As MMPs são endopeptidases zinco dependentes que, em conjunto, podem degradar todos os componentes da MEC e gerar moléculas bioativas. São as principais responsáveis pelo remodelamento tecidual durante eventos fisiológicos normais como a embriogênese e organogênese e também em eventos patológicos como a invasão tumoral nos tecidos. As pesquisas na área de mineralização biológica têm buscado identificar os genes envolvidos nos mecanismos moleculares que regula o processo de ossificação endocondral. As MMPs e seus inibidores são responsáveis pelo controle da degradação desta matriz, como os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs) e a proteína RECK, que, muito provavelmente, determinam o grau de remodelação da matriz extracelular. Desta forma, nosso objetivo foi delinear o perfil temporal e espacial da expressão das MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3- MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP e MMP-25/MT6-MMP durante a ossificação endocondral em embriões de camundongos e em animais recémnascidos através das técnicas de PCR em tempo real e imunohistoquímica. Por imunohistoquímica, nós não encontramos imunomarcação para a MMP-15/MT2- MMP em nenhum dos períodos analisados, apesar da padronização do anticorpo primário. Tanto a MMP-16/MT3-MMP quanto a MMP-24/MT5-MMP foram imunolocalizadas, principalmente, nos osteoblastos do fronte de ossificação da placa de crescimento. Para a MMP-17/MT4-MMP, durante a diferenciação condrocítica (E13) os condrócitos proliferativos foram imunocorados, bem como os condrócitos hipertróficos no centro da cartilagem do molde cartilaginoso (E14). Durante a invasão celular e vascular (E15), as células mesenquimais oriundas do colar ósseo, provavelmente pré-osteoblastos, foram imunocorados na cavidade medular primitiva e osteoblastos fronte de ossificação foram imunocorados, de E16 a PN1. Observamos para a MMP-25/MT6-MMP o mesmo padrão de imunomarcação das demais MT-MMPs, exceto no molde cartilaginoso, onde apenas as células do periósteo e pericôndrio foram imunocoradas, diferentemente da demais que foram localizadas apenas no centro do molde cartilaginoso. A análise da expressão dos transcritos para todas as MT-MMPs revelou o mesmo perfil de expressão, sendo alta durante a fase de diferenciação condrocítica (E13), tendo queda de expressão de E14 a E16. Em E16 há um aumento de expressão até E18 e, novamente, queda até E20 e pouca ou nenhuma expressão em PN7. Apesar deste perfil semelhante, houve uma expressão diferencial entre elas, sendo a MMP-15/MT2-MMP > MMP- 17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Os resultados obtidos mostram, pela primeira vez, que as MT-MMPs estão diferencialmente expressas durante a ossificação endocondral normal em camundongos, sugerindo que a atividade biológica destas enzimas esteja atuando na degradação da matriz extracelular pericelular tanto durante a fase de desenvolvimento quanto de formação óssea. / MMPs are zinc-dependent endopeptidases that, collectivelly, degrade all components of the ECM and generate bioactive molecules. They are able to remodelate the ECM during normal developmental processes such as embryogenesis and organogenesis, as well as in pathological processes such as tumoral invasion. The biological mineralization research looking for discovering the genes involved in the molecular mechanisms that control the endochondral ossification process. MMPs and their inhibitors (TIMPs and RECK) are responsable for bone matrix remodeling and, probably, determinate the level of its turnover. Thus, our goal was to evaluate the temporal-spatial expression of MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3-MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP, and MMP-25/MT6- MMP in mice embryos and newborns during endochondral ossification by Real Time PCR and immunohistochemistry. By immunohistochemistry, MMP-15/MT2-MMP signal was not detected. Both MMP-16/MT3-MMP and MMP-24/MT5-MMP were immunostained, mainly in osteoblasts at ossification front of growth plate. For MMP- 17/MT4-MMP, proliferative chondrocytes were immunopositive during chondrocyte differentiation (E13) as well as in hipertrophyc chondrocytes at the middle of cartilaginous template (E14). During cellular e vascular invasion (E15), mesenchymal cells from bone collar, probable pre-osteoblasts, were immunostained at primary bone marrow and osteoblasts at ossification front from E16 e PN1. For MMP- 25/MT6-MMP, perichondrial and periostal cellls were immunostained at cartilaginous template. All MT-MMPs evaluated showed the same transcript levels profile, being high in chondrocyte differentiation (E13), decreasing from E14 to E16. mRNA levels increased from E16 to E18 and, once more, decreasing from E18 to E20. Despite this profile, we observed difference levels: MMP-15/MT2-MMP > MMP-17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Our findings show, for the first time, that MT-MMPs are differentially expressed during normal endochondral ossification in mice, suggesting their biological activity act in pericellular extracellular matrix degradation in both development and bone formation.

Introdução: As queimaduras alcalinas da córnea fazem parte dos ferimentos mais devastadores para o olho. Objetivo: Os objetivos foram investigar o efeito aditivo do olho seco na atividade de proteases na superfície ocular e complicações corneanas apos lesão ocular alcalina e também investigar a eficácia da terapia anti-inflamatória controlar este processo. Métodos: Um modelo combinado (CM) de olho seco e queimadura alcalina unilateral foi usada. Resumidamente, camundongos C57BL /6 foram submetidos à queimadura alcalina unilateral (AB) com ou sem olho seco concomitante por 2 ou 5 dias. Um grupo separado de animais foram submetidos a ambos modelos (AB e olho seco) foram tratados topicamente com a Dexametasona, ou Doxiciclina ou colírio controle de solução salina balanceada (BSS). Os camundongos foram observados diariamente para verificar o aparecimento de perfuração da córnea. Córneas inteiras foram colhidas e homogeneizadas para extração de RNA. PCR quantitativo em tempo real foi realizada para medir a expressão de citocinas inflamatórias, metaloproteinases de matriz (MMP). Ativdade da MMP-9, atividade da gelatinase e da atividade da mieloperoxidase (MPO) foram avaliados em córneas homogeneizadas. A presença da infiltração de neutrófilos foi avaliada por imunohistoquímica e citometria de fluxo. Resultados: Os olhos submetidos ao modelo combinado de AB e olho seco (CM) tiveram 20% de taxa de perfuração estéril da córnea 1 dia após a lesão inicial; que aumentou para 35% em 5 dias. Houve um atraso no fechamento da ferida e aumento de opacidade residual da córnea. Aumento dos níveis de IL-1, IL-6, e as MMPs 1, -3, -8, -9, 13 e CXCL1, foram encontrados após 2 dias no CM comparando com córneas AB. Um aumento da imunorreatividade da MMP-1, -3, -9 e -13 e atividade gelatinolítica da MMP-9 foram observadas em comparação com córneas do grupo CM comparado com AB. O aumento da infiltração de neutrófilos e a atividade da mieloperoxidase foi observado no grupo CM comparando-se com córneas do grupo AB após dois dias da lesão inicial. Não foram observadas perfurações nas córneas tratadas com Dexametasona. Nos olhos tratados com Doxiciclina, 100% do fechamento da ferida pós-lesão no dia 2 e pontuação significantemente menor na escala de opacidade da córnea em relação ao BSS também foram observadas nos dias 4 e 5. Córneas tratadas com Dexametasona apresentaram a menor pontuação de opacidade da córnea. Tratamento com Dexametasona diminuiu significativamente os níveis de mRNA da IL-1, IL-6, e MMP-1, -9, -13, e o TIMP-1 depois de 2 dias, e aumentou os níveis de MMP-8, enquanto que o tratamento com Doxiciclina diminuiu significativamente IL-1, IL-6, MMP-8, -9 e, em comparação com córneas tratadas com BSS. A diminuição da imunorreatividade da MMP-1, -9 e -13 e atividade gelatinolítica foram vistos em córneas tratadas com Doxiciclina e Dexametasona em comparação com o veículo BSS. O aumento da infiltração de neutrófilos e a atividade da mieloperoxidase foi observado no grupo BSS comparação com o grupo Dexametasona 2 dias pós-lesão. Conclusões: O olho seco ambiental piora o resultado da queimadura ocular alcalina, criando uma tempestade de citocinas e proteases, aumentando o risco de perfuração corneana. Entretanto, o tratamento inicial com terapia anti-inflamatória é muito eficaz na preservação da transparência corneana e facilita a cicatrização de feridas, enquanto controla a produção de MMP e a migração de neutrófilos. / Introduction: Alkali burns to the cornea are among the most devastating injuries to the eye. Purpose: To evaluate the effects of dry eye on ocular surface protease activity and sight threatening corneal complications following ocular surface chemical injury and also to investigate the efficacy of anti-inflammatory therapy controlling this. Methods: A combined model (CM) of unilateral alkali burn and dry eye was used. Briefly, C57BL/6 mice were subjected to unilateral alkali burn (AB) with or without concomitant dry eye for 2 or 5 days. A separate group of mice subjected to both AB and dry eye were topically treated with Dexamethasone (Dex), Doxycycline (Doxy) or saline control (BSS). Mice were observed daily for appearance of corneal perforation. Whole corneas were harvested and lysed for RNA extraction. Quantitative real time PCR was performed to measure expression of inflammation cytokines, matrix metalloproteinases (MMP). MMP-9 activity, gelatinase activity and myeloperoxidase (MPO) activity were evaluated in corneal lysates. Presence of infiltrating neutrophils was evaluated by immunohistochemistry and flow cytometry. Results: Eyes subjected to the combined model of AB and dry eye (CM) had 20% sterile corneal perforation rate as soon as 1 day after the initial injury, which increased to 35% by 5 days, delayed wound closure and increased corneal opacity. Increased levels of IL- 1, IL-6, and MMPs 1,-3,-8,-9, 13, and CXCL1 transcripts were found after 2 days in CM compared to AB corneas. Increased MMP-1, -3,-9 and -13 immunoreactivity and gelatinolytic activity were seen in CM corneas compared to AB. Increased neutrophil infiltration and MPO activity was noted in the CM group compared to AB 2 days post injury. No perforations were observed in the Dex treated corneas. Doxy treated eyes had 100% of wound closure 2D post-injury, and significant lower corneal opacity scores at days 4 and 5 compared to BSS. Dex-treated corneas showed the lowest corneal opacity score. Dex treatment significantly decreased mRNA levels of IL-1, IL-6, and MMPs -1,-9, -13, and TIMP-1 after 2 days with increased levels of MMP-8, while Doxy treatment significantly decreased IL-1, IL-6, MMP-8, and -9, compared to BSS-treated corneas. Decreased MMPs -1,-9 and -13 immunoreactivity and gelatinolytic activity were seen in corneas treated with Doxy and Dex compared to BSS vehicle. Increased neutrophil infiltration and MPO activity was noted in the BSS group compared to Dex 2 D post-injury. Conclusions: Desiccating stress worsens outcome of ocular alkali burn, creating a cytokine and protease storm with greater neutrophil infiltration, increasing the risk of corneal perforation. However, early treatment with anti-inflammatory therapy is very efficacious in preserving corneal clarity and facilitating wound healing, while controlling MMP production and migration of neutrophils.

Os avanços relacionados à ciência dos biomateriais e engenharia tecidual buscam esclarecer os mecanismos envolvidos na resposta biológica associada ao uso desses dispositivos e sua interação com o sistema imune. Neste estudo, avaliou-se a resposta imune e inflamatória desenvolvida em camundongos frente à implantação de membrana de cortical óssea bovina no tecido subcutâneo, em implantação única e sequencial de duas membranas, assim como os possíveis mecanismos envolvidos no processo de reconhecimento e reabsorção desse biomaterial, de acordo com análise histomorfométrica, enzimática e molecular. Após a implantação da membrana, sinais de reabsorção que antes eram notados em pontos isolados, aos poucos se unem até sua completa degradação, observada somente após 15 dias. Todo o processo de reabsorção da membrana é acompanhado por uma reação inflamatória de magnitude moderada, seguida pelo declínio do número de leucócitos, surgimento de células gigantes multinucleadas e formação de uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso. A cinética de TNF- e MMP-2, MMP-8, MMP-9 e MMP-13 apresentou um padrão de produção decrescente, entretanto os níveis dos inibidores de metaloproteinases (TIMPs) e TGF- parecem atuar de forma inversa. A velocidade de reabsorção após duas implantações consecutivas da membrana foi maior quando comparada ao grupo de animais que sofreu apenas uma implantação, porém os resultados do teste de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) demonstraram que a membrana é biocompatível, pois não elicitou resposta imunológica exacerbada após uma segunda implantação, confirmando então a natureza não imunogênica desse biomaterial. Finalmente, os animais CD14KO e MyD88KO apresentaram uma reabsorção mais lenta da membrana implantada, quando comparados aos animais C57Bl/6 (WT), demonstrando que as moléculas CD14 e MyD88 estão envolvidas no reconhecimento do biomaterial e desempenham importante papel no processo de reabsorção da membrana de cortical óssea bovina, indicando a participação de PAMPs e/ou DAMPs na resposta biológica gerada por esse biomaterial. / Advances related to the biomaterials science and tissue engineering seek to clarify the mechanisms involved in the biological response associated with the use of those devices and their interaction with the immune system. This study evaluated the inflammatory and immune response developed in mice after implantation bovine bone cortical membrane in subcutaneous tissue, in both, unique and sequential implantation of 2 membranes, as the mechanisms involved in this biomaterial recognition and resorption process, on regards to histomorphometric, enzymatic and molecular analysis. After membrane implantation, previously observed signs of resorption in isolated spots, gradually unite until their complete degradation after 15 days. The whole membrane resorption process is accompanied by a moderate inflammatory reaction, followed by a decline in the leukocytes number, appearance of multinucleated giant cells and formation of a capsule of fibrous connective tissue. The kinetics of TNF-, MMP-2, MMP-8, MMP-9 e MMP-13 showed a pattern of decreasing production, however, levels of metalloproteinases inhibitors (TIMPs) and TGF- seem to act in reverse way. The resorption rate after two successive membrane implantations was higher when compared to the group which suffered only one implantation, however, the results of delayed test hypersensity (DTH) demonstrated that the membrane is biocompatible, that is, it does not elicited too high immune response after a second position, confirming the non immunogenic nature of this biomaterial. Eventually, CD14KO and MyD88KO strains showed a slower membrane resorption when compared to animals C57Bl/6, demonstrating that the CD14 and MyD88 molecules are involved in biomaterial recognition and play an important role in bovine cortical bone membrane resorption process, indicating that PAMPs and/or DAMPs are involved in biological response generated by this biomaterial.

Orientador: José Eduardo Tanus dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-11-07T16:45:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_ValeriaAguiar_D.pdf: 9967733 bytes, checksum: 0f5a9488cc56b0e1272b80bd9cb6ea0b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A síndrome do ovário policístico (SOP) é a endocrinopatia mais comum em mulheres na idade reprodutiva e está frequentemente associada a alguns fatores de risco cardiovascular. A grande maioria das doenças cardiovasculares (DCV) ocorre inicialmente com o remodelamento vascular, em que as metaloproteinases de matriz (MMPs) são os principais mediadores. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi comparar os níveis plasmáticos da MMP-2 e da MMP-9 e dos inibidores teciduais de MMPs (TIMPs) das pacientes com SOP com as controles saudáveis e examinar se os níveis desses biomarcadores estão associados com às características clínicas e bioquímicas da SOP. Além disso, avaliar o efeito do anticoncepcional oral sobre os níveis plasmáticos de MMPs e respectivos inibidores endógenos nas mulheres com SOP. Para isso, na primeira parte do estudo, avaliamos 65 controles ovulatórias e 80 pacientes com SOP. As concentrações plasmáticas de MMP-8, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 foram medidas por Elisa e, as de MMP-2, por zimografia. Os níveis de MMP-2, MMP-8, MMP-9 e TIMP-1 não foram significativamente diferentes entre os grupos (p? 0,05). Pacientes com SOP apresentaram menores níveis plasmáticos de TIMP-2 do que as controles saudáveis (182,30 ± 5,60 vs. 204,20 ± 7,28 ng/ml; p ?0,05). Além disso, a testosterona foi preditor independente dos níveis de TIMP-2 (estimativa = -0,35, p = 0,04) e da razão MMP-9/TIMP-1 (estimativa = 0,01, p = 0,04). Para avaliar se a redução do hiperandrogenismo iria promover alguma alteração no perfil das MMPs, foram analisadas 20 mulheres com SOP que queriam contracepção hormonal (grupo SOP- ACO), 20 mulheres ovulatórias que desejavam contracepção hormonal (grupo controle- ACO) e 15 mulheres ovulatórias que desejavam contracepção não-hormonal (grupo controle). O tratamento com ACO contendo 30 mcg de etinilestradiol/2mg de acetato de clormadinona durante 6 meses reduziu significativamente as concentrações plasmáticas de MMP-2 no grupo controle ( de 1,44 ± 0,11 unidades arbitrárias no tempo basal para 1,22 ± 0,07 unidades arbitrárias após 6 meses; p = 0,01), e no grupo SOP ( de 1,43 ± 0,08 unidades arbitrárias no tempo basal para 1,25 ± 0,09 unidades arbitrárias após 6 meses; p = 0,007). O ACO reduziu as concentrações de TIMP-2 e TIMP-1 no grupo controle (todos p ?0,05), mas não teve efeitos na MMP-9 plasmática e nas razões MMP-2/TIMP-2 e MMP-9/TIMP-1 (todos p? 0,05) nos grupos avaliados. Os achados do presente estudo indicam que as mulheres com SOP possuem um desequilíbrio nas razões MMP-2/TIMP-2 e MMP-9/TIMP-1, bem como níveis reduzidos de TIMP-2. Parte desses achados estão relacionados ao hiperandrogenismo presente nessas mulheres. Na segunda parte do estudo, observamos que a redução do hiperandrogenismo, promovido pelo tratamento em longo prazo com o ACO, reduziu as concentrações plasmáticas de MMP-2. Considerando o desequilíbrio no perfil das MMPs apresentado pelas mulheres com SOP e, as possíveis consequências decorrentes desse cenário, o tratamento com ACO se mostra benéfico nessas pacientes, podendo reduzir os riscos de futuras complicações cardiovasculares / Abstract: The polycystic ovary syndrome (PCOS) is the most common endocrinopathy in women of reproductive age and it is often associated with some cardiovascular risk factors. The majority of cardiovascular disease (CVD) occurs initially with vascular remodeling in which matrix metalloproteinases (MMPs) are key mediators. Therefore, the aim of this study was to compare plasma levels of MMP-2 and MMP-9 and tissue inhibitors of MMPs (TIMPs) of PCOS patients with healthy controls and to examine whether the levels of these biomarkers are associated with clinical and biochemical characteristics of PCOS. In addition to it, our goal was to evaluate the effect of oral contraceptives on plasma levels of MMPs and their endogenous inhibitors in women with PCOS. In order to prove it, in the first part of the study we evaluated 65 controls and 80 patients with ovulatory PCOS. The plasma concentration of MMP-8, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 were measured by Elisa, and MMP-2 by zymography. The levels of MMP-2, MMP-8, MMP-9 and TIMP-1 were not significantly different between groups (p? 0.05). PCOS patients had lower their plasma levels of TIMP-2 than healthy controls ones (182,30 ± 5,60 vs. 204,20 ± 7,28 ng/ml; p = 0,02). Furthermore, testosterone was an independent predictor of the levels of TIMP-2 (estimate = -0.35, p = 0.04) and the MMP-9/TIMP- 1 ratio (estimate = 0.01, p = 0.04). To assess whether the reduction of hyperandrogenism would promote a change in the profile of MMPs, we analyzed 20 women with PCOS who wanted to hormonal contraception (OC-PCOS group), 20 ovulatory women who required hormonal contraception (OC-control group) and 15 ovulatory women who wanted non-hormonal contraception wanted a nonhormonal contraception (non-OC control group). Treatment with OC containing 2 mg chlormadinone acetate/30 ?g ethinylestradiol for 6 months significantly reduced plasma MMP-2 concentrations in the OC-control (from 1.44 ± 0.11 arbitrary units at baseline to 1.22 ± 0.07 arbitrary units after 6 months; p = 0.01) and the PCOS groups (from 1.43 ± 0.08 arbitrary units at baseline to 1.25 ± 0.09 arbitrary units after 6 months; p = 0.007) and TIMP-2 and TIMP-1 levels (448.0 ± 66.3 ng/mL versus 349.0 ± 40.9 ng/mL; p = 0.009) in the OC-control group (all p ?0.05) but had no effects on MMP-9 concentrations or on MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP- 1 ratios (all p? 0.05) in any group. The results of this study indicate that women with PCOS have an imbalance in the MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP-1 ratios and reduced levels of TIMP-2. Parts of these findings are also related to hyperandrogenism presence in these women. In the second part of the study, we observed that the reduction of hyperandrogenism promoted by long-term treatment with the OC reduced plasma concentrations of MMP-2. Given the imbalance in the profile of MMPs presented by women with PCOS and the possible consequences of this scenario, treatment with OC shows beneficial in these patients may reduce the risk of future cardiovascular complications / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Introdução: Demonstramos previamente que em modelo experimental de enfisema pulmonar induzido por instilação de elastase, o inibidor de serinoprotease rBmTI-A promoveu a melhora da destruição tecidual em camundongos. Considerando que o tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e que o modelo de exposição à fumaça de cigarro é considerado o que melhor mimetiza esta doença em humanos, este estudo teve por objetivo verificar a ação do inibidor para serinoproteases rBmTI-A sobre os processos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do enfisema pulmonar, em modelo de exposição ao tabaco. Métodos: Para a indução do enfisema pulmonar, os animais foram expostos à fumaça de cigarro (duas vezes ao dia/ 30 minutos/ 5 dias por semana/ durante 12 semanas), e os animais controle permaneceram expostos ao ar ambiente. Dois protocolos de tratamento com o inibidor rBmTI-A foram realizados. No primeiro, os animais receberam duas administrações do inibidor rBmTI-A ou de seu veículo (Solução Salina 0,9%) por via intranasal, sendo a primeira após 24h do término das exposições ao cigarro e outra, 7 dias após à primeira instilação do inibidor. No segundo protocolo, os animais receberam 3 administrações do inibidor rBmTI-A, durante o tempo de exposição (1ª dose: 24h antes do início da exposição à fumaça de cigarro; 2ª dose: um mês após o início da exposição; 3ª dose: dois meses após o início). Após o término dos protocolos de exposição e tratamento, os animais foram submetidos aos procedimentos para coleta dos dados de mecânica respiratória e avaliação do Intercepto Linear Médio (Lm). Para o segundo protocolo, realizamos também as medidas para quantificação de fibras de colágeno e elástica, da densidade de células positivas para MAC-2, MMP-12 e 9, TIMP-1, Gp91phox e TNFalfa; no parênquima através de imunohistoquímica, contagem de células polimorfonucleares além da expressão gênica de MMP-12 e 9 no pulmão através de RT-qPCR. Resultados e Discussão: O tratamento com o inibidor para serinoprotease rBmTI-A atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar apenas no segundo protocolo, quando foi administrado durante a exposição à fumaça de cigarro. Embora os grupos Fumo-rBmTIA e Fumo-VE apresentem aumento de Lm comparados aos grupos controles, houve uma redução deste índice no grupo Fumo-rBmTIA comparado ao grupo Fumo-VE. O mesmo comportamento foi observado para as análises de proporção em volume de fibras de elástica e colágeno no parênquima. Além disto, observamos aumento de macrófagos, MMP-12, MMP-9 e TNFalfa; nos grupos expostos à fumaça de cigarro, mas o tratamento com o inibidor rBmTI-A diminuiu apenas a quantidade de células positivas para MMP-12. Na avaliação da expressão gênica para MMP-12 e 9, não observamos diferença entre os grupos experimentais e o mesmo comportamento foi observado para a quantidade de células polimorfonucleares no parênquima. Além disso, observamos aumento de GP91phox e TIMP-1 nos grupos tratados com rBmTIA. Conclusões: Tais resultados sugerem que o inibidor rBmTI-A não foi efetivo como tratamento da lesão após a doença instalada. Entretanto, atenuou o desenvolvimento da doença quando administrado durante a indução do enfisema, possivelmente através do aumento de GP91phox e TIMP-1, acompanhados pela diminuição de MMP-12. / Introduction: We have previously showed that in an elastase-induced model of emphysema, the treatment with a serine protease inhibitor rBmTI-A, resulted in an improvement of tissue destruction in mice. Considering that smoking is the main risk factor for the development of COPD, and the cigarette smoke (CS) exposure is considered the best model to reproduce physiopathologic similarities with such disease in humans, this study aimed to verify the rBmTI-A treatment on the physiopathological processes involved in the development of cigarette smoke-induced emphysema. Methods: To induce pulmonary emphysema, animals were exposed to cigarette smoke (twice a day/ 30 minutes/ 5 days per week/ for 12 weeks) and the control animals were exposed to room air. Two treatment protocols with rBmTI-A inhibitor were performed. In the first one, animals received two administrations of rBmTI-A inhibitor or its vehicle (Saline Solution 0.9%) by nasal instillation, one dose at 24 hours after the end of exposure to tobacco smoke and another one, 7 days after the first instillation of the inhibitor. In the second protocol, animals received 3 rBmTI-A inhibitor administrations during the exposition time (1st dose: 24 hours before the start of exposure to cigarette smoke; 2nd dose: one month after the start of exposure, 3rd dose: two months after the start). After the end of exposure and treatment protocols, animals were submitted to procedures for collection of respiratory mechanics and evaluation of the Mean Linear Intercept (Lm). For the second protocol, we also measured the volume proportion of collagen and elastic fibers, the density of positive cells for MAC-2, MMP-12 and -9, TIMP-1, GP91phox and TNF-alfa in lung parenchyma by immunohistochemistry. Also, we evaluated the measurement of polymorphonuclear cells and the lung gene expression for MMP-12 and 9 by RT-qPCR. Results and Discussion: Treatment with the serine protease inhibitor rBmTI-A attenuated the development of emphysema only in the second protocol, when it was administered during exposure to cigarette smoke. Although Smoke-rBmTIA and Smoke-VE groups showed an increase of Lm measure compared to Control groups, there were a decrease in the Smoke-rBmTIA group compared to Smoke-VE group. The same response was observed for the analysis of volume proportion of elastic and collagen fibers in parenchyma. In addition, we observed an increase of macrophages, MMP-12, MMP-9 and TNF-alfa; in groups exposed to cigarette smoke, but treatment with rBmTI-A inhibitor only decreased the number of positive cells for MMP-12. We did not observed difference between the experimental groups in lungs gene expression for MMP- 12 and 9, and the same behavior was observed for the amount of polymorphonuclear cells in parenchyma. Moreover, we observed an increase of GP91phox and TIMP-1 in groups treated with rBmTI-A. Conclusions: These results suggest that rBmTI-A inhibitor was not effective for treatment of parenchymal lesions after established disease. However, this inhibitor attenuated the development of disease when administered during the induction of emphysema, possibly by an increase of GP91phox and TIMP-1, accompanied by a decrease of MMP-12

A desnutrição proteica (DP) pode ocasionar alterações na matriz extracelular (MEC) de diferentes órgãos e tecidos, inclusive o hematopoético, com comprometimento funcional. Estudos do nosso laboratório demonstraram, em modelo murino de DP, aumento da expressão proteica de fibronectina (FN) no estroma medular ósseo in vivo, principalmente na região subendosteal (local de fixação da célula tronco progenitora hemopoética). Já in vitro, no estroma medular ósseo, observou-se tanto o aumento quanto a diminuição de FN e a presença de suas isoformas. Essas alterações de FN parecem estar envolvidas com a hipoplasia da medula óssea (MO) em camundongos desnutridos. As modificações quantitativas de FN podem ser devidas: (i) à ação das metaloproteinases de matriz (MMP) responsáveis pela degradação das proteínas da MEC; (ii) aos inibidores de metaloproteinases (TIMP) que regulam a degradação da MEC; (iii) às alterações transcricionais, reguladas pela via de AKT/mTOR, que controla os splicing alternativos na FN, resultando em isoformas dessa proteína; (iv) a processos pós-transcricionais modulados por LC3, que aumenta a tradução do RNAm de FN. Assim, o objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos que alteram o turnover de FN no estroma medular ósseo em modelo murino de DP. Utilizamos camundongos, C57BL/6J machos, adultos, separados em dois grupos: controle e desnutrido, alimentados, ad libitum, com ração contendo 12% e 2% de proteína, respectivamente. Após cinco semanas de indução à desnutrição os camundongos foram eutanasiados, e coletado o material biológico. Avaliamos: o estado nutricional, o hematológico, a histologia da MO femoral bem como a determinação imunohistoquímica da FN, MMP-2 e MMP-9, determinação da expressão de FN e suas isoformas em células totais da MO, o estabelecimento do estroma medular ósseo in vitro, por 28 e 35 dias de cultivo. A partir das culturas foram avaliadas a expressão de RNAm de FN e suas isoformas, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR e LC3α e β, quantificação de MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ e IL-1β e determinação de LC3β e proteínas da via de AKT/mTOR. Não observamos alterações na expressão do RNAm de FN e suas isoformas ex vivo e in vitro, mas um aumento da deposição de FN na MO.Também não observamos modificações na imunolocalização de MMP-2 e MMP-9 na MO e na atividade dessas proteínas no sobrenadante de culturas de células estromais in vitro, mas houve aumento da expressão do RNAm de MMP-9 em 28 dias de cultivo. Não detectamos alterações na expressão de RNAm e na concentração de TIMP-1 e TIMP-2 no sobrenadante das culturas. Houve redução significativa de TNFα e TGFβ no sobrenadante das culturas de 28 dias. Observamos aumento da expressão do RNAm de mTOR em culturas de 28 dias e LC3α e LC3β em 35 dias de células estromais. Encontramos menor fosforilação de PI3K, AKT, PTEN, mTOR e mTOR total e aumento de LC3β em culturas de 28 dias, mas redução de LC3β em 35 dias. Em função dos dados inferimos que a DP conduz a alterações da FN que não estão relacionadas à ação de MMPs e TIMPs e sim a modificações de LC3β e da via de AKT/mTOR. / Protein malnutrition (PM) can lead changes in extracellular matrix (ECM) from several organs and tissues, including hematopoietic, with functional impairments. Research from our laboratory demonstrated, in a murine model of protein malnutrition, increase in proteic expression of fibronectin (FN) in vivo bone marrow stroma, principally in subendosteal region (attachment site of hematopoietic stem/progenitor cell - HSPC). It was observed as both an increase and a decrease in the presence of FN and its isoforms in vitro bone marrow stroma. These FN changes seem to be related to bone marrow (BM) hypoplasia in malnourished mice. Quantitative FN changes may be due to: (i) action of matrix metalloproteinases (MMP) responsible for ECM proteins degradation; (ii) tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) that regulate ECM degradation; (iii) transicional changes regulated by AKT/mTOR pathway, which controls alternative splicing in FN, resulting in isoforms from this protein; (iv) post-transcriptional processes modulated by LC3 that increases FN mRNA translation. Therefore, the aim of this study was to elucidade the mechanisms that changes the FN turnover in bone marrow stroma in a murine model of PM. C57BL/6J, adult and male mice were used and divided into two groups: control and malnourished, fed ad libitum with ration containing 12% and 2% of protein, respectively. After five weeks of induction malnutrition, mice were euthanized and the biological material was collected. We evaluated: nutritional and hematologic status, the femoral BM histology, immunohistochemistry determination of FN, MMP-2 and MMP-9, the FN and its isoforms expression determination in total BM cells, establishment of in vitro bone marrow stroma for 28 and 35 days of culture. From the cultures were evaluated FN mRNA expressions and its isoforms, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, AKT, mTOR, LC3α and β, quantification of MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2,TNFα, TGFβ and IL-1β and determination of LC3β and AKT/mTOR proteins. No changes were observed, ex vivo and in vitro, in the expression of FN mRNA and its isoforms, but there was a FN deposition increase in BM. We did not observe modifications in MMP-2 e MMP-9 immunolocalization in BM and in these proteins activity in the supernatant of in vitro stromal cell culture, but there was an increase in MMP-9 mRNA expression after 28 days of culture. We did not detect changes in mRNA and in TIMP-1 and TIMP-2 expressions in the supernatant of cultures. There was significant reduction of TNFα and TGFβ in the cultures supernatant of 28 days. We observed an increase of mTOR RNAm in 28 days cultures and also LC3α and LC3β in stromal cells with 35 days. We found lower phosphorylation of PI3K, AKT, PTEN, mTOR e total mTOR and an LC3β increase in 28 days cultures, yet an LC3β reduction in 35 days. According to the data we conclude that PM leads to FN changes that are not related to MMPs and TIMPs actions, but the LC3β and AKT/mTOR pathway modifications.

Introdução: As queimaduras alcalinas da córnea fazem parte dos ferimentos mais devastadores para o olho. Objetivo: Os objetivos foram investigar o efeito aditivo do olho seco na atividade de proteases na superfície ocular e complicações corneanas apos lesão ocular alcalina e também investigar a eficácia da terapia anti-inflamatória controlar este processo. Métodos: Um modelo combinado (CM) de olho seco e queimadura alcalina unilateral foi usada. Resumidamente, camundongos C57BL /6 foram submetidos à queimadura alcalina unilateral (AB) com ou sem olho seco concomitante por 2 ou 5 dias. Um grupo separado de animais foram submetidos a ambos modelos (AB e olho seco) foram tratados topicamente com a Dexametasona, ou Doxiciclina ou colírio controle de solução salina balanceada (BSS). Os camundongos foram observados diariamente para verificar o aparecimento de perfuração da córnea. Córneas inteiras foram colhidas e homogeneizadas para extração de RNA. PCR quantitativo em tempo real foi realizada para medir a expressão de citocinas inflamatórias, metaloproteinases de matriz (MMP). Ativdade da MMP-9, atividade da gelatinase e da atividade da mieloperoxidase (MPO) foram avaliados em córneas homogeneizadas. A presença da infiltração de neutrófilos foi avaliada por imunohistoquímica e citometria de fluxo. Resultados: Os olhos submetidos ao modelo combinado de AB e olho seco (CM) tiveram 20% de taxa de perfuração estéril da córnea 1 dia após a lesão inicial; que aumentou para 35% em 5 dias. Houve um atraso no fechamento da ferida e aumento de opacidade residual da córnea. Aumento dos níveis de IL-1, IL-6, e as MMPs 1, -3, -8, -9, 13 e CXCL1, foram encontrados após 2 dias no CM comparando com córneas AB. Um aumento da imunorreatividade da MMP-1, -3, -9 e -13 e atividade gelatinolítica da MMP-9 foram observadas em comparação com córneas do grupo CM comparado com AB. O aumento da infiltração de neutrófilos e a atividade da mieloperoxidase foi observado no grupo CM comparando-se com córneas do grupo AB após dois dias da lesão inicial. Não foram observadas perfurações nas córneas tratadas com Dexametasona. Nos olhos tratados com Doxiciclina, 100% do fechamento da ferida pós-lesão no dia 2 e pontuação significantemente menor na escala de opacidade da córnea em relação ao BSS também foram observadas nos dias 4 e 5. Córneas tratadas com Dexametasona apresentaram a menor pontuação de opacidade da córnea. Tratamento com Dexametasona diminuiu significativamente os níveis de mRNA da IL-1, IL-6, e MMP-1, -9, -13, e o TIMP-1 depois de 2 dias, e aumentou os níveis de MMP-8, enquanto que o tratamento com Doxiciclina diminuiu significativamente IL-1, IL-6, MMP-8, -9 e, em comparação com córneas tratadas com BSS. A diminuição da imunorreatividade da MMP-1, -9 e -13 e atividade gelatinolítica foram vistos em córneas tratadas com Doxiciclina e Dexametasona em comparação com o veículo BSS. O aumento da infiltração de neutrófilos e a atividade da mieloperoxidase foi observado no grupo BSS comparação com o grupo Dexametasona 2 dias pós-lesão. Conclusões: O olho seco ambiental piora o resultado da queimadura ocular alcalina, criando uma tempestade de citocinas e proteases, aumentando o risco de perfuração corneana. Entretanto, o tratamento inicial com terapia anti-inflamatória é muito eficaz na preservação da transparência corneana e facilita a cicatrização de feridas, enquanto controla a produção de MMP e a migração de neutrófilos. / Introduction: Alkali burns to the cornea are among the most devastating injuries to the eye. Purpose: To evaluate the effects of dry eye on ocular surface protease activity and sight threatening corneal complications following ocular surface chemical injury and also to investigate the efficacy of anti-inflammatory therapy controlling this. Methods: A combined model (CM) of unilateral alkali burn and dry eye was used. Briefly, C57BL/6 mice were subjected to unilateral alkali burn (AB) with or without concomitant dry eye for 2 or 5 days. A separate group of mice subjected to both AB and dry eye were topically treated with Dexamethasone (Dex), Doxycycline (Doxy) or saline control (BSS). Mice were observed daily for appearance of corneal perforation. Whole corneas were harvested and lysed for RNA extraction. Quantitative real time PCR was performed to measure expression of inflammation cytokines, matrix metalloproteinases (MMP). MMP-9 activity, gelatinase activity and myeloperoxidase (MPO) activity were evaluated in corneal lysates. Presence of infiltrating neutrophils was evaluated by immunohistochemistry and flow cytometry. Results: Eyes subjected to the combined model of AB and dry eye (CM) had 20% sterile corneal perforation rate as soon as 1 day after the initial injury, which increased to 35% by 5 days, delayed wound closure and increased corneal opacity. Increased levels of IL- 1, IL-6, and MMPs 1,-3,-8,-9, 13, and CXCL1 transcripts were found after 2 days in CM compared to AB corneas. Increased MMP-1, -3,-9 and -13 immunoreactivity and gelatinolytic activity were seen in CM corneas compared to AB. Increased neutrophil infiltration and MPO activity was noted in the CM group compared to AB 2 days post injury. No perforations were observed in the Dex treated corneas. Doxy treated eyes had 100% of wound closure 2D post-injury, and significant lower corneal opacity scores at days 4 and 5 compared to BSS. Dex-treated corneas showed the lowest corneal opacity score. Dex treatment significantly decreased mRNA levels of IL-1, IL-6, and MMPs -1,-9, -13, and TIMP-1 after 2 days with increased levels of MMP-8, while Doxy treatment significantly decreased IL-1, IL-6, MMP-8, and -9, compared to BSS-treated corneas. Decreased MMPs -1,-9 and -13 immunoreactivity and gelatinolytic activity were seen in corneas treated with Doxy and Dex compared to BSS vehicle. Increased neutrophil infiltration and MPO activity was noted in the BSS group compared to Dex 2 D post-injury. Conclusions: Desiccating stress worsens outcome of ocular alkali burn, creating a cytokine and protease storm with greater neutrophil infiltration, increasing the risk of corneal perforation. However, early treatment with anti-inflammatory therapy is very efficacious in preserving corneal clarity and facilitating wound healing, while controlling MMP production and migration of neutrophils.

As MMPs são endopeptidases zinco dependentes que, em conjunto, podem degradar todos os componentes da MEC e gerar moléculas bioativas. São as principais responsáveis pelo remodelamento tecidual durante eventos fisiológicos normais como a embriogênese e organogênese e também em eventos patológicos como a invasão tumoral nos tecidos. As pesquisas na área de mineralização biológica têm buscado identificar os genes envolvidos nos mecanismos moleculares que regula o processo de ossificação endocondral. As MMPs e seus inibidores são responsáveis pelo controle da degradação desta matriz, como os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs) e a proteína RECK, que, muito provavelmente, determinam o grau de remodelação da matriz extracelular. Desta forma, nosso objetivo foi delinear o perfil temporal e espacial da expressão das MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3- MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP e MMP-25/MT6-MMP durante a ossificação endocondral em embriões de camundongos e em animais recémnascidos através das técnicas de PCR em tempo real e imunohistoquímica. Por imunohistoquímica, nós não encontramos imunomarcação para a MMP-15/MT2- MMP em nenhum dos períodos analisados, apesar da padronização do anticorpo primário. Tanto a MMP-16/MT3-MMP quanto a MMP-24/MT5-MMP foram imunolocalizadas, principalmente, nos osteoblastos do fronte de ossificação da placa de crescimento. Para a MMP-17/MT4-MMP, durante a diferenciação condrocítica (E13) os condrócitos proliferativos foram imunocorados, bem como os condrócitos hipertróficos no centro da cartilagem do molde cartilaginoso (E14). Durante a invasão celular e vascular (E15), as células mesenquimais oriundas do colar ósseo, provavelmente pré-osteoblastos, foram imunocorados na cavidade medular primitiva e osteoblastos fronte de ossificação foram imunocorados, de E16 a PN1. Observamos para a MMP-25/MT6-MMP o mesmo padrão de imunomarcação das demais MT-MMPs, exceto no molde cartilaginoso, onde apenas as células do periósteo e pericôndrio foram imunocoradas, diferentemente da demais que foram localizadas apenas no centro do molde cartilaginoso. A análise da expressão dos transcritos para todas as MT-MMPs revelou o mesmo perfil de expressão, sendo alta durante a fase de diferenciação condrocítica (E13), tendo queda de expressão de E14 a E16. Em E16 há um aumento de expressão até E18 e, novamente, queda até E20 e pouca ou nenhuma expressão em PN7. Apesar deste perfil semelhante, houve uma expressão diferencial entre elas, sendo a MMP-15/MT2-MMP > MMP- 17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Os resultados obtidos mostram, pela primeira vez, que as MT-MMPs estão diferencialmente expressas durante a ossificação endocondral normal em camundongos, sugerindo que a atividade biológica destas enzimas esteja atuando na degradação da matriz extracelular pericelular tanto durante a fase de desenvolvimento quanto de formação óssea. / MMPs are zinc-dependent endopeptidases that, collectivelly, degrade all components of the ECM and generate bioactive molecules. They are able to remodelate the ECM during normal developmental processes such as embryogenesis and organogenesis, as well as in pathological processes such as tumoral invasion. The biological mineralization research looking for discovering the genes involved in the molecular mechanisms that control the endochondral ossification process. MMPs and their inhibitors (TIMPs and RECK) are responsable for bone matrix remodeling and, probably, determinate the level of its turnover. Thus, our goal was to evaluate the temporal-spatial expression of MMP-15/MT2-MMP, MMP-16/MT3-MMP, MMP-17/MT4-MMP, MMP-24/MT5-MMP, and MMP-25/MT6- MMP in mice embryos and newborns during endochondral ossification by Real Time PCR and immunohistochemistry. By immunohistochemistry, MMP-15/MT2-MMP signal was not detected. Both MMP-16/MT3-MMP and MMP-24/MT5-MMP were immunostained, mainly in osteoblasts at ossification front of growth plate. For MMP- 17/MT4-MMP, proliferative chondrocytes were immunopositive during chondrocyte differentiation (E13) as well as in hipertrophyc chondrocytes at the middle of cartilaginous template (E14). During cellular e vascular invasion (E15), mesenchymal cells from bone collar, probable pre-osteoblasts, were immunostained at primary bone marrow and osteoblasts at ossification front from E16 e PN1. For MMP- 25/MT6-MMP, perichondrial and periostal cellls were immunostained at cartilaginous template. All MT-MMPs evaluated showed the same transcript levels profile, being high in chondrocyte differentiation (E13), decreasing from E14 to E16. mRNA levels increased from E16 to E18 and, once more, decreasing from E18 to E20. Despite this profile, we observed difference levels: MMP-15/MT2-MMP > MMP-17/MT4-MMP > MMP-16/MT3-MMP > MMP-24/MT5-MMP > MMP-25/MT6/MMP. Our findings show, for the first time, that MT-MMPs are differentially expressed during normal endochondral ossification in mice, suggesting their biological activity act in pericellular extracellular matrix degradation in both development and bone formation.

Os tumores odontogênicos benignos compreendem um grupo de neoplasias originárias dos tecidos dentários. Pesquisas vêm buscando identificar moléculas envolvidas nos mecanismos moleculares que regulam a remodelação da matriz extracelular (MEC) e como isto influencia no comportamento localmente invasivo presente em alguns destes tumores. A Transição Epitélio-Mesenquimal (TEM conversão do fenótipo epitelial em mesenquimal) é bem caracterizada em diversos carcinomas, culminando em mestástase. MMPs são enzimas que degradam os componentes da MEC, geram moléculas bioativas, participam da TEM e o controle da remodelação da MEC dá-se pelo balanço entre elas, seus inibidores (TIMPs e RECK) e seu ativador (EMMPRIN). Assim, o objetivo deste trabalho foi delinear o perfil de expressão das MMPs (-2, -7, -9 e -14), seus inibidores (TIMPs -2, -3, -4 e RECK), seu ativador (EMMPRIN) e marcadores da TEM (Snail, Slug, N-caderina, Fibronectina, a-Actina de músculo liso e Vimentina) em Ameloblastomas (AB) e Tumores Odontogênicos Cístico Calcificantes (TOCC). Ainda, realizamos a comparação da expressão de cada molécula avaliada em cada compartimento celular (epitélio e estroma) e correlação entre as moléculas avaliadas no mesmo tumor. Utilizamos 19 casos de AB e 18 casos de TOCC (Serviço de Anatomia Patológica da FOUSP), localização das enzimas/proteínas por imunoistoquímica e analisadas nos compartimentos epitelial e estromal. Todas as proteínas/enzimas analisadas foram detectadas tanto nos AB quanto nos TOCC, sendo a maioria expressa em ambos os compartimentos. A N-caderina foi localizada apenas no epitélio dos AB e a Vimentina somente no estroma em ambos os tumores. Na comparação entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Vimentina, Snail e Slug. Na comparação entre o epitélio x estroma dos TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentina, N-caderina, Snail e Slug. Assim, entre o epitélio x estroma dos ameloblastomas e TOCC, verificamos que houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) para a MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectina, Vimentina, a-Actina de músculo liso, N-caderina, Snail e Slug. Esta é a primeira vez que a EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, Ncaderina, Snail e Slug são descritas em TOCC e TIMP-3, TIMP-4, Snail e Slug em ameloblastomas. Concluímos que estas proteínas/enzimas estão diferencialmente expressas tanto no epitélio quanto no estroma destes tumores e sugerimos que estes podem participar do comportamento localmente invasivo. / Odontogenic tumors comprise a group of benign neoplasms originating from dental tissues. Research looking for identify molecules involved in the molecular mechanisms that regulate extracellular matrix remodeling (ECM) and how this impacts on locally invasive behavior present in some of these tumors. Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT - conversion of epithelial phenotype into mesenchymal phenotype) is well characterized in several carcinomas, leaving to metastasis. MMPs are enzymes that degrade ECM components, generate bioactive molecules, participating in the EMT and control ECM remodeling is given by the balance between them, their inhibitors (TIMPs and RECK) and its activator (EMMPRIN). The aim of this study was evaluate expression profile of MMPs (-2, -7, -9 and - 14), their inhibitors (TIMPs -2, -3, -4 and RECK), its activator (EMMPRIN) and EMT markers (Snail, Slug, N-cadherin, Fibronectin, -smooth muscle actin and Vimentin) in ameloblastomas (AB) and Calcifying Cystic Odontogenic Tumor (CCOT). We also compared the expression of each molecule assessed in each cellular compartment (epithelium and stroma) and correlation between molecules evaluated in the same tumor. We used 19 AB cases and 18 CCOT cases from files of Pathology Laboratory (FOUSP), localization of enzymes/proteins and analyzed by immunohistochemistry in epithelial and stromal compartments. All proteins/enzymes were detected in both AB and CCOT, mostly expressed in both compartments. N-cadherin was localized only in the epithelium of AB and Vimentin only in stromal in both tumors. Comparing \"epithelium vs stroma\" of AB, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, -smooth muscle actin, N-cadherin, Vimentin, Snail and Slug. Comparing \"epithelium vs stroma\" of CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Vimentin, N-cadherin, Snail and Slug. Analizing epithelium vs stroma\" between AB and CCOT, we observed a statistically significant difference (p <0.05) for MMP-2, MMP-7, MMP-9, RECK, EMMPRIN/CD147, Fibronectin, Vimentin , -smooth muscle actin, N-cadherin, Snail and Slug. This is the first time that EMMPRIN, RECK, TIMP-3, TIMP-4, N-cadherin, Snail and Slug are described in CCOT and TIMP-3, TIMP-4, Snail and Slug in AB. We conclude that these proteins/enzymes are differentially expressed in both epithelium and stroma of these tumors and suggest that they may participate locally invasive behavior.

O tratamento radioterápico para pacientes com neoplasias de cabeça e pescoço pode trazer consequências secundárias graves como alterações da estrutura dental, com conseguinte prejuízo da função oral, a qual influencia negativamente a qualidade de vida. Recentemente trabalhos de pesquisa tem demonstrado que a radiação induz a expressão e ativação das metaloproteinases da matriz (MMPs), consideradas as principais enzimas responsáveis pela remodelação da matriz orgânica, incluindo os componentes e estruturas da junção amelodentinária (JAD). Questiona-se então se as alterações dentais observadas em pacientes pós-radioterapia poderiam ser causadas também pela ativação das MMPs que se encontram na JAD. O presente estudo apresentou três avaliações: a ativação e expressão das MMPs, a implementação de inibidores de proteases como método de inibição das MMPs e a ativação das MMPs devido a um desafio ácido. Para as medições foram utilizados 178 fragmentos dentais de molares, divididos aleatoriamente em 2 grupos (decíduos e permanentes) / 4 subgrupos experimentais (irradiados e não-irradiados). Os fragmentos foram expostos à radiacao com Co-60, com fracao de dose de 2 Gy, 5 dias consecutivos, ate atingirem a dose total de 60 Gy, com um total de 30 ciclos, durante 6 semanas. Com o objetivo de determinar a expressão e atividade das MMPs, foram realizados os ensaios de imunofluorescência e zimografia in situ, nos fragmentos dentais de 0,6mm, analisando os tecidos duros do esmalte, dentina e JAD. Para avaliar se produtos odontológicos inativam as MMPs, os dentes foram imersos em 0,5ml de digluconato de clorexidina a 0,12%, fluoreto de sódio a 0,05%, polifenol epigalocatequina 3-galato 400&mu;M e água destilada (grupo controle), por 1 hora. Assim também com objetivo de avaliar se em um ambiente ácido, as MMPs apresentariam maior atividade, os dentes foram colocados em contato com 20&mu;l de solucao desmineralizadora com pH de 4,8, por um minuto, e posteriormente lavados com 20&mu;l de água deionizada, por um minuto. De maneira geral pudemos observar que a irradiação ativa as MMPs na JAD e estes efeitos foram mais evidentes nos dentes permanentes que nos decíduos. Com relação à expressão das diferentes MMPs, foi observada uma maior expressão das MMPs-9 e -20 para dentes decíduos, e para dentes permanentes as MMPs-2, -9 e -20 apresentaram expressão semelhante. Tendo em vista que a irradiação foi capaz de ativar as MMPs expressas na JAD de dentes permanentes, e em busca de soluções capazes de inibi-las, observamos que o Digluconato de Clorexidina, o Fluoreto de Sódio e o Polifenol Epigalocatequina 3-galato inibiram a atividade das MMPs na JAD em dentes permanentes. Por último ao investigar o efeito de um desafio ácido, na atividade das MMPs, observamos que a desmineralização não aumentou a atividade das MMPs em dentes não irradiados, porém aumentou a atividade das MMPs em dentes irradiados. Comparando dentes irradiados submetidos ou não à desmineralização, observou-se que a desmineralização incrementou a atividade das MMPs, já induzida pela irradiação. / Radiotherapy for patients with head and neck cancer can have serious secondary consequences such as changes in tooth structure, with consequent loss of oral function which negatively influences an individual\'s quality of life. Recently research work has shown that radiation induces the expression and activation of matrix metalloproteinases (MMPs) which are considered the major enzymes responsible for the remodeling of the organic matrix, including the components and structures of the dentinoenamel junction (DEJ). It is questionable if the dental changes observed in post-radiotherapy patients could also be caused by the activation of MMPs that are in the DEJ. The present study has three assessments: the activation and expression of MMPs, the implementation of protease inhibitors such as method of inactivating MMPs and the activation of MMPs due to an acid challenge. The measurements that were used were 178 molar dental fragments randomly divided into 2 groups (deciduous and permanent) / 4 experimental subgroups (irradiated and non-irradiated). The samples were exposed to radiation using Co-60 at a cumulative dose of 2 Gy fraction, 5 consecutive days, until they reached a total dose of 60 Gy, with a total of 30 cycles for 6 weeks. In order to determine the expression and activity of MMPs immunofluorescence assays were performed and in situ zymography, the dental fragments of 0.6mm, analyzing the DEJ in three areas of the tooth (cervical, cuspal and groove of pit). To assess whether MMPs inactivate dental products, the teeth were immersed in 0.5 ml of chlorhexidine digluconate at 0.12%, sodium fluoride 0.05%, polyphenol epigallocatechin-3 gallate 400&mu;M and distilled water (control group) for 1 hour. To evaluate effects in an acidic environment, MMPs have higher activity, the teeth were put in contact with 20&mu;l of demineralizing solution with pH 4.8, for a minute, and then washed with 20&mu;l of deionized water, one minute. In general we observed that the radiation active MMPs in DEJ and these effects were more evident in the permanent teeth than in the primary teeth. Regarding the expression of different MMPs, showed the greatest expression of MMP-9 and -20 for deciduous teeth, and permanent teeth MMPs-2, -9 and -20 showed similar expression. Given that the irradiation was able to activate MMPs expressed in the DEJ permanent teeth, and looking for solutions that inactive them, we observed that the digluconate Chlorhexidine, the Sodium Fluoride and Polyphenol Epigallocatechin-3-gallate inhibited activity of MMPs in the DEJ in permanent teeth. Finally, to investigate the effect of an acid challenge, in the activity of MMPs, we observed that the demineralization did not increase the activity of MMPs in non-irradiated teeth but increased the activity of MMPs in irradiated teeth. Comparing irradiated whether subjected to demineralization teeth or not, it was found that demineralization increased activity of MMPs, induced by the radiation.