Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo correto.pdf: 535635 bytes, checksum: 2ca42e241dd388099a705af6f2c401d0 (MD5) Previous issue date: 2008-10-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Filamentous fungi are recognized as excellent producers of extracellular enzymes and the genetically modified strains have made possible the production of pectinases with greater specificity and purity, better use of raw materials and lower production of waste. The production of pectin lyase (PL) and polygalacturonase (PG) by genetically modified strain Penicillium griseoroseum T20 has been studied. The response surface methodology (RSM) was used to optimize PL and PG production. The parameters sucrose concentration and cultivation time were evaluated. The highest PL production in Erlenmeyer flasks with 200 mL of culture medium was achieved after 87.7 h in sucrose 15.7 g/L and the highest PL estimated activity was 2428 U/ml. The higher PG production in Erlenmeyer flasks with 200 mL of culture medium was achieved after 83.8 hours and the highest PG estimated activity was 9465 U/ml. The sucrose concentration showed no significant influence on the production of this enzyme. The optimization in Erlenmeyer flasks was followed by the scaleup to 10 L bioreactor. The aeration conditions were evaluated and the highest PL and PG activity was observed in 1.0 L of air per minute. Under this condition, the strain showed low protease activity, just in the final period of cultivation, and β-glucosidase activity was not detected. The protein profile of the recombinant strain T20 showed the presence of two distinct bands of with approximately 38 and 36 kDa. These bands corresponded to PL and PG, respectively. The mycelial growth of the strain P. griseoroseum T20 has been studied by RSM, and the maximum mycelial dry weight observed was 8.63 g/L, on 30 g/L sucrose and 120 hours of cultivation. The mycelial morphology suggested a link between the occurrence of free and dispersed hyphae and the production of PL and PG. The kinetic parameters of fermentation were determined and compared between the scales of PL and PG production. The maximum total protein was 9.1 and 9.5 mg/L in cultures of 200 ml and 10 L, respectively. The specific PL (PspePLp) and PG (PspePGp) activities in relation to total protein were 353 and 613 U/g at 200 mL cultivation and 305 and 1106 U/g at 10 L cultivation, respectively. The maximum yield of PL (PdPL) and PG (PdPG) observed were 33.4 and 73.3 U/mL.h at 200 mL cultivation and 24.1 and 289 U/L.mL.h at 10 L. The performance parameters of PL (RPL/S) and PG (RPG/S) were 214 and 352 at 200 ml cultivation and 87.4 and 1049 at 10 L, respectively. The PL and PG production between P. griseoroseum T20 and P. griseoroseum wide type strain was compared. Increases of more than 400 times in the PL production and at least 14 times in the PG production were observed. The results suggest the great potential for industrial application of this strain for the production of PL and PG. / Fungos filamentosos são reconhecidos como excelentes produtores de enzimas extracelulares e as linhagens geneticamente modificadas têm tornado possível a produção de pectinases com maior especificidade e pureza, melhor utilização de matéria-prima e menor produção de resíduos. O processo de produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) pela linhagem geneticamente modificada Penicillium griseoroseum T20 foi estudado. As condições ótimas de cultivo para a produção de PL e PG foram determinadaspor meio da Metodologia de Superfície de Resposta (RSM). A maior produção de PL em frascos Erlenmeyer com 200 mL de meio de cultivo foi obtida após 87,7 h em meio contendo sacarose em concentração inicial de 15,7 g/L, sendo a maior atividade de PL estimada de 2.428 U/mL. A maior produção de PG em frascos Erlenmeyer com 200 mL de meio de cultivo foi obtida após 83,8 h, sendo a maior atividade de PG estimada de 9.465 U/mL. A concentração de sacarose não mostrou influência significativa sobre a produção dessa enzima. Após otimização dos fatores tempo de cultivo e concentração de sacarose em Erlenmeyers, foi feito o escalonamento para biorreator com 10 L de trabalho. A condição de aeração que proporcionou a maior atividade de PL e PG foi de 1,0 L de ar por minuto. Nessa condição, a linhagem apresentou baixa atividade de protease no período final de cultivo e não foi detectada atividade de β-glicosidase. O perfil protéico da linhagem recombinante T20 mostrou a presença de duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 e 36 kDa, correspondentes à PG e à PL, respectivamente. O crescimento micelial da linhagem P. griseoroseum T20 foi estudado por meio da RSM, e a massa micelial seca máxima estimada foi de 8,63 g/L, na condição de 30 g/L de sacarose após 120 horas de cultivo. A avaliação da morfologia micelial sugeriu a existência de uma relação entre a ocorrência de hifas livres e dispersas e a produção de PL e PG. Os parâmetros cinéticos da fermentação foram determinados e comparados entre as escalas de produção de PL e PG. A proteína total máxima observada foi de 9,1 e 9,5 mg/L nos cultivos de 200 mL e 10 L, respectivamente. As atividades específicas de PL (PspePLp) e PG (PspePGp) em relação à proteína total foram de 353 e 613 U/μg no cultivo em 200 mL e de 305 e 1.106 U/μg no cultivo em 10 L, respectivamente. As produtividades enzimáticas máximas de PL (PdPL) e PG (PdPG) observadas foram de 33,4 e 73,3 U/mL.h em 200 mL e de 24,1 e 289 U/mL.h em 10 L. Os parâmetros rendimento de PL (RPL/S) e de PG (RPG/S) calculados foram de 214 e 352 no cultivo em 200 mL e de 87,4 e 1.049 no cultivo em 10 L, respectivamente. A produção de PL e PG entre as linhagens P. griseoroseum T20 e P. griseoroseum selvagem foi comparada e aumentos de mais 400 vezes na produção de PL e de pelo menos 14 vezes na produção de PG foram observados. Os resultados sugerem o grande potencial de aplicação industrial dessa linhagem para a produção de PL e PG.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1252953 bytes, checksum: 5c4901cfbd21633e7c02d3de0ad4790a (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Endophytic fungi are those living at least a part of their life cycle within plant tissue, apparently without causing any damage to their hosts. These microorganisms have been studied for their capacity to produce secondary metabolites of biotechnological interest, and also for their ability for biological control of phytopathogens. Endophytic fungi have been isolated from a wide variety of plant species, including crops such as common bean (Phaseolus vulgaris L.). Fungi from the genus Diaporthe were abundant in the endophytic community of this legume. The objectives of this study were to evaluate the antimicrobial activity and the potential use of endophytic fungi of P. vulgaris in the control of phytopathogens of bean, and to analyze phylogenetic relationships and genetic variability of endophytic fungi of the genus Diaporthe isolated from P. vulgaris. Dual culture assays were performed between ninety endophytic fungi and four phytopathogenic fungi (Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum) to assess for the ability of endophytic fungi inhibit the growth of phytopathogens. The isolates that were able to inhibit the four phytopathogens tested were selected for cultivation and obtention of metabolites crude extracts. These extracts were evaluated for antibacterial and antifungal activity. The sequences of the ITS region of rDNA of the isolates of the genus Diaporthe from common bean, along with the partial sequences of the genes encoding translation elongation factor 1-α, β-tubulin and calmodulin were used for the study of the phylogenetic relationships of these isolates. Molecular markers based on sequences of retrotransposons, IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) and REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), were used for the analysis of genetic variability. It was found that endophytic fungi of common bean are able to inhibit the in vitro growth of phytopathogenic fungi and that metabolites crude extracts of endophytic exhibit significant antimicrobial activity especially regarding the inhibitory activity against Gram-positive bacteria (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, B. subtilis and Staphylococcus aureus). Diaporthe sp., D. infecunda, D. melonis and D. phaseolorum are members of the endophytic fungal community in the common bean as verified by multilocus phylogenetic analysis. Cluster analysis, conducted with pooled data from IRAP and REMAP markers, was consistent regarding what was observed in multilocus phylogeny and revealed the existence of high genetic variability, particularly among isolates of D. infecunda. It was concluded that the metabolites crude extracts of endophytic fungi of common bean exhibit promising antimicrobial activity; that endophytic fungi used in this study have the potential to control phytopathogens that affect the bean crop; the multilocus phylogenetic approach was more effective than individual analysis of ITS sequences in the study of phylogenetic relationships of endophytic fungi of the genus Diaporthe from common bean and that IRAP and REMAP markers can be employed in the study of genetic variability of this genus of fungi. / Fungos endofíticos são aqueles que vivem, em pelo menos uma parte de seu ciclo de vida, no interior de tecidos vegetais, sem causar aparentemente qualquer dano a seus hospedeiros. Esses micro-organismos têm sido estudados em relação à capacidade de produzirem metabólitos secundários de interesse biotecnológico e quanto ao potencial de controle biológico de fitopatógenos. Fungos endofíticos já foram isolados de uma ampla variedade de espécies vegetais, incluindo culturas agrícolas como o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). O gênero Diaporthe foi um dos mais abundantes na comunidade endofítica dessa leguminosa. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a atividade antimicrobiana e o potencial de uso de fungos endofíticos de P. vulgaris no controle de fitopatógenos da cultura do feijoeiro e analisar as relações filogenéticas e a variabilidade genética de fungos endofíticos do gênero Diaporthe isolados de P. vulgaris. Ensaios de cultura dupla entre 90 isolados endofíticos e quatro fungos fitopatogênicos (Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum) foram realizados para verificar a capacidade dos isolados endofíticos inibirem o crescimento dos fitopatógenos. Os isolados que foram capazes de inibir os quatro fitopatógenos testados foram selecionados para cultivo e obtenção de extratos brutos de metabólitos. Esses extratos foram avaliados quanto à atividade antibacteriana e antifúngica. As sequências da região ITS do rDNA dos isolados do gênero Diaporthe do feijoeiro, juntamente com as sequências parciais dos genes codificam o fator de elongação da tradução 1-α, β-tubulina e calmodulina, foram utilizadas para o estudo das relações filogenéticas desses isolados. Marcadores moleculares baseados em sequências de retrotransposons, IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) e REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), foram utilizados para a análise de variabilidade genética. Foi constatado que os fungos endofíticos do feijoeiro comum são capazes de inibir o crescimento in vitro de fungos fitopatogênicos e, que extratos brutos de metabólitos de isolados endofíticos exibem atividade antimicrobiana significativa, principalmente em relação à atividade inibitória sobre bactérias Gram-positivas (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, B. subtilis e Staphylococcus aureus). Por meio de análise filogenética multilocus, verificou-se que Diaporthe sp., D. infecunda, D. melonis e D. phaseolorum são integrantes da comunidade fúngica endofítica do feijoeiro comum. A análise de agrupamento, realizada com os dados dos marcadores IRAP e REMAP em conjunto, foi coerente em relação ao que foi verificado na filogenia multilocus e, revelou a existência de grande variabilidade genética, sobretudo entre os isolados de D. infecunda. Concluiu-se que extratos brutos de metabólitos de fungos endofíticos do feijoeiro exibem atividade antimicrobiana promissora; que fungos endofíticos utilizados neste estudo apresentam potencial para controle de fitopatógenos que acometem a cultura do feijoeiro; que a abordagem filogenética multilocus foi mais efetiva que análise individual de sequências de ITS no estudo das relações filogenéticas de fungos endofíticos do gênero Diaporthe do feijoeiro e que marcadores IRAP e REMAP podem ser empregados no estudo de variabilidade genética de fungos desse gênero.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 868663 bytes, checksum: 23683551a9b1133991133585463f9959 (MD5) Previous issue date: 2007-08-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The angular leaf spot, caused by Phaeoisariopsis griseola, also known as Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, is one of the most important diseases in the bean plant, causing serious damages to the production. The most efficient cost strategy for the management of plant diseases is the use of resistant cultivars. However, studies related to the genetic diversity of P. griseola have been demonstrating great genetic variability in this fungus, what has been hardening the achievement of those cultivars. Therefore, the aim of this work was to verify if the techniques of ERIC-PCR, BOX-PCR, ISSR-PCR and PCR- RFLP of the rDNA ITS region are able to detect the genetic diversity of the P. griseola isolates from Goiás, Minas Gerais, Espírito Santo and Paraná states. The total DNA of the 29 P. griseola isolates were extracted and, later, amplified using specific primers for ERIC, BOX, ISRR and ITS sequences. The cleavages of the ITS region with the restriction enzymes AluI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI produced identical restriction profiles for all the isolates, and, therefore, the ITS sequence under used conditions supply markers that could differ the isolates of P. griseola. Through the grouping analysis of the results obtained by the BOX-PCR, ERIC-PCR and ISSR-PCR techniques, 2, 5, and 28 genotypes were revealed, respectively, among the isolates studied. Those results showed that BOX-PCR and ERIC-PCR techniques were less efficient to detect the genetic variability of P. griseola isolates. The best results were obtained using the ISSR- PCR technique, revealing high capacity in the polymorphism detection among the isolates. The genetic diversity observed can help in the development of appropriate strategies to obtain resistant bean plant varieties to this fungus. / A mancha-angular, causada pelo fungo Phaeoisariopsis griseola, também conhecido como Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, é uma das doenças mais importantes que ocorre no feijoeiro, causando sérios prejuízos na produção. A forma mais econômica de controle dessa doença é a utilização de cultivares resistentes. Entretanto, estudos relacionados à diversidade genética de P. griseola têm demonstrado grande variabilidade genética nesse fungo, o que tem dificultado a obtenção dessas cultivares. Diante disso, o objetivo desse trabalho foi verificar se as técnicas ERIC-PCR, BOX-PCR, ISSR-PCR e PCR-RFLP da região ITS do rDNA são apropriadas para a detecção de polimorfismos genéticos que permitam estimar a diversidade genética de isolados de P. griseola provenientes dos estados de Goiás, Minas Gerais, Espírito Santo e Paraná. O DNA total de 29 isolados de P. griseola foi extraído e, posteriormente, utilizado para amplificação de seqüências ERIC, BOX, ISSR e ITS utilizando oligonucleotídeos específicos. As clivagens da região ITS com as enzimas de restrição AluI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MspI e RsaI produziram perfis de restrição idênticos para todos os isolados, e, portanto, a sequência ITS nas condições empregadas não forneceu marcadores que pudessem diferenciar os isolados de P. griseola. Por meio da análise de agrupamento dos resultados obtidos pelas técnicas BOX-PCR, ERIC-PCR e ISSR-PCR, foram detectados 2, 5 e 28 genótipos, respectivamente, entre os isolados estudados. Os resultados obtidos mostraram que as técnicas BOX-PCR e ERIC-PCR foram menos eficientes na detecção de polimorfismo genético entre os isolados de P. griseola. Os melhores resultados foram obtidos com o emprego da técnica ISSR- PCR, que mostrou grande capacidade de detecção de marcadores polimórficos entre os isolados. A diversidade genética estimada poderá auxiliar no desenvolvimento de estratégias adequadas para a obtenção de variedades de feijoeiro resistentes a esse fungo.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 807100 bytes, checksum: 0492f1cb907f9d50a51882efd7f76fcd (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Three thermophilic lignocellulolytic microbial communities were selected by enriched method with continual subcultivation at 55 °C. One community was selected from cow manure compost, another from decaying sugar cane bagasse, and the last one was obtained by mixing aliquots of the culture suspension from the first two. Those communities were able to degrade a cellulosic strip in three cultivation days. Evaluating the maximal day of CMCase and xylanase activity, it was observed that the mixed consortium showed the best results, with CMCase activity of 0.09 U mg-1 at the second day of cultivation, and xylanase activity of 2.86 U mg-1 at the fourth day. These enzymes were partially characterized with relation to temperature and pH of optimal activity. It was observed that CMCase showed the highest activity at 60 °C and pH 5.4, and kept 80% of its activity in a pH range of 4.5-6.5. On the other hand, the best activity for xylanase was verified at 65 °C, and in that same pH range, the enzyme kept 97% of its residual activity. Cell-free extract was concentrated by ultrafiltration. The enzymatic cocktail obtained showed CMCase activity 25-fold higher and xylanase activity 55-fold higher than the crude enzymatic extract. The cocktail was conserved by adding 50% glycerol. After storage for 60 days at 4 °C, xylanase kept 80% of the initial activity and CMCase didn t show loss of activity when kept at 25 °C for the same period. The mixed community cellular mass constitutes an inoculant able to maintain the cellulolytic phenotype after rapid freezing and storage at - 80 °C for 60 days. Fed-batch essay suggested that this community has potential to be manipulated in order to continuously hold the cellulolytic enzymes expression over time. The results evidenced the acquisition of an enzymatic cocktail from an inoculant which cellulolytic activity supported pH changes and optimal activity around 60 °C. / Três comunidades microbianas lignocelulolíticas e termofílicas foram selecionadas por subcultivo em meio de enriquecimento a 55 °C. Uma comunidade foi selecionada a partir de esterco de gado em compostagem, outra de bagaço de cana em decomposição e a terceira foi obtida a partir da mistura de alíquotas do meio de cultivo das duas anteriores. Tais comunidades apresentavam a característica de decompor uma fita de celulose em três dias de cultivo. Ao se avaliar o dia de máxima atividade CMCase e xilanase em cada comunidade, verificou-se que os melhores resultados foram encontrados no consórcio misto, com atividade de 0,09 U mg-1 para CMCase no segundo dia de cultivo e 2,86 U mg-1 para xilanase no quarto dia. Essas enzimas foram parcialmente caracterizadas em relação à temperatura e pH ótimos de atuação. Verificou-se que CMCase apresentou maior atividade a 60 °C e pH 5,4, e manteve 80% de sua atividade numa faixa de pH de 4,5 a 6,5. Já para a xilanase, a temperatura ótima foi de 65 °C e nessa mesma faixa de pH manteve uma atividade residual de 97%. O extrato livre de células foi concentrado por ultrafiltração e obteve-se um coquetel enzimático com atividade de CMCase e xilanase maior que no extrato bruto cerca de 25 e 55 vezes, respectivamente. O coquetel foi conservado pela adição de 50% de glicerol. Após 60 dias de armazenamento a 4 °C, a xilanase manteve 80% de sua atividade inicial e a CMCase não apresentou perda de atividade quando mantida a 25 °C pelo mesmo período. A massa celular da comunidade mista constitui um inoculante capaz de manter o fenótipo celulolítico após congelamento rápido e armazenamento a - 80 °C por 60 dias. Ensaio em batelada alimentada mostrou que essa comunidade apresenta potencial para ser manipulada a fim de se manter continuamente a expressão de enzimas celulolíticas ao longo do tempo. Os resultados mostraram que foi possível obter um coquetel de enzimas a partir do inoculante, cuja atividade celulolítica tolerou variações de pH e temperatura ótima em torno de 60 °C.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2830202 bytes, checksum: 646d57cf2258798f7f8bcfe375e2b6ab (MD5) Previous issue date: 2009-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Hydnangium sp. is a basidiomycetous fungus that is capable of forming ectomycorrhiza with Eucalyptus species. The in vitro mycorrhization system is widely used for mycorrhizal interactions studies, becoming a simple and reproducible system for the symbiosis-regulated genes expression analysis. In this work, the in vitro mycorrhization system for the Hydnangium sp. and Eucalyptus grandis interaction was performed for the colonization, differentiation and functioning phases for the ectomicorriza formation. The colonization phase were verified after five days of inoculation with the Hydnangium sp., the differentiation phase after ten days and the functioning phase after 20 days of inoculation. The extern morphology was analyzed by stereomicroscopy and the section microscopy was performed for the mantle and Hartig net detection. The total RNA extraction was performed for each phase, with the objective of to analyze genes expression. However, the material quantity from roots of 130 seedlings for each phase was insufficient for the transcripts detection through RTPCR. The intron analysis of the partial sequences of the genes that encode ATP sintase (atp) and acetyl-CoA acetyltransferase (aat) of Hydnangium sp. enabled two introns identification in partial sequence of atp gene (53 and 65 bp), while in partial sequence of aat gene were identified three introns (52, 52 e 46 bp). All introns analyzed have the canonical sequence 5 GT 3 AG on splicing sites, ranging the adjacent nucleotides. The phylogenetic analysis, using the partial sequences of amino acids of atp and aat genes, enabled the correct group separation, corroborating the Hydnangium sp. classification as belonging the same family of Laccaria bicolor. / Hydnangium sp. é um fungo basidiomiceto capaz de formar ectomicorriza com espécies de Eucalyptus. Os sistemas de micorrização in vitro vêm sendo largamente utilizados para estudar interações micorrízicas, tornando-se um sistema simples e reproduzível para as análises de expressão de genes envolvidos na interação. Neste trabalho, a técnica de micorrização in vitro para a interação do fungo Hydnangium sp. com E. grandis foi realizada para as fases de colonização, diferenciação e funcionamento da ectomicorriza. A fase de colonização foi verificada após cinco dias de inoculação com Hydnangium sp., a fase de diferenciação após 10 dias e a fase de funcionamento após 20 dias de inoculação. A morfologia externa foi analisada por lupa e foram avaliados cortes microscópicos para a detecção do manto e da rede de Hartig. A extração de RNA total foi realizada para cada uma das fases, com o objetivo de analisar a expressão gênica. Entretanto, a quantidade de material proveniente de raízes de 130 plântulas para cada fase, foi insuficiente para a detecção de transcritos por meio de RTPCR. A análise dos íntrons das seqüências parciais dos genes que codificam ATP sintase (atp) e acetil-CoA acetiltransferase (aat) de Hydnangium sp. permitiu a identificação de dois íntrons na seqüência parcial do gene atp (53 e 65 pb), enquanto que na seqüência parcial do gene aat foram identificados três íntrons (52, 52 e 46 pb). Todos os íntrons analisados possuem a seqüência padrão 5 GT 3 AG no sítio de processamento, variando os nucleotídeos adjacentes. A análise filogenética, utilizando as seqüências parciais de aminoácidos deduzidas dos genes atp e aat, permitiu a separação correta dos grupos, corroborando a classificação do fungo Hydnangium sp. como pertencente à mesma família de Laccaria bicolor.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1109551 bytes, checksum: 5f0d13927b00626f1a0d15b78536b7bc (MD5) Previous issue date: 2009-07-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This is the first study of genetic diversity of the Archaea community associated to coffee fruits (Coffea arabica L.). It was performed in cherry coffee fruits of cultivars Bourbon Amarelo, Bourbon Vermelho, Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho and Catucaí Vermelho in different altitudes. The archaeal diversity during natural drying of depulped grains in cement covered yard was also studied. The addition of proteases during the coffee fruits metagenomic DNA extraction cell lysis step provided better recovery of DNA from Archaea. Comparing different hypervariable regions of 16S rDNA by DGGE (Denaturing Gradiente Gel Electrophoresis), the highest diversity resolution was obtained with the V3 region, for the cultivar Catucaí Vermelho at an altitude of 936m. The Archaea endophytic community analysis in four C. arabica cultivars revealed varied genotypic profiles among the samples. Three samples that showed distinct DGGE profiles were chosen for 16S rDNAs libraries construction. Sequencing of 63 clones revealed 12 OTUs and the prevalence of sequences related to Euryarchaeota phylum, mainly the halophylic genera Halobacterium, Halococcus, and Haloferax. Sequences with high identity with Methanobrevibacter, with the thermophilic Thermoplasma, and sequences related to uncultivated Archaea from marine environment were also found in the Euryarchaeota phylum. Of the four sequences belonging to the Crenarchaeota phylum, three phylogenetically clustered with uncultivated archaea from soil, and one with sequences from a marine environment. Rarefaction curve analysis and the estimated Coberture pointed out that the libraries constructed were large enough to cover the most of Archaea diversity in cherry coffee. The archaeal diversity study during natural drying revealed higher increase in OTUs number beginning at the seventh day up to the last day. Cluster analysis of DGGE fingerprints distinguished the population of the first days of drying from those in the last ones. The absence of physiological studies of uncultivable Archaea, especially in mesophilic environments, limits the knowledge of metabolism of these microorganisms and the determination of endophytes role in coffee fruits. Although, metagenomic studies of microbial community associated to coffee fruits will help to identify archaeal genes and establish relations among the presence of certain microorganisms and precursors of those compounds that make up the aroma and the flavor in the final quality of the beverage. / Este é o primeiro estudo de diversidade genética da comunidade de Archaea associada a frutos de café (Coffea arabica L.). Ele foi realizado em amostras de frutos no estádio cereja das cultivares Bourbon Amarelo, Bourbon Vermelho, Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho e Catucaí Vermelho, em diferentes altitudes. A diversidade de arqueas presentes durante a secagem natural de grãos despolpados em terreiro revestido com cimento também foi estudada. A adição de proteases durante a etapa de lise celular para extração de DNA metagenômico de frutos de café propiciou melhor recuperação de DNA de Archaea. A maior resolução da diversidade na comparação de diferentes regiões hipervariáveis do rDNA 16S por DGGE foi obtida quando se utilizou a região V3 para a amostra da cultivar Catucaí Vermelho em altitude de 936m. A análise da comunidade endofítica de Archaea em quatro cultivares de C. arabica revelou um variado perfil genotípico entre as amostras. Três amostras que apresentaram perfis de DGGE distintos entre si foram escolhidas para construção de bibliotecas de rDNAs 16S. O sequenciamento de 63 clones revelou a existência de 12 UTOs e a prevalência de sequências relacionadas ao filo Euryarchaeota, principalmente de arqueas halofílicas dos gêneros Halobacterium, Halococcus e Haloferax. Ainda no filo Euryachaeota, foram identificadas sequências com alta identidade com Methanobrevibacter, com a hipertermófila Thermoplasma e com sequências relacionadas à arqueas não cultiváveis de ambiente marinho. Das quatro sequências pertencentes ao filo Crenarchaeota, três agruparam filogeneticamente com sequências de arqueas não cultiváveis do solo, e uma com sequências de ambiente marinho. A análise das curvas de rarefação e o cálculo das coberturasmostraram que as bibliotecas construídas foram grandes o suficiente para cobrir a maior parte da diversidade de Archaea presentes em frutos de café cereja. No estudo da diversidade de Archaea durante a seca natural observou-se um aumento do número de UTOs a partir do sétimo dia,permanecendo até o último dia do processo. A análise de agrupamento dos perfis distinguiu as populações presentes nos dias finais de secagem. A ausência de estudos fisiológicos de arqueas não cultiváveis, especialmente de ambientes mesófilos, limita o conhecimento do metabolismo destes micro-organismos e a determinação do papel das endofíticas dos frutos de café. Contudo, estudos metagenômicos da comunidade microbiana associada a frutos de café ajudarão a identificar genes de Archaea e a estabelecer relações entre a presença de determinados micro- organismos e de compostos precursores daqueles que compõe o aroma e sabor na qualidade final da bebida.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 482532 bytes, checksum: 1c1dce279e9ef945c0bd479992a99516 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The hemibiothrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witche's broom disease in cocoa (Theobroma cacao), presents different transposable elements in its genome. A transposable element of Class II belonging to the super-family PIF/Harbinger, named Boto, had been partially characterized in previous studies. The element Boto, as well as other elements PIF/Harbinger, presents two ORFs (ORF 1 and ORF 2). OFR 2 codifies the transposase while ORF 1 codifies one protein which function is unknown. The aim of this work was to prove the Boto element activity and characterize the ORF 1. For assure the activity of the transposable element Boto in the genome of M pernicious was carried out the evaluation of the integration profile in isolates resultants of sexual cycle. Three of such isolates showed variation in the copy number of transposable element Boto, proving Boto activity. Furthermore, PCR reactions were carried out for detection of insertion sites of this element in different isolates. Among the 28 isolates used in this experiment, 14 showed amplification products with expected size. The products of amplification of two isolates, randomly chosen, were cloned and sequenced. The analysis of the obtained sequences showed that in both isolated sequenced the element Boto did not transpose for the insertion site analyzed in the M. perniciosa genome. It proves the activity of this element in the genome of M. perciciosa, because, in the isolated used as reference for this study, the Boto element was inserted in that position. In the in silico analysis of the ORF 1 sequence, the presence of two possible introns was verified, one containing 55 pb and another 48 pb. This sequence codifies a protein of 422 amino acids residues. To demonstrate the presence of the two introns, experiments of RT-PCR were carried out using two oligonucleotides groups. Amplified products obtained, when cDNA was used as template of PCR reaction, were cloned and sequenced, being confirmed the position and the size of the two predicted introns. Analysis of RT-PCR also showed that this ORF is expressed even in normal conditions of cultivation of the fungi, what is important for activity of this element, since other studies showed that the expression of this ORF is fundamental to the transposition of elements PIF/Harbinger. The results of this work showed that Boto is active in the M. perniciosa genome and it can have an important role as generating agent of genetic variability in this phytopathogen. It is worth to emphasize that this is the first description of an element of the superfamily PIF/Harbinger that presents two introns in ORF 1. / O basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao) apresenta diferentes elementos transponíveis em seu genoma. Um elemento transponível da Classe II pertencente à superfamília PIF/Harbinger, denominado Boto, foi parcialmente caracterizado em estudos anteriores. O elemento Boto, assim como os demais elementos PIF/Harbinger, apresenta duas ORFs (Open Reading Frame), uma que codifica a transposase e outra, denominada ORF 1, cuja seqüência de aminoácidos deduzida representa uma proteína de função é desconhecida. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de comprovar a atividade de Boto e caracterizar a ORF 1. Para a confirmação da atividade do elemento transponível Boto no genoma de M. perniciosa realizou-se a avaliação do perfil de integração em isolados resultantes do ciclo sexual, isto é, obtidos a partir da germinação de basidiósporos. Três isolados apresentaram variação no número de cópias, demonstrando a atividade de Boto. Foi realizado PCR para detecção dos sítios de inserção deste elemento em diferentes isolados. Dentre os 28 isolados utilizados no experimento, 14 apresentaram produtos de amplificação com o tamanho esperado. Os produtos de amplificação de dois isolados, escolhidos aleatoriamente, foram clonados e seqüenciados. Na análise das seqüências obtidas, verificou-se que, em ambos os isolados sequenciados, o elemento Boto provavelmente não sofreu transposição para os sítios analisados no genoma de M. perniciosa. Isto comprova a atividade deste elemento, pois, no isolado usado como referência para este estudo, o elemento Boto estava inserido naquela posição. Na análise da seqüência da ORF 1, verificou-se a presença de dois possíveis íntrons, um contendo 55 pb e outro de 48 pb. Esta seqüência codifica uma proteína de 422 resíduos de aminoácidos. Para comprovar a presença dos íntrons, experimentos de RT-PCR foram realizados com a utilização de dois conjuntos de oligonucleotídeos. Os amplificados obtidos, quando cDNA foi utilizado como molde da reação de PCR, foram clonados e sequenciados, sendo confirmada a posição e o tamanho dos dois íntrons preditos. Análise de RT-PCR mostrou que esta ORF é expressa mesmo em condições normais de cultivo do fungo, o que é importante para atividade deste elemento, visto que outros estudos mostram que a expressão desta ORF é fundamental à transposição de elementos PIF/Harbinger. Os resultados deste trabalho mostram que Boto é ativo no genoma de M. perniciosa e pode ter um importante papel como agente gerador de variabilidade genética neste fitopatógeno. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de um elemento da superfamília PIF/Harbinger que apresenta dois íntrons na ORF 1.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 577759 bytes, checksum: 8b7270200348b4cbbdc4f40d5e821098 (MD5) Previous issue date: 2010-08-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work aimed to study the diversity of endophytic bacteria associated to Coffea arabica L. fruit during their development. Seven monthly collections were conducted, following coffee fruit development in homogeneous stand of Catuai Vermelho coffee cultivar plantation. Each sample was processed according to protocol aiming to obtain total DNA from the endophytic bacterial community, associated to each stage of fruit development. The strategy of rDNA16S amplification through the Nested-PCR technique and DGGE discrimination were applied. The total population of endophytic bacteria and the phylos Actinobacteria, Firmicutes and Proteobacteria (alpha, beta and gamma classes) were investigated. The analysis of each gel, representing the evolution of a population along time, was carried out using the program Bionumerics®. The existence of endophytic bacteria associated to coffee fruit since the first month of their development was confirmed, by using the universal primer for Eubacteria. Based on the similarity between the distribution pattern of the OTUs on the rays representing the two final months of fruit development, it was inferred that the populations tend to stabilize. Less similarity between the endophytic populations, present in the different phases of fruit development, was confirmed in the phylo Firmicutes, while the beta-Proteobacteria displayed greater similarity among the different phases of fruit development. Amplification of the rDNA by Nested PCR and DGGE discrimination were found to be adequate to distinguish the alteration dynamics among the phylo populations and the bacterial classes studied. / Neste trabalho foi estudada a diversidade de bactérias endofíticas associadas a frutos de Coffea arabica L. durante o seu desenvolvimento. Foram realizadas sete coletas mensais, acompanhando o desenvolvimento dos frutos em cafeeiros de um talhão homogêneo de lavoura do cultivar Catuaí Vermelho. Cada amostra foi processada seguindo protocolo para obter o DNA total da comunidade bacteriana endofítica, associada a cada estádio de desenvolvimento do fruto. Foi empregada a estratégia de amplificação do rDNA16S pela técnica de Nested-PCR e discriminação em DGGE. A população total de bactérias endofíticas e os filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria (classes alfa, beta e gama) foram investigados. A análise de cada gel, representando a evolução de uma população ao longo do tempo, foi realizada empregando o programa Bionumerics®. Demonstrou-se a existência de populações de bactérias endofíticas associadas aos frutos de café desde o primeiro mês de seu desenvolvimento, com emprego do primer universal para Eubacteria. Pela maior similaridade entre o padrão de distribuição das UTOs nas raias que representam os dois meses finais de desenvolvimento dos frutos inferiu-se que as populações tendem para a estabilização. A menor similaridade entre as populações endofíticas, presentes nas diferentes fases de desenvolvimento dos frutos, foi constatada no filo Firmicutes, enquanto as beta- Proteobacteria exibiram maior similaridade entre as diferentes fases de desenvolvimento dos frutos. A amplificação do rDNA por Nested PCR e discriminação em DGGE mostrou-se adequada para a distinção da dinâmica de alterações nas populações entre os filos e as classes de bactérias estudadas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 649442 bytes, checksum: 480c7019b7f152a1aa0ec2308fbde07e (MD5) Previous issue date: 2006-03-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Epidendrum secundum and Zygopetalum mackaii, native from State Park of Serra do Brigadeiro, Minas Gerais State, Brazil, were studied to characterize the structure of mycorrhizae and associated mycorrhizal fungi. From August/2004 to July/2005, roots were collected from four different areas. A total of 28 isolates were obtained, all belonging to genus Epulorhiza, which were separated in three groups according their morphological and cultural characteristics. In both orchid species, mycorrhizae were tolipophagic, and colonizing all extension of the root system, presenting intact and degraded pelotons. Root colonization occurs mainly through root hairs and sometimes via epidermic cells, while cortex colonization occurs, mainly, via passage cells of the exodermis. Cortex colonization occurs by cell-to cell, and pelotons occupy all cellular space. Peloton degradation starts by hypha deformation, followed by a uniform reduction of peloton volume. Colonization intensity was higher in the dry season. The species growing on rocks showed higher colonization frequency and higher mycotrophic activity. This is the first report on the mycorrhizal association of Z. mackaii. Isolated fungi in this study show high potential to be used in commercial propagation of this orchid species. / Epidendrum secundum e Zygopetalum mackaii, nativas do Parque Estadual Serra do Brigadeiro (MG), foram estudadas com objetivo de caracterizar a associação micorrízica e os fungos micorrízicos associado a estas plantas. Durante o período de agosto/2004 a julho/2005, foram realizadas coletas do sistema radicular dessas espécies crescendo em quatro áreas com características distintas. Obtiveram-se o total de 28 isolados fúngicos, todos pertencentes ao gênero Epulorhiza, os quais foram divididos em três grupos, de acordo com as características culturais e morfológicas. A micorriza encontrada foi o tolipofágico, sendo observado pelotons intactos e degradados em toda a extensão do sistema radicular das espécies estudadas. A infecção da raiz ocorre via pêlo radicular ou células epidérmicas, enquanto a colonização do córtex é, principalmente, via célula de passagem da exoderme. A colonização no córtex ocorre via célula-célula, sendo todo o espaço celular ocupado pela estrutura fúngica, os pelotons. O estádio de degradação inicia-se pela deformação do peloton, seguida da redução uniforme de seu volume. A intensidade de colonização foi maior nos períodos de seca. As espécies crescidas diretamente sobre rochas apresentaram maior freqüência de colonização e maior atividade micotrófica. Este é o primeiro relato sobre o isolamento e caracterização de fungos micorrízicos em Z. mackaii. Os fungos isolados neste trabalho apresentam um grande potencial para serem utilizados na propagação comercial destas orquídeas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - Capa_Abstract.pdf: 84206 bytes, checksum: fde95bad13eae98fb18c23bd5a1f8e62 (MD5) Previous issue date: 2011-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Silage is a sort of conserved fodder obtained through the fermentation of forage by lactic bacteria, which convert the soluble carbohydrates in lactic acid. This acid is responsible for reducing the pH of the ensiled mass, inhibiting the growth of deteriorating and pathogenic microorganisms, with no interference in the nutritional features of the ensiled culture. In addition to the lactic acid, the lactic bacteria may produce other antimicrobial compounds, such as the bacteriocins. In the present study, it was isolated 256 cultures of lactic bacteria from Estilosantes Campo Grande, in varied periods of fermentation. Among the 256 isolates obtained, 83% (214) displayed antagonist activity against the indicator microorganism. Among these, only 10% were capable of growing in basal medium. An analysis of the genetic diversity of 20 isolates was done by BOX-PCR. Eight isolates of lactic bacteria which presented high antagonist activity and elevated growth rate were selected and their fermenting profile in 49 carbohydrates sources allowed the identification of theses isolates, such as Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. The analysis of the 16S rDNA showed the same identification. The crude extract of the antimicrobial substance similar to bacteriocin (Blis) of three isolates inhibited the growth of the indicator microorganism, and the antagonist activity was also observed after pH neutralization (pH 7,0) with NaOH. The antagonist activity of the Blis crude extract was lost after the treatment with proteolytic enzymes. These three lactic acid bacteria isolates presented a broad spectrum of antagonist activity, inhibiting several species of different microorganisms. The antimicrobial feature of these isolates observed in this in this work, associated with other growth and fermentation physiological parameters shows that the lactic bacteria cultures isolated in silage from Estilosantes Campo Grande are potential candidates to be evaluated as inoculants in legume silage. / A silagem é uma forma de forragem conservada obtida por meio da fermentação da forrageira pelas bactérias lácticas, que convertem os carboidratos solúveis em ácido láctico. Este ácido é responsável por reduzir o pH da massa ensilada, inibindo o crescimento de micro-organismos deterioradores e patogênicos, sem interferir com as características nutricionais da cultura ensilada. Além do ácido láctico, as bactérias lácticas podem produzir outros compostos antimicrobianos, como as bacteriocinas. Neste estudo, foram isoladas 256 culturas de bactérias lácticas da silagem de Estilosantes Campo Grande, em diferentes períodos de fermentação. Dos 256 isolados de bactérias lácticas obtidos, 83% (214) demonstraram atividade antagonista contra o micro-organismo indicador. Dentre estes, apenas 10% foram capazes de crescer em meio basal. Análise da diversidade genética de 20 isolados foi realizada por BOX-PCR. Oito isolados de bactérias lácticas que apresentaram alta atividade antagonista e elevada velocidade de crescimento foram selecionados e o perfil de fermentação de 49 carboidratos permitiu a identificação desses isolados como Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. A análise do gene 16S rDNA mostrou a mesma identificação. O extrato bruto da substância antimicrobiana semelhante a bacteriocina (Blis) de três isolados de bactérias lácticas inibiu o crescimento do micro-organismo indicador, e a atividade antagonista do extrato também foi observada após a neutralização do pH (pH 7,0) com NaOH. A atividade antagonista do extrato bruto da Blis foi perdida após o tratamento com enzimas proteolíticas. Estes tres isolados de bactérias lácticas demonstraram amplo espectro de atividade antagonista, inibindo várias espécies de micro-organismos diferentes. A característica antimicrobiana destes isolados observada neste trabalho, associada com outros parâmetros fisiológicos de crescimento e fermentação faz com que as culturas de bactérias lácticas isoladas de silagem de Estilosantes Campo Grande sejam candidatos potenciais para serem avaliados como inoculantes em silagens de leguminosas.