Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477917 bytes, checksum: 4ab8f5cc2dd481acd067b02bd7abf32d (MD5) Previous issue date: 2012-01-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Colletotrichum is one of the most important genera of plant-pathogenic fungi in the world. The pathogenic species of this genus have hemibiotrophic lifestyle and cause diseases in several economically significant crops. Besides the economic importance, Colletotrichum has great significance as a model system for studying the molecular and cellular bases of fungal pathogenicity. The species C. graminicola, causal agent of corn anthracnose (Zea mays), has rare sexual stage and was the first species of the genus to have its genome completely sequenced. The transposable elements are ubiquitous and constitute a source of new mutations, being an important source of genetic variability. These elements are divided into two classes according to the presence or absence of an RNA intermediate in transposition. Elements of class I transpose via RNA intermediate, while class II elements transpose directly as DNA. The transposable elements can be applied as mutagenic agents aimed at the identification and labeling of genes and in phylogenetic and population studies. Given the importance of transposable elements in the generation of genetic variability and its applications in research, the aim of this study was to identify and characterize the class II transposable elements in the genome of C. graminicola. For this purpose, we used a bioinformatic approach combined with experimental activities. We identified 132 complete sequences of transposable elements in the sequenced genome of C. graminicola, which represent a significant proportion of the genome (0.47%). The elements were classified into six families according to similarity, all elements have characteristics of Tc1-mariner superfamily. Although some of these elements possess putative transposases with conserved DDE domain, all are interrupted by multiple stop codons. None of the elements identified has all the necessary features to be considered an active element. In silico analysis revealed evidence that these sequences are mutated by RIP (repeat point induced mutation) mechanism. TCg1 element was amplified by PCR from a Brazilian isolate and has imperfect terminal inverted repeats and the putative transposase sequence has three conserved domains characteristic of transposases: DDE, CENPB and HTH. However, this sequence is interrupted by stop codons and lacks the initiation codon and termination codon, therefore, is probably inactive. The genomic DNA from 49 different isolates were analyzed by hybridization with a probe derived from the inner region of TCg1 and different profiles were identified. The strategy allowed the efficient identification of a variety of Tc1-Mariner transposable elements degenerated by mutations characteristics of RIP in C. graminicola. It is unlikely that any of the identified elements is autonomous, however, these elements must have an important role in the genetic variability of this fungus. The TCg1 element is present in the genomes of different isolates of C. graminicola and has the potential to be used as a molecular marker in population analyzes. / Colletotrichum é um dos gêneros mais importantes de fungos fitopatogênicos em todo o mundo. As espécies fitopatogênicas desse gênero apresentam ciclo de vida hemibiotrófico e causam doenças em diversas culturas economicamente importantes. Além da importância econômica, Colletotrichum possui grande relevância como um sistema modelo para o estudo das bases celulares e moleculares da patogenicidade fúngica. A espécie Colletotrichum graminicola, agente causal da antracnose do milho (Zea mays), possui ciclo sexual raro e foi a primeira espécie do gênero a ter o seu genoma completamente sequenciado. Os elementos transponíveis são ubíquos e constituem uma fonte de novas mutações, sendo, portanto, uma importante fonte de variabilidade genética. Esses elementos são divididos em duas classes de acordo com a presença ou ausência de um intermediário de RNA na transposição. Os elementos da classe I se transpõem via intermediário de RNA, enquanto os elementos da classe II se transpõem diretamente como DNA. Os elementos transponíveis podem ser utilizados como agentes mutagênicos visando à identificação e etiquetagem de genes e em estudos filogenéticos e populacionais. Tendo em vista a importância dos elementos transponíveis na geração de variabilidade genética e as suas aplicações na pesquisa, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar elementos transponíveis da classe II no genoma de C. graminicola. Para tanto, foi utilizada uma abordagem de bioinformática (análises in silico) aliada às atividades experimentais. Foram identificadas 133 sequências completas de elementos transponíveis no genoma sequenciado de C. graminicola, que representam uma proporção relevante do genoma (0,47%). Os elementos foram classificados em 6 famílias de acordo com a identidade e apresentam características da superfamília Tc1-Mariner. Apesar de algumas transposases putativas codificadas por esses elementos possuírem domínio DDE conservado, todas estão interrompidas por vários códons de parada. Nenhum elemento identificado possui todas as características necessárias para um elemento autônomo. A análise in silico revelou evidências de mutações geradas pelo mecanismo de RIP (Mutação de ponto induzida por repetição). O elemento TCg1, amplificado por PCR a partir de um isolado brasileiro de C. graminicola, possui extremidades repetidas invertidas imperfeitas e a sequência putativa da transposase apresenta os três domínios característicos conservados: DDE, HTH e CENPB. Entretanto, essa sequência está interrompida por códons de parada e não foram localizados os códons de iniciação e de terminação, sendo, portanto, provavelmente inativa. O DNA genômico de 49 diferentes isolados foi analisado por hibridização com uma sequência derivada da região interna de TCg1 e apresentaram diferentes perfis. A estratégia utilizada permitiu uma identificação eficiente de uma variedade de elementos transponíveis Tc1-Mariner degenerados por mutações características de RIP em C. graminicola. É improvável que algum dos elementos identificados seja autônomo, entretanto, esses elementos devem possuir um importante papel na variabilidade genética desse fungo. O elemento TCg1 está presente no genoma de diferentes isolados de C. graminicola e possui potencial para ser utilizado como marcador molecular em análises populacionais.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1119528 bytes, checksum: 3f39721f8aa2a5aa0f53cfd21af511b6 (MD5) Previous issue date: 2012-07-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bacteria of the genus Lactobacillus are inhabit the human gastrointestinal tract (GHT) and species such as Lactobacillus delbrueckii UFV H2B20, isolated from feces of infant exclusively fed breast milk, have physiological characteristics, technology, immunological and genetic desirable and necessary to probiose. The objective of this work was to study the tolerance of L. delbrueckii UFV H2b20 to gastric juice and simulated intestinal when incorporated in a food matrix, fermented milk, and also the expression of the gene encoding the fbpA, binding protein fibronectin, involved in adhesion to the human gastrointestinal tract. The results showed that L. delbrueckii UFV H2b20 is able to maintain its viability at levels above 108 UFC.mL-1 after 28 days of storage. When subjected to the conditions prevailing in TGH found that the food matrix evaluated, the fermented milk, confer protection. After the fourteenth day of the experiment, no significant survival in simulated intestinal juice. The fbpA gene was identified by PCR and sequencing. This gene is clustered with the orthologs of probiotic bacteria. However, exposure of cells of L. delbrueckii UFV H2B20 incorporated in fermented milk, for 240 minutes to the conditions prevailing in TGH caused reduced expression of this gene, detected by RT-PCR. Confirmation of the involvement of this gene under stress conditions, in adherence to the TGH compartments remains dependent on studies with mutant bacteria. / Bactérias do gênero Lactobacillus são habitam do trato gastrointestinal humano (TGH) e espécies como Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20, isolado a partir de fezes de criança alimentada exclusivamente com leite materno, apresentam características fisiológicas, tecnológicas, imunológicas e genéticas desejáveis e necessárias à probiose. O objetivo deste trabalho foi estudar a tolerância de L. delbrueckii UFV H2b20 ao suco gástrico e intestinal simulado quando incorporado a uma matriz alimentar, leite fermentado, e também a expressão do gene fbpA que codifica a proteína de ligação a fibronectina, envolvida na adesão ao trato gastrointestinal humano. Os resultados mostraram que L. delbrueckii UFV H2b20 é capaz de manter sua viabilidade em níveis superiores 108 UFC.mL-1 após 28 dias de estocagem refrigerada. Quando submetida às condições prevalecentes no TGH detectou-se que a matriz alimentar avaliada, o leite fermentado, conferiu proteção.. Após o décimo quarto dia de experimento, não houve sobrevivência expressiva ao suco intestinal simulado. O gene fbpA foi identificado por PCR e sequenciamento. Este gene se agrupou com os ortólogos de bactérias probióticas.No entanto, a exposição das células de L. delbrueckii UFV H2b20 incorporadas em leite fermentado, por 240 minutos às condições prevalecentes no TGH provocou redução da expressão desse gene, detectado por RT-PCR. A confirmação do envolvimento desse gene sob condições de estresse, na adesão a compartimentos do TGH continua dependente de estudos com mutantes da bactéria.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1647302 bytes, checksum: 907782aa4c5aca00a3a2aaadedd6d8f0 (MD5) Previous issue date: 2012-07-06 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Cyanobacteria used for centuries as a food has antioxidant mechanisms highly developed and production capacity higher than any other agricultural system, presenting a great potential as a source of natural antioxidant compounds, and various other compounds. One of the factors that interfere with the metabolism of photosynthetic organisms is the level of incident light, yet for cyanobacteria are not well understood the relations between luminosity, bioactive compounds and antioxidant activity. Under this approach, the objective of this study was to determine the influence of different light intensities on antioxidant activity of cyanobacteria of the genus Nostoc spp., and on the levels of some of the main antioxidant compounds found in their cells: the pigments phycobiliproteins (phycocyanin, allophycocyanin and phycoerythrin), carotenoids and chlorophyll, and phenolic compounds. The antioxidant activity was determined by the percentage of inhibition of the radical 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH ) and phenols were determined using the Folin-Cicalteau. The data from this study demonstrated that significant variations can occur for the pigment and antioxidant activity between narrow bands of light intensity, thus, a precise definition of the intensity applied through response curves previously constructed is necessary in according to biotechnological interest in question. The lowest intensities were more advantageous in terms of yield pigments, antioxidant potential and phenolic compounds. The decreased level of chlorophyll and phycobiliproteins in higher irradiances were observed, probably being prevention against photo-oxidative damage caused by free radical generation. However, for carotenoids was observed in some instances increase the content of higher irradiances, which could reflect their function as heat sinks of the light energy absorbed in excess and as antioxidant agents of the photosynthetic apparatus. The phycobiliproteins was the major contributor to total antioxidant status at lower intensities, while for higher intensities are the carotenoids. However, not always the behaviors observed were similar between the biocompostos contents and antioxidant activity, since this relationship may prove to be quite complex, requiring a qualitative and quantitative determination of many compounds that may have antioxidant properties and use of highly purified extracts. In addition, the methodology used to determine the antioxidant activity could also be a source of variation, generating inconsistent results between the content of bioactive compounds and antioxidant activity. / As cianobactérias, utilizadas há séculos como alimento, possuem mecanismos antioxidantes altamente desenvolvidos e produtividade superior a qualquer outro sistema agrícola, apresentando, portanto grande potencial como fonte de compostos antioxidantes naturais, além de vários outros biocompostos. Um dos fatores que mais interferem no metabolismo dos organismos fotossintetizantes é o nível de luz incidente, todavia para cianobactérias não são bem comprendidas as relações entre luminosidade, compostos bioativos e atividade antioxidante. Sob este enfoque, o objetivo deste trabalho foi determinar a influência de diferentes intensidades luminosas sobre a atividade antioxidante de cianobactérias do gênero Nostoc spp., e sobre os níveis de alguns dos principais compostos antioxidantes presentes em suas células: os pigmentos ficobiliproteínas (ficocianina, aloficocianina e ficoeritrina), carotenóides e clorofila a, além de compostos fenólicos. A atividade antioxidante foi determinada pelo percentual de inibição do radical 2,2-difenil-1-picril hidrazil (DPPH ) e os fenóis foram determinados pelo método Folin-Cicalteau. Os dados deste trabalho mostraram que variações significativas podem ocorrer para os teores de pigmentos e atividade antioxidante entre faixas de intensidade luminosas estreitas; assim, uma definição precisa da intensidade aplicada, através de curvas de resposta previamente construídas é necessária de acordo com o interesse biotecnológico em questão. As menores intensidades se mostraram mais vantajosas em termos de rendimento de pigmentos, potencial antioxidante e conteúdo de compostos fenólicos. A diminuição do teor de clorofila a e ficobiliproteínas em maiores irradiâncias foram observadas, sendo provavelmente uma estratégia de prevenção contra o dano foto-oxidativo ocasionado pela geração de radicais livres. No entanto, para carotenóides, observou-se em alguns momentos aumento do conteúdo em maiores irradiâncias, o que poderia refletir suas funções como dissipadores da energia luminosa absorvida em excesso e como agentes antioxidantes do aparato fotossintético. As ficobiliproteínas foram as maiores contribuintes para totalidade da defesa antioxidante nas menores intensidades, enquanto que para as maiores intensidades foram os carotenóides. No entanto, nem sempre foram observados comportamentos semelhantes entre os teores de biocompostos e a atividade antioxidante, já que esta relação pode se mostrar bastante complexa, sendo necessária uma determinação quali e quantitativa dos inúmeros compostos que podem apresentar propriedades antioxidantes e utilização de extratos altamente purificados. Além disso, a própria metodologia utilizada para a determinação da atividade antioxidante também poderia ser uma fonte de variação, gerando resultados inconsistentes entre o teor de compostos bioativos e atividade antioxidante.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2496359 bytes, checksum: 3acf1d82313dda08bea8e0ab625fe65e (MD5) Previous issue date: 2012-08-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Salmonella enterica is a foodborne pathogen able to enter in viable but nonculturable state (VNC) in response to adverse environmental conditions. S. enterica is capable to produce (p)ppGpp, a nucleotide responsible for controlling gene expression at the level of transcription and translation in nutritional stress conditions. Due to gene expression determined by the accumulation of (p)ppGpp, S. enterica supports various environmental conditions. The aims of this work were to quantify by real time PCR the expression of the genes mreB, related to the cytoskeleton, and rpoS, which codifies stress response genes, in single and double mutants of Salmonella Enteritidis PT4 578 deficient in the synthesis of (p)ppGpp, due to the mutation on gene relA, which codifies a GTP pyrophosphokinase, and, or spoT, which codifies guanosine-3',5'-diphosphate 3'-pyrophosphohydrolase, submitted to nutritional stress and cold shock; to induce these strains to VNC state in Butterfield phosphate solution (BPS), in the absence or presence of sodium chloride at 4 ºC and to evaluate the morphology of these strains in logarithmic growth phase and in VNC state. The expression of gene mreB was reduced in both mutant strains (single and double) after 25 days in stress condition. However, the double mutant presented an increase in rpoS gene expression after 25 days in the same stress condition. Wild and mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578 entered in VNC state after incubation in BPS in the absence or presence of sodium chloride at 4 °C, in different periods of time. Single and double mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578 in logarithmic growth phase presented filamentous cells. On the other hand, VNC cells of single and double mutants showed a reduction in diameter, volume and length and also transition from bacillary to coccoid form. In conclusion, the expression of mreB and rpoS genes in single and double mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578 was different when compared to the wild strain. There was also alteration in the morphology of cells in log phase when compared to the VNC cells of mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578. However, the (p)ppGpp molecule is not essential for induction and permanence of this bacterium in VNC state. / Salmonella enterica é um patógeno de origem alimentar capaz de entrar no estado viável não cultivável em resposta a condições ambientais adversas. S. enterica é capaz de produzir (p)ppGpp, um nucleotídeo responsável pelo controle da expressão gênica no nível da transcrição e da tradução, em condições de estresse nutricional. Em razão da expressão gênica determinada pelo acúmulo de (p)ppGpp, S. enterica suporta condições ambientais variadas. Este trabalho teve como objetivos: quantificar por PCR em tempo real a expressão dos genes mreB, relacionado ao citoesqueleto e, rpoS, que codifica genes de resposta ao estresse, de estirpes mutantes simples e duplo da Salmonella Enteritidis PT4 578 deficientes na síntese de (p)ppGpp, em razão de mutação no gene relA, que codifica uma GTP pirofosfoquinase, e,ou spoT, que codifica guanosina-3',5'-difosfato 3'-pirofosfohidrolase submetidas aos estresses nutricional e choque frio; induzir essas estirpes ao estado VNC em solução fosfato de Butterfield (BPS) acrescida ou não de cloreto de sódio a 4 ºC e avaliar a morfologia dessas estirpes em fase logarítmica de crescimento e no estado VNC. A expressão do gene mreB foi reduzida para ambas as estirpes mutantes (simples e duplo) após 25 dias em condição de estresse. No entanto, o mutante duplo apresentou um aumento na expressão do gene rpoS após 25 dias nesta mesma condição de estresse. As estirpes de Salmonella Enteritidis PT4 578 selvagem e mutantes entraram no estado VNC após incubação em BPS acrescido ou não de cloreto de sódio a 4 °C em diferentes tempos. Estirpes de Salmonella Enteritidis PT4 578 mutantes simples e duplo em fase logarítmica de crescimento apresentaram células filamentosas. Em vez disso, células VNC de mutantes simples e duplo mostraram redução no diâmetro, volume e comprimento e também transição da forma bacilar para a forma cocoide. Concluiu-se que a expressão dos genes mreB e rpoS das estirpes de Salmonella Enteritidis PT4 578 mutantes simples e duplo difere da estirpe selvagem. Houve também mudança da morfologia entre as células da fase log e células VNC das estirpes mutantes de Salmonella Enteritidis PT4 578. No entanto, a molécula de (p)ppGpp não é importante para indução e permanência no estado VNC desta bactéria.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3002168 bytes, checksum: 936461b9e52c3ed25ff8924c9843452e (MD5) Previous issue date: 2013-10-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Basidiospores of the ectomycorrhizal fungus P. microcarpus are characterized by impermeable, hydrophobic cell walls. These features are possibly related to the low germination percentages of these propagules and make it difficult the isolation of monokaryons and the use of these spores as inoculants. Sodium hypochlorite can be used as a permeabilizing agent of the cell wall of fungal spores. The aim of this study was to evaluate the effects of permeabilization treatments with commercial bleach on the cell wall ultrastructure and hydrophobicity, and on the viability and germination of P. microcarpus basidiospores. For this, fungal basidiospores, from fruiting bodies associated with Eucalyptus spp., were collected and permeabilized using different concentrations of bleach and times of exposure. After permeabilization, the basidiospores were analyzed by scanning and transmission electron microscopy. Surface hydrophobicity, viability, and germination of these propagules were also analyzed. The percentage of permeabilized basidiospores of P. microcarpus was proportional to the increases in bleach concentration and the exposure time. Basidiospores from different fruiting bodies differed significantly in their susceptibility to the permeabilization treatments with bleach and in the decrease of cell surface hydrophobicity after permeabilization. Changes in the ultrastructure of permeabilized basidiospores were observed at bleach concentrations of 15 and 50 %, with an exposure time of 40 s. For one basidiocarp, after permeabilization with bleach at 5 % for 40 s, 80% of the permeabilized basidiospores were viable. The plating of basidiospores permeabilized with 10% bleach for 40 s resulted in the production of colonies of P. microcarpus. The colonies appeared after 15 days of incubation of the permeabilized basidiospores in the presence of the host plant, E. citriodora. The germination percentage obtained, 0,001 %, was similar to those reported for non-permeabilized basidiospores. This work is the first report on the ultrastructure of the cell wall of basidiospores of P. microcarpus and contributes to the understanding of the recalcitrance of these propagules to germination. / Basidiósporos do fungo ectomicorrízico P. microcarpus apresentam parede celular impermeável e hidrofóbica. Essas características estão possivelmente relacionadas às baixas porcentagens de germinação desses propágulos, dificultando a obtenção de monocários e a utilização desses esporos em inoculantes. O hipoclorito de sódio pode ser usado como agente permeabilizador da parede celular de esporos fúngicos. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do tratamento de permeabilização com água sanitária sobre a ultraestrutura e hidrofobicidade da parede celular, a viabilidade e a capacidade de germinação de basidiósporos de P. microcarpus. Para isso, basidiósporos fúngicos, oriundos de corpos de frutificações associados a plantas de Eucalyptus spp., foram coletados e permeabilizados utilizando-se diferentes concentrações de água sanitária e tempos de exposição ao composto. Após a permeabilização, os basidiósporos foram analisados por microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. A hidrofobicidade superficial, a viabilidade e a germinação desses propágulos também foram analisadas. A porcentagem de basidiósporos de P. microcarpus permeabilizados foi proporcional ao aumento na concentração de água sanitária e ao tempo de exposição. Basidiósporos oriundos de diferentes basidiocarpos diferiram de forma significativa na susceptibilidade ao tratamento de permeabilização com água sanitária e na redução da hidrofobicidade da superfície celular após esse tratamento. Alterações da ultraestrutura dos basidiósporos permeabilizados foram observadas nas concentrações de 15 e 50 % de água sanitária pelo tempo de exposição de 40 s. Para um dos basidiocarpos avaliados e após a permeabilização com água sanitária a 5 % por 40 s, 80 % dos esporos permeabilizados encontravam-se viáveis. O inóculo dos basidiósporos permeabilizados com água sanitária a 10 % por 40 s resultou na produção de algumas colônias de P. microcarpus. As colônias apareceram após 15 dias de incubação dos basidiósporos permeabilizados na presença da planta hospedeira, Eucalyptus citriodora. A porcentagem de germinação obtida, 0,001%, foi semelhante àquelas relatadas na literatura para basidiósporos não-permeabilizados. Este trabalho é o primeiro relato sobre a ultraestrutura da parede celular dos basidiósporos de P. microcarpus e contribui para a compreensão da recalcitrância desses propágulos à germinação.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 952076 bytes, checksum: 7fbcb43414ecacd3439620826b6172cd (MD5) Previous issue date: 2012-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean anthracnose. Genes that encode cell wall-degrading enzymes are essential for the development of this disease. The pectinases are characterized as the most important group of cell wall- degrading enzymes produced by phytopathogen fungi. The gene coding for pectate lyase, pecCl1, was previously identified in a suppressive subtractive library of bean infected with C. lindemuthianum. Isolation of the gene pecCl1 made it possible to obtain mutants and to analyze the regulation of this gene during development of anthracnose, determining whether the pectate lyase is a pathogenic factor. Thus, the aim of our study was structurally and functionally characterize the gene encoding pectate lyase in C. lindemuthianum. Initially, was performed the structural analysis of the gene pecCl1. The complete nucleotide sequence of the gene pecCl1 was deposited in Genbank with accession number JX270683. The analysis of the promoter region revealed some putative cis-elements and potential binding motifs of transcription factors involved in the regulation of pectate lyase gene expression. The deduced amino acid sequence of pecCl1 showed sequence identity with the pectate lyase F of Colletotrichum higginsianum and the pectate lyase C of Glomerella graminicola M1.001. Furthermore, it was found putative conserved domain pfam03211 of the pectate lyases superfamily. The gene pecCl1 is represented by a single copy in the C. lindemuthianum genome. However, into the genome of Colletotrichum graminicola, three sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, and into the genome of C. higginsianum seven sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, indicating that the C. lindemuthianum genome can possess other genes encoding pectate lyase. Phylogenetic analysis of pectate lyase amino acid sequences of filamentous fungi exhibited the formation of two distinct groups which are grouped on the basis of members of the pectate lyases multigene family. The Split-Marker technique was effective in C. lindemuthianum pecCl1 gene inactivation, allowing the study of pecCl1 function in a mutant by specific integrations and without ectopic integrations. The pecCl1 gene inactivation did not lead to complete loss of the pectate lyase activity, and consequently only decreased anthracnose symptoms in its host, which is consistent with the presence of other genes coding pectate lyase, allowing greater flexibility in pathogen aggressiveness. The analysis of differential expression of gene pecCl1 by qPCR was performed at different stages of bean infection and were observed expression levels of pecCl1 at all stages of development of the fungus in the plant, but a significant increase was observed five days after infection, in the onset of necrotrophic stage. At this stage, secondary hyphae cause extensive degradation of plant cell wall through the secretion of wide range of depolymerases, among these, the pectate lyase. Thus, the pectate lyase encoded by the gene pecCl1 is important to aggressiveness of C. lindemuthianum. The analysis of pectate lyases in C. lindemuthianum can not only assist in understanding the disease, but may also lead to discovery of one more target for disease control. / Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Genes que codificam enzimas que degradam a parede celular são essenciais para o desenvolvimento dessa doença. As pectinases são caracterizadas como o grupo de enzimas que hidrolisam a parede celular mais importante produzidas por fungos fitopatogênicos. O gene pecCl1, que codifica pectato liase, foi previamente identificado em uma biblioteca subtrativa supressiva de feijoeiro infectado com C. lindemuthianum. O isolamento do gene tornou possível a obtenção de mutantes e análise da regulação deste gene durante o desenvolvimento da antracnose, visando determinar se a pectato liase é um fator de patogenicidade. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar estruturalmente e funcionalmente o gene que codifica pectato liase em C. lindemuthianum. Inicialmente, foi realizada a análise estrutural do gene pecCl1. A sequência completa de nucleotídeos do gene pecCl1 foi deposita no Genbank com número de acesso JX270683. A análise da região promotora revelou alguns possíveis cis-elementos e sítios de ligação a fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão gênica da pectato liase. A sequência de aminoácidos deduzida de pecCl1 apresentou identidade de sequências com a pectato liase F de Colletotrichum higginsianum e a pectato liase C de Glomerella graminicola M1.001. Além disso, detectou-se um possível domínio conservado pfam03211 da superfamília de pectato liases. O gene pecCl1 encontra-se representado por uma cópia única no genoma de C. lindemuthianum. No entanto, no genoma de Colletotrichum graminicola, três sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, e no genoma de C. higginsianum sete sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, indicando que o genoma de C. lindemuthianum pode possuir além do gene pecCl1 outros genes que codificam pectato liase. A análise filogenética de sequências de aminoácidos de pectato liases de fungos filamentosos mostrou a formação de dois grupos distintos, que se agruparam com base nos membros da família multigênica de pectato liases. A técnica de Split-Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene pecCl1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene pecCl1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. A inativação do gene pecCl1 não levou a perda completa da atividade de pectato liase, e consequentemente, somente diminuiu os sintomas de antracnose em seu hospedeiro, o que é consistente com a presença de outros genes que codificam pectato liase no fungo, permitindo ao patógeno uma maior flexibilidade em sua agressividade. Foi realizada a análise da expressão diferencial do gene pecCl1 por qPCR nos diferentes estágios de infecção no feijoeiro e foram observados transcritos de pecCl1 em todas as fases de desenvolvimento do fungo na planta, mas houve um aumento significativo destes transcritos cinco dias após a infecção, no início da fase necrotrófica do fungo. Nesta fase, as hifas secundárias causam degradação extensiva da parede celular vegetal por meio da secreção de vasta gama de despolimerases, dentre estas, a pectato liase. Portanto, a pectato liase codificada pelo gene pecCl1 é importante para agressividade de C. lindemuthianum. A análise de pectato liases poderá não somente auxiliar na compreensão da antracnose em feijoeiro comum, mas também poderá levar a descoberta de mais um alvo para o controle dessa doença.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 536332 bytes, checksum: 5951891794c17e210fb52fda2d6fa297 (MD5) Previous issue date: 2013-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Devido à ausência de estudo de caracterização da variabilidade genética das populações de Pseudocercospora fijiensis recentemente introduzidas no Brasil, o objetivo desse trabalho foi avaliar a adequabilidade do marcador IRAP para estudar variações genéticas entre indivíduos, bem como determinar a estrutura genética da população brasileira de P. fijiensis com base no fingerprinting gerado por amplificação de polimorfismo entre retrotransposons (IRAP). Um total de 22 locos foi amplificado, sendo 77.3 % polimórficos. A análise de agrupamento revelou dois principais grupos no Brasil. A diversidade gênica (HE) foi de 0.22 e pela análise de variância molecular verificou-se que a maior variabilidade genética está dentro das populações. A Análise Discriminante de Componente Principal (DAPC) revelou que não há nenhuma estruturação relacionada com as origens geográficas e cultiva hospedeiro. O sistema de marcador baseado em retrotransposon IRAP é ferramenta apropriada para estudar a variabilidade genética em P. fijiensis. / Due to the lack of characterization study of genetic variability in populations of Pseudocercospora fijiensis recently introduced in Brazil, the objective of this study was to evaluate the suitability of IRAP marker for studying genetic variations between individuals, and to determine the genetic structure of the population of P. fijiensis based on fingerprinting generated by inter-retrotransposons amplified polymorphism (IRAP). A total of 22 loci were amplified and 77.3% showed a polymorphism. Cluster analysis revealed two major groups in Brazil. The observed genetic diversity (HE) was 0.22, and through molecular analysis of variance, it was determined that the greatest genetic variability occurs within populations. The Discriminant Analysis of Principal Components (DAPC) revealed no structuring related to the geographical origin of culture of the host. The IRAP-based marker system is a suitable tool for the study of genetic variability in P. fijiensis.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2800985 bytes, checksum: 40fca2e6fae55c6c55dc0ea1697df826 (MD5) Previous issue date: 2013-10-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In pigmented microorganisms, carotenoids are pigments, precursors of vitamin A that provide protective effects against oxidative damage. Extrinsic environmental factors such as temperature, specific carbon sources and inducers of reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide and light associated with physiological conditions (maximum exponential growth phase, early and late stationary phase) influence the accumulation of carotenoids in microbial cells. A pigmented yeast was isolated from an orchard in Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brazil. The main aims were to identify the isolated yeast and analyze the influence of environmental (light, temperature and arabinose) and physiological conditions (log phase, early and late stationary phase) on the production of carotenoids and the growth rate of the yeast. The taxonomical identification of the yeast strain was accomplished through analysis of 5.8S and 26S rRNA by the Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) and biochemical and molecular approaches. The yeast was identified as Rhodotorula mucilaginosa. In order to analyze the influence of factors on production of carotenoids and growth rate we used a methodology of response surface (RSM), and a central composite factorial design (CCD) with three factors and six replicates of central point was applied. The 20 experiments were done in batch in 91h and samples were collected at different physiological stages of the culture, at maximum growth rate (log phase), at deceleration growth phase (2h initial at the entrance of the stationary phase) and at stationary phase (60h after reaching the maximum cell mass). It implicates that carotenogenesis is not associated with cellular growth. The maximum carotenoid yield per cell mass (μg/g) occurred at deceleration growth phase. The growth rate (μ) and total carotenoid yield (μg/g) calculations well- adjusted to the mathematical model, with R2 of 0.96 and 0.91, respectively, and the lack of fit was not significant (p>0.05). The levels of light (μmol m-2s-1), arabinose (%w/v) and temperature (°C) that created a maximum answer of total carotenoid yield (93.92 μg/g) were 100 μmol m-2s-1; 5% and 18 °C and growth rate (0.31h-1) were 63.6 μmol m-2s-1; 3.7% and 24.6 °C. / Em micro-organismos produtores, carotenoides são pigmentos, precursores de vitamina A, que os protegem contra o estresse oxidativo. Fatores ambientais extrínsecos tais como temperatura, fontes específicas de carbono e indutores de espécies reativas de oxigênio (ROS) como luz e peróxido de hidrogênio associados a condições fisiológicas (fase de crescimento exponencial máxima, fase estacionária inicial e tardia) influenciam no acúmulo de carotenoides pelas células microbianas. Uma levedura pigmentada foi isolada do horto da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil. Os objetivos desse trabalho foram identificar esta levedura isolada no horto da UFV e analisar a influência dos fatores ambientais (temperatura, intensidade de luz e concentração de arabinose) e das diferentes condições fisiológicas (fase log, estacionária inicial e tardia) na produção de carotenoides e na velocidade de crescimento da levedura. A identificação taxonômica da levedura foi feita pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) por meio das análises das sequências 5,8S e 26S do rRNA e por ferramentas moleculares e bioquímicas, resultando na identificação da espécie como Rhodotorula mucilaginosa. A influência das condições ambientais e fisiológicas na produção de carotenoides e na taxa de crescimento foi verificada pela metodologia de superfície de resposta (RSM) por meio de um delineamento composto central (CCD) com três fatores e seis replicatas do ponto central. Os 20 experimentos foram feitos em 91h de batelada e as amostras foram coletadas em diferentes estados fisiológicos da cultura, isto é na fase de crescimento máximo (fase log), fase de desaceleração do crescimento (2h iniciais na entrada da fase estacionária) e fase estacionária (60h após alcançar a massa celular máxima). Demonstrou-se que a formação de carotenoides pela levedura não é associada ao crescimento. O rendimento máximo de carotenoides por massa celular (μg/g) ocorreu na fase de desaceleração do crescimento. A velocidade específica máxima de crescimento (μmax) e o rendimento em carotenóide total por massa celular (μg/g) foram ajustados ao modelo matemático, com R2 de 0,96 e 0,91 respectivamente, e o desajuste não foi significante (p>0,05). Os níveis de intensidade de luz (μmol m-2s-1), arabinose (%p/v) e temperatura (°C) que criaram a resposta máxima de rendimento de carotenóides totais (93,92 μg/g) foram 100 μmol m-2s-1; 5%; 18 °C e da velocidade de crescimento (0,31h-1) foram 63,6 μmol m-2s-1; 3,7% e 24,6 °C.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 775105 bytes, checksum: a65f62092072dba5b21d0daf4645e166 (MD5) Previous issue date: 2013-12-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The effectiveness of spray dried surfactin, produced from a culture of Bacillus subtilis 4914 strain, was evaluated in microcosms containing sandy clay loam soil (SCL) or clayey soil (CLA) contaminated with petroleum. The highest respiratory rates in the microcosms additioned of petroleum demonstrated that oil was utilized as carbon source for microbiota in the microcosms of both soils. Maltodextrin, utilized as a drying adjuvants in the preparation of spray dried surfactin, was also utilized as a source of carbon and energy. The means of accumulated CO2 during the decline phase of the respiration rate shared by all microcosms of a same soil type, ranged from 47,6 to 137,7 μmol g-1 for SCL soil and from 37,5 to 98,5 μmol g-1 for CLA soil. The removal of TPH ranged from 19,6 to 38,4 % and from 62,6 to 73,2 % for the SCL and CLA soils, respectively. Surfactin in its two forms (in liquid solution and dried) influenced positively the degradation of the TPH in the SCL and CLA soils and in late phase of bioremediation. Maltodextrin did not interfere in the degradation of TPH. The lowest values of residual TPH in microcosms assembled with CLA soil were attributed to the highest microbial activity and biomass. The microbial community dynamics was studied by T-RFLP multiplex analysis of the groups Bacteria, Fungi e Archaea. The results demonstrated the occurrence of negative impact of oil on the microbial communities of all microcosms of both soil types, in the beginning of incubation period, and recovery of the community structure in subsequent times. The fungal community showed highest values of Shannon-Weaver index (H ), Simpson index (D) and Richness (S), followed by the Bacteria. In conclusion, spray dried surfactin favors the biodegradation of petroleum hydrocarbons in soils. / A efetividade da surfactina desidratada em spray dryer, produzida a partir do cultivo do isolado Bacillus subtilis LBBMA 4914, foi avaliada em microcosmos contendo amostras de solos franco-argilo-arenoso (FAA) ou argiloso (ARG) contaminados com petróleo. As taxas respiratórias mais elevadas nos microcosmos adicionados de petróleo demonstraram que o petróleo foi utilizado como fonte de carbono pelas microbiotas nos microcosmos de ambos os tipos de solo. A maltodextrina, utilizada como adjuvante de secagem na preparação da surfactina desidratada por spray dryer, foi também utilizada como fonte de carbono e energia. As médias dos valores de CO2 acumulado durante a fase de declínio das taxas respiratórias compartilhada por todos os microcosmos em um mesmo tipo de solo variaram entre 47,6 a 137,7 μmol g-1 (microcosmos com o solo FAA) e 37,5 a 98,5 μmol g-1 (microcosmos com solo ARG). A remoção dos HTPs variou entre 19,6 a 38,4 % (solo FAA) e 62,6 a 73,2 % (solo ARG). A surfactina em suas duas formas (solução e desidratada) influenciou positivamente a degradação dos HTPs nos solos FAA e ARG e em fase tardia da biorremediação. A maltodextrina não interferiu na degradação dos HTPs. Os menores valores de HTPs residuais em microcosmos montados com o solo ARG foram atribuídos às maiores atividade e biomassa microbianas. A dinâmica das comunidades microbianas foi estudada pela análise de T-RFLP multiplex dos grupos de Bacteria, Fungi e Archaea. Os resultados demonstraram a ocorrência de impacto negativo do petróleo nas comunidades microbianas de todos os microcosmos em ambos os tipos de solo, no início do período de incubação, e recuperação da estrutura das comunidades nos tempos subsequentes. A comunidade de fungos apresentou valores mais elevados dos índices de Shannon-Weaver (H ), Simpson (D) e Riqueza (S), seguida pela de Bacteria. Conclui-se que surfactina desidratada por spray-drying favorece a biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo em solos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 996773 bytes, checksum: 7322b4697c096a6f17a4388ca498fede (MD5) Previous issue date: 2014-02-17 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The L-ascorbic acid (ALA) is produced naturally by plants from D-glucose. Yeasts synthesize a similar metabolite, D-eritroascorbic acid (ADEA). Although this compound does not show activity against scurvy, it contains an antioxidant function, but it is produced in low concentrations by the microorganism. Recently, in order to make yeasts are capable of converting D-galactose D-lactose from cheese whey into ALA, the wild strain Kluyveromyces lactis CBS2359 has been transformed with genes that integrate the L-galactose biosynthesis pathway, isolated from Arabidopsis thaliana. In the presence of intermediate L-galactose, ALA can be synthesized by yeast with enzymes responsible for ADEA production. It has been demonstrated that the engineered strain JVC 1-56 was able to synthesize ALA compared to the wild type, but the yield was still low. In this regard, studies to assist the increased of ALA production are relevant. Once the engineered ALA pathway and native cell wall formation pathway of K. lactis have a common intermediate, GDP-D-mannose, we need to evaluate the effect of uncoupling of vitamin C synthesis route of the growth that requires constant wall synthesis. Moreover, considering the antioxidant properties of ALA, the expectation is that the production of this metabolite increase when JVC 1-56 is exposed to a oxidative stress condition by menadione. In this context, this study investigated the both physiological conditions, using the media Yeast Galactose Base (YGB) and ultrafiltered cheese whey (SQU - byproduct of cheese industry that predominates lactose as carbon source). It was analyzed that Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produces higher yields of ALA when it is grown for 96 hours in batch culture in the middle YPGal. Cultivation at low growth rates (0.04 h-1) predisposes the cells to synthesize more ALA per unit cell mass (0.80 mg/mg). However, the yield of continuous culture operated as quimostato, limiting the substrate nitrogen, still proved to be lower than expected in the batch (1.94 mg/mg). Oxidative stress by 12.5 mM menadione on K. lactis JVC1 -56, in the conditions applied, was not effective in the increasing the ALA production (1.47 mg/mg). Still, ADEA yield was higher than ALA in two strategies: 1.37 mg/mg at 0.21 h-1 in culture under steady state, 8.52 mg/mg in batch under oxidative stress and 10.33 mg/mg in the batch in the absence of oxidizing agent, indicating that ADEA may be in a more stable configuration than vitamin C. Finally, the permeate cheese whey remains a prospect for the conversion of lactose into a biotechnological product of higher value aggregate. / O ácido L-ascórbico (ALA) é produzido naturalmente por plantas a partir de D-glicose. Leveduras sintetizam um metabólito semelhante, o ácido D-eritroascórbico (ADEA). Embora este composto não mostre atividade contra o escorbuto, ele contém uma função antioxidante, mas é produzido pelo micro-organismo em baixas concentrações. Recentemente, com a finalidade de fazer as leveduras serem capazes de converter o componente D-galactose da D-lactose do soro de queijo em ALA, a linhagem selvagem de Kluyveromyces lactis CBS2359 foi transformada com genes, que integram a via de biossíntese de L-galactose, isolados de Arabidopsis thaliana. Na presença do intermediário L-galactose, ALA pode então ser sintetizado pela levedura com as enzimas responsáveis pela produção de ADEA. Foi demonstrado que a linhagem engenheirada JVC 1-56 foi capaz de sintetizar ALA em comparação com a selvagem, mas com baixo rendimento. Neste sentido, estudos que auxiliem o aumento da produção de ALA são relevantes. Uma vez que a via engenheirada da síntese de ALA e a via nativa da formação da parede celular de K. lactis possuem um intermediário comum, GDP-D-manose, faz-se necessário avaliar o efeito do desacoplamento da produção de ALA do crescimento que requer constante síntese da parede. Além disso, considerando a propriedade antioxidante do ALA, a expectativa é de que a produção deste metabólito aumentasse quando JVC 1-56 fosse exposta a uma condição de estresse oxidativo por menadiona. Neste contexto, este trabalho investigou as condições fisiológicas mencionadas utilizando os meios Yeast Galactose Base (YGB) e soro de queijo ultrafiltrado (SQU - subproduto de indústrias de queijo em que predomina lactose como fonte de carbono). Foi averiguado que Kluyveromyces lactis JVC 1-56 produz ALA com rendimentos maiores quando cultivada por 96 horas em batelada no meio YPGal. O cultivo em baixas velocidades de crescimento (0,04 h -1) predispõe as células a sintetizar mais ALA por unidade de massa celular (0,80 mg/mg). Entretanto, o rendimento da cultura contínua operada como quimostato, tendo nitrogênio como substrato limitante, ainda mostrou ser inferior ao previsto na batelada (1,94 mg/mg). Já o estresse oxidativo por 12,5 μM de menadiona sobre K. lactis JVC1- 56, nas condições aplicadas, não foi eficaz no aumento da produção de ALA (1,47 mg/mg). Ainda, o rendimento de ADEA foi superior ao de ALA nas duas estratégias: 1,37 mg/mg a 0,21 h-1 na cultura sob regime permanente, 8,52 mg/mg na batelada sob estresse oxidativo e 10,33 mg/mg na batelada na ausência do agente oxidante, indicando que ele pode estar em uma configuração mais estável do que a vitamina C. Finalmente, o permeado do soro de queijo continua sendo uma perspectiva para a conversão da lactose em um produto biotecnológico de maior valor agregado.