O mecanismo de ação de fotossensibilizadores (FS) fenotiazínicos (azul de metileno - AM, tionina - TIO e azure B - AB) foi estudado em mitocôndrias e células Hela, e a dosimetria de AM em células HL60. Foi observado que a ligação de AM em mitocôndrias é dependente da concentração de mitocôndrias, concentração de AM e do potencial de membrana mitocondrial (Δ Ψ). A geração de oxigênio singlete a partir de AM é influenciada pelo Δ Ψ, sendo aproximadamente o dobro em mitocôndrias desacopladas. Essa variação se deve a influência do Δ Ψ sobre a relação dímero/monômero (D/M) do AM. A ligação de AM também é reduzida pela metade em mitocôndrias desacopladas. Esses efeitos não foram observados para os outros fotossensibilizadores, embora tenham a mesma carga e estrutura semelhante. Isso indica um efeito diferencial do Δ Ψ sobre o AM. Foi observada a toxicidade desses FSs em células Hela. Sem irradiação, apenas AB se mostrou tóxico. Em amostras irradiadas, AB e AM se mostraram tóxicos. Todos os FSs mostraram capacidade de produzir núcleos sub-diplóides, típicos de apoptose, com a maior eficiência sendo do AB. Em relação a toxicidade no escuro e claro, AB mostrou toxicidade em ambas as condições, TIO mostrou pouca toxicidade em ambas as condições e AM mostrou pouca toxicidade no escuro e alta toxicidade quando irradiado. A dosimetria que favorece apoptose em células HL60 também foi testada, sendo que µM de AM, os melhores resultados para formação de núcleos sub-diplóides foram com 10 2 com irradiação (contínua ou fracionada) de 0,55 J/cm2 . Essas dosagens foram as mais baixas utilizadas, indicando que um aumento na concentração de FS ou de luz tende a levar as células à morte necrótica. Conclui-se que os FSs fenotiazínicos tem afinidade por mitocôndrias e por células, podendo levar a indução de apoptose em doses não tóxicas no escuro. / The mechanism of action of phenotiazinic fotossensitizers (FS) (methylene blue - AM, tionin - TIO and azure B - AB) was studied into mitochondria and Hela cells, and AM dosimetry into HL60 cells was determined. AM binding to mitochondria is dependent of mitochondrial concentration, AM concentration and mitochondrial membrane potentials (Δ Ψ). Singlet oxygen generation from AM is influenced by Δ Ψ, almost doubling in uncoupled mitochondria. This effect is due to the influence of Δ Ψ on AM dimer/monomer (D/M) ratio. Also, AM binding drops to half into uncoupled mitochondria. For all the others FSs studied, these effects were not observed, even though they present the same Δ Ψ action over AM. charge and similar structure. This indicates a specific FSs toxicity was observed in Hela cells. In the dark, only AB showed toxicity. In irradiated samples, AM and AB showed toxicity. All the tested FSs showed capacity to induce sub-diploid nuclei formation, a hallmark of apoptosis, with AB showing the highest efficiency. AB showed high toxicity in both (irradiated and non-irradiated) conditions, TIO showed low toxicity in both conditions and AM showed low toxicity in the dark and high toxicity with laser irradiation. The dose that promotes apoptotic cell death in HL60 cells was also tested. Results 2 were observed at 10 µM AM, with laser irradiation (fraction or continuous) of 0,55 J/cm . These doses were the lowest doses tested, indicating that high doses of FS or laser induce necrotic cell death. We conclude that phenotiazinic FSs have affinity for mitochondria and cells, and induce apoptosis at doses that are not toxic without irradiation

No presente trabalho são apresentadas a síntese e a caracterização estrutural, fotofísica, fotoquímica e fotobiológica de nanopartículas contendo os fotossensibilizadores (FS) Azul de Metileno (AM) e Tionina. AM e Tionina foram incorporados nas nanopartículas sil-AM e sil-Tio pelo processo sol-gel. Nas nanopartículas Cab-Tio, Tionina foi ligada à superfície de sílica CabOsil® através de ligação covalente com reagentes bifuncionais. Todas as nanopartículas mostraram-se esféricas e com de diâmetro médio na faixa de 30 a 60nm. A imobilização dos FS induziu a agregação destes em extensões diferentes para cada tipo de nanopartícula. Foi observado que a maior presença de dímeros de FS leva à menor eficiência de geração de 1O2. Constatou-se que as nanopartículas sofrem pouca influência do meio, uma vez que os FS a elas ligadas não sofreram redução química por NADPH, nem supressão do estado tripleto por íons ascorbato e a supressão de fluorescência por íon brometo foi diminuída. Foi testado também o efeito do recobrimento destas nanopartículas com lipídios dioleilfosfatidil colina (DOPC) e fosfatidilglicerol (PG) e com Polietileno glicol (PEG). A adsorção das nanopartículas sobre membranas miméticas foi reduzida após os recobrimentos, resultado que foi explicado pelas interações de carga superficial (potencial zeta) e pela força de hidratação. As nanopartículas sil-AM e Cab-Tio apresentaram fototoxicidades in vitro, 38% e 20% maiores que os respectivos FS livres. A modificação das nanopartículas de sil-AM com lipídios e com PEG diminuiu a fototoxicidade das mesmas e no caso do recobrimento com lipídios levou ao aumento da toxicidade no escuro. Imagens de microscopia confocal mostraram que as nanopartículas com e sem recobrimento de lipídios entram em células B16. No caso das nanopartículas recobertas, observou-se um perfil de distribuição difuso por todo o citoplasma e no caso de nanopartículas sem recobrimento, estas encontraram-se em poucas regiões vacuolares do citoplasma. O perfil de distribuição homogênea por todo o citoplasma no caso de nanopartículas recobertas com lipídios pode ser o responsável pelo aumento de toxicidade no escuro. Concluiu-se que a ligação dos FS em nanopartículas com diferentes graus de agregação pode ser uma estratégia para obtenção de sistemas com capacidade modulada de geração de 1O2 e com reduzida susceptibilidade às composições do meio. As atividades fototóxicas das nanopartículas contra células B16 mostraram que estas podem ser úteis em Terapia Fotodinâmica de Câncer / In this work we present the synthesis and the characterization (structural, photophysical, photochemical and photobiological) of nanoparticles with incorporated photosensitizers (PS) Methylene Blue (MB) and Thionin. MB and Thionin were incorporated in sil-MB and sil-Th nanoparticles through sol-gel process. In the case of Cab-Th nanoparticles Thionin was linked to the surface of CabOsil® nanoparticles through cross-linking reactions. All nanoparticles were spherical and presented average diameter in the range of 30 to 60nm. Different extension of PS aggregation was observed in each nanoparticle. It was characterized that the higher the proportion of dimers to monomers the smaller the efficiency of singlet oxygen (1O2) generation. It was shown that nanoparticles can protect PS from external interferences, since NADPH did not reduce them, neither were their triplet state quenched by ascorbate ions. Besides, fluorescence quenching by bromide ions was reduced compared to free PS. The effect of covering the nanoparticles with lipids, i.e., di-oleil phosphatidylcholine (DOPC) and phosphatidylglycerol (PG), and with Polyethylene glycol was also tested. The nanoparticle adsorption over membrane mimics was reduced, which was explained by the interaction among surface charges (zeta potential) and by hydration forces. Sil-MB and Cab-Th nanoparticles presented in vitro phototoxicity 38% and 20% higher than the respective free PS. It was observed that the nanoparticle coating with lipids and with PEG reduced their photoxicity. Nanoparticles coated with lipids showed higher toxicity in the dark. Confocal fluorescence images of B16 cells showed that nanoparticles with or without lipid coating enter the cells. In the case of lipid-coated nanoparticles a diffuse distribution profile was observed and in the case of nanoparticles without coating, they concentrated in specific vacuolar regions of the cytoplasm. The homogeneous cytoplasmic distribution profile of lipid-coated nanoparticles can explain the increased toxicity in the dark. It has been concluded that immobilization of PS with different aggregation degrees is a strategy to obtain systems in which the modulated efficiency of 1O2 generation is not affected by the external medium. Finally, based on the observed in vitro phototoxicity activity against B16 cells, these systems can be useful in Photodynamic Therapy of Cancer

Neste trabalho investigamos efeitos de fotoirradiação e toxinas sob membranas celulares miméticas. Foram utilizadas, como modelo de membranas lipídicas, vesiculas unilamelares gigantes (GUVs) compostas pro lipídeos oxidados e não oxidados observadas por microscopia ótica de contraste de fase. Inicialmente estudamos a foto-resposta de membranas compostas por POPC e POPG dispersas em solução contendo azul de metileno (MB). Na sequência, estudamos o efeito de toxinas formadoras de poros, Esticolisina I (ST I) e Esticolisina II (ST II), em membranas contendo lipídeos oxidados e não oxidados. Os resultados de MB (10 µM) disperso em solução de membranas compostas por POPC e o lipídeo aniônico POPG indicaram que o aumento da densidade de carga negativa nas membranas das GUVs, que favorece a ligação da moléculas positivamente carregadas como MB nas membranas, tem como consequência um aumento de permeabilidade da membrana muito mais rápído em relação a membranas compostas apenas por POPC. Isto se deve ao fato que a localização preferencial do MB na membrana de POPC:POPG favorece a formação de oxigênio singlete próximo a dupla ligação da cadeia alquílica, dando início a reação de peroxidação lipídica de maneira mais efetiva que em membrana de POPC. Os resultados da ação das toxinas STI e STII (21 nM) em GUVs contendo lipídeos não oxidados PC e esfingomielina evidenciam que apenas STII é capaz de permear estas membranas a esta concentração. Mais ainda, nossos resultados sugerem que a existência de separação de fases fluida-gel na bicamada lipidica composta por PC:SM (razão molar 1:1) favorece a ação da toxina StII. Ao analisarmos membranas contendo lipídeos hidroperoxidados (POPC-OOH) dispersas em solução contendo STII (21 nM) observamos um aumento de permeabilidade na membrana num conjunto de GUVs, associado a formação de poros, apenas em bicamadas lipídicas formadas por misturas de lipídeos oxidados (POPC) e não oxidados (POPC-OOH). Quanto maior a concentração de lipídeos oxidados na membrana mais rapidamente ocorre o aumento de permeabilidade. / In this work we investigate the effects of photoirradiation and toxins on mimetic cell membranes. As a model of lipid membranes, giant unilamellar vesicles (GUVs) composed of oxidized and oxidized pro-lipids were observed by optical phase contrast microscopy. Initially we studied the photo-response of membranes composed of POPC and POPG dispersed in solution containing methylene blue (MB). Following, we studied the effect of pore-forming toxins, Sticolysin I (ST I) and Sticolysin II (ST II), on membranes containing oxidized and non-oxidized lipids. The results of MB (10 M) dispersed in solution of membranes composed of POPC and the anionic lipid POPG indicated that the increase in the negative charge density in the membranes of GUVs, which favors the binding of positively charged molecules as MB in the membranes, consequently increases membrane permeability in regard to membranes composed only of POPC. This is due to the fact that the preferred location of the MB in the POPC: POPG membrane favors the formation of singlet oxygen near the double bond of the alkyl chain, initiating the lipid peroxidation reaction more effectively than in the POPC membrane. The results of the action of the STI and STII toxins (21 nM) on GUVs containing non oxidised lipids PC and sphingomyelin show that only STII is able to permeate these membranes at this concentration. Moreover, our results suggest that the existence of fluid-gel phase separation in the lipid bilayer composed of PC:SM (molar ratio 1:1) favors the action of the StII toxin. When analyzing membranes containing hydroperoxidized lipids (POPC-OOH) dispersed in solution containing STII (21 nM) we observed an increase in membrane permeability in a set of GUVs, associated with pore formation, only in lipid bilayers formed by mixtures of oxidized lipids (POPC-OOH) and non-oxidized ones. The higher the concentration of oxidized lipids in the membrane, the faster the permeability increases.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade clínica para tratar uma variedade de neoplasias, doenças de pele e representa um promissor tratamento estético. O presente trabalho avaliou os aspectos histopatológicos e moleculares do tratamento pela TFD mediada por azul de metileno (TFD-AM) no modelo experimental in vivo do Carcinoma Espinocelular Cutâneo (CEC) e na pele sadia de camundongos Swiss. O protocolo da TFD foi de uma única sessão, com aplicação da solução de AM a 1% seguido por irradiação com laser diodo na dose total de 24 J/cm2 nos tecidos tumorais e sadios. Os animais foram sacrificados em dois períodos, 24 horas e 15 dias após TFD. Alterações morfológicas foram pouco marcantes nos tecidos tumorais tratados, entretanto, foram mais pronunciadas nos tecidos sadios. Podemos concluir que os efeitos de uma única sessão da TFD mediada pelo AM na dose aplicada não conferiu melhora no tratamento do CEC. Estes resultados motivam novos estudos com ajustes no protocolo para melhorar a eficácia desta terapia. / Photodynamic therapy (PDT) is a clinical method for treating a variety of tumors, skin disorders and represents a promising cosmetic treatment. This study evaluated the histopathological and molecular aspects of the treatment by PDT mediated by methylene blue (PDT-MB) in vivo experimental model of cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) and in healthy skin of swiss mice. The PDT protocol was a single session with the application of MB 1% solution followed by irradiation with diode laser at a total dose of 24 J/cm2 in tumor and healthy tissue. The animals were sacrificed at two periods, 24 hours and 15 days after PDT. Morphological changes were less marked in the tumor tissues treated, however, were more pronounced in healthy tissues treated. We can conclude that the effects of a single session of PDT mediated by MB in applied dose conferred no improvement in the treatment of SCC. These results motivate further studies with adjustments in the protocol to improve the effectiveness of this therapy.

A nanotecnologia tem sido aplicada para o desenvolvimento de materiais para diversas aplicações inclusive na inativação de patógenos. As nanopartículas de sílica (npSi) destacam-se pela alta área superficial, facilidade na alteração da superfície para aumento da eficiência adsortiva, penetrabilidade e toxicidade para bactérias gram-negativas sendo biocompatíveis para células de mamíferos e mais foto-estáveis que a maioria dos compostos orgânicos. Devido as suas vantagens, as npSi podem ser usadas para veicular fotossensibilizadores (FSs) uma vez que permitem sua utilização em solução aquosa em que os FSs geralmente são insolúveis. Além disso, o uso de FSs em vez de antibióticos, permite a inativação microbiológica pela Terapia Fotodinâmica sem que as bactérias adquiram resistência por mecanismos genéticos. Esse processo ocorre pela interação entre um FS, luz e oxigênio molecular produzindo oxigênio singleto que é extremamente reativo danificando estruturas celulares. O objetivo desse estudo foi otimizar a fotoinativação dinâmica de E .coli utilizando Azul de Metileno (AM) e Azul de Toluidina O (ATO) veiculados por npSi. As npSi foram preparadas pela metodologia sol-gel, caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e submetidas à adsorção de AM e ATO em sua superfície. A presença de AM e ATO na superfície das npSi foram analisadas por espectroscopia no infravermelho; espectroscopia de fluorescência por raio-X e análise termogravimétrica. O planejamento experimental, iniciado pelo fatorial 23 e modelado ao composto central em busca das condições ótimas foi adotado pela primeira vez nessa aplicabilidade, visando a fotoinativação de E. coli empregando AM e ATO em solução e em seguida com npSi. AM e ATO veiculados por npSi permitem a fotoinativação em concentrações mais baixas de FS (20 e 51% respectivamente), causando desestruturação da integridade bacteriana demonstrada por MEV. Os resultados sugerem que a veiculação de AM e ATO por npSi é extremamente efetiva para a fotoinativação dinâmica de E. coli e que o planejamento composto central pode levar à completa inativação das bactérias. / Nanotechnology has been applied to the development of materials for several apllications inclusive inactivation of pathogens. The silica nanoparticles (npSi) are distinguished by high surface area, ease of change the surface in order to increase the adsorption efficiency, penetrability and toxicity in gram-negative bacteria being biocompatible with mammalian cells and more photo-stable than most the organic compounds. Due to its advantages, npSi can be used to carry photosensitizers (PSs) since they allow its use in aquous solution in which PSs are frequently insoluble. Furthermore, the use of PSs instead of antibiotics, allows the microbiological inactivation by Photodynamic Therapy without bacteria to develop resistance by genetic mechanisms. This process occurs by the interaction among a PS, light and molecular oxygen producing singlet oxygen, which is extremely reactive, causing damage to cellular structures. The aim of this study was to optimize the photoinactivation of E. coli using Methylene Blue (MB) and Toluidine Blue O (TBO) carried by npSi using the central composite design. The npSi were prepared by sol-gel method, characterized by scanning electron microscopy (SEM) and subjected to adsorption of MB and TBO on its surface. The presence of FSs on the surface of npSi were analyzed by infrared spectroscopy, fluorescence X-ray spectroscopy and thermogravimetric analysis. The experimental design, initiated by the factorial 23 and modeled by the central composite in search of the optimal conditions was adopted for the first-time for this applicability, aiming the E. coli photoinactivation employing MB and TBO in solution and then with npSi. MB and TBO carried by npSi allowed the photoinactivation in lower concentrations of PS (20 and 51% respectively), causing disruption of bacterial integrity demonstrated by SEM. The results suggest that MB and TBO carried by npSi are extremely effective for dynamic photoinactivation of E. coli and the central composite design can lead to complete inactivation of bacteria.

Neste trabalho são apresentados estudos do efeito de interfaces nas propriedades fotofísicas e fotoquímicas do azul de metileno (AM) e de derivados fenotiazínicos com o intuito de avaliar o potencial destes compostos como fotossensibilizadores (FS) em terapia fotodinâmica. As propriedades físico-químicas do AM foram estudadas em soluções de SOS e observou-se que a presença do AM em solução altera o equilíbrio entre as micelas de SOS, diminuindo o valor da concentração micelar crítica de 7mmolL-1 para 70µmoIL-1. A presença das micelas em solução também interfere nas propriedades do AM. Em baixas concentrações de SOS há formação de dímeros de AM, constatados pelo aumento da absorbância em 580nm e diminuição da emissão de fluorescência. A caracterização das espécies transientes mostrou a existência de moléculas de azul de metileno no estado triplete (3AM) e de oxigênio singlete em soluções com altas concentrações de SOS e a formação de espécies radicalares do AM em baixas concentrações do tensoativo. Esta observação sugere que o mecanismo fotoquímico do AM é dependente da sua concentração local próxima de interfaces carregadas. As interações do AM e de alguns de seus derivados fenotiazínicos (tionina, azure A e azure B) com vesículas e com células HeLa foram estudadas e em ambos os casos observou-se que as moléculas com estruturas assimétricas são incorporadas em maior extensão. Em estudos de fototoxicidade, os compostos assimétricos apresentaram maior nível de morte celular do que o verificado para os compostos simétricos. Entretanto, ao se considerar a incorporação em células, os compostos simétricos se mostraram mais eficientes por molécula. Foi desenvolvido um método para determinação do 10gP dos fotossensibilizadores (FS) por voltametria com microeletrodos que se mostrou reprodutível. Novos FSs assimétricos derivados do Azure A com duas caudas hidrofóbicas de 4, 6 e 8 carbonos (AzC4, AzC6 e AzC8) foram sintetizados. Esses novos compostos possuem eficiências de fluorescência semelhantes ao AM. O composto AzC4 apresenta eficiência de geração de oxigênio singlete bem próxima à do AM (0,56), enquanto os outros dois compostos têm uma eficiência de geração de oxigênio singlete cerca de duas vezes menor. Este comportamento se deve ao fato dos FSs com cadeias carbônicas maiores interagirem mais fortemente entre si, apresentando maior grau de agregação. Os compostos sintetizados apresentam maior incorporação em vesículas que os compostos anteriormente estudados, indicando que a assimetria da molécula favorece a incorporação, assim como, o comprimento da cadeia hidrofóbica. Resultados de incorporação em células HeLa, mostraram que o composto AzC4 interage mais facilmente com a membrana celulare apresenta maior nível de morte celular devido à sua maior incorporação. / The effect of interfaces on photophysical and photochemical properties of methylene blue (MB) and its derivatives was studied in this work, aiming to emploit their potencial as photosensitizers (PS) in photodynamic therapy.The presence of MB in SDS solutions affect the micelle equilibrium decreasing the apparent critical micelle concentration of SDS from 7mmolL-1 to 70µmoIL-1. The properties of MB were also affected. At low SDS concentrations the formation of MB dimers was detected by the increase in the absorption in 580 nm and decrease of fluorescence emission. The characterization of transient species of MB showed the existence of MB molecules in the triplet state and emission of singlete oxygen at large SDS concentration and the formation of MB radicals in small surfactant concentration. These observations suggest that the photochemical mechanism of MB depends on its local concentration close to charged interfaces.The interactions of MB as well as other phenotiazine derivatives with synthetic vesicles and HeLa cells were studied. In both cases, the PS with asymmetrical structure presented higher degrees of incorporation. Studies of phototoxicity showed that the PS with asymmetrical structures present higher degree of cell death than the symmetrical compounds. However, if one consider the degree of incorporation the symmetrical compounds are more efficient per molecule. A method to determinate logP by voltammetry with microelectrodes was developed, showing good repeatability. New asymmetric photosensitizers derived from Azure A with two hydrophobic chains of 4, 6 or 8 carbons (AZC4, AZC6 e AzC8) were synthesized in order to study structure/activity relationship. These new compounds presented similar fluorescence efficiency to MB. The oxygen singlet generation efficiency of AZC4 is similar to MB, while the efficiency of the other PSs was twice smaller. This behavior was explained in terms PS aggregation, due to their longer hydrophobic chains. The synthesized PSs presented larger degree of incorporation than the commercial PSs, showing the role of asymmetry and hydrophobicity in incorporation yields. Incorporation in HeLa cells showed that AZC4 interacts more strongly with cells than the other synthesized PSs due to the rigidity of plasmatic membrane. Under the same illumination conditions, AzC4 was the PS that presented higher degree of cell death as a result of its larger incorporation in cells.

O basidiomiceto Cryptococcus neoformans é um fungo saprófita, com ampla distribuição geográfica, que é normalmente isolado de solos que contêm excretas de pombos e detritos vegetais. Apesar de saprófita, o fungo pode infectar e causar doença em uma grande variedade de hospedeiros animais, como mamíferos, aves e insetos. O número de casos de micoses graves, causadas por C. neoformans e por outros gêneros de fungos, tem aumentado em todo o mundo, principalmente devido ao aumento do número de indivíduos imunocomprometidos. Adicionalmente, a emergência de novas espécies de patógenos e a seleção de linhagens tolerantes aos antifúngicos comumente utilizados fazem com que o desenvolvimento de novas estratégias para o controle de fungos seja extremamente desejável. A inativação fotodinâmica de fungos é um método novo e promissor, que pode ser utilizado tanto para o controle de micoses (em animais e em vegetais), como para a eliminação de fungos do ambiente. A fotoinativação de fungos é baseada no uso de fotossensibilizadores que se acumulam ou que são preferencialmente metabolizados pelas células do microrganismo-alvo. A seguir, o fotossensibilizador é exposto à luz visível, que, na presença de oxigênio, inicia processos fotoquímicos que produzem uma série de espécies reativas de oxigênio capazes de matar as células fúngicas sem provocar danos significativos nos tecidos do hospedeiro. Neste trabalho, foram avaliadas as eficácias do azul de metileno (MB) (em solução e em nanoemulsão), da cloro-alumínio ftalocianina (em nanoemulsão) e do complexo nitrosilo de rutênio (em solução) como fotossensibilizadores para a fotoinativação de células melanizadas e não melanizadas de C. neoformans. C. neoformans foi suscetível à fotoinativação pela cloro-alumínio ftalocianina, com uma inativação próxima de 100% quando foi utilizada uma combinação apropriada da concentração do fotossensibilizador e da dose de luz. A completa fotoinativação do fungo pela ftalocianina, em condições compatíveis com a terapia fotodinâmica, abre a perspectiva da utilização desse fotossensibilizador para o tratamento de micoses causadas por C. neoformans. A fotoinativação pelo MB foi apenas parcial e não ocorreu fotoinativação pelo nitrosilo de rutênio. Nenhum dos fotossensibilizadores matou o fungo na ausência da luz. Também foram feitos experimentos para se verificar a influência do tempo de crescimento e da melanização na tolerância de C. neoformans à fotoinativação pelo MB. Houve diferença significativa na tolerância entre diferentes linhagens de C. neoformans. Para a maioria dos tratamentos [linhagens e tempo de crescimento (4, 6 ou 8 dias)], não houve diferença significativa entre a tolerância de células melanizadas e não melanizadas. Também não foi observada diferença na tolerância entre células com idade de 4 a 8 dias. / The basidiomycete Cryptococcus neoformans is a saprophytic worldwide fungus which is normally isolated from soils contaminated with pigeon excreta and plant detritus. Despite a saprophytic existence, the fungus can infect and cause disease in a wide variety of animal hosts such as mammals, birds and insects. Serious infections caused by C. neoformans and by other genera of fungi have emerged all over the world, primarily due to the increased numbers of immunocompromised individuals. Additionally, the emergence of new species and antimycotic-resistant strains of pathogenic fungi makes the development of new fungus-control techniques highly desirable. Photodynamic inactivation of fungi is a new and promising method that can be used to control localized mycoses or kill fungi in the environment. The photodynamic inactivation of fungi is based on the use of a photosensitizer that accumulates in, or preferentially is metabolized by, cells of the target microorganism. The photosensitizer is then exposed to visible light in the presence of oxygen, and this starts photochemical processes that produce a series of reactive oxygen species (ROS) capable of killing the fungal cells without causing significant damage to host tissues. We report here the efficacy of methylene blue (MB) (in solution and in nanoemulsion), chloroaluminum phthalocyanine (in nanoemulsion) and nitrosyl ruthenium complex (in solution) as photosensitizers in photoinactivation of melanized and nonmelanized Cryptococcus neoformans yeast cells. C. neoformans were susceptible to photoinactivation by chloroaluminum phthalocyanine with inactivation close to 100% when the appropriate combination of photosensitizer concentration and light-exposure dose was used. Photoinactivation by MB was only partial and nitrosyl ruthenium complex was ineffective. In the dark, neither photosensitizers inactivated the fungus. Complementary experiments were performed to estimate the effect of the age of the cells and of melanization in the fungus tolerance to photoinactivation by MB. There was a significative difference in the tolerance among strains of C. neoformans. For most of the treatments (strains and time of growth) there was no difference between the tolerance of melanized and nonmelanized cells. There was no difference in the tolerance among 4 to 8-day cells either.

O objetivo deste trabalho foi observar a ação da terapia fotodinâmica (PDT) antimicrobiana do azul de metileno (AM) frente ao Aggregatibacter actinomycetemcomitans em estudo in vitro e em periodontite induzida em ratos. No estudo in vitro foram utilizadas suspensões de cultura de A. Actinomycetemcomitans selvagens na avaliação de diferentes parâmetros de irradiação na busca de otimizar a redução bacteriana. No estudo in vivo foram selecionados 20 ratos Wistar machos, adultos, com massa corpórea semelhante de aproximadamente 300 g. Os animais foram submetidos a uma antibioticoterapia durante cinco dias. A indução foi elaborada através da colocação de ligaduras embebidas em A. actinomycetemcomitans por um período de 15 dias. Após este período, observou-se clinicamente e por sondagem a presença da doença sendo os animais divididos em dois grupos: Grupo RM (n=10) - remoção mecânica de placa e Grupo RM + PDT (n=10) - remoção mecânica de placa + terapia fotodinâmica. Para a PDT, o azul de metileno a 0,01% foi aplicado topicamente diretamente nas bolsas periodontais que foram então irradiadas com um laser de emissão vermelha, A = 660nm, P= 100 mW, t= 54s e E= 5,4 J. Foram realizadas coletas microbiológicas antes, imediatamente após tratamento, 3 dias e sete dias para análises por cultura e reação de polimerase em cadeia (PCR). Os resultados microbiológicos obtidos no experimento in vitro apresentaram uma eficácia da terapia fotodinamica frente ao A. actinomycetemcomitans, 98,4% quando irradiado com uma energia de 5,4J e 99,9% com energia de 9J. No estudo in vivo, foi obtida uma redução microbiana de 93,5% no grupo RM+PDT, frente a uma redução de 87,7% no grupo RM. No controle do dia 7 foi observado uma recolonização em ambos os grupos. As análises por PCR confirmaram a presença do microorganismo em todas as coletas. Estes estudos sugerem que a terapia fotodinâmica pode ser uma alternativa promissora para sua utilização coadjuvante em periodontia. / The aim of this study was to evaluate the antimicrobial effects of photodynamic action of methylene blue (MB) against the Aggregatibacter actinomycetemcomitans in vitro and on periodontitis-induced in rats. The in vitro study used suspensions of A. actinomycetemcomitans to evaluate the different irradiation parameters to optimize the bacterial reduction. Twenty four male adult rats, body mass of 300 g were selected for in vivo study. The animals were submitted to an antibiotic therapy during five days. The periodontitis induction was performed by the ligature insertion imbibed in A. actinomycetemcomitans for 15 days. After this period, the disease was confirmed by clinical and probing aspects. The animals were divided into two groups: Group MR (n=10) - mechanical plaque removal and Group MR+PDT (n=10) - mechanical plaque removal + photodynamic therapy. The MB solution 0.01% (m/w) was topically applied into the periodontal pockets which were irradiated by a laser in red emission, A = 660nm, P= 100mW, t= 54s e E= 5.4 J. Microbiological samples were collected before, immediately after treatment, 3 and 7 days to cultural and Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis. The results of in vitro study showed an antimicrobial efficacy of PDT against A. actinomycetemcomitans: reduction of 98.4% when the samples were irradiated with 5.4J and 99.9%, with 9J. The in vivo results showed reduction of 93.5% for Group MR+PDT and 87.7% for Group MR. The analysis on day 7 showed a recolonization in both groups. The PCR analysis confirmed the presence of the microorganism in all samples. This study suggests that the photodymnamic therapy could be a promising adjunctive therapy to periodontal treatment.

A TFD é considerada uma nova terapia minimamente invasiva destinada ao tratamento e destruição seletiva de diversos tipos de cânceres. Objetivo foi avaliar se os efeitos do azul de metileno fotoativado podem desencadear processos inflamatórios interferindo no desenvolvimento e na progressão tumoral. Os resultados demonstraram que o grupo tratado com 0.1% de azul de metileno+1J provocou um aumento estatísticamente significativo quando comparado em relação aos diferentes grupos tratados nos níveis e na expressão gênica dos diferentes marcadores inflamatórios, na geração EROS e MPO. Análise histológica complementou com os resultados anteriores, indicando que neste grupo há alterações morfológicas representadas por áreas de necrose na massa tumoral sólida com presença neutrofílica. Concluímos que há indícios que o tratamento 0.1% azul de metileno+ 1J foi capaz de gerar efeitos citotóxicos que por consequência aumentou a expressão dos mediadores inflamatórios promovendo inflamação e finalmente induzindo morte celular. / PDT is considered a new minimally invasive therapy for the treatment and selective destruction of various types of cancers. The objective was to evaluate the effects of methylene blue light activated may trigger inflammatory processes interfering with the development and tumor progression. The results showed that the group treated with 0.1 % methylene blue +1 J caused a statistically significant increase levels and gene expression of different inflammatory markers in ROS generation and MPO when compared at the different treat groups. Histological analysis complemented with previous results, indicating that there are morphological changes represented by areas of necrosis in the solid tumor mass with neutrophil presence in this group. We conclude that there is evidence that treatment 0.1 % methylene blue + 1J was able to generate cytotoxic effects therefore increased expression of inflammatory mediators, promoting inflammation and finally inducing cell death.

O presente projeto tem como objetivo contribuir para o desenvolvimento de dispositivos para monitoração de pressão dinâmica do ar. Para isso, foram produzidos filmes sensíveis a pressão baseados na detecção de concentração de oxigênio por meio de processos de emissão fotoluminescente das moléculas de Azul de Metileno (MB) e Platina Octaetilporfirina (PtOEP). Nesse sentido, foi estudado o comportamento da emissão fotoluminescente dessas moléculas em interação com o gás de oxigênio. A concentração de oxigênio (do ar) sobre superfície sensível depende da pressão dinâmica de superfície. Desta forma, monitorando a fotoluminescência dos dispositivos submetidos a diferentes concentrações de oxigênio, pode-se determinar uma relação entre a pressão pontual da superfície analisada e a intensidade de emissão fotoluminescente do filme. Os dispositivos de monitoração de pressão dinâmica são constituídos de um filme de estado sólido contendo as moléculas sensíveis. Foram utilizados como substratos hospedeiros para o Azul de Metileno e para a Octaetilporfirina de Platina, os filmes de silício poroso oxidado e Poliestireno, respectivamente. É proposto um arranjo experimental que utiliza um fluorímetro para caracterizar as amostras produzidas e uma câmara de fluxo de gases. Os dispositivos apresentaram elevada sensibilidade e evidenciaram o potencial para desenvolvimento e integração de sensores baseados no silício poroso à microeletrônica. / This project aims to contribute to the development of devices for monitoring dynamic pressure of the air. In this sense, films were produced based on pressure-sensitive detection of oxygen concentration through processes of photoluminescence emission from the molecules of methylene blue (MB) and platinum octaethylporphyrin (PtOEP). Accordingly, it was studied the behavior of the photoluminescence emission of these molecules in interaction with the oxygen gas. The concentration of oxygen (of the air composition) on the sensitive surface depends on the surface dynamic pressure. Thus, monitoring the photoluminescence of the devices under different oxygen concentrations, it can be determined a relationship between the punctual pressure of the tested surface and the photoluminescence emission intensity of the film. The devices for monitoring dynamic pressure are made of a solid state film containing the sensitive molecules. Oxidized porous silicon and polystyrene films were used as hosts for the Methylene Blue and for the Platinum Octaethylporphyrin, respectively. It was proposed an experimental setup that uses a spectrofluorophotometer and a gas flow chamber to characterize the produced samples. The devices showed high sensitivity and potential for development and integration of the sensors based on porous silicon for microelectronics.