Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-31Bitstream added on 2014-06-13T19:53:54Z : No. of bitstreams: 1 zimbardi_d_me_botib.pdf: 1403669 bytes, checksum: 19185c803cd5bc8168341c616f75325f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A endometriose constitui uma doença de etiologia incerta, caracterizada pela presença de tecido endometriótico fora da cavidade uterina. E uma causa comum de morbidade, atingindo 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva. A metilção anormal na região promotora de genes especificos e os niveis de expressão alterados das DNA metiltransferases (DNMTs) compoem 0 conjunto de evidencias recentes indicando a endometriose como uma doença epigenetica. 0 presente estudo propos a investigaçao do perfil diferencial de metilaçao do DNA na endometriose, utilizando uma abordagem genomica de alta resoluçao baseada na metodologia de microarrays. Para isso, foram coletadas amostras pareadas de endometrio eutópico e de endometriose intestinal profunda de 18 pacientes. Foram selecionadas dez amostras pareadas para a hibridação do DNA: cinco casos foram submetidos ao enriquecimento das sequencias não metiladas (digerido com a enzima de restrição dependente de metilação McrBC ) e nove ao enriquecimento das sequencias metiladas (digerido com 0 coquetel de enzimas sensiveis a metilação do DNA Acil, HinP11, HpyCH41Ve Hpall). Os ensaios foram realizados em duplicatas totalizando 28 hibridações independentes na plataforma disponivel comercialmente Human CpG Island ChIP-on-Chip Set 244K (Agilent Technologies). Este protocolo foi previamente padronizada utilizando-se 0 DNA das linhagens derivadas de carcinomas de c610n HCT116 e DKO (celulas HCT116 duplo knockout para as DNMT1 e DNMT3b) usando marcação reversa (dye swap). Os dados foram avaliados nos software Agilent Technologies Genomic Workbench (DNA Analytics 5.0) e GeneSpring 7.3 (Agilent Technologies). Estre os 925 genes que apresentaram metila9ao diferencial, 55 foram recorrentes em dois ou mais casos. Varios destes genes mostram-se interessantes por exercerem funções relacionadas a fatores de transcrição (MSX1, EMX2, HOXB13, HOXD8 e HOXD9)... / Endometriosis is a disease of unknown etiology characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. It is a common cause of morbidity, affecting 5-10% of women in reproductive ages. The aberrant methylation in the promoter region of specific genes and the higher expression levels of DNA methyltransferases (DNMTs) in comparison with normal endometrium have been reported as evidences indicating that endometriosis is an epigenetic disease. The present study investigated the differential profile of DNA methylation in endometriosis using a high-resolution microarray-based assay. There were collected paired samples of eutopic endometrium and deep intestinal endometriosis from 18 patients and, subsequently, it was selected ten pairs to the DNA hybridization: five matched samples were submitted to the enrichment of unmethylated sequences (digested with the methylation-dependent restriction enzyme McrBG) and ten to the enrichment of methylated sequences (digested with the cocktail of enzymes sensitive to DNA methylation AGII, HinP1/, HpyGH4/V and Hpa/I). The assays were performed in duplicates totalizing 28 independent hybridizations in the commercially available platform Human CpG Island ChIP-on-Chip Set 244K (Agilent Technologies). The protocol was previously standardized using the DNA from the colon carcinomas cell lines HCT116 and DKO (HCT116 cells double-knockout for DNMT1 and DNMT3b) using reverse labeling (dye swap). The data were evaluated using the software Genomic Workbench (DNA Analytics 5.0) and GeneSpring 7.3. Among the 925 genes showing differential methylation, 55 genes were detected in at least two cases. Several of these gene could be considered good candidates to molecular biomarkers of endometriosis since that they act as transcription factors (MSX1, EMX2, HOXB13, HOXDB e HOXD9) , chromatin remodeling (MAD1L 1, WDR5 e BGOR)... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-05-30Bitstream added on 2014-06-13T20:23:15Z : No. of bitstreams: 1 silveira_cgt_dr_botib.pdf: 2492157 bytes, checksum: 96e0023d4fecc0d746ebf4a3705ecbc8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A endometriose (EDT) é uma doença ginecológica crônica e heterogênea considerada um importante problema de saúde pública. As metodologias de Hibridação Genômica Comparativa de Alta resolução (HR-CGH) e CGH array (aCGH) são ferramentas importantes para a triagem de alterações genômicas em diferentes lesões endometrióides. No presente estudo, as análises de HR-CGH foram realizadas em 20 amostras de EDT fixadas em formalina e em blocos de parafina, de diferentes sítios e tipos histológicos, obtidas de oito pacientes submetidas à laparoscopia (Grupo I). Os componentes estromais e epiteliais foram isolados por microdissecção a laser. As amostras de endométrio tópico de três pacientes apresentaram perfis genômicos normais. Nos tecidos ectópicos, foi observada uma média de 68 regiões alteradas por caso. Análises comparativas entre os componentes estromais e epiteliais demonstraram alta freqüência de alterações genômicas comuns. As perdas foram mais prevalentes e envolveram principalmente os cromossomos 3p, 5q, 7p, 9p, 11q, 16q, 18q e 19q. A comparação entre os perfis de alteração de lesões de diferentes localizações derivadas da mesma paciente revelou a predominância de regiões comuns envolvidas em perdas e ganhos. Baseado nestes resultados foi realizada a análise de expressão protéica de sete marcadores de células-tronco pela metodologia de imunohistoquímica. A maioria das amostras apresentou expressão positiva dos marcadores CD9, CD34, c-Kit e Oct-4 em células isoladas do epitélio glandular e/ou células estromais. A presença de alterações genômicas comuns nos componentes estromal e epitelial de diferentes lesões sugere que a EDT apresenta uma origem monoclonal e a expressão positiva de marcadores de células-tronco sugere fortemente o envolvimento... / Endometriosis (EDT) is a chronic and heterogeneous gynecological disease increasingly recognized as an important women’s health issue. High Resolution Comparative Genomic Hybridization (HR-CGH) and array-CGH (aCGH) methods are potential tools for screening of genomic imbalances in distinct EDT lesions. In this study, HR-CGH was performed on 20 formalin-fixed paraffin-embedded EDT samples from different anatomical sites and histological types obtained from eight patients undergoing laparoscopy (Group 1). Stromal and epithelial components from each sample were laser microdissected. Eutopic endometrium from three patients was also analyzed and presented normal genomic pattern. In ectopic tissues, an average of 68 genomic imbalances was detected per sample. The comparison between stroma and epithelia showed the prevalence of common genomic alterations. DNA losses were more frequently detected and involved mainly 3p, 5q, 7p, 9p, 11q, 16q, 18q and 19q. Interestingly, the comparison among genomic profiles of distinct endometriotic lesions from particular patients also showed a high frequency of common losses and gains. Based on these findings, we also evaluated the expression of seven stemness-related markers by immunohistochemistry. Positive immunostaining for CD9, CD34, c-kit and Oct-4 markers was detected in isolated epithelial and/or stromal cells in majority of analyzed samples. The presence of common genomic alterations in stromal and epithelial cells from different sites and the expression of stemness-related markers suggested that EDT presents a clonal proliferation like in tumors and it may have a stem cell origin. Additionally, we investigated copy number variation (CNV) by high resolution array-CGH (aCGH) in 18 fresh microdissected infiltrating EDT lesions (Group II) using 4x44K oligonucleotide... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Silvia Regina Rogatto / Banca: Mauricio Simões Abrão / Banca: Georgi Sabio Porto Mundin / Banca: José Ricardo Paciência Rodrigues / Banca: Claudia Aparecida Rainho / Resumo: A endometriose (EDT) é uma doença ginecológica crônica e heterogênea considerada um importante problema de saúde pública. As metodologias de Hibridação Genômica Comparativa de Alta resolução (HR-CGH) e CGH array (aCGH) são ferramentas importantes para a triagem de alterações genômicas em diferentes lesões endometrióides. No presente estudo, as análises de HR-CGH foram realizadas em 20 amostras de EDT fixadas em formalina e em blocos de parafina, de diferentes sítios e tipos histológicos, obtidas de oito pacientes submetidas à laparoscopia (Grupo I). Os componentes estromais e epiteliais foram isolados por microdissecção a laser. As amostras de endométrio tópico de três pacientes apresentaram perfis genômicos normais. Nos tecidos ectópicos, foi observada uma média de 68 regiões alteradas por caso. Análises comparativas entre os componentes estromais e epiteliais demonstraram alta freqüência de alterações genômicas comuns. As perdas foram mais prevalentes e envolveram principalmente os cromossomos 3p, 5q, 7p, 9p, 11q, 16q, 18q e 19q. A comparação entre os perfis de alteração de lesões de diferentes localizações derivadas da mesma paciente revelou a predominância de regiões comuns envolvidas em perdas e ganhos. Baseado nestes resultados foi realizada a análise de expressão protéica de sete marcadores de células-tronco pela metodologia de imunohistoquímica. A maioria das amostras apresentou expressão positiva dos marcadores CD9, CD34, c-Kit e Oct-4 em células isoladas do epitélio glandular e/ou células estromais. A presença de alterações genômicas comuns nos componentes estromal e epitelial de diferentes lesões sugere que a EDT apresenta uma origem monoclonal e a expressão positiva de marcadores de células-tronco sugere fortemente o envolvimento ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Endometriosis (EDT) is a chronic and heterogeneous gynecological disease increasingly recognized as an important women's health issue. High Resolution Comparative Genomic Hybridization (HR-CGH) and array-CGH (aCGH) methods are potential tools for screening of genomic imbalances in distinct EDT lesions. In this study, HR-CGH was performed on 20 formalin-fixed paraffin-embedded EDT samples from different anatomical sites and histological types obtained from eight patients undergoing laparoscopy (Group 1). Stromal and epithelial components from each sample were laser microdissected. Eutopic endometrium from three patients was also analyzed and presented normal genomic pattern. In ectopic tissues, an average of 68 genomic imbalances was detected per sample. The comparison between stroma and epithelia showed the prevalence of common genomic alterations. DNA losses were more frequently detected and involved mainly 3p, 5q, 7p, 9p, 11q, 16q, 18q and 19q. Interestingly, the comparison among genomic profiles of distinct endometriotic lesions from particular patients also showed a high frequency of common losses and gains. Based on these findings, we also evaluated the expression of seven stemness-related markers by immunohistochemistry. Positive immunostaining for CD9, CD34, c-kit and Oct-4 markers was detected in isolated epithelial and/or stromal cells in majority of analyzed samples. The presence of common genomic alterations in stromal and epithelial cells from different sites and the expression of stemness-related markers suggested that EDT presents a clonal proliferation like in tumors and it may have a stem cell origin. Additionally, we investigated copy number variation (CNV) by high resolution array-CGH (aCGH) in 18 fresh microdissected infiltrating EDT lesions (Group II) using 4x44K oligonucleotide... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Cláudia Aparecida Rainho / Banca: Maria Claudia Moura Campos / Banca: Ester Silveira Ramos / Resumo: A endometriose constitui uma doença de etiologia incerta, caracterizada pela presença de tecido endometriótico fora da cavidade uterina. E uma causa comum de morbidade, atingindo 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva. A metilção anormal na região promotora de genes especificos e os niveis de expressão alterados das DNA metiltransferases (DNMTs) compoem 0 conjunto de evidencias recentes indicando a endometriose como uma doença epigenetica. 0 presente estudo propos a investigaçao do perfil diferencial de metilaçao do DNA na endometriose, utilizando uma abordagem genomica de alta resoluçao baseada na metodologia de microarrays. Para isso, foram coletadas amostras pareadas de endometrio eutópico e de endometriose intestinal profunda de 18 pacientes. Foram selecionadas dez amostras pareadas para a hibridação do DNA: cinco casos foram submetidos ao enriquecimento das sequencias não metiladas (digerido com a enzima de restrição dependente de metilação McrBC ) e nove ao enriquecimento das sequencias metiladas (digerido com 0 coquetel de enzimas sensiveis a metilação do DNA Acil, HinP11, HpyCH41Ve Hpall). Os ensaios foram realizados em duplicatas totalizando 28 hibridações independentes na plataforma disponivel comercialmente Human CpG Island ChIP-on-Chip Set 244K (Agilent Technologies). Este protocolo foi previamente padronizada utilizando-se 0 DNA das linhagens derivadas de carcinomas de c610n HCT116 e DKO (celulas HCT116 duplo knockout para as DNMT1 e DNMT3b) usando marcação reversa (dye swap). Os dados foram avaliados nos software Agilent Technologies Genomic Workbench (DNA Analytics 5.0) e GeneSpring 7.3 (Agilent Technologies). Estre os 925 genes que apresentaram metila9ao diferencial, 55 foram recorrentes em dois ou mais casos. Varios destes genes mostram-se interessantes por exercerem funções relacionadas a fatores de transcrição (MSX1, EMX2, HOXB13, HOXD8 e HOXD9)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Endometriosis is a disease of unknown etiology characterized by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. It is a common cause of morbidity, affecting 5-10% of women in reproductive ages. The aberrant methylation in the promoter region of specific genes and the higher expression levels of DNA methyltransferases (DNMTs) in comparison with normal endometrium have been reported as evidences indicating that endometriosis is an epigenetic disease. The present study investigated the differential profile of DNA methylation in endometriosis using a high-resolution microarray-based assay. There were collected paired samples of eutopic endometrium and deep intestinal endometriosis from 18 patients and, subsequently, it was selected ten pairs to the DNA hybridization: five matched samples were submitted to the enrichment of unmethylated sequences (digested with the methylation-dependent restriction enzyme McrBG) and ten to the enrichment of methylated sequences (digested with the cocktail of enzymes sensitive to DNA methylation AGII, HinP1/, HpyGH4/V and Hpa/I). The assays were performed in duplicates totalizing 28 independent hybridizations in the commercially available platform Human CpG Island ChIP-on-Chip Set 244K (Agilent Technologies). The protocol was previously standardized using the DNA from the colon carcinomas cell lines HCT116 and DKO (HCT116 cells double-knockout for DNMT1 and DNMT3b) using reverse labeling (dye swap). The data were evaluated using the software Genomic Workbench (DNA Analytics 5.0) and GeneSpring 7.3. Among the 925 genes showing differential methylation, 55 genes were detected in at least two cases. Several of these gene could be considered good candidates to molecular biomarkers of endometriosis since that they act as transcription factors (MSX1, EMX2, HOXB13, HOXDB e HOXD9) , chromatin remodeling (MAD1L 1, WDR5 e BGOR)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Coorientador: José Buratini Junior / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: José Antonio Visentini / Banca: Mario Binelli / Resumo: Objetivo deste experimento foi estudar os mecanismos envolvidos na sobrevivência à criopreservação de embriões Bos taurus indicus (Nelore) e Bos taurus taurus (Simental) produzidos in vitro (PIV) e in vivo (TE). Em um arranjo fatorial 2 x 2, duas subespécies (Bos taurus indicus vs Bos taurus taurus) e duas origens (PIV vs TE) foram utilizadas para testar a hipótese de que a capacidade de sobrevivência após a criopreservação é um evento multifatorial, e que a composição lipídica e o padrão de expressão gênica global afetam a criotolerância embrionária. Vacas Nelore (N=14) e Simental (N=14) foram submetidas a OPU e os oócitos recuperados (N=840 e 450, respectivamente) foram submetidos a MIV, FIV e CIV. Além disso, vacas Nelore (N=7) e Simental (N=8) foram submetidas a superestimulação ovariana, IATF e lavagem uterina. Os embriões PIV (N=349 e N=105) e TE (N=80 e N=74), respectivamente Nelore e Simental, foram submetidos as técnicas de vitrificação (N=70-94), coloração de Sudan Black (n=30), espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MS; N=8 por grupo), microarray genômico (Nelore PIV N=4, Nelore TE N=4, Simental PIV N=3, Simental TE N=3) e validação no qPCR (N=8 por grupo). Modelos univariados (PROC LOGISTIC e PROC GLIMMIX- SAS 9.2) e multivariados (análise dos componentes principais-PCA- Piruete v.3.11 e MetaboAnalyst) foram utilizados na análise estatística. A análise do Microarray genômico procedeu-se no FlexArray 1.6.1.1. Genes com "fold change" de 1,5 e P≤0,05 foram considerados diferentemente expressos. Embriões Simental apresentaram maior sobrevivência após a vitrificação que os Nelore (34,6 vs 20,2%; P<0,05). Apesar disso, os embriões Simental apresentaram maior conteúdo lipídico do que os Nelore (3,4±0,3 vs 2,4±0,3 intensidade de cinza x 10-4 / μm3 ; P<0,05)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective was to study mechanisms involved in the post-cryopreservation survival of Bos taurus indicus (Nellore) and Bos taurus taurus (Simmental) in vitro (IVP) and in vivo (ET) produced embryos. In a 2x2 factorial experimental design, two subspecies (Bos taurus indicus vs Bos taurus taurus) and two origins (PIV vs ET) were used to test the hypotheses that the postcryopreservation embryo survival capacity is a multifactorial event and that the lipid composition and the global gene expression pattern affect embryo cryotolerance. Nellore and Simmental cows (N=14) were submitted to OPU sessions and recovered oocytes (840 and 450, respectively) underwent IVM, IVF and IVC. Moreover, Nellore (N=7) and Simmental (N=8) cows were submitted to ovary superstimulation, FTAI, and uterine flushing. The IVP (N=349 and N=105) and ET (N=80 and N=74) embryos, Nellore and Simmental respectively, were used in the vitrification (N=70-94), Sudan Black B stain (N=30), matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDIMS) (N=8 per group), genomic microarray (Nellore IVP N=4, Nellore ET N=4, Simmental IVP N=3, Simmental ET N=3) and qPCR (N=8 per group) techniques. Univariate (PROC LOGISTIC and PROC GLIMMIX, SAS 9.2) and multivariate (PCA - Piruete v.3.11 and MetaboAnalyst) models were used for the statistical analysis. Microarray data analysis was performed in FlexArray 1.6.1.1 software. Genes with a fold change of at least 1.5 and a probability of P<0.05 were considered differentially expressed. Simmental embryos had higher post-vitrification survival (34.6 vs 20.2%; P<0.05) compared with Nellore. Nevertheless, Simmental embryos had higher lipid content than Nellore (3.4±0.3 vs 2.4±0.3 gray intensity x 10-4 / μm3; P<0.05). When compared ET with PIV embryos, it was observed that the former had higher post-vitrification... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-11Bitstream added on 2014-06-13T19:45:09Z : No. of bitstreams: 1 sudano_mj_dr_botfmvz.pdf: 2445410 bytes, checksum: b31fdea0d1a6b4b576d49b7e856ede8a (MD5) / Objetivo deste experimento foi estudar os mecanismos envolvidos na sobrevivência à criopreservação de embriões Bos taurus indicus (Nelore) e Bos taurus taurus (Simental) produzidos in vitro (PIV) e in vivo (TE). Em um arranjo fatorial 2 x 2, duas subespécies (Bos taurus indicus vs Bos taurus taurus) e duas origens (PIV vs TE) foram utilizadas para testar a hipótese de que a capacidade de sobrevivência após a criopreservação é um evento multifatorial, e que a composição lipídica e o padrão de expressão gênica global afetam a criotolerância embrionária. Vacas Nelore (N=14) e Simental (N=14) foram submetidas a OPU e os oócitos recuperados (N=840 e 450, respectivamente) foram submetidos a MIV, FIV e CIV. Além disso, vacas Nelore (N=7) e Simental (N=8) foram submetidas a superestimulação ovariana, IATF e lavagem uterina. Os embriões PIV (N=349 e N=105) e TE (N=80 e N=74), respectivamente Nelore e Simental, foram submetidos as técnicas de vitrificação (N=70-94), coloração de Sudan Black (n=30), espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MS; N=8 por grupo), microarray genômico (Nelore PIV N=4, Nelore TE N=4, Simental PIV N=3, Simental TE N=3) e validação no qPCR (N=8 por grupo). Modelos univariados (PROC LOGISTIC e PROC GLIMMIX- SAS 9.2) e multivariados (análise dos componentes principais-PCA- Piruete v.3.11 e MetaboAnalyst) foram utilizados na análise estatística. A análise do Microarray genômico procedeu-se no FlexArray 1.6.1.1. Genes com “fold change” de 1,5 e P≤0,05 foram considerados diferentemente expressos. Embriões Simental apresentaram maior sobrevivência após a vitrificação que os Nelore (34,6 vs 20,2%; P<0,05). Apesar disso, os embriões Simental apresentaram maior conteúdo lipídico do que os Nelore (3,4±0,3 vs 2,4±0,3 intensidade de cinza x 10-4 / μm3 ; P<0,05)... / The objective was to study mechanisms involved in the post-cryopreservation survival of Bos taurus indicus (Nellore) and Bos taurus taurus (Simmental) in vitro (IVP) and in vivo (ET) produced embryos. In a 2x2 factorial experimental design, two subspecies (Bos taurus indicus vs Bos taurus taurus) and two origins (PIV vs ET) were used to test the hypotheses that the postcryopreservation embryo survival capacity is a multifactorial event and that the lipid composition and the global gene expression pattern affect embryo cryotolerance. Nellore and Simmental cows (N=14) were submitted to OPU sessions and recovered oocytes (840 and 450, respectively) underwent IVM, IVF and IVC. Moreover, Nellore (N=7) and Simmental (N=8) cows were submitted to ovary superstimulation, FTAI, and uterine flushing. The IVP (N=349 and N=105) and ET (N=80 and N=74) embryos, Nellore and Simmental respectively, were used in the vitrification (N=70-94), Sudan Black B stain (N=30), matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDIMS) (N=8 per group), genomic microarray (Nellore IVP N=4, Nellore ET N=4, Simmental IVP N=3, Simmental ET N=3) and qPCR (N=8 per group) techniques. Univariate (PROC LOGISTIC and PROC GLIMMIX, SAS 9.2) and multivariate (PCA - Piruete v.3.11 and MetaboAnalyst) models were used for the statistical analysis. Microarray data analysis was performed in FlexArray 1.6.1.1 software. Genes with a fold change of at least 1.5 and a probability of P<0.05 were considered differentially expressed. Simmental embryos had higher post-vitrification survival (34.6 vs 20.2%; P<0.05) compared with Nellore. Nevertheless, Simmental embryos had higher lipid content than Nellore (3.4±0.3 vs 2.4±0.3 gray intensity x 10-4 / μm3; P<0.05). When compared ET with PIV embryos, it was observed that the former had higher post-vitrification... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Gonçalo Amarante Guimães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:23:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lepikson-Neto_Jorge_M.pdf: 1765356 bytes, checksum: c73289c953d58c6b221c2e0927805499 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Com o intuito de obter informações relevantes para o melhoramento genético do eucalipto para a produção de biomassa, o presente trabalho buscou comparar a expressão dos genes relacionados com a formação e desenvolvimento da madeira em quatro diferentes espécies de eucalipto, tendo como objetivo identificar os padrões que as tornam mais aptas, bem como quais genes relacionados com determinadas características. Essa análise abre a possibilidade da identificação de genes chave que possam ser manipulados, através do melhoramento clássico ou da transgênia, para aumentar o conteúdo relativo de celulose das plantas, incrementando a sua eficiência para processos econômicos. 384 ESTs do banco de dados do Consórcio Genolyptus foram selecionadas para serem analisadas através da tecnologia de microarranjos de cDNA. Foram selecionadas ESTs de genes com funções conhecidas relacionadas com a formação da madeira, bem como de genes relacionados com o desenvolvimento do vegetal e de genes com função ainda desconhecida. Os dados obtidos foram cruzados com a biblioteca de ESTs do Consorcio Genolyptus (Northern Eletrônico), e foram feitos PCR em tempo real para os principais genes diferenciais nos microarranjos e para os genes da via de lignina e flavonóides. Os resultados mostraram que diferentes genes estão expressos nas espécies estudadas sendo um grande número deles ainda com função desconhecida no metabolismo do eucalipto. A maioria dos genes relacionados com a formação da parede celular não apresentou perfil de expressão diferencial nos microarranjos, sugerindo que as diferenças fenotípicas entre as madeiras das espécies estudadas podem estar sustentadas em vias alternativas, com fatores de elongação, cliclínas e outros genes desempenhando papel importante, bem como genes ainda não relacionados com o desenvolvimento da parede celular e ou ao desenvolvimento do vegetal. Os experimentos com PCR em tempo real mostraram que genes da via de flavonóides relacionados com a via de lignina e formação da madeira podem estar desempenhando papeis importantes no controle da formação da madeira da espécie. Esses resultados representam avanços significativos no entedimento da formação da madeira em eucalipto e servem como base para orientar futuras investigações no intuito de melhorar geneticamente esta espécie. / Abstract: In this work we intended to assemble relevant information for the genetic engineering of Eucalyptus for biomass production by comparing gene expression of genes related with the xylem and wood development of four different Eucalyptus species with distinct caractheristics, as a form to identify patterns and wich genes are possibly related to their differences. This analysis opens the possibilities to manipulate the specie and increase the overall celluloses content and its purpose for industrial production. 384 ESTs were selected from de Genolyptus database and analysed by microarryay cDNA experiments. Among the ESTs selected some were related to wood formation, cell wall assembly and some still had no general function known on the specie. The data from the microarray experiments were then crossed with the Genolyptus ESTs lybrary (Eletronic Northern) and Real-Time PCR were performed for the most relevant resultas as well as the genes from de lignin and flavonoid pathway. Results show that different genes are expressed among the xylem of the four species studied and most of them still have no related function to the metabolism of the plant. Most of the genes related to cell wall formation were not differentially expressed on the microarrays suggesting that the differences on the quality and structure of the wood among the four species might as well be resulted from the expression of alternative pathways and genes such as elongation factors, ciclins and others not yet related to the cell wall formation and wood development. Real-Time PCR experiments shown that genes from the flavonoid pathway related to lignin and wood formation might be playing a crucial role determining wicht pathway must be followed and therefore the type and quality of the wood on Eucalyptus. These results represent significant advances to our understanding on the formation of wood on Eucalyptus and will be valuable as a basis for future investigation aiming genetic engeneering of the specie. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Foi realizado um programa de seqüenciamento de cDNAs obtidos de bibliotecas da fase de germinação do fungo aquático Blastocladiella emersonii. Os dados gerados, em conjunto com o projeto de seqüenciamento de cDNAs da fase de esporulação do fungo, permitiram a descoberta de aproximadamente 4.900 genes diferentes de B. emersonii (Ribichich et al., 2005). Os genes putativos foram anotados e associados com as categorias funcionais descritas pelo Gene Ontology Consortium e encontram-se na base de dados http://www.blasto.iq.usp.br. O perfil de expressão dos genes foi avaliado por Northern digital e vários transcritos apresentaram perfil de expressão regulado durante a germinação. Numa segunda etapa deste trabalho, cerca de 3.600 genes putativos de B. emersonii foram arranjados em lâminas de vidro e empregados como sondas para a investigação da expressão gênica global em células de diferentes tempos após a indução da germinação. Analisamos ainda, as diferenças entre a germinação induzida em meio nutriente e a germinação em solução inorgânica, na qual os indutores efetivos da germinação foram adenina ou íons potássio. Na germinação em meio nutriente mais de 900 genes, cerca de 26% do total presente nos micro-arranjos, mostraram-se diferencialmente expressos em pelo menos um dos tempos analisados. Foram induzidos durante a germinação, principalmente, genes envolvidos no crescimento celular, incluindo biossíntese de proteínas, transcrição e ativação do metabolismo energético. No entanto, estes genes não foram induzidos quando a germinação ocorreu em solução inorgânica. Verificamos ainda que vários transcritos envolvidos com a percepção do meio extracelular e com a sinalização celular, codificando proteínas necessárias para disparar o programa de germinação, encontram-se presentes nos zoósporos. Além disso, observamos que alguns dos transcritos encontrados nos zoósporos foram reprimidos na germinação em meio nutriente, mas mantiveram níveis elevados de expressão quando a germinação foi feita em solução inorgânica, indicando que os nutrientes exercem um papel importante na regulação da expressão de determinados genes nesta fase do desenvolvimento. / We conducted large scale cDNA sequencing from libraries obtained using RNA from germinating cells of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Data obtained in this work, along with cDNAs from sporulating cells, lead to the discovery of nearly 4.900 different genes from B. emersonii (Ribichich et al., 2005). The putative genes were annotated and associated with the functional categories described by the Gene Ontology Consortium and are available at the web site http://www.blasto.iq.usp.br. The expression patterns of these genes were evaluated by digital Northern analysis and we detected several transcripts that presented expression profile regulated during germination. In a second approach, nearly 3.600 putative genes from B. emersonii were spotted into glass slides and used as probes to investigate the global gene expression pattern in cells isolated at different times after induction of germination. We also analyzed the differences between the germination triggered in nutrient medium and the germination in inorganic solution, in which the effective inducers of germination were either adenine or potassium ions. More than 900 genes were differentially expressed during germination in nutrient medium in at least one of the time points analyzed, which correspond to 26 % of the total genes in the microarrays. The genes induced during this process were mainly those involved in cellular growth, including protein biosynthesis, transcription and energetic metabolism. However, these genes were not induced when germination occurred in inorganic solution. In addition, we verified that many transcripts involved in sensing the environment and also in signal transduction, encoding proteins necessary to trigger the germination program, were present in the zoospores. Another finding is that some of the transcripts found in zoospores were repressed when germination proceeded in nutrient medium, but were maintained at high levels when germination occurred in inorganic solution, suggesting that nutrients exert an important role in regulating the expression of some genes in this stage of development.

Neste trabalho realizamos um programa de seqüenciamento em larga escala de cDNAs obtidos de bibliotecas construídas a partir de mRNA de células de B. emersonii submetidas ao choque térmico e ao estresse por cádmio. Obtivemos 6350 seqüências expressas (ESTs) de alta qualidade, que representam 2326 seqüências únicas putativas (unigenes) do fungo. Destes unigenes putativos, 1282 genes foram classificados em pelo menos uma das categorias do Consórcio Gene Ontology (GO). A análise do transcriptoma parcial de B. emersonii determinado até o momento permitiu a identificação de 78 unigenes codificando chaperones moleculares de todas as famílias conhecidas. Para avaliarmos a expressão global dos genes em resposta a estresses ambientais, como o choque térmico e o cádmio, realizamos ensaios de microarranjos de DNA nestas condições de estresse. Observamos que em resposta ao choque térmico, B. emersonii induz a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas com o enovelamento de proteínas e com a proteólise, o que seria esperado em condições de temperaturas elevadas, assim como genes que codificam proteínas com propriedades antioxidantes, além de proteínas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos e no metabolismo de carboidratos. Em resposta ao estresse por cádmio, verificou-se a indução de genes que codificam principalmente proteínas com propriedades antioxidantes, proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos, proteínas relacionadas com o transporte celular e proteínas envolvidas no enovelamento de proteínas e proteólise. Uma das conseqüências do estresse por cádmio é o aumento do estresse oxidativo e proteínas antioxidantes têm um papel fundamental na resposta a este tipo de estresse. Dentre os genes observados durante o seqüenciamento das ESTs de B. emersonii, observamos dez genes codificando proteínas distintas da família Hsp70. Nove genes hsp70 são expressos em pelo menos um dos estágios do desenvolvimento do fungo e sete apresentam uma indução significativa após o choque térmico. Estes dados sugerem que estes genes desempenham um papel importante durante o desenvolvimento e em resposta ao estresse térmico em B. emersonii. Outro dado interessante obtido neste trabalho foi o enriquecimento de ESTs que continham íntrons em sua seqüência nas bibliotecas de estresse. Portanto, o choque térmico e o estresse por cádmio em B. emersonii diminuem a eficiência de processamento dos íntrons permitindo sua caracterização. O cDNA da proteína Hsp17 foi o que apresentou o maior número de ESTs seqüenciadas nas bibliotecas de estresse. Experimentos de Northern blot indicaram que o gene hsp17 possui um nível de expressão muito baixo durante o ciclo de vida de B. emersonii, no entanto, como esperado sua expressão aumenta drasticamente quando as células de esporulação ou germinação são submetidas a choque térmico. Os níveis da proteína Hsp17 acompanham os níveis do seu mRNA, indicando que o controle da expressão do gene hsp17 deve ocorrer em nível de transcrição. / In this work we realized a large scale, sequencing program of cDNAs libraries obtained from mRNA of B. emersonii cells submitted to heat shock and cadmium stress. A total of 6350 high quality expressed sequence tags (ESTs) were obtained, representing 2326 unique putative genes (unigenes) of this fungus. From these putative unigenes, 1282 genes were classified at least in one of the three Gene Ontology Consortium (GO) categories. The analysis of the partial transcriptome of B. emersonii, determined until now, allowed the identification of 78 unigenes encoding molecular chaperones of all known protein families. To evaluate the global expression of the genes in response to environmental stresses, such as heat shock and cadmium, DNA microarray assays were performed. We observed that in response to heat shock B. emersonii induces the expreession of genes encoding proteins related to protein folding and proteolysis, as expected under high temperature conditions, as well as genes encoding proteins with antioxidant properties and proteins involved in nucleotide and carbohydrate metabolism. In response to cadmium stress, we mainly verified the induction of genes for proteins with antioxidant properties, proteins involved in amino acid metabolism, proteins related to cellular transport and proteins related to protein folding and proteolysis. One of the consequences of the exposure to cadmium is the increase of oxidative stress, and antioxidant proteins have a fundamental role in the response to this kind of injury. Amongst the genes observed during the B. emersonii EST sequencing program, ten genes encoding distinct proteins from the Hsp70 family were observed. Nine of them are expressed at least in one stage of the fungus development and seven genes presented a significant induction during heat shock treatment. These data suggest that the hsp70 genes perform an important role during development and in response to heat stress in B. emersonii. Another interesting result from this work was the enrichment of ESTs containing introns in the stress libraries. Thus, heat shock and cadmium stress decrease the efficiency of intron processing in B. emersonii, allowing for intron characterization. The cDNA for the Hsp17 protein presented the highest number of ESTs sequenced from the stress libraries. Northern blot experiments indicated that the hsp17 gene is expressed at very low levels throughout the life cycle of B. emersonii, however, as expected its expression increases drastically when sporulation or germination cells are submitted to heat shock. Hsp17 protein levels accompany its mRNA levels, indicating that the control of expression of the hsp17 gene occurs at a transcriptional level.

Orientador: Sonia Marli Zingaretti / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Mozart de Azevedo Marins / Banca: Janete Apparecido Desiderio Sena / Banca: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Resumo: A seca é o principal estresse abiótico que afeta a produtividade das plantas. Para detectar os genes expressos sob condições de deficiência hídrica foi desenvolvido um estudo de expressão gênica usando plantas de cana-de-açúcar tolerantes (cv. SP83-5073) e sensíveis (cv. SP90-1638) à seca. A metodologia de macroarranjos de DNA foi empregada para monitorar a expressão gênica de 3.575 clones de folhas de cana-de-açúcar e os resultados foram confirmados por PCR quantitativo. Na cultivar tolerante 165 genes foram identificados em resposta ao déficit hídrico severo, em contraste à cultivar sensível, na qual um maior número de genes (n = 432) foi diferencialmente expresso ao longo do tratamento de deficiência hídrica. A cultivar tolerante ativou um menor número de genes em função do déficit hídrico aplicado. No entanto, 94% destes genes foram induzidos, enquanto na cultivar sensível 45% dos genes diferencialmente expressos foram reprimidos sob condições de deficiência hídrica. Comparando os perfis de expressão identificados em cada planta verifica-se que aproximadamente 55% dos genes expressos na cultivar tolerante também foram comuns à cultivar sensível, a maioria exibindo um perfil de expressão muito similar entre os genes induzidos. A classificação funcional dos genes foi realizada com base no papel exercido pela proteína no metabolismo celular, e mostrou que importantes vias metabólicas relacionadas ao déficit hídrico foram reprimidas na resposta das plantas sensíveis à seca. Além disso, 50% dos transcritos identificados em cada cultivar representam novos genes, os quais não estão descritos nos bancos de dados ou cuja função ainda não foi caracterizada / Abstract: Drought is a major abiotic stress that affects the plant productivity. To detect expressed genes under drought conditions, a gene expression study using tolerant (SP83-5073) and sensitive (SP90-1638) sugarcane plants was performed. Macroarray methodology was used to monitor the gene expression profile of the 3,575 cDNA clones from sugarcane leaves and the results were confirmed by real time PCR analysis. For the tolerant cultivar 165 genes were identified in response to severe water stress, contrasting with sensitive cultivar, in which a higher number of genes (n = 432) were responsive to the stress-treatment. Tolerant cultivar expressed a few genes in stress conditions. However 94% of them were induced, while for sensitive cultivar 45% of the differentially expressed genes were down-regulated under water stress conditions. Comparing the gene expression profiles identified in each cultivar, it is possible to verify that 55% of the expressed genes in tolerant cultivar were also observed in sensitive cultivar, the majority showing a very similar gene expression pattern. Functional gene classification was performed according to roles in cellular metabolism, and showed that important drought-pathways were repressed in sensitive plants response. Besides, 50% of the identified transcripts in each cultivar represent novel genes, which were not described in databases or whose functions were not characterized yet / Doutor