas estudadas, indicando a presença de uma alta atividade ecto-adenosina deaminase em astrócitos. Dipiridamol aumentou significativamente os níveis de inosina no meio extracelular de astrócitos de hipocampo e córtex, mas não em astrócitos de cerebelo. Essas diferenças observadas podem indicar heterogeneidade funcional dos nucleotídeos no cérebro. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos como indicadoras da invasividade e agressividade dos gliomas malignos, nós avaliamos a degradação dos nucleotídeos extracelulares em cinco linhagens de gliomas diferentes e comparamos com astrócitos. Todas as linhagens de gliomas examinadas apresentaram baixas razões de hidrólise quando comparadas com astrócitos. Resultados preliminares sugerem que a falta de expressão da NTPDase1 e 2 possam ser responsáveis pela baixa hidrólise de ATP nas linhagens de gliomas. Considerando que o ATP é reconhecido como um fator mitogênico que induz a proliferação em células de gliomas, a substancial diminuição na hidrólise de ATP e ADP observadas em gliomas, sugere que alterações na via das ecto-nucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna desse tipo de tumor.

As acidúrias L-2-hidroxiglutárica (LHGA) e D-2-hidroxiglutárica (DHGA) são distúrbios neurometabólicos hereditários caracterizados por extenso e severo dano cerebral, ocasionando predominantemente convulsões, coma e atrofia cerebral. Na LHGA, as lesões cerebrais ocorrem principalmente no cerebelo enquanto a maior parte do cérebro é afetada na DHGA. Além disso, hipotonia, fraqueza e hipotrofia muscular, bem como cardiomiopatia têm sido observadas nos pacientes afetados por essas acidemias orgânicas, com maior freqüência na DHGA. Bioquimicamente, ocorre acúmulo tecidual dos ácidos L- 2-hidroxiglutárico (LGA) e D-2-hidróxiglutárico (DGA), respectivamente, na LHGA e na DHGA. Além disso, elevadas concentrações urinárias de lactato, 2-cetoglutarato e outros metabólitos do ciclo de Krebs têm sido descritas em pacientes acometidos por essas patologias, sugerindo uma disfunção mitocondrial. mitocondrial. Tendo em vista que a etiopatogenia da disfunção tecidual nesses pacientes é desconhecida, o presente trabalho investigou o efeito in vitro dos ácidos LGA e DGA sobre diversos parâmetros do metabolismo energético celular. Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos DGA e LGA sobre a utilização de glicose e produção de CO2 em homogeneizados e fatias de córtex cerebral. Verificamos que o DGA reduziu significativamente tanto o consumo de glicose quanto a produção de CO2 pelo córtex cerebral, enquanto o LGA não demonstrou efeito sobre esses parâmetros. Além disso, o DGA inibiu significativamente a atividade da citocromo c oxidase em homogeneizado de córtex cerebral de ratos (35-95%), de forma dose-dependente, sem alterar a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória. A inibição verificada foi do tipo acompetitiva. Por outro lado, o LGA não alterou a atividade de nenhum dos complexos enzimático estudados. Posteriormente, avaliamos o efeito in vitro dos ácidos DGA e LGA sobre a atividade da creatina quinase (CK) em homogeneizado total e nas frações citosólica e mitocondrial de tecido cerebral, muscular esquelético e cardíaco de ratos. Os resultados mostraram que o DGA inibiu significativamente a atividade das isoformas mitocondrial e citosólica da CK em preparações de córtex cerebral, músculo esquelético de cardíaco. Por outro lado, tanto DGA quanto LGA inibiram seletivamente a isoforma mitocondrial em preparações de cerebelo. Estudos cinéticos mostraram um perfil não competitivo de inibição com relação à fosfocreatina para ambos os ácidos nos tecidos estudados. Além IV disso, observamos também que o efeito inibitório de ambos os ácidos foi totalmente revertido por glutationa reduzida, sugerindo uma modificação causada pelos metabólitos sobre os grupos sulfidrila, essenciais para a atividade da enzima. Nossos resultados sugerem que a inibição significativa causada pelo DGA sobre as atividades da citocromo c oxidase e da creatina quinase no córtex cerebral, assim como nos músculos cardíaco e esquelético poderiam explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da disfunção neurológica e anormalidades estruturais no sistema nervoso central, bem como a mitocondriopatia esquelética e a cardiomiopatia presente nos pacientes afetados por DHGA. Por outro lado, é possível que a inibição seletiva da creatina quinase mitocondrial provocada pelo LGA em cerebelo possa estar associada à degeneração cerebelar característica dos pacientes com LHGA.

Realizamos um estudo observacional de pacientes com mucopolissacaridose tipo VI, com o objetivo de determinar o perfil epidemiológico, clínico e bioquímico de um grupo de pacientes sul-americanos a fim de contribuir em estudos futuros de correlação genótipo-fenótipo e de avaliação de protocolos clínicos. Os critérios de inclusão foram: ter 4 anos ou mais e confirmação bioquímica da doença (níveis reduzidos da atividade da ARSB, aumento de GAGs urinários e atividade normal de outra sulfatase). Os critérios de exclusão foram: terapia com reposição enzimática atual ou prévia ou ter realizado transplante de medula óssea. Foram avaliados 28 pacientes por anamnese, exame físico, acocardiograma, eletrocardiograma, avaliação oftalmológica, medidas de glicosaminoglicanos urinários e da atividade da N-acetilgalactosamina-4-sulfatase em leucócitos. A amostra estudada tinha 92,9% de brasileiros, sendo 53,8% da região sudeste. No momento da avaliação, a média de idade foi de 97,1 meses e a média de idade ao diagnóstico foram de 48,4 meses. Em 88% da amostra os sintomas iniciaram com menos de 36 meses e em 27% das famílias houve relato de consangüinidade entre os pais. A média de peso e estatura ao nascimento foi de 3481 gramas e 51,3 centímetros, respectivamente. Da amostra, 57,1% nasceram de parto vaginal. Todos apresentavam alguma alteração ecocardiográfica, bem como opacificação corneana. As manifestações clínicas mais freqüentes foram: baixa estatura, opacificação corneana, facies grosseira, contraturas articulares e mãos em garra. A média da atividade enzimática em leucócitos foi de 5,4 nmoles/h x mg proteína e a excreção urinária de glicosaminoglicanos foi, em média, 7,9 vezes superior ao normal. O número de manifestações clínicas citadas não apresentou correlação significativa com a idade, com a excreção urinária de GAGs ou com a atividade enzimática em leucócitos. Também não houve correlação significativa entre a excreção urinária de GAGS e a atividade enzimática. Concluímos que a MPS VI é uma patologia com alta morbidade e que, comparados com a literatura, os pacientes da nossa amostra têm um diagnóstico tardio e maior freqüência de alterações cardiológicas. / An observational study of South-American patients with mucopolysaccharidosis type VI was carried out, aiming at determining their epidemiological, clinical and biochemical profile, and, to evaluate the correlation of signs/ symptoms reported with present age and biochemical findings (urinary excretion of GAGs and ARSB activity in lekocytes), so that it can serve as basis for future studies of the genotype-phenotype correlation and for protocols of future clinical studies. Each individual needed to meet the inclusion criteria: the signing of an informed term consent; age of four years or older; biochemical confirmation of the disease (reduction in level of ARSB activity and the increase in the levels of GAGs in urine, and a normal activity of another sulfatase). The exclusion criteria were: previous bone marrow transplant; previous or present enzyme replacement therapy. Twenty-eight patients were evaluated through anamnesis, physical examination, echocardiogram, electrocardiogram, ophthalmologic evaluation, and measurements of glycosaminoglycan levels in urine and of the activity of N-acetylgalactosamine-4-sulfatase (ARSB) in leukocytes. Of the sample studied, 92.9% were Brazilian, being 53.8% from the Brazil’s Southeast region. Mean age at evaluation was 97.1 months and at diagnosis 48.4 months. For 88% of patients, the onset of symptoms was before the age of 36 months, and in 27% of cases parental consanguinity was reported. Mean weight and height at birth were 3481 g and 51.3 cm, respectively. Birth was through vaginal delivery in 57.1% of cases. All patients presented some echocardiographic finding, as well as corneal clouding. The most frequently reported signs and symptoms were: short stature, corneal clouding, coarse facial features, joint contractures, and claw hands. Mean ARSB activity in leukocytes was 5,4 mmoles/h/mg prot. (rv: 72–174), and urinary excretion of glycosaminoglycans was, on average, 7.9 times higher than normal. The number of signs and symptoms reported has not shown a significant correlation with the age with the excretion of glycosaminoglycans nor with the level of enzyme activity in leukocytes. Also, no significant correlation was found between the excretion of glycosaminoglycans and the level of enzyme activity. It was concluded that MPS VI has high morbidity and that, when compared with data published in the literature, patients in our study had a later diagnosis and a higher frequency of cardiologic findings.

Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Resumo: As células eucarióticas desenvolveram diversas estratégias para combater os efeitos nocivos de uma variedade de condições estressantes. Linhagens de Saccharomyces cerevisiae tem uma capacidade inata de suportar altos níveis de etanol que se tornariam letais ou prejudiciais à fisiologia de outros organismos. A resposta de estresse sob alta concentração de etanol em S. cerevisiae é importante em reações de fermentação e opera através da superexpressão e subexpressão de genes, alterando o perfil proteico e podendo resultar em perturbações do bioprocesso. O objetivo deste estudo foi determinar as diferenças no metabolismo de cada cepa de levedura visando à obtenção de informações a respeito da resistência à alta concentração de etanol a 12%. Para isso, as linhagens industriais PE-2 e CAT-1, e a linhagem Y12632 de S. cerevisiae isolada de processo de produção de etanol, foram utilizadas para a realização de testes em meio sintético contendo etanol 12%, simulando uma situação de estresse ocorrente em processos industriais para produção de etanol. Sendo assim, para avaliar essa resposta durante o estresse, a caracterização do processo fermentativo e a análise de integridade da membrana celular foram relacionadas à análise proteômica por shotgun. Principalmente através da avaliação de integridade da membrana citoplasmática, a cepa PE-2 demonstrou elevada resistência, além de alto consumo de substrato durante a fermentação com estresse induzido em comparação com a cepa industrial CAT-... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T06:30:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 276359.pdf: 1473962 bytes, checksum: 6cb68d86b04b24c68bbeb51ee0cb3ae7 (MD5) / O receptor de Vitamina D (VDR) e o receptor Pregnano X (PXR) são receptores nucleares e agem como fatores de transcrição quando ativados pela ligação de moléculas específicas. PXR e VDR possivelmente se originaram da duplicação de um gene ancestral. Em mamíferos, esses receptores compartilham um número de genes alvos e dividem a função de mediação da resposta de detoxificação de xenobióticos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito de agonistas dos receptores nucleares PXR e VDR na expressão de genes de biotransformação de xenobióticos em peixes da espécie Danio rerio. Para isso, 48 horas após o tratamento de peixes D.rerio com agonistas específicos para estes receptores, foi analisada a expressão hepática e intestinal dos genes CYP3A65, CYP3C1, CYP24, CYP2AA1, CYP2AA2, GST?, GST?, ABCB5, VDR? e PXR. Os agonistas utilizados foram 1?,25-diidroxivitamina D3, como ativador do VDR, e 5-Pregnen-3?-ol-20-ona, como ativador do PXR. A análise da expressão dos genes foi feita através da técnica de RT-PCR em tempo real, utilizando o método delta-delta Ct. A expressão da ?-actina foi utilizada para normalizar os dados. Ambos ligantes induziram genes da fase I, II e III do processo de biotransformação em peixes, no intestino e no fígado. A pregnenolona aumentou a expressão de CYP3A65, CYP3C1, CYP2AA1, CYP2AA2, GST?, GST?, ABCB5 e PXR no fígado e CYP3A65, CYP3C1, CYP2AA1, CYP2AA2, GST?, GST? e PXR no intestino dos peixes, o que sugere um importante papel do PXR como mediador da biotransformação em peixes desta espécie. Além disso, 1?,25-diidroxivitamina D3 aumentou a expressão dos genes CYP24, CYP3C1, CYP2AA1, CYP2AA2, GST? e PXR no fígado e CYP24, CYP2AA1, CYP2AA2, GST?, GST? e PXR no intestino dos peixes. Até então, não havia sido demonstrado o efeito do hormônio derivado da vitamina D na expressão de genes envolvidos no processo de biotransformação em peixes. Os resultados obtidos neste trabalho suportam a hipótese de que os dois receptores da família NR1I, PXR e VDR, compartilham a mediação na resposta de detoxificação em peixes, assim como em mamíferos.

Orientador: Leonardo Susumu Takahashi / Resumo: Em peixes, a utilização dos carboidratos da dieta pode variar em função da fonte e características estruturais do amido. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de dietas com diferentes quantidades de amilose e amilopectina no metabolismo de carboidratos e desempenho produtivo de juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus). Os animais foram alojados (n = 216) em 24 caixas de polietileno (100-L) e alimentados três vezes por dia até a saciedade aparente durante 90 dias. O experimento foi conduzido em um delineamento em blocos casualizados com seis tratamentos (dietas experimentais): T1 - 0,5/38,7; T2 - 6,9/32,6; T3 - 10,3/29,5; T4 - 20,4/18,6; T5 - 27,3/11,0 e T6 - 28,4/9,8 (% de amilose e % de amilopectina, respectivamente) e quatro blocos (faixa de peso), sendo cada bloco considerado como uma repetição. Os resultados obtidos foram submetidos a ANOVA e as médias comparadas pelo teste de Tukey (5%). Melhor peso final, ganho de peso, taxa de crescimento especifico, conversão alimentar, taxa de eficiência proteica e atividade da amilase foram observadas nos peixes que receberam as dietas com menor quantidade de amilose (até 6,9%). As reservas de lipídio muscular, lipídeo hepático e índice hepatossomático foram mais elevadas nos peixes que receberam a dieta com a 38,7% de amilopectina. Dentre os indicadores das vias metabólicas, a atividade hepática da glicoquinase foi maior nos peixes que receberam essas dietas com maior percentagem de amilopectina. Na composição corporal o ext... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre