Se realizó un estudio de tipo descriptivo – observacional retrospectivo de casos y controles de los niveles plasmáticos de homocisteína total en pacientes tratados con fenitoína atendidos en Consultorio Externo del Departamento de Neurocirugía del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen durante el período Abril - Noviembre 2003. Se analizaron 45 casos en la que se evaluaron los niveles de homocisteína plasmática en pacientes tratados con fenitoína; detectándose 14 pacientes con hiperhomocisteinemia moderada que representa el 31,11%; presentándose dentro del rango de 17 a 73 años mayormente en el grupo etáreo de pacientes varones de 47 a 73. Se evaluaron también los niveles de ácido fólico en pacientes con prescripción de fenitoína, cuyos valores fueron más bajos con respecto a los pacientes que no recibían dicho medicamento. / A descriptive – observational retrospective cases and controls study of levels of total homocysteine in patients with medic prescription of phenytoin attending in Neurosurgery facility of Guillermo Almenara Irigoyen National Hospital during April – November 2003 of was carried out. It was analized 45 cases of patients in that facility during 6 months in order to assess the levels of plasmatic homcysteine, it was detected 14 patients with levels of moderate hyperhomocisteinemia, having obtained an incidence of 31, 11 %; particularly presented in male patients and between 62-73 and 47-61 years old. It was evaluated the levels of folic acid in patients have like a medic prescription the use of phenytoin, which ones were lower with regard to controls patients.

La obesidad es quizá la enfermedad más frecuente en todo el mundo. Tanto es así que la OMS la califica de pandemia. Todo el exceso de energía que ingerimos se almacena en el tejido adiposo, diseñado específicamente para llevar a cabo tal función. Pero el exceso puede llegar a ser tanto, que el tejido adiposo se ve sobrepasado y debe derivar la grasa que no puede almacenar a otros tejidos como el hígado, el páncreas y el músculo, que no están preparados para tal fin. El estrés celular que esto supone, se acompaña de una respuesta inflamatoria y metabólica alteradas en múltiples tipos celulares. Por otro lado, un estés celular moderado es normal, y no por ello perjudicial. Por ejemplo, el ejercicio físico puede suponer un estrés importante en algunos tipos celulares, pero no por ello deja de ser saludable. Algunas moléculas capaces de producir estrés celular, como los tóxicos, se comportan de forma parecida. A dosis muy bajas, pueden proporcionar efectos beneficiosos; es lo que se conoce como hormesis. Las plantas sintetizan diferentes tipos de moléculas para defenderse del estrés que produce la sequía o las plagas entre otras agresiones. Los humanos, al comernos las plantas, somos capaces de aprovechar el estrés que sufren utilizando los compuestos que sintetizan. La idea de que una especie se aproveche del estrés de otra especie, es lo que trata de explicar la hipótesis de la xenohormesis. Los polifenoles son un tipo de compuestos horméticos. En esta Tesis hemos desarrollado técnicas analíticas para la caracterización de los compuestos presentes en extractos acuosos de plantas y hemos evaluado los efectos biológicos del consumo de extractos acuosos ricos en polifenoles de Hibiscussabdariffay Aspalathuslinearis (rooibos). / Obesity is perhaps the most common disease worldwide. The WHO qualify it as a pandemic disease. The excess of energy ingested is stored in adipose tissue, specifically designed to perform this function. But too much can be therefore, that adipose tissue is overwhelmed and must derive the excess of fat to other tissues such as liver, pancreas and muscle, which are not prepared for this purpose. The concomitant cellular stress generated, is accompanied by an altered metabolic and inflammatory response in multiple cell types. On the other hand, a moderate cell stress is normal, and does not have to be harmful. For example, exercise can cause a significant stress in some cell types, but not for that isunhealthy. Some molecules that can produce cellular stress, such as toxic, have similar behavior. Used at very low doses, can provide beneficial effects, it is what is known as hormesis. Plants synthesize different types of molecules to defend against the stress of drought or pests among other attacks. When humans eat plants, are able to benefit this stress experienced by plants by using the synthesized compounds. The idea that a specie will take advantage of the stress of another specie, is what the hypothesis of xenohormesistry to explain. Polyphenols are a class of hermetic compounds. In this Thesis we have developed analytical techniques for the characterization of the compounds present in aqueous extracts of plants and assessed the biological effects of consumption of polyphenol-rich aqueous extracts from Hibiscus sabdariffa and Aspalathuslinearis (rooibos).

La hipótesis de este trabajo de tesis es que tanto <i>in vitro</i> como <i>in vivo</i>, el tratamiento con Metformina podría proteger y/o bloquear los efectos deletéreos de los AGEs sobre el hueso. Objetivos Generales Investigar los mecanismos patogénicos de los AGEs así como los efectos de la Metformina sobre el hueso, en un modelo <i>in vitro</i> de células óseas en cultivo y en un modelo <i>in vivo</i> en ratas diabéticas y controles. Objetivos Específicos 1) Analizar el efecto de los AGEs y la Metformina sobre el citoesqueleto de actina y la diferenciación de osteoblastos en cultivo. 2) Investigar los efectos pro y anti-apoptóticos de los AGEs y la Metformina en osteoblastos en cultivo. 3) Estudiar el efecto de la Metformina sobre el estrés oxidativo inducido por los AGEs sobre osteoblastos en cultivo. 4) Determinar los mecanismos involucrados en la acción de AGEs y Metformina sobre osteoblastos en cultivo. 5) Estudiar el efecto de la Metformina sobre osteoclastos en cultivo. Determinar los mecanismos de transducción de señales involucrados en su acción. 6) Investigar la formación/resorción ósea en ratas diabéticas o control, tratadas o no con Metformina. Estudiar el grado de reparación de heridas óseas, expuestas o no a la acción de la droga Metformina.

La capacidad de pegado de ácido palmítico por proteínas citosólicas fue medido a partir de raspado diferencial de mucosa intestinal bovina, obteniendo tres zonas de la vellocidad intestinal determinadas por la actividad de la fosfatasa alcalina en cada una de las mismas. Los resultados obtenidos indicaron que la actividad de pegado de ácido palmítico depende de la posición que las células ocupan a lo largo del eje cripta-ápice de la vellosidad. Las proteínas citosólicas de alto y bajo peso molecular con afinidad por ácido palmítico en el ápice de la vellosidad pegaron 1,24 + - 0,41 y 1,54 + - 0,16 pmoles de palmitato/ug de proteína respectivamente. La actividad de pegado decreció de 0,50 + - 0,25 1,10 + - 0,23 pmoles de palmitato/ug de proteína para las proteínas citosólicas en zona de cripta de la vellosidad. Utilizando diversas técnicas: filtración en geles, cromatografía de intercambio iónico, remosión de ácido palmítico de membranas microsomales, precipitación con sulfato de amonio, ensayo de pegado de ácdisos grasos (Lipidex 1000), se demostró tanato en hígado como en intestino la presencia de proteínas citosólicas de bajo peso molecular (14-15 KDa) con afinidad por ácidos grasos de cadena larga. Este trabajo demostró que la fracción de proteínas citosólicas de bajo peso molecular (Proteína Transportadora de Acidos Grasos-PTAG) jugaría un rol importante en la utilización y transporte de ácidos grasos.

Se investigó la composición química y la calidad higiénico sanitaria de dietas elaboradas con residuos de merluza capturadas en diferentes etapas del ciclo reproductivo, almacenadas a temperatura ambiente por 48 hs. y la posterior influencia de esas dietas sobre la salud y el desarrollo de visones durante el período de crecimiento y muda de pelo. La calidad higiénico sanitaria de las dietas se determinó química y microbiológicamente. El efecto de esas dietas sobre los animales, se evaluó a través de parámetros plasmáticos y tisulares, y estudios anatomopatológicos. / Chemical composition and hygienic quality of diets prepared with oftal from hake in different gonadal stages stored 48 in different gonadal stages sotred 48 hs. at room temperature or not, were investigated. The influence of these diets on health and peromance of growing minks was also evaluated. The gonadal stage of hake influenced the hygienic quality of diets and food consumption. The hygienic quality of diets was determined by chemical and microbiologycal methods. Diet effects on animals were evaluated by monitoring of plasmatic, tisular and anatomopathological paramethers. / Información extraída de: <a href="http://www.sidalc.net/cgi-bin/wxis.exe/?IsisScript=TESI.xis&method=post&formato=2&cantidad=1&expresion=mfn=000099"> SIDALC (Sistema de Información y Documentación Agropecuario de las Américas)</a>

Bajo la hipótesis de que la pubertad es un carácter complejo influenciado por múltiples genes, además de factores ambientales, el objetivo de este trabajo fue identificar genes y/o marcadores genéticos asociados a la edad de inicio de la pubertad en bovinos machos de la raza Angus. El estudio se llevó a cabo mediante diferentes estrategias. La primera de ellas consistió en secuenciar dos genes (LHR y KISS1R) claramente involucrados en la regulación del desarrollo sexual, con el objetivo de detectar polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) potencialmente asociados a la edad de pubertad. Además, dado que la pubertad es un proceso biológico influenciado por diversos factores, se decidió seleccionar SNPs localizados en genes candidatos relacionados al metabolismo lipídico, al crecimiento corporal y a la regulación del desarrollo sexual, con el objetivo de analizar su posible asociación la edad de pubertad.

En el presente trabajo se evaluó la capacidad antiproliferativa, anticolesterogénica y los efectos sobre el metabolismo lipídico de dos isoprenoides de 10 carbonos, linalool (monoterpeno alcohol lineal) y 1,8-cineole (monoterpeno cíclico con grupo éter), sobre células HepG2 (procedentes de un hepatocarcinoma humano) como modelo de célula hepática y A549 (provenientes de adenocarcinoma de pulmón humano) como tipo celular extra-hepático. Se analizaron los mecanismos de acción involucrados y los efectos del tratamiento combinado de ambos monoterpenos entre sí o de cada monoterpeno con simvastatina (una estatina modelo) evaluando los posibles efectos sinérgicos de cada interacción. La actividad de los isoprenoides naturales sobre la colesterogénesis y proliferación celular se concentra en la vía del mevalonato (VM), una vía metabólica muy compleja indispensable para la homeostasis celular. Esto se debe a que la VM no solo es la vía de síntesis del colesterol, sino que además provee intermediarios fundamentales para la prenilación de proteínas de la superfamilia Ras, proteínas reguladoras de la proliferación y supervivencia celular. Durante el desarrollo de este trabajo se determinó la viabilidad y proliferación celular por los métodos de MTT, rojo neutro y recuento celular. En todos los casos, tanto los monoterpenos como la simvastatina inhibieron la proliferación celular, mientras que las combinaciones de a pares entre monoterpenos y cada uno de ellos con simvastatina mostraron un efecto sinérgico en dicha inhibición. Se estudió la distribución de las poblaciones en el ciclo celular, apoptosis por diferentes metodologías y la localización subcelular de Ras, a diferentes concentraciones. Tanto linalool como 1,8-cineole arrestaron el ciclo celular, principalmente en G0/G1 mientras que linalool también indujo apoptosis en células HepG2. Al combinar los compuestos se observó en gran parte de los casos una interacción sinérgica sobre la inducción de apoptosis. Linalool disminuyó los niveles de Ras en membrana plasmática y los aumentó en citosol, mientras que al combinase con simvastatina, la inhibición de la traslocación a membrana fue levemente potenciada. A través de experimentos de incorporación de 14C-acetato en lípidos en condiciones donde la proliferación no se encuentra afectada, se demostró que linalool y 1,8-cineole inhibieron la VM, probablemente a diferentes niveles. Esto resultó en una reducción de la colesterogénesis y una acumulación de intermediarios y/u otros productos finales de la vía. Las concentraciones efectivas en la inhibición de la síntesis de colesterol fueron considerablemente inferiores a las necesarias para ejercer efecto antiproliferativo, sobre todo para 1,8-cineole. En ciertos casos, los tratamientos aumentaron la incorporación de colesterol exógeno. Ambos monoterpenos afectaron la incorporación de acetato en lípidos neutros, fosfolípidos y ácidos grasos, cada uno de manera diferente. La combinación de ambos isoprenoides entre sí, o de cada uno con simvastatina, inhibió sinérgicamente la síntesis de colesterol. A bajas concentraciones linalool y 1,8-cineole bloquearon etapas específicas de la colesterogénesis mientras que a concentraciones elevadas provocaron una inhibición de la enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR), enzima limitante de la velocidad de la VM. El agregado de mevalonato exógeno fue incapaz de revertir la inhibición de la proliferación promovida por ambos compuestos, lo que demuestra que la inhibición de HMGCR por sí sola no es responsable de tal efecto y refuerza la hipótesis de la inhibición a nivel de la prenilación de proteínas como principal mecanismo antiproliferativo. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis contribuyen a un mejor entendimiento de la acción de linalool y 1,8-cineole sobre la VM aportando conocimiento sobre los posibles mecanismos involucrados en su actividad anticolesterogénica y antiproliferativa. También sugieren el potencial uso de estos compuestos como una alternativa natural para ser utilizados en terapias contra cáncer y/o enfermedades cardiovasculares, ya sea solos, combinados entre sí o con estatinas.

Las propiedades quimioterapéuticas e hipolipemiantes de los compuestos de origen vegetal han recibido gran atención con el objetivo de encontrar sustancias que puedan ser usadas como alternativas a las drogas convencionales. Los monoterpenos -presentes en aceites esenciales de frutas cítricas y plantas aromáticas- están siendo activamente muy estudiados debido a su bajo costo, buena biodisponibilidad y escasa toxicidad. Se demostró que muchos de ellos ejercen múltiples efectos sobre la vía del mevalonato (VM) en células de mamíferos que podrían causar los efectos terapéuticos deseados. La VM produce isoprenoides que son incorporados en diversos productos finales como colesterol, dolicol y ubiquinona o grupos prenilo utilizados por preniltransferasas para las modificaciones postraduccionales de ciertas proteínas de la superfamilia Ras y Rho, GTPasas pequeñas que regulan importantes procesos celulares, como proliferación celular, diferenciación, apoptosis y organización del citoesqueleto. Mutaciones en los genes que codifican estas proteínas forman oncogenes encontrados en una amplia variedad de tumores; por ejemplo, en un 90% de las neoplasias de páncreas, 50% de las tumoraciones de colon y tiroides y, aproximadamente, en un 30% de las leucemias mieloides y en el cáncer de pulmón. La etapa limitante de la velocidad de la VM es catalizada por la 3-hidroxi-3-metil glutaril coenzima A reductasa (HMGCR), enzima que se encuentra regulada -a nivel transcripcional, traduccional y postraduccional- a través del propio colesterol y de algunos intermediarios de la vía. La VM está presente en células de todos los tejidos estudiados y es particularmente activa en el hígado, órgano que cumple un rol central en el mantenimiento de la homeostasis del colesterol corporal. La familia de las estatinas está constituida por drogas naturales (de origen fúngico), semisintéticas (obtenidas por modificaciones de las anteriores) y sintéticas. Estos compuestos son estructuralmente similares a la mevalonolactona, característica que les posibilita actuar como inhibidores competitivos de la HMGCR. Uno de los posibles efectos de las estatinas es la modulación del crecimiento celular. Las estatinas se utilizan con éxito en el tratamiento de la hipercolesterolemia, ya que ocasionan una disminución del contenido de colesterol celular que se traduce, vía SREBPs, en un incremento del número de receptores para LDL con el concomitante aumento de la captación de LDL-colesterol del plasma. La dosis recomendada en terapias hipocolesterolemiantes en humanos es menor a 1mg/Kg/día. Pero, aún a dosis terapéuticas, las estatinas causan en ocasiones disfunción hepática, progresión de las cataratas, disfunción eréctil, miopatías, sensibilidad al tacto o debilidad con niveles elevados de creatina quinasa. Hipótesis de Trabajo - Debido a sus múltiples efectos sobre la vía del mevalonato, los monoterpenos tendrían “in vivo” efectos hipocolesterolemiantes y antitumorales - El hecho de que la inhibición de la HMGCR por los monoterpenos se produzca a través de un mecanismo diferente del empleado por las estatinas y que además afecten a la vía del mevalonato a otros niveles, sugiere la posibilidad de que el uso combinado de estatinas con monoterpenos naturales permita disminuir la dosis efectiva de estatinas en el tratamiento de hipercolesterolemias e incrementar la eficacia de ambos compuestos. Objetivos - Evaluar in vivo la actividad hipocolesterolemiante e hipolipemiante del geraniol (G) y avanzar en el conocimiento de los mecanismos de acción de este monoterpeno en el metabolismo del colesterol y los triglicéridos mediante el estudio de la expresión de genes claves como el de HMGCR, el receptor de LDL y de SREBP. De este modo, se avanzará en el conocimiento de los beneficios que aporta G en la prevención / tratamiento de enfermedades cardiovasculares. - Estudiar el efecto antitumoral de G y de las estatinas in vivo, utilizando un modelo de adenocarcinoma de pulmón humano, en células A549 implantadas en ratones atímicos, con el fin de aportar conocimientos sobre los mecanismos por los cuales podrían ejercer actividad antitumoral, como así también determinar la relación existente entre la VM y el control del crecimiento celular. - Estudiar el efecto y mecanismo de acción de la combinación de estatinas (simvastatina) con monoterpenos (G) sobre el metabolismo lipídico, la síntesis de colesterol y el crecimiento tumoral. Metodología Ensayos con Geraniol: Para los estudios in vivo se utilizaron ratones NIH nu/nu. Los animales de aproximadamente 6 semanas de edad, provistos por el Centro Atómico Ezeiza, fueron criados en nuestro bioterio en ambiente climatizado, con ciclos de luz (6 a.m. a 6 p.m.) y oscuridad (6 p.m. a 6 a.m.) controlados en forma automática. Estos fueron alimentados “ad libitum” con una dieta standard de laboratorio para roedores esterilizada con radiación gamma, permitiéndoseles libre acceso al consumo de agua esterilizada en autoclave. Los ratones se dividieron en dos grupos: animales no portadores y animales portadores de tumor, los cuales fueron implantados subcutáneamente con la línea tumoral A549. Cada grupo fue subdividido en lotes experimentales que recibieron una dieta suplementada con cantidades crecientes de geraniol (0; 25; 50; 75 mmol de geraniol/Kg dieta) durante 21 días. Durante el tratamiento el tumor fue medido dos veces por semana. Se cuantificó trigliceridemia y colesterolemia utilizando un kit enzimático, síntesis lipídica en hígado por incorporación de [14C]acetato y contenido hepático de colesterol (libre y esterificado) y de ácidos grasos por métodos bioquímicos. Se determinó HMGCR por western blot y se midió su actividad enzimática en microsomas de hígado aislados. Se establecieron los niveles de ARNm de HMGCR, del receptor de LDL y del factor de transcripción SREBP-2 por RT-PCR a partir de ARN hepático aislado. Se determinaron los niveles de apoptosis tumoral por el método de TUNEL y midiendo la actividad de caspasa-3 y se cuantificó Ras en homogenado y en membrana del tumor. Ensayos con Simvastatina: Se utilizaron ratones NIH hembras portadoras del genotipo nu/nu. Los animales de aproximadamente 6 semanas de edad, provistos por el Centro Atómico Ezeiza, fueron criados en nuestro bioterio como se detalla anteriormente. Luego de ser implantados subcutáneamente con la línea tumoral A549 se dividieron en dos grupos, control y experimental, al que se le suplementó la dieta con Simvastatina (0.5mM) en el agua de bebida. El tratamiento se prolongó por 3 semanas. Dos veces por semana se midió el crecimiento relativo del tumor, en los diferentes lotes de animales, utilizando un calibre. Luego de finalizado el tratamiento los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron los tumores y los hígados de los mismos. Se determinó el porcentaje de células apoptóticas en los tumores obtenidos al momento del sacrificio de los animales y se cuantificó la proteína Ras en homogenado y en membrana plasmática del tumor. Aquí también se determinó síntesis lipídica hepática y contenido de colesterol (libre y esterificado) y de ácidos grasos en hígado. Ensayos con Geraniol y Simvastatina: animales portadores de tumor subcutáneo de células A549, se separaron en cuatro grupos: un grupo control y tres grupos experimentales; un grupo tratado con G (50 mmol / Kg de dieta) adicionado al alimento, otro con S (50 mg / Kg peso / día) suministrada en el agua de bebida y un grupo con la combinación de ambos compuestos a las concentraciones previamente mencionadas (G + S). El tratamiento se realizó durante tres semanas, en las cuales se monitoreó el crecimiento de los tumores y se controló asimismo el peso, el consumo de alimento y de agua de los animales. A las 3 semanas de tratamiento los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y se obtuvieron muestras de suero, hígado y tumor. Se midió apoptosis tumoral y los niveles de Ras total y Ras anclada a membrana plasmática de las células tumorales. Se determinó colesterol plasmático, hepático y tumoral, incorporación en hígado y en tumor de [14C]acetato en lípidos totales, lípidos insaponificables y ácidos grasos. Resultados y Conclusiones - Hemos demostrado que el geraniol tiene efectos hipolipemiantes y antitumorales “in vivo” en ratones nude con dosis que no presentan toxicidad. - Se avanzó en el conocimiento de los mecanismos de acción de este monoterpeno sobre la vía del mevalonato debido a que hemos demostrado: - Inhibición de la HMGCR a nivel postranscripcional, con una disminución de la cantidad y actividad de la enzima. Como consecuencia de ello disminuye la colesterogénesis en hígado y en tumor y aumenta la expresión del receptor de LDL hepático como mecanismo compensatorio al descenso del colesterol intracelular. - Inhibición de la cantidad de proteína Ras unida a membranas sin modificación de los niveles totales de la misma. Estos resultados sugieren una disminución de la prenilación por limitación en la disponibilidad de precursores o bien por inhibición directa de las preniltranferasas. - Se demostró una disminución de la síntesis de ácidos grasos que sugiere un posible mecanismo responsable del efecto hipolipemiante ejercido por el geraniol. - Se demostró un efecto proapoptótico y antiproliferativo del geraniol. A partir de nuestros resultados se sugiere que estos efectos se deberían a la limitación en la disponibilidad de lípidos esenciales para el crecimiento tumoral. - La administración combinada de geraniol y simvastatina inhibió significativamente el crecimiento e indujo la apostosis tumoral, y demostró tener un efecto sinérgico sobre la inhibición de la síntesis de lípidos tanto hepáticos como tumorales. Esto reforzaría la hipótesis de la acción inhibitoria del geraniol en distintos puntos de vías del metabolismo lipídico. Consideramos que la labor desarrollada en el presente trabajo colabora con una mejor comprensión de la acción de un componente muy frecuente en los aceites esenciales sobre una compleja vía metabólica, con el objetivo de mejorar el diseño de estrategias terapéuticas que incluyan el uso de compuestos naturales de manera individual o en combinación con drogas sintéticas para la lucha contra el cáncer y enfermedades asociadas a dislipemias.

La GK és clau en la regulació del metabolisme glucídic tant per la seva funció al pàncrees en què determina la secreció d’insulina, com per la seva funció al fetge on controla les vies d’utilització i d’emmagatzematge de glucosa. Per aquest motiu és una bona diana per a la teràpia de la diabetis, i diverses companyies farmacèutiques estan desenvolupant activadors sintètics de la GK (GKA) pel tractament de la diabetis de tipus 2. Els estudis de GKAs existents avaluen l’activació de la GK a nivell sistèmic i no es coneixen els seus efectes específis sobre la GK al fetge. Per indagar-los, com que no disposàvem d’un GKA específic per a la GK del fetge, ens vam proposar la sobrexpressió d’una forma de GK amb una mutació activadora (GK-A456V) que confereix característiques cinètiques a l’enzim idèntiques a les obtingudes amb els GKAs. L’introduírem al fetge perivenós mitjançant transfecció gènica hidrodinàmica (perquè és la zona on s’expressa majoritàriament l’enzim salvatge en condicions fisiològiques). Un dels controls emprats en l’estudi fou la sobrexpressió de la GK salvatge també a la zona perivenosa, que ens permetria comparar els resultats d’aquesta sobrexpressió local de la GK amb la sobrexpressió no zonal descrita a la bibliografia. Per una banda, avaluàrem els efectes de la sobrexpressió i de l’activació de la GK hepàtica en el context d’un animal sa a llarg termini, per determinar si hi havia risc de resistència a insulina (com s’esdevé en alguns models de sobrexpressió no zonal de GK al fetge). Tant l’activació com la sobrexpressió de GK al fetge perivenós a curt termini comportaren una disminució de la glicèmia i de la insulinèmia. No obstant, en avaluar-ho a llarg termini, la sobrexpressió de GK generà un fenotip de resistència a insulina exclusivament al fetge. En canvi, la GK-A456V comportà un fenotip amb un perfil metabòlic similar als animals controls, sense alteracions dels nivells de glúcids i lípids (sèrics i hepàtics). Al fetge, malgrat que no provocava canvis en el metabolisme glucídic i lipídic, l’activació de la GK va promoure la desregulació per GKRP i la inducció de la glucosa-6-fosfatasa. Per altra banda, la presència de la GK activada al fetge resultà en una activació del catabolisme al teixit adipós. Per altra banda, vam emprar un model de diabetis de tipus 1 per determinar els efectes de la GK-A456V sobre el fenotip diabètic independentment de la insulina, amb la finalitat de valorar l’activació de la GK hepàtica com a tractament alternatiu als GKAs sistèmics. La sobrexpressió perivenosa de GK, tot i que comportà un increment del metabolisme de glucosa al fetge (increment del glicogen hepàtic, de ub-PFK-2, de L-PK, c-myc) i una disminució de la gluconeogènesi (reducció dels nivells de PEPCK), va provocar dislipidèmia com a resultat de la disminució de la β-oxidació d’àcids grassos (reducció dels nivells de Cpt-1) i una inducció de la lipogènesi hepàtica (augment de FAS, ACC, ChREBP). Altres models de sobrexpressió de GK, descrits a la literatura, que no tenien en compte el concepte de zonació hepàtica, també presentaven alteracions en el metabolisme lipídic. En canvi, l’activació de la GK comportà una rellevant disminució de la hiperglicèmia diabètica tot i tenir un lleu efecte sobre l’activació del metabolisme de glucosa i sobre la inhibició de la gluconeogènesi. Sobretot és interessant que la millora de la hiperglicèmia diabètica no va acompanyada d’alteracions del metabolisme lipídic. En conjunt, aquest treball suggereix que l’activació de la GK exclusivament al fetge és una estratègia terapèutica millor per a la diabetis que la sobrexpressió de la GK. / Synthetic glucokinase activators have been used in the context of type 2 diabetes therapy, mainly for their insulin secretagogue activity. However, the impact of these drugs on liver GK has not been studied in vivo. Since GK activators and activating GK mutations confer identical kinetic properties to GK, we hypothesize that hepatic overexpression of a mutated form of GK, GKA456V, described in a patient with Persistent Hyperinsulinemic Hypoglycemia of Infancy (PHHI), shall mimic the liver-specific effects of GK-activating drugs. GKA456V was overexpressed in the liver of streptozotocin diabetic mice and also in healthy mice. Metabolite profiling in serum and liver extracts, together with key components of glucose and lipid homeostasis, were analyzed and compared to GK wild-type transfected animals. Cell compartmentalization of mutant and wild-type GK was also examined in vivo. In the type 1 diabetic mice, GKA456V overexpression markedly reduced blood glucose in the absence of dislipidemia, in contrast to wild-type GK-overexpressing mice. Enhanced glucose utilization did not correlate with glycogen synthesis or lactate production. PEPCK mRNA was not affected, whereas the mRNA for the catalytic subunit of glucose-6-phosphatase was upregulated ~4-fold in the liver of GKA456V treated animals. Moreover, GKA456V was not translocated to the nucleus after a short fast, confirming that this activating mutation disrupted GKRP regulation. In healthy mice, the overexpression of hepatic GK resulted in insulin resistance. Otherwise, GKA456V overepxressing animals were not insulin resistant. They showed increased mRNA and protein content of the catalytic subunit of glucose-6-phosphatase in the liver, and an idnuction of catabolism in their adipose tissue. Our results validate liver specific GK activation as a strategy for diabetes therapy and provide new insights into the complex GK regulatory network.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-25Bitstream added on 2014-06-13T19:09:24Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_ga_me_arafcf.pdf: 728795 bytes, checksum: bcd6fbe0c1522e95f7d9b8b9b1c94323 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O ácido ascórbico (AA), conhecido como vitamina C, é vital para o funcionamento das células e isso é particularmente evidente no tecido conjuntivo, pois é co-fator de duas enzimas essenciais na biossíntese do colágeno, a lisil e prolil hidroxilase. Aumenta a absorção de ferro e através de sua capacidade antioxidante protege as células e tecidos contra os danos oxidativos provocados pelos radicais livres e espécies reativas de oxigênio. No entanto, o AA quando incorporado em sistemas para o uso tópico é instável e por isso, é necessário que seja avaliada a sua estabilidade química. Este trabalho teve como objetivo desenvolver sistemas que auxiliem na estabilidade do AA, e para a avaliação da sua estabilidade química, foram propostos métodos de quantificação aplicados ao longo do tempo. Foram utilizados três métodos para a determinação e quantificação do AA, dois métodos titulométricos, que utilizam o NBS e o IODO como agentes titulantes e o método de inibição do radical DPPH (MIR), todos de baixo custo e fácil reprodutibilidade. Também foram realizados os ensaios in vitro de liberação, permeação e retenção cutânea para avaliar a eficácia do sistema que melhor auxiliou na manutenção da estabilidade química do AA ao longo do tempo. Foram preparados sistemas binários constituídos por propilenoglicol e água, sistemas contendo agregados supramoleculares (microemulsões e sistemas líquido cristalinos) e sistema emulsionado, e todos os sistemas foram adicionados de AA a 1%. Dentre os métodos de escolha o MIR foi validado por ser eficiente na quantificação de todos os sistemas propostos, diferentemente dos métodos titulométricos, que não foram adequados para os sistemas contendo agregados supramoleculares. O AA presente nos sistemas binários e sistemas contendo agregados supra moleculares foi determinado... / Ascorbic acid (AA), known as vitamin C is vital to the functioning of cells and this is particularly evident in the tissue, it is a cofactor for two essential enzymes for the biosynthesis of collagen, the lysyl and prolyl hydroxylase. Increases iron absorption and by its antioxidant protects cells and tissues against oxidative damage caused by free radicals and reactive oxygen species. However, when the AA incorporated into systems for topical use is unstable and therefore it must be evaluated their chemical stability. This study aimed to develop systems that aid in the stability of AA, and to evaluate their chemical stability, have been proposed quantification methods applied over time. Three methods were used for the determination and quantification of AA, two titrimetric methods, using NBS and iodine agents as titrants and method of inhibiting the radical DPPH (MIR), all of low cost and easily reproduced. Were also performed in vitro release, permeation and skin retention to evaluate the effectiveness of the system that best helped in maintaining the AA chemical stability over time. Binary systems were prepared consisting of propylene glycol and water system containing supramolecular aggregates (microemulsions and liquid crystalline systems) and emulsified system, in all systems were added 1% of AA. Among the methods of choice has been validated by the MIR to be effective in the quantification of all the systems proposed, unlike titrimetric methods, which are not suitable for systems containing supramolecular aggregates. The AA present in binary systems and systems containing molecular aggregates was determined above, and these systems have been less effective in relation to the emulsified system O/A, which showed greater ability to maintain the stability of AA with 63.98% content active throughout the 90... (Complete abstract click electronic access below)