Assim como tecidos normais, tumores possuem uma demanda de nutrientes e oxigênio, suprida através da vasculatura a eles associada que resulta do processo de angiogênese. Fatores pró-angiogênicos são capazes de atrair monócitos, os quais se diferenciam em macrófagos associados a tumores (TAMs). TAMs comumente apresentam fenótipo M2, cujas características são consideradas pró-tumorais, como a promoção da angiogênese e a degradação de matriz extracelular. Estudos indicam que galectina-3 (gal-3), uma proteína pleiotrópica que se liga a ?-galactosídeos, participa do controle da angiogênese e da infiltração de macrófagos M2 na massa tumoral, mas pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos. No presente estudo, utilizamos um modelo de sarcoma induzido por carcinógeno em camundongos selvagens (WT) e knockout para gal-3 (Gal- 3 KO). Comparando os tumores de animais WT e Gal-3 KO, não observamos diferenças no padrão de crescimento tumoral, na área necrótica relativa, na proliferação celular e na quantificação de fibras de colágeno. Demonstramos que, embora ambos os grupos desenvolvam tumores, a angiogênese foi inibida em um microambiente desprovido de gal-3. Entretanto, não houve diferença na produção do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). As imagens obtidas in vivo indicaram que gal- 3 também influencia na formação estrutural de vasos adjacentes ao tumor. Além de mediar aspectos morfológicos relacionados à angiogênese, demonstramos que gal-3 também contribuiu para a funcionalidade vascular, pois houve uma redução na velocidade de fluxo sanguíneo nos vasos intratumorais de animais Gal-3 KO. Nossos dados sugeriram que há menos macrófagos no tumor que não expressa gal-3 e, dentre os TAMs, há mais M2 em comparação ao tumor gal-3-positivo. A análise do tecido onde o tumor se desenvolve, na fase inicial da tumorigênese, indicou que a ausência de gal-3 está relacionada a uma maior densidade de macrófagos M2. Considerando que a presença maior de macrófagos M2 nos sarcomas gal-3-negativos não resultou em maior produção de VEGF, mas sim na inibição da angiogênese, nossos resultados apontam para uma participação significativa de gal-3 na mediação da angiogênese pelos macrófagos / As well as normal tissues, tumors require nutrients and oxygen, which are supplied by the associated vasculature that results from the process of angiogenesis. Pro-angiogenic factors are able to attract monocytes and they differentiate into tumor-associated macrophages (TAMs). TAMs commonly exhibit M2 phenotype, which has characteristics considered pro-tumoral, such as angiogenesis promotion and degradation of extracellular matrix. Studies show that galectin-3 (gal-3), a pleiotropic ?-galactosidebinding protein, participates in angiogenesis control and M2 macrophage infiltration into the tumor mass, but little is known about the mechanisms involved. In this work, we established a model of carcinogen-induced sarcoma in wild-type (WT) and gal-3 knockout (Gal-3 KO) mice. Comparing tumors from WT and Gal-3 KO animals, there were no differences in the pattern of tumor growth, relative necrotic area, cell proliferation and collagenous fibers. We demonstrated that, although both groups develop tumors, angiogenesis was inhibited in a microenvironment devoid of gal-3. However, there was no difference in the production of vascular endothelial growth factor (VEGF). The images obtained in vivo indicated that gal-3 also influenced the structural formation of vessels adjacent to the tumor. In addition to mediating morphological aspects related to angiogenesis, we demonstrated that gal-3 also contributes to vascular functionality, since there was a reduction in blood flow velocity in intratumoral vessels from Gal-3 KO animals. Our data suggested that there are fewer macrophages in tumors without gal-3 and, among TAMs, there are more M2 compared to gal-3-positive tumors. Analysis of the tissue where the tumor develops, in early stages of tumorigenesis, indicated that the lack of gal-3 is related to an increased density of M2 macrophages. Since the greater number of M2 macrophages in gal-3-negative fibrosarcomas did not result in increased VEGF production, but inhibited angiogenesis, our results suggest a significant role of gal-3 in regulation of angiogenesis by macrophages

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular / Mesenchymal stem cells (MSC) display tropism to tumors, being recruited to its microenvironment where they comprise the tumor stroma. In brain, perivascular niche is a substantial source of MSC. Although mechanisms involved are poorly understood, MSC may directly and/or indirectly contribute to tumor development. Herein, the influence of MSC on the proliferation, invasiveness and tumorigenicity of human glioblastoma cells (GBM) was investigated. Moreover, since MSC releases TGFB1, a multifunctional cytokine with roles in immunomodulation, proliferation, migration and epithelial-mesenchymal transition of tumor cells, we analyzed if MSC-secreted TGFB1 affects GBM behavior. In vitro studies performed in the presence of conditioned media from human umbilical cord MSC with a stable TGFB1 gene expression knockdown showed that MSC-secreted TGFB1 is able to significantly increase the proliferation and viability of a GBM cell line (U87FP635). These results revealed an important paracrine effect of this regulatory cytokine when secreted by other cell types in tumor microenvironment. However, under experimental conditions that better mimic the tumor microenvironment, it was found that MSC also affect tumor cell behavior by an alternative mechanism dependent on cell-cell contact, but independent of TGFB1 levels secreted by MSC. The cell-cell contact between MSC and GBM U87FP635 significantly enhaced tumor viable cells. Additionally, the spheroid tumor cell culture with MSC cell contact increased the invasiveness of U87FP635 cells. Finally, in vivo ectopic implantation model showed more developed tumors when GBM U87FP635 cells were coinjected with MSC. These pro-tumorigenic effects were found both in cell-cell contact with control MSC, as with MSC containing TGFB1 gene expression knockdown. Thus, these findings indicate that MSC can exert pro-tumorigenic effects by two alternative and independent mechanisms: paracrine action of TGFB1 secreted by MSC and action mediated by cell-cell contact. In the present experimental conditions, the cell-cell contact-dependent mechanism was predominant. The secretome proteomic study of those cells identified 126 differentially expressed proteins as well as 10 proteins exclusively detected in conditioned media from GBM U87FP635 cell cocultures with MSC. About 80% of proteins uniquely secreted by cell-cell contact are exosomes components and are involved in cell proliferation and tissue development. These results indicate a dynamic interaction of communication between MSC and tumor cells and reveal some interesting proteins potentially involved in a MSC pro-tumorigenic action mediated by cell contact

Orientador: Maria Aparecida Custodio Domingues / Resumo: Mieloma Múltiplo é uma neoplasia maligna de células plasmocitárias, cujas repercussões clínicas de interação da célula tumoral com seu microambiente e com o hospedeiro podem causar danos irreversíveis e progressivos ao doente. Estratégias terapeuticas têm tentado reunir antídotos às várias linhas de atuação da célula tumoral. Objetivou-se avaliar características clíncas e possíveis interações com o microambiente da medula óssea. Foram colhidos dados clínicos, reavaliado material histológico e confeccionado bloco de TMA com grupos de pacientes ao diagnóstico, na primeira recaída e após transplante autólogo de medula óssea. A análise estatística compreendeu descrição dos dados de distribuições de frequência para as variáveis qualitativas e calculadas as médias, desvios padrão, valores mínimo e máximo e mediana para as variáveis quantitativas. O teste de Qui-quadrado de Pearson foi empregado para variáveis qualitativas. Gráficos do tipo mosaico apresentaram os cruzamentos das variáveis discretas e técnica FAMD para verificação da contribuição das variáveis qualitativas e quantitativas simultaneamente. As curvas de sobrevida foram obtidas usando a metodologia de Kaplan & Meier e a estatística de Breslow foi empregada para testar a diferença entre as curvas observadas. Os intervalos de confiança para as curvas e testes foram feitos com nível de significância de 5%. As análises e figuras foram elaboradas com o software R (R Core Team, 2017). Concluímos que pacientes com condições c... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Multiple Myeloma is a malignant neoplasm of plasma cells whose clinical repercussions of tumor cell interaction with its microenvironment and host may cause irreversible and progressive damage to the patient. Therapeutic strategies have attempted to gather antidotes to the various lines of action of the tumor cell. This study aimed to evaluate clinical characteristics and possible interactions with the bone marrow microenvironment. Clinical data were collected, histological material was reevaluated and an AMT block was made with patient groups at diagnosis, in the first relapse and after autologous bone marrow transplantation. Statistical analysis included description of frequency distribution data for qualitative variables and calculated means, standard deviations, minimum and maximum values and median for quantitative variables. Pearson's chi-square test was used for qualitative variables. Mosaic graphs showed the intersections of discrete variables and FAMD technique to verify the contribution of qualitative and quantitative variables simultaneously. Survival curves were obtained using the Kaplan & Meier methodology and the Breslow statistic was employed to test the difference between the observed curves. Confidence intervals for curves and tests were made at a significance level of 5%. The analyzes and figures were elaborated with the R software (R Core Team, 2017).We conclude that patients with clinical conditions for more aggressive initial therapies may impact their su... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O melanoma é o mais agressivo tumor da pele, cuja resistência aos tratamentos quimioterápicos tem promovido a crescente utilização de imunoquimioterapia, como é o caso da utilização de agonistas dos receptores Toll-Like (TLRs). Nesse contexto, os compostos abreviados por P-MAPA e seu sintético estrutural MRB-CFI-1 com reconhecidas propriedades antitumorais e imunológicas, são fortes candidatos na terapia e prevenção desse tipo de câncer. Esse estudo visa determinar o potencial anticâncer do P-MAPA e de MRB-CFI-1 contra o melanoma murino em consequência ao padrão de resposta microambiental semelhante ao de morte imunogênica, em regimes de tratamento terapêutico ou vacinal, na vigência de quimioterapia com cisplatina e/ou em associação com antígenos de células tumorais totais. Após avaliação In vivo do crescimento de tumores B16F10 implantados em modelos murinos selvagem e nocaute para o gene Myd88, na vigência ou não do tratamento com cisplatina e/ou P-MAPA, nossos resultados mostraram que o P-MAPA apresentou atividade pró-tumoral e antagonizou a ação da cisplatina em inibir o crescimento dos tumores, de forma dependente de Myd88. Além disso, através de análises qualitativa e quantitativa pelo software ImageJ em fotomicrografias de secções tumorais coradas histologicamente, observamos que o P-MAPA promoveu mudanças microambientais nos tumores que podem impactar negativamente em seu desempenho. Como monoterapia em esquema de vacinação com lisado tumoral total em combinação com quimioterapia, o P-MAPA em dose baixa falhou em suprimir o crescimento de tumores B16F10, mas o seu sintético MRB-CFI-1 foi capaz de prevenir o crescimento desse tipo de melanoma num regime de vacinação profilática. Apesar do sucesso terapêutico desse imunomodulador em diversos modelos de câncer e de doenças infecciosas, o P-MAPA não foi eficaz em produz respostas microambientais contra o melanoma murino, dados esses que limitam a aplicabilidade clínica do composto. De outro modo, o composto fosfato inorgânico MRB-CFI-1 foi protetivo em retardar o aparecimento desse tipo de doença. Assim, o presente estudo foi importante por ampliar o entendimento funcional do P-MAPA numa abordagem imunoquimioterápica em modelos biológicos de tumores de melanoma, e representa uma importante mudança na utilização de constituintes individuais similares ao P-MAPA que sejam mais eficazes, de fácil obtenção, e de produção controlada e garantida / Melanoma is the most aggressive skin cancer, whose resistance to chemotherapeutic treatments has promoted the increasing use of immunochemotherapy, as is the case for the use of Toll-Like receptor agonists (TLRs). In this context, the compounds abbreviated by P-MAPA and its structural synthetic MRB-CFI-1 with recognized antitumor and immunological properties are strong candidates in the therapy and prevention of this type of cancer. This study aims to determine the anti-cancer potential of P-MAPA and MRB-CFI-1 against murine melanoma as a consequence of the microenvironmental response pattern similar to that of immunogenic death in therapeutic or vaccine treatment regimens when using chemotherapy with cisplatin alone or in combination with whole tumor cell antigens. After In vivo evaluation of the growth of B16F10 tumors implanted in wild-type and Myd88 gene knockout mice, under treatment or not with cisplatin and / or P-MAPA, our results showed that P-MAPA showed pro-tumor activity and antagonized the action of cisplatin in inhibiting the growth of tumors in a Myd88-dependent manner. In addition, using qualitative and quantitative analysis by ImageJ software in histological images of tumor sections, we observed that P-MAPA promoted microenvironmental changes in tumors that may negatively impact its performance. As monotherapy in vaccination schedule with total tumor lysate in combination with chemotherapy, low dose P-MAPA failed to suppress the growth of B16F10 tumors, but its synthetic MRB-CFI-1 was able to prevent the growth of this type of melanoma in prophylactic vaccination regimen. Despite the therapeutic success of this immunomodulator in various cancer models and infectious diseases, P-MAPA has not been effective in producing microenvironmental responses against murine melanoma, data that limit the clinical applicability of the compound. Otherwise, the inorganic phosphate compound MRB-CFI-1 was protective in delaying the onset of this type of disease. Thus, the present study was important because it broadened the functional understanding of P-MAPA in an immuno-chemotherapeutic approach in biological models of melanoma tumors and represents an important change in the use of individual constituents similar to P-MAPA that are more efficient, easily obtainable, and controlled and guaranteed production

Introdução: Indivíduos sobreviventes à sepse apresentam maior mortalidade à longo prazo e maior risco de apresentar infecções oportunistas. Existem evidências clínicas e experimentais de desregulação imune no estado pós-sepse. Essas alterações apresentam semelhança com aquelas encontradas no microambiente tumoral, estando relacionadas à imunossupressão. O presente trabalho avaliou o papel de macrófagos associados ao tumor (TAM) em modelo de progressão tumoral em camundongos sobreviventes à sepse. Materiais e Métodos: Camundongos C57/BL6 foram submetidos a ligadura e punção cecal (CLP) e tratados com ertapenem (20 mg/kg, i.p., 6 horas após CLP e 12/12 h por 3 dias). Os animais sobreviventes de sepse eram inoculados com células de melanoma B16-F10 (30 mil, s.c., 15 dias após a CLP). Animais naïve foram usados como controle. Foram avaliadas a progressão tumoral, sobrevida e formação de metástases espontâneas à distância. No D+14, animais foram sacrificados para mensuração do acúmulo de TAM por citometria de fluxo (CD45+F4/80+CD206+) e de citocinas no soro e no tumor por ELISA (IFN-?, IL-10, TNF-?, TGF-?, CCL2, CXCL12). Macrófagos derivados de medula óssea de animais pós-CLP ou naïve foram coinoculados com células B16 para avaliação de progressão tumoral e sobrevida. TAM de animais naïve ou pós-CLP foram isolados através de gradiente de Percoll seguido de adesão seletiva e o RNA foi isolado para análise diferencial de expressão gênica por microarray. Para avaliação da participação da via CXCL12/CXCR4 foi realizada sua inibição com o AMD3100, antagonista de CXCR4 (5 mg/kg, i.p., D+10 e D+14). Foi avaliada a progressão tumoral, sobrevida, acúmulo de TAM e proliferação extramedular de TAM no D+14. Resultados: Animais sobreviventes de sepse apresentaram aumento de progressão tumoral (após 15, 30 e 60 dias da CLP), aumento da carga de metástases (após 15 dias da CLP) e redução de sobrevida. Foi detectado o aumento de TAM nos animais pós-CLP, associado a maior marcação de Ki67, em comparação com animais naïve no D+14. Verificamos aumento das concentrações séricas de TGF-?, CXCL12, CCL2 e TNF-?. Camundongos naïve que coinoculados com macrófagos derivados de medula óssea de animais pós-CLP apresentaram aumento de progressão tumoral e redução de sobrevida em comparação com o grupo controle. TAM de animais pós-CLP apresentaram menor expressão de genes relacionados ao MHC-II e genes relacionados à ativação leucocitária. A inibição de CXCL12/CXCR4 preveniu a progressão tumoral induzida por sepse, com menor acúmulo de TAM e menor presença de TAM Ki67+. Conclusões: O estado pós-sepse promove a progressão tumoral de melanoma B16 em camundongos, o qual foi associado a aumento de 12 TAM. A via CXCL12/CXCR4 participa do processo de acúmulo de TAM nesse modelo experimental. / Background: Survivors from sepsis present higher long-term mortality and increased risk of opportunistic infections. There is clinical and experimental evidence for an immunosuppressive immune dysregulation in post-sepsis. These alterations are similar to those found in tumor microenvironment. The present work assessed the role of tumorassociated macrophage (TAM) in a model of tumor progression in sepsis-surviving mice. Materials and Methods: C57/BL6 mice were submitted to cecal ligation and puncture (CLP) and treated with ertapenem (20 mg/kg, ip. - 6 h after CLP and then each 12 h for 3 days). Sepsis surviving mice were inoculated with B16-F10 melanoma cells (30,000, sc., 15 days after CLP). Naïve mice were used as controls. Tumor progression, survival and distant spontaneous metastasis were evaluated. Mice were killed at D+14 for TAM measurement through flow cytometry (CD45+F4/80+CD206+) and for cytokines (IFN-?, IL-10, TNF-?, TGF-?, CCL2, CXCL12) quantification by ELISA. Bone marrow-derived macrophage (BMDM) were isolated and co-inoculated together with B16 melanoma cells for tumor progression and survival evaluation. TAM from naïve or post-sepsis mice were isolated through Percoll gradient (70/30) followed by selective adhesion. The RNA was isolated for gene expression analysis using microarray assay. To evaluate the role of CXCL12/CXCR4, we used the specific antagonist AMD3100 (5 mg/kg, ip., at D+10 and D+14) and assessed tumor progression, survival and TAM accumulation at D+14. Results: Sepsis-surviving mice showed increased tumor progression (15, 30 or 60 days after CLP), higher metastatic burden (15 days after CLP), and less overall survival. TAM were increased in post-sepsis mice at D+14. We found increased serum levels of TGF-?, CXCL12, CCL2 e TNF-?. Naïve mice inoculated with BMDM from post-sepsis and B16 cells showed higher tumoral progression and less survival, when compared to the control group. TAM from post-sepsis showed decreased expression of MHC-II related genes and genes related to leukocyte activation. The inhibition of CXCL12/CXCR4 prevented the post-sepsis-induced tumor progression, with less TAM accumulation and reduced expression of Ki67 in TAM. Conclusions: The post-sepsis state promotes the progression of B16 melanoma in mice, which was associated with an increase in TAM accumulation. CXCL12/CXCR4 mediates TAM accumulation in this experimental model.

A pele dos anfíbios atua como primeira barreira de proteção contra microorganismos invasores. Além dos componentes mecânicos, essa proteção deve incluir mecanismos bioquímicos e biológicos derivados tanto da comunidade microbiana ali residente quanto da secreção de moléculas bioativas a partir de glândulas dérmicas. Os objetivos gerais deste estudo foram: caracterizar a comunidade microbiana hospedada pela espécie Proceratophrys boiei e analisar a sua relação com comunidades microbianas ambientais; avaliar se nessa espécie a microbiota e a secreção cutâneas podem ser entendidas como um componente de proteção; avaliar a estabilidade de tais componentes a partir de diferentes populações em fragmentos florestais. Especificamente, as seguintes hipóteses foram testadas: 1. A composição da microbiota ambiental varia entre os fragmentos e micro-hábitats de Floresta Atlântica amostrados e tem relação com alguns parâmetros ambientais analisados; 2. A diversidade da microbiota cutânea de P. boiei é relacionada à diversidade da microbiota nos ambientes que ocupa. Ademais, em termos de composição, a microbiota cutânea é um subconjunto da microbiota ambiental que ocorre nos seus micro-hábitats; 3. A riqueza e abundância de bactérias da microbiota cutânea de P. boiei varia entre os diferentes remanescentes de Floresta Atlântica; 4. A riqueza e a abundância de bactérias presente na pele de P. boiei com atividade antimicrobiana varia entre populações ou locais de amostragem; 5. Existe efeito antimicrobiano das secreções sobre alguns patógenos e os perfis das secreções cutâneas diferem entre populações de P. boiei. Os resultados mostraram que a microbiota cutânea de P. boiei apresenta variações entre indivíduos e populações. Além disso, a qualidade do hábitat pode ser importante para a composição de bactérias hospedadas. Existe um compartilhamento de bactérias entre a microbiota cutânea de P. boiei e os micro-hábitats solo e água, ocupados por essa espécie, porém as comunidades dérmicas compõem-se principalmente por bactérias não detectadas nas amostras ambientais analisadas. Foi observada certa estabilidade na estrutura da microbiota cutânea de P. boiei quando analisadas populações distintas, mas variações na distribuição de morfotipos bacterianos em uma mesma localidade ocorre. Microbiota cutânea e secreções dérmicas de P. boiei podem prevenir infecções na pele, dada a atividade antimicrobiana demonstrada nesta pesquisa. Contudo, variações nos espectros de ação foram observadas em ambos os componentes, assim como, diferenças populacionais nas abundâncias e percentuais de bactérias produtoras de antimicrobianos. O estudo também demonstrou que certas características independem do contexto ambiental ocupado pelas populações, uma evidência de que o microambiente da pele dessa espécie oferece condições e certa estabilidade para a colonização de comunidades bacterianas específicas. A sustentabilidade de populações dessa espécie pode estar relacionada às interações entre hospedeiro, microrganismos e ambiente. / The skin of amphibians acts as first barrier of protection against invading microorganisms. Besides the mechanical components, this protection probably include biochemical and biological mechanisms derived from both the resident microbial community and the secretion of bioactive molecules from dermal glands. The aims of this study were to characterize the microbial community hosted by Proceratophrys boiei and analyse its relationship with environmental microbial communities; evaluate whether microbiota and skin secretion of this species can be understood as a protection component; evaluate the stability of these components through different populations in forest fragments. Specifically, the following hypotheses have guided this research: 1. The composition of environmental microbiota varies among microhabitats and fragments of Atlantic Forest and relates to some environmental parameters; 2. The diversity of skin microbiota of P. boiei relates to the diversity of microbes in the environment it occupies. Furthermore, in terms of composition, the skin microbiota is a subset of environmental microbes that occurs in its microhabitat; 3. The richness and abundance of bacteria from the skin microbiota of P. boiei varies between different remnants of Atlantic Forest; 4. The richness and abundance of bacteria present on the skin P. boiei with antimicrobial activity varies between populations or sampling sites; 5. There is antimicrobial activity of the skin secretions against some pathogens and its profiles differ between populations of P. boiei. The results showed variations on the microbial skin of P. boiei between individuals and populations and the quality of habitats could be important for the composition of hosted community. There is a sharing of bacteria between the skin microbiota of P. boiei and the microbial communities of microhabitats soil and water. However, mainly bacteria not detected in environmental samples composes the dermal communities. We observed some stability in the structure of the skin microbiota when analysed different populations, but variations in the distribution of bacterial morphotypes occurs in all sites. Skin microbiota and dermal secretions of P. boiei can prevent infection through the skin, according to the antimicrobial activity demonstrated in this study. There were variations in the action spectrum for both components, but population differences were mainly in abundance and percentage of bacteria producing antibiotics. This research showed the importance of the microbiota and skin secretion of P. boiei as components of protection and the importance of the environment for the composition of these associated communities. At the same time, we have shown that certain characteristics are independent of the environmental context occupied by the population, evidence that the microenvironment of the skin provides a certain stability for the colonization of specific bacterial communities. The sustainability of populations of this species may relates to interactions between host organisms and the environment.

A heterogeneidade entre as células tumorais e o suporte a elas proporcionado pelos componentes do microambiente tumoral (TME) são os dois principais responsáveis pela progressão do câncer e por tornar essas doenças essencialmente incuráveis. Assim, identificar as principais dependências das células malignas, sejam elas internas ou advindas do meio extracelular, é fundamental para entender seu comportamento e propor terapias mais eficientes. Nesta tese, abordamos aspectos destas duas questões separadamente. Em um primeiro trabalho, investigamos as interações de células tumorais com células-tronco mesenquimais (MSCs), um dos principais componentes do TME. MSCs participam ativamente do nicho tumoral, especialmente por serem capazes de liberar uma vasta gama de moléculas que, via sinalização parácrina, podem modular as células ao seu redor. No entanto, os principais mediadores e respectivos efeitos do secretoma dessas células nos tumores ainda precisam ser melhor elucidados. Ao investigar esses efeitos em glioblastomas (GBM), um dos tumores primários mais agressivos em adultos, mostramos que o secretoma de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hADSCs) foi capaz de bloquear a autofagia das células malignas. Nossos dados revelaram que o secretoma de hADSCs ativou a via de sinalização de mTORC1 e reduziu a translocação nuclear de TFEB, um fator de transcrição chave que regula a autofagia e a a função lisossomal, nas células de GBM, impedindo que o fluxo autofágico fosse completado. Já em um segundo trabalho, no contexto da heterogeneidade celular em tumores, propusemos uma abordagem para análise de dados de céulas únicas focada em outliers. Minorias celulares com níveis anormalmente elevados, ou reduzidos, de expressão de determinados genes ou proteínas são em muitos casos responsáveis por resistir aos tratamentos e levar à recidiva da doença, ao mesmo tempo que, por serem outliers, são muitas vezes ignoradas ou excluídas das análises de dados. Assim, decidimos utilizar métodos estatísticos em dados de expressão de células únicas para detectar e analisar células outliers, comparando o seu comportamento com as demais células não-outliers. Denominamos essa abordagem de Single Cell OUTlier analysis (SCOUT) e a testamos em dados de células tumorais avaliadas por citometria de massas e por sequenciamento de RNA de células únicas (sc-RNA-seq). Como resultado, pudemos confirmar que, especialmente diante de determinados tratamentos, células outliers podem se comportar de maneira distinta de não-outliers, revelando informações potencialmente relevantes ao desenvolvimento de estretégias terapêuticas. Por fim, desenvolvemos uma ferramenta para automatizar a detecção e seleção de outliers em dados de célula única a fim de facilitar o estudo dessas células em diversos aspectos na pesquisa do câncer. / Intratumoral heterogeneity and the support provided by components of the tumor microenvironment (TME) to malignant cells are major contributors to cancer progression, and the two main factors that make this disease essentially incurable. Thus, identifying malignant cells dependencies, either in the intra- or extracellular environment, is fundamental to understand their behavior and propose more efficient therapies. In this thesis, we approached aspects of these two issues separately. In a first work, we investigated interactions between tumors and mesenchymal stem cells (MSCs), one of the main components in the TME. MSCs actively participate in the tumor niche, especially due to their capacity of releasing a wide range of molecules that can modulate cells in their surroundings. However, little is known about the effects of MSCs-derived molecules in tumor cells behavior. In investigating these effects on glioblastomas (GBM), one of the most aggressive primary tumors in adults, we found out that the secretome of human adipose-derived stromal cells (hADSCs) was able to block autophagy in malignant cells. Our data revealed that hADSCs secretome activated mTORC1 signaling pathway and reduced nuclear translocation of TFEB, a master transcription factor that regulates autophagy and lysosomal function, in GBM cells, preventing autophagic flux from being completed. In a second work, we addressed intratumoral heterogeneity by proposing an approach to analyze outliers in single cell data. Cellular minorities with abnormally high, or low, expression levels of certain genes or proteins are in many cases responsible for resisting treatments and lead to disease relapse, while for being outliers they are also frequently ignored or excluded from data analysis. Thus, we decided to apply statistical methods on single cell expression data to detect outliers and analyze them, comparing their behavior with the remaining non-outlier cells. We called this approach Single Cell OUTlier analysis (SCOUT) and tested it on tumor cell datasets obtained from mass cytometry and single cell RNA sequencing (scRNA-seq) experiments. Using SCOUT we were able to confirm that, especially upon specific treatments, outlier cells may behave differently from non-outliers, revealing potentially relevant information to aid in the development of novel therapeutic strategies. Finally, we developed a tool to automate detection and selection of outliers in single cell data with the aim to facilitate the study of these cells under different contexts in cancer research.

O melanoma é a forma mais letal entre os cânceres de pele. Essa neoplasia freqüentemente apresenta-se resistente a abordagens terapêuticas. A angiogênese associada ao tumor representa um crítico passo da tumorigênese, resultado da ação de diferentes citocinas e fatores de crescimento como VEGF produzidos no microambiente tumoral. As galectinas extracelulares participam de múltiplos processos biológicos incluindo angiogênese tumoral e metástases, sua interação com as células presentes no microambiente tumoral pode ocorrer via receptores toll-like sugerindo seu envolvimento nos processos pro-inflamatórios e na secreção de citocinas. Recentemente mostramos que a ausência de gal-3 no estroma e parênquima tumoral diminui a angiogênese por interferir na resposta de macrófagos via VEGF e/ou TGFbeta1. Entretanto, o envolvimento de galectinas extracelulares na angiogênese e na modulação do sistema imune no microambiente tumoral ainda não está esclarecido. Assim, este estudo visa buscar respostas ao envolvimento das galectinas no crescimento tumoral e angiogênese contribuindo ao combate do melanoma maligno. Nossos resultados mostram a participação das galectinas 1 e 3 no crescimento tumoral e seu envolvimento com macrófagos via receptores toll-like, além de coordenarem a modulação do perfil de polarização de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos wild-type. Dessa forma, podemos inferir que essas galectinas agem como coordenadoras de mudança de perfil dos macrófagos, uma vez que inibidas extracelularmente promovem uma diminuição do crescimento tumoral em camundongos wild-type, inoculados com células de melanoma murino e uma manutenção do perfil de macrófagos M1 in vitro. Assim, concluimos que as galectinas 1 e 3 extracelulares são importantes para o crescimento tumoral de melanomas murinos pois promovem o crescimento tumoral e são coordenadoras da mudança do perfil de macrófagos / Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. This tumor often presents itself resistant to therapeutic approaches. The tumor-associated angiogenesis is a critical step in tumorigenesis and the result of the action of several cytokines and growth factors such as VEGF produced in the tumor microenvironment. The extracellular galectins participate in multiple biological processes including tumor angiogenesis and metastasis, their interaction with cells present in the tumor microenvironment may occur via toll-like receptors suggesting their involvement in pro-inflammatory processes and the secretion of cytokines. We have recently shown that the absence of Gal-3 the stroma and tumor parenchyma decreases angiogenesis by interfering with the macrophage response by VEGF and / or TGFbeta1. However, the involvement of extracellular galectins on angiogenesis modulation of the immune system in the tumor microenvironment is not yet clear. This study aims is to find answers to the involvement of galectins on tumor growth and angiogenesis contributing to the study of the malignant melanoma. Our results demonstrate the involvement of galectin 1 and 3 on tumor growth and its involvement in macrophage by toll-like receptors pathway, and coordinating the modulation of the polarization profile in wild-type mice bone marrow derived macrophages. Therefore, we show these galectins act as coordinators of macrophages profile change, since inhibited extracellularly promote a reduction in tumor growth in wild-type mice inoculated with murine melanoma cells and macrophages M1 maintenance of profile in vitro. Thus, we conclude that galectins 1 and 3 extracellular are important for tumor growth of murine melanomas because they promote tumor growth and are coordinators of change macrophages profile

O transplante de células-tronco hematopoéticas (CTHs) é o tipo mais bem-sucedido de terapia celular realizado até os dias atuais. No entanto, apesar do sucesso e da relevância clínica das CTHs isoladas a partir de fontes adultas, o uso destas células tem algumas limitações em relação à sua disponibilidade, compatibilidade imunológica e risco de contaminação. Desse modo, busca-se o desenvolvimento de soluções para as dificuldades apontadas para suprir a demanda de transplantes. Uma abordagem emergente para superar este problema é baseada na cultura e diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (CTEhs). Estas são célulastronco pluripotentes e indiferenciadas com elevada capacidade de auto-renovação e diferenciação em todas as células derivadas dos três folhetos germinativos. No entanto, os métodos de diferenciação utilizados para a produção de CTHs a partir de células pluripotentes ainda não são eficientes. Os protocolos descritos até o momento têm gerado números variados e populações de células heterogêneas, e produz apenas CTHs muito primitivas e imaturas com baixa capacidade funcional in vivo. Parte desta dificuldade pode decorrer da ineficiência do microambiente de cultura para a diferenciação. Neste trabalho, nós demonstramos um eficiente protocolo de diferenciação hematopoética baseado em cocultivo de CTEhs com fibroblastos embrionários murinos com alto rendimento na geração de célulastronco/progenitoras hematopoéticas (CTPHs) que expressam os antígenos CD45, CD43, CD31 e CD34, e apresentam potencial clonogênico in vitro equivalente ao de células mononucleares isoladas de sangue de cordão umbilical. Nós fomos capazes de produzir todas as células das linhagens eritróide e mielóide em diferentes estágios de maturação, como também células positivas para marcadores linfóides. Demonstramos ainda que as células hematopoéticas surgem no sistema de cultura a partir de um endotélio-hemogênico constituído por células CD34+CD31+. No entanto, apesar das características maduras das CTPHs obtidas por tal método, os ensaios de reconstituição hematopoiética mostraram que estas células ainda possuem limitada capacidade funcional de enxertamento em camundongos imunocomprometidos quando transplantadas por via retro-orbital. / Hematopoietic stem cells (HSC) transplant is the most successful type of cell therapy carried out to date. However, despite the success and the clinical relevance of HSC isolated from adult sources, these cells have some limitations regarding its availability, immunological compatibility and risk of contamination. Thus, we seek to develop solutions to overcome these difficulties to supply the demand for transplants. An emerging approach to overcome this problem is based on human embryonic stem cells (hESCs) culture and differentiation. These are pluripotent and undifferentiated stem cells with high capacity for self-renewal and differentiation in all cells derived from the three embryonic germ layers. However, differentiation methods used for HSC production from pluripotent cells are not efficient yet. Protocols described so far have generated varying numbers and heterogeneous cell populations, and produce only very primitive and immature HSC with low in vivo functional capacity. Part of this difficulty may result from the inefficiency of the microenvironment of culture for differentiation. Here, we demonstrate an efficient protocol based on co-culture of hESCs with mouse embryonic fibroblasts for hematopoietic differentiation with high performance to generate in vitro hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) that express CD45, CD43, CD31 and CD34 antigens with high purity of positive cells. We were able to produce all cells of erythroid and myeloid lineages at different stages of maturation. Lymphoid potential of hematopoietic cells was also evidenced. We demonstrated the primitive origin of hematopoietic cells through capillary-like structures constituted by hemogenic CD34+CD31+ cells. However, despite mature features of HSPCs obtained by our protocol, hematopoietic reconstitution assays showed that these cells have yet limited functional capacity for grafting into immunocompromised mice when exogenously transplanted by retro-orbital route.

O melanoma é o mais agressivo tumor da pele, cuja resistência aos tratamentos quimioterápicos tem promovido a crescente utilização de imunoquimioterapia, como é o caso da utilização de agonistas dos receptores Toll-Like (TLRs). Nesse contexto, os compostos abreviados por P-MAPA e seu sintético estrutural MRB-CFI-1 com reconhecidas propriedades antitumorais e imunológicas, são fortes candidatos na terapia e prevenção desse tipo de câncer. Esse estudo visa determinar o potencial anticâncer do P-MAPA e de MRB-CFI-1 contra o melanoma murino em consequência ao padrão de resposta microambiental semelhante ao de morte imunogênica, em regimes de tratamento terapêutico ou vacinal, na vigência de quimioterapia com cisplatina e/ou em associação com antígenos de células tumorais totais. Após avaliação In vivo do crescimento de tumores B16F10 implantados em modelos murinos selvagem e nocaute para o gene Myd88, na vigência ou não do tratamento com cisplatina e/ou P-MAPA, nossos resultados mostraram que o P-MAPA apresentou atividade pró-tumoral e antagonizou a ação da cisplatina em inibir o crescimento dos tumores, de forma dependente de Myd88. Além disso, através de análises qualitativa e quantitativa pelo software ImageJ em fotomicrografias de secções tumorais coradas histologicamente, observamos que o P-MAPA promoveu mudanças microambientais nos tumores que podem impactar negativamente em seu desempenho. Como monoterapia em esquema de vacinação com lisado tumoral total em combinação com quimioterapia, o P-MAPA em dose baixa falhou em suprimir o crescimento de tumores B16F10, mas o seu sintético MRB-CFI-1 foi capaz de prevenir o crescimento desse tipo de melanoma num regime de vacinação profilática. Apesar do sucesso terapêutico desse imunomodulador em diversos modelos de câncer e de doenças infecciosas, o P-MAPA não foi eficaz em produz respostas microambientais contra o melanoma murino, dados esses que limitam a aplicabilidade clínica do composto. De outro modo, o composto fosfato inorgânico MRB-CFI-1 foi protetivo em retardar o aparecimento desse tipo de doença. Assim, o presente estudo foi importante por ampliar o entendimento funcional do P-MAPA numa abordagem imunoquimioterápica em modelos biológicos de tumores de melanoma, e representa uma importante mudança na utilização de constituintes individuais similares ao P-MAPA que sejam mais eficazes, de fácil obtenção, e de produção controlada e garantida / Melanoma is the most aggressive skin cancer, whose resistance to chemotherapeutic treatments has promoted the increasing use of immunochemotherapy, as is the case for the use of Toll-Like receptor agonists (TLRs). In this context, the compounds abbreviated by P-MAPA and its structural synthetic MRB-CFI-1 with recognized antitumor and immunological properties are strong candidates in the therapy and prevention of this type of cancer. This study aims to determine the anti-cancer potential of P-MAPA and MRB-CFI-1 against murine melanoma as a consequence of the microenvironmental response pattern similar to that of immunogenic death in therapeutic or vaccine treatment regimens when using chemotherapy with cisplatin alone or in combination with whole tumor cell antigens. After In vivo evaluation of the growth of B16F10 tumors implanted in wild-type and Myd88 gene knockout mice, under treatment or not with cisplatin and / or P-MAPA, our results showed that P-MAPA showed pro-tumor activity and antagonized the action of cisplatin in inhibiting the growth of tumors in a Myd88-dependent manner. In addition, using qualitative and quantitative analysis by ImageJ software in histological images of tumor sections, we observed that P-MAPA promoted microenvironmental changes in tumors that may negatively impact its performance. As monotherapy in vaccination schedule with total tumor lysate in combination with chemotherapy, low dose P-MAPA failed to suppress the growth of B16F10 tumors, but its synthetic MRB-CFI-1 was able to prevent the growth of this type of melanoma in prophylactic vaccination regimen. Despite the therapeutic success of this immunomodulator in various cancer models and infectious diseases, P-MAPA has not been effective in producing microenvironmental responses against murine melanoma, data that limit the clinical applicability of the compound. Otherwise, the inorganic phosphate compound MRB-CFI-1 was protective in delaying the onset of this type of disease. Thus, the present study was important because it broadened the functional understanding of P-MAPA in an immuno-chemotherapeutic approach in biological models of melanoma tumors and represents an important change in the use of individual constituents similar to P-MAPA that are more efficient, easily obtainable, and controlled and guaranteed production