Orientador: Ana Lúcia Barretto Penna / Banca: Svetoslav Dimitrov Todorov / Banca: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Resumo: As bactérias acidoláticas (BAL) constituem um grupo de micro-organismos heterogêneos Gram positivos, catalase negativos, anaeróbios facultativos e produtores de ácido lático . Estas bactérias têm despertado grande interesse na indústria de alimentos devido à produção de substâncias antimicrobianas, tais como as bacteriocinas. Estas substâncias têm a capacidade de reduzir a contaminação por patógenos e deteriorantes em alimentos, resultando em produtos com maior vida de prateleira. Outra característica importante presente em algumas linhagens de BAL é apresentar efeitos benéficos aos consumidores. O objetivo desse trabalho foi avaliar a produção de substâncias antimicrobianas por 38 cepas de BAL isoladas de mussarela de búfala, caracterizar as bacteriocinas quanto ao espectro de ação, estabilidade em diferentes pH, estabilidade térmica e resistência a agentes químicos. Para as cepas produtoras de bacteriocina também foi avaliado o efeito inibitório de L isteria monocytogenes ATCC 7644 em leite UHT integral e leite UHT desnat ado, e avaliar o potencial probiótico . Das trinta e oito cepas de BAL isoladas de mussarela de búfala, oito foram produtoras de substância antimicrobiana. Essas cepas foram identificadas como: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (cepa 13) , Lactobac illus casei ( cepa 24), L eu conostoc citreum (cepa 28 ) e Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (cepas 26, 30 e 32). O estudo da natureza do composto confirmou que os compostos microbianos são bacteriocinas. As bacteriocinas produzidas pel as cepas 26 e 32 não foram afetadas pelo calor , extremos d e pH e diferentes detergentes. As cepas 26 e 32 reduziram a população do micro -organismo patogênico L. monocytogenes ATCC 7644 quando inoculadas em leite UHT integral e leite UHT desnatado, apresentando um efeito... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lactic acid bacteria (LAB) ar e a heterogeneous group of Gram-positive microorganisms, catalase negative, facultative anaerobes and lactic acid producers. These bacteria have attracted great attention from the food industry due to the production of antimicrobial substances such as bacteriocins. These substances have the ability to reduce food spoilage and contamination by pathogens, resulting in products with longer shelf life. Another important feature present in some strains of LAB is to provide benefits to consumers. The aim of this study is to evaluate the production of antimicrobial substances by 38 LAB strains isolated from water-buffalo mozzarella cheese, and characterize the spectrum of activity of the bacteriocins, stability at different pH values, thermal stability and its resistance to chemicals. The bacteriocin-producing strains were also evaluated regarding the inhibitory effect on L. monocytogenes ATCC 7644 in UHT whole milk and UHT skim milk, and the probiotic properties. Six of the thirty-eight strains of LAB isolated from water-buffalo mozzarella cheese produce d antimicrobial substances. These strains were identified as L actobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (strain 13), Lactobacillus casei (strain 24), Leuconostoc citreum (strain 28) and Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (strains 26, 30 and 32). The study of the nature of the antimicrobial compounds confirmed that they are bacteriocins. The bacter iocins produced by strains 26 and 32 were not affected by heat, extreme pH and different detergents. Strains 26 and 32 reduced the pathogenic microorganism Listeria monocytogenes ATCC 7644 population when inoculated in UHT whole and UHT skim milk, presenting a bacteriostatic effect. Strains 1 3, 24, 28 and 32 survived during the passage through the simulated gastrointestinal tract when inoculated... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Adriane Maria Ferreira Milagres / Banca: Heloisa Ferreira Alves do Prado / Resumo: A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é uma enzima microbiana que converte o amido em ciclodextrinas (CDs). Estes compostos são moléculas cíclicas, formadas por monômeros de D-glicoses unidas por ligações glicosídicas do tipo a-1,4. As CDs podem ser uma alternativa para controlar o escurecimento de batatas e frutas devido a sua capacidade de formar complexo de inclusão com substratos da reação de escurecimento. Alimentos contendo amido, quando adicionados da CGTase são também, potencialmente capazes de sofrer a ação da enzima formando CD localmente. Esse trabalho teve por finalidade estudar a aplicação direta da enzima CGTase em batatas e a aplicação de ciclodextrina comercial em batatas, maçãs, bananas e pêras visando controlar as reações de escurecimento enzimático ou não enzimático, destes alimentos. A formação de complexos com ciclodextrina foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Este trabalho mostrou pela primeira vez que tanto a CGTase produzida por Bacillus clausii E16 quanto a CGTase comercial (Toruzyme., Novozymes), foram capazes de controlar o escurecimento químico de batata e enzimático de batata e maçã. A utilização da CD mostrou efeito similar a ação das CGTases para batata e maçã, reduzindo dessa forma o escurecimento enzimático causado pela enzima polifenoloxidase. Pode-se inferir que ocorreu a produção da CD pela ação da CGTase em presença do substrato natural (amido de batata e maçã) e por conseqüência sua ação complexante junto aos agentes responsáveis pelo escurecimento, inibindo assim a efetivação das reações. Essa possível encapsulação foi demonstrada pela análise de DSC referente à diminuição do pico da amostra de batata tratada com CGTase. / Abstract: The cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is a microbial enzyme that converts starch to cyclodextrins (CDs). These compounds are cyclical molecules, formed by D-glucose monomers linked by a-1,4-glycosidic linkages type. The CDs can be an alternative to control the potato and fruits browning due its capacity to form complexes of inclusion with substrate of the browning reaction. Foods containing starch, when added of the CGTase are also potentially able to the action from the enzyme, then forming CD. This work had the purpose to study the direct application of the CGTase enzyme in potatoes and the commercial cyclodextrin application in potatoes, apples, bananas and pears aiming to control the browning enzymatic or no enzymatic reactions of these foods. The cyclodextrin complexes formation was determined by differential scanning calorimetry (DSC). This work showed for the first time that as the CGTase produced for Bacillus clausii E16 as the commercial CGTase (Toruzyme., Novozymes), were capable to control the chemical browning of potato and enzymatic browning of potato and apple. The use of the CD showed to similar effect to the action of CGTases for potato and apple, reducing in both the enzymatic browning caused by polyphenoloxidase enzyme. It can be concluded that the production of CD occurred by CGTase action in presence of the natural substrate (starch of potato and apple) and for consequence it’s action to form complexes next to the responsible agents for the browning, thus inhibiting effectively the reactions. This possible encapsulation was demonstrated by analysis of DSC referring to the reduction of the peak of the potato sample treated with CGTase. / Mestre

Resumo: A degradação da lignina ocorre através de um processo oxidativo que envolve enzimas extracelulares como as ligninases (MnP, LiP e lacase) produzidas, principalmente por fungos basidiomicetos. Os caminhos atuais da biotecnologia indicam que tais fungos denominados “de fungos de degradação branca” sejam eficientes na degradação de corantes sintéticos. Foram estudadas cinco linhagens de basidiomicetos quanto a produção das ligninases em de fermentação em estado sólido (FES). Todos os fungos analisados (Inonotus rickii, Dacryopinax elegans, Pycnoporus sanguineus, Chaetocalathus liliputianus e Lentinus strigellus) mostraram-se bons produtores de MnP. Nenhum dos microrganismos apresentaram níveis significantes de LiP. As espécies L. strigellus e P. sanguineus produziram quantidades consideráveis de lacase. Esses dois últimos fungos foram selecionados em função de sua capacidade de produção de MnP e lacase, e o farelo de trigo foi o melhor meio para a produção das duas enzimas. A MnP e lacase produzida tanto por L. strigellus quanto por P. sanguineus apresentaram pH ótimo ácido. A temperatura ótima para a MnP de ambos os fungos foi de 40°C. Para a lacase de L. strigellus a temperatura ótima ficou entre 50°C e 55°C, para a de P. sanguineus entre 60°C e 70°C. A MnP produzida pelos dois fungos mantiveram-se estável em toda a faixa de pH estudada. A lacase de L. strigellus apresentou estabilidade em pH 7,0 e a de P. sanguineus, 7,5. A temperatura de estabilidade para a MnP de L. strigellus ficou entre 15°C e 25°C e para a enzima de P. sanguineus entre 35°C e 45°C. Todos os corantes estudados sofreram descoloração por essas enzimas, especialmente o Laranja II (cerca de 74%), Azul Cibacron 3GA (cerca de 85%), Azul Brilhante Remazol R (cerca de 87%) e o Cristal Violeta (cerca de 65%) / Abstract: Lignin degradation occurs through an oxidative process that involves extracellular enzymes such as ligninases (MnP, Lip and laccase) produced specially by basidiomycete fungi. Current biotechnological studies indicate that these fungi, known as “white rot fungi”, may be efficient on the degradation of synthetic dyes. Five strains of basidiomycetes were studied regarding the production of ligninases through solid state fermentation (SSF). All of the fungi tested (Inonotus rickii, Dacryopinax elegans, Pycnoporus sanguineus, Chaetocalathus liliputianus e Lentinus strigellus), proved to be good MnP producers. None of the microorganisms produced significant amounts of LiP. The species L. strigellus e P. sanguineus produced considerable amounts of laccase. These last two were selected due to their ability to produce MnP and laccase, and wheat bran was the best medium for the production of both enzymes. .MnP and laccase from L. strigellus and P. sanguineus acted optimally in acid pH. Optimum temperature for MnP activity from both fungi was 40°C. Optimum temperature for laccase from L. strigellus was between 50°C e 55°C, and from P. sanguineus was between 60°C e 70°C. MnP from both fungi maintained stability through the whole pH range studied. Laccase from L. strigellus was stable in pH 7,0 and from P. sanguineus in pH 7,5. MnP from L. strigellus remained stable in temperatures between 15°C and 25°C and from P. sanguineus between 35°C e 45°C. The enzymes were effective in the decoloration of all the dyes tested, specially Orange II (approximately 74%), Cibacron Blue 3GA (approximately 85%), Remazol Brilliant Blue R (approximately 87%) and Crystal Violet (approximately 65%) / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Maurício Boscolo / Banca: Valquíria Barco Damiano / Banca: Érika Barbosa Neves Graminha / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Inês Conceição Roberto / Banca: Haghuvir Arni / Resumo: A glucoamilase é uma enzima importante na produção enzimática de xarope de glicose a partir do amido. Neste processo o amido é primeiramente dextrinizado pela ação da a-amilase a aproximadamente 100°C. Em seguida, a suspensão de dextrinas é resfriada a uma temperatura próxima de 55°C para a sacarificação, pela ação da glucoamilase. A característica de alta termoestabilidade para essa enzima é fundamental para agilizar o processo e reduzir custos operacionais. O presente estudo visou à obtenção, caracterização físico-química, bem como a cinética de termoinativação das glucoamilases mutantes de Aspergillus awamori expressa em Saccharomyces cerevisiae. O gene da glucoamilase sofreu alterações através da técnica de PCR mutagênico, e os clones expressando glucoamilases mais termoestáveis foram selecionados e avaliados. A glucoamilase selvagem apresentou temperatura ótima de atividade a 58°C, as enzimas mutantes apresentaram atividades ótimas a 68°C para a linhagem M1, e 65°C para a linhagem M2. As glucoamilases mutantes M1 e M2 também apresentaram maior termoestabilidade que a enzima selvagem. As temperaturas de desnaturação térmicas na ausência de substrato por 1 hora foram 45, 50 e 55°C para as enzimas, selvagem, M1 e M2, respectivamente. Todas as enzimas apresentaram atividade ótima no pH 3,5 - 4,0, sendo que os mutantes M1 e M2 também exibiram maior estabilidade à variação de pH, retendo acima de 80% da atividade na faixa de pH 5,5 a 10,0. A meia vida (t1/2) a 70°C foi de 8,1 minutos para a glucoamilase mutante M2, 3,8 minutos para o mutante M1 e 3 minutos para a glucoamilase selvagem. A termoinativação das enzimas seguiram uma cinética de primeira ordem. A energia de desnaturação foi de 262,8 e 252,9 KJ mol-1 para os mutantes M2 e M1 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucoamylase is an important enzyme for the production of glucose syrup made from starch. In this process, starch is initially dextrinized by the action of a a-amylase at approximately 100ºC. Secondly, the dextrins suspension is cooled down to a temperature near 55ºC for the saccharification, by the action of an glucoamylase. High thermostability is a fundamental characteristic for this enzyme to accelerate the process and to reduce operational costs. This work had the purpose of studying physicochemical characteristics as well as thermoinactivation kinetics of mutants glucoamylases of Aspergillus awamori expressed in Saccharomyces cerevisiae. Glucoamylases gene was modified through mutagenic PCR technique and the clones which produced more thermostable glucoamylases were selected and evaluated. The wild glucoamilase exhibited optimum temperature at 58ºC, the mutants from strain M1 and M2 acted optimally at 68ºC and 65ºC, respectively. The mutants M1 and M2 also exhibited higher thermostability when compared to the wild enzyme. Thermic denaturation temperatures in the absence of substrate for 1 hour were 45, 50 and 55ºC for the wild, M1 and M2 enzymes, respectively. All enzymes showed optimum activity at pH 3.5 – 4.0, and the mutants M1 and M2 also exhibited higher stability towards pH variation, maintaining 80% of activity in pH from 5.5 to 10.0. Half life (t1/2) at 70ºC was 8.1 minutes for mutant M2, 3.8 minutes for mutant M1 and 3 minutes for wild glucoamylase. The enzymes thermoinactivation followed a first order kinetics. Denaturation energy was 262.8 and 252.9 KJ mol-1 for mutants M2 and M1 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild enzyme. Thermodynamic parameter of thermoinactivation, .G was lower for wild glucoamylase showing a higher denaturation for the enzyme. All enzymes revealed similar activity profile on different substrates, of which corn starch was the best substrate for hydrolysis for all glucoamylases tested. / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Resumo: Os refrigerantes são bebidas gaseificadas, obtidas através da diluição do suco ou extrato vegetal de sua origem em água potável, adicionada de açúcares. Devido ao elevado teor de açúcar neste produto e ao baixo pH, os refrigerantes tornam-se propícios ao desenvolvimento de microrganismos, em especial as leveduras. A contaminação microbiológica é mais comum na etapa de produção, entretanto, a maioria dos contaminantes pode ser proveniente de matérias-primas como água ou equipamentos quando não higienizados de maneira adequada. De acordo com o histórico de análises microbiológicas da Indústria BEBIDAS POTY Ltda, foram detectados alguns pontos de contaminação por leveduras dentro do fluxograma de produção, as quais têm apresentado certa resistência aos sanificantes utilizados. Desta forma o presente trabalho teve como objetivo isolar, identificar leveduras de matérias primas e diversos equipamentos da produção e avaliar o efeito inibitório dos sanificantes nas leveduras isoladas, buscando conhecer a eficácia dessas preparações. Neste estudo, foram isoladas 26 leveduras apenas da água de enxágue após o processo de higienização dos equipamentos de produção em todas as linhas de produtos carbonatados. Dentre as leveduras isoladas, os gêneros mais comuns foram Candida tropicalis, C. orthopsilosis, C. viswanathii, C. boidinii, Pichia manshurica, Zygosaccharomyces bisporus, sendo a espécie C. sojae a mais frequente. Os isolados foram testados na presença de 1) detergente alcalino clorado, 2) detergente alcalino não clorado, 3) desinfetante ácido peracético e 4) base ácida com ação de detergência/desinfetante de duas marcas comerciais identificadas como Marca I e Marca II, na perspectiva de encontrar a concentração mínima inibitória. Os agentes químicos de basicidade elevada com ação de limpeza foram os mais eficientes nos testes de... / Abstract: Soft drinks are carbonated beverages, obtained by diluting the juice or vegetable extract in drinking water, added of sugars. Because of the high sugar content of this product and the low pH, the refrigerants are susceptible to development of microorganisms, in particular yeasts. Microbial contamination is most common in the production step, however, most of the contaminants can come from raw materials and equipment such as water when not cleaned properly. According to the history of microbiological analyzes of Industry DRINKS POTY Ltda, some points of contamination by yeasts were detected within the production flow chart, which have shown some resistance to the sanitizers used. Thus, the present study aims to isolate and identify yeast from raw materials and from various equipment and evaluate the inhibitory effect of sanitizers on yeasts. It was isolated 26 yeasts strains from rinse water after the process of cleaning production equipment in all lines of carbonated products. Among the yeasts, the most common genera were Candida tropicalis. C. orthopsilosis, C. viswanathii, C. boidinii, Pichia manshurica, Zygosaccharomyces bisporus, the most frequent species was C. sojae. The isolates were tested in the presence of 1) chlorinated alkaline detergent, 2) alkaline detergent non-chlorinated, 3) disinfectant peracetic acid and 4) acid based detergent with disinfectant action two trademarks identified as Marca I and Marca II with a view to find the minimum inhibitory concentration. Chemical agents with high alkalinity were the most efficient in inhibition of yeast growth the less effective was alkali detergent containing chlorine being necessary to use very high concentrations to achieve the minimum inhibitory action. The data showed that the yeasts were very sensitive, to oxidizers such as nitric acid, peracetic acid and O3 gas / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-30T13:31:01Z No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23950574 bytes, checksum: ada26d8276116b5222dad832b831254c (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: on 2013-05-10T13:18:44Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-05-10T13:32:25Z No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23952407 bytes, checksum: 83c151a080c3915cba63eff313a6648b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-16T14:30:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23952407 bytes, checksum: 83c151a080c3915cba63eff313a6648b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-16T14:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_VivianeCasteloBrancoReis_Parcial.pdf: 23952407 bytes, checksum: 83c151a080c3915cba63eff313a6648b (MD5) / Para a produção economicamente viável de etanol de segunda geração a partir de bagaço de cana são necessários vários avanços tecnológicos em diferentes etapas deste bioprocesso incluindo o melhoramento genético de microrganismos fermentadores. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais usado para tal por ser uma excelente fermentadora e tolerante aos estresses dos grandes processos fermentativos industriais. Dentre os principais açúcares que compõem o bagaço de cana, destaca-se a xilose, uma pentose que pertence à fração hemicelulósica. Todavia, S. cerevisiae só utiliza hexoses na fermentação, não sendo capaz de metabolizar pentoses. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver uma levedura capaz de fermentar xilose. Inicialmente, foi feito um estudo das características genéticas da linhagem industrial de S. cerevisiae JP1 – microrganismo hospedeiro selecionado como alvo das modificações desejadas (Capítulo 1). Pode-se verificar que a linhagem JP1 é diploide e heterotálica. Mostrou-se também sensível às principais drogas usadas em processo de seleção de recombinantes assim com uma boa eficiência de transformação. Além disso, foi construída uma linhagem auxotrófica para uracila com a dupla deleção do gene URA3. Posteriormente, a linhagem JP1 foi modificada geneticamente para se tornar capaz de fermentar xilose a etanol (Capítulo 2). Foram construídos cassetes de expressão para duas enzimas da via metabólica de xilose - xilose isomerase e xiluloquinase – clonados em vetor epissomal. A linhagem recombinante obtida foi submetida à adaptação metabólica por 48 dias em meio contendo apenas xilose como fonte de carbono, levando a um aumento na taxa de crescimento de 0,008 h-1para 0,13 h-1. Estudos preliminares de fermentação em meio sintético mostrou um acúmulo de xilitol (YX/S = 0,29 g g-1) e baixa produção de etanol (YE/S = 0,27 g g-1). Para incrementar a produção de etanol, um cassete de deleção para o gene GRE3 (aldose redutase) foi desenvolvido. Além disso, consideramos a introdução de um gene codificador para um transportador com afinidade por xilose, visando aumentar o influxo de xilose para a célula. Para tanto, foi iniciada uma análise transcricional da levedura Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 adaptada ao hidrolisado de bagaço de cana a fim de compreender a regulação em diferentes concentraçõesde xilose e glicose, além de selecionar um possível transportador de xilose para ser expresso em S. cerevisiae (Capítulo 3). Dados preliminares indicam que o gene com maior expressão em xilose foi XYL3 e, dentre os transportadores putativos de xilose, XUT1. Esse trabalho representou uma das primeiras iniciativas no País no emprego de abordagens de engenharia metabólica para o desenvolvimento de um bioprocesso em linhagem industrial de S. cerevisiae. No seu conjunto, nossos resultados preliminares mostram que o desenvolvimento da tecnologia nacional para a produção de álcool lignocelulósico utilizando microrganismos modificados geneticamente é plenamente viável. Embora a linhagem obtida nesse estudo não tenha apresentado rendimentos de etanol desejáveis a partir de xilose, foi demonstrada a eficácia das ferramentas moleculares desenvolvidas que poderão ser empregada em futuros estudos. Além disso, comprovamos que as características genéticas da linhagem industrial JP1 a tornam uma interessante plataforma para futuras modificações relacionadas a outros bioprocessos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In order to achieve cost-effective, second-generation ethanol production from sugarcane bagasse, several stages of this bioprocess need to be technologically upgraded, which includes the genetic improvement of fermenting microorganisms. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most employed microbe to this purpose due to its excellent fermentative properties and high tolerance to the stressing conditions of large-scale industrial fermentation. Among the sugars that constitute sugarcane bagasse, xylose, a pentose abundant in the hemicellulosic fraction, is one of the most important. However, S. cerevisiae only uses hexoses in fermentation and is incapable of catabolising pentoses. The main goal of this project was to develop a xylose-fermenting yeast strain. Initially, we made genetic profiled the industrial S. cerevisiae strain JP1, which was to be subjected to the genetic manipulations in the pursuit of our goal (Chapter 1). We assessed that JP1 is diploid and heterothallic. It was also shown to be susceptible to the main drugs used in recombinant derivative selection and to be transformable with good efficiency. Next, we created an uracyl-auxotroph derivative by double-deleting the URA3 gene. Later, the JP1 strain was genetically modified to become able to ferment xylose to ethanol (Chapter 2). We created expression cassettes for two enzymes of the xylose catabolic pathway – xylose isomerase and xylulokinase – cloned into an episomal vector. The recombinant strain was submitted to metabolic adaptation for 48 days in medium with xylose as the sole carbon source, which led to an increase in the growth rate from 0.008 h-1 to 0.13 h-1. Preliminary studies of fermentation in synthetic medium revealed a buildup of xylitol (YX/S= 0,29 g g-1) and low ethanol production (YE/S= 0,27 g g-1) by this strain. In order to increase ethanol production, a deletion cassette for the GRE3 gene (aldose reductase) was developed. In addition, we considered introducing a gene coding for a membrane transporter with affinity for xylose to increase the influx of xylose to cell. To this end, we carried out a transcriptional analysis of the yeast Pichia stipitis (Scheffersomyces stipitis) CBS 5774 that had been adapted to sugarcane bagasse hydrolysate in order to understand gene regulation under different xylose and glucose concentrations and thus select a putative xylose transporter that could be expressed in S. cerevisiae (Chapter 3). Preliminary data indicate that the most upregulated gene with xylose as carbon source was XYL3 and, among putative xylose transporters, XUT1. The present work was one of the first attempts in the country to use metabolic engineering to develop a bioprocess in an industrial strain of S. cerevisiae. Overall, our preliminary results show that it is fully possible to develop national technology for production of ethanol from lignocellulosic residues using genetically modified microorganisms. Although the strain obtained in the present study did not show the desired ethanol yield from xylose, the molecular tools developed in this work were shown to be effective and validated to be used in future studies. Besides, we showed that the genetic features of the industrial strain JP1 make it interesting for future modifications related to other bioprocesses.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-09-17T14:10:25Z No. of bitstreams: 1 2013_FelipeSalgadodePadua.pdf: 773033 bytes, checksum: 79bc19e930b50ceeb2fb6ac19544f075 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-09-17T15:58:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_FelipeSalgadodePadua.pdf: 773033 bytes, checksum: 79bc19e930b50ceeb2fb6ac19544f075 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T15:58:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_FelipeSalgadodePadua.pdf: 773033 bytes, checksum: 79bc19e930b50ceeb2fb6ac19544f075 (MD5) / A caprinocultura leiteira brasileira é uma atividade econômica relativamente recente, e com grande potencial de crescimento, devido às suas características sensoriais únicas e também a sua caracterização de alimento saudável e funcional, porém não há dados publicados suficientes para se criar um padrão do produto obtido no Brasil. Os objetivos desse trabalho foram avaliar os padrões físico-químicos da produção e caracterizar a qualidade e segurança microbiológica do leite de cabra na região Centro Oeste. Amostras de leite de cabra, de pool de animais (n=40) e de conjunto (n=10), foram coletadas para pesquisa de aeróbios mesófilos (AM), coliformes totais (CT), Escherichia coli (EC), bactérias ácido láticas (BAL), Staphylococcus aureus (SA), bactérias psicrotróficas (PSI), bolores e leveduras (B/L), Listeria monocytogenes e Salmonella spp. Ainda, todas as amostras foram analisadas quanto aos teores de gordura (G), sólidos não gordurosos (SNG), densidade (D), proteína (Ppt), lactose (Lac),pH, acidez Dornic, índice crioscópico (IC) e pesquisa de resíduos de antibióticos. Nas amostras que apresentaram crescimento microbiológico, as contagens médias deAM foram1,2x103 UFC/mL (animais) e 7,6x103 UFC/mL (conjunto); de CT foram 1,0 UFC/mL (animais) e 1,2x104 UFC/mL (conjunto); de EC foi 2,0 UFC/mL (conjunto); de PSI, 1,0x104 UFC/mL (conjunto); de BAL, 4,7x102 UFC/mL (animais) e 7,8x103 UFC/mL (conjunto); de B/L 1,0 UFC/mL (animais) e 4,9x103 UFC/mL (conjunto) e de SA foram 2,1x102 UFC/mL (animais) e 2,8x102 UFC/mL (conjunto). L. monocytogenes e Salmonella spp não foram detectadas em nenhuma amostra. Nas análises físico químicas os resultados médios foram: G (animais:2,87%, conjunto: 4,8%); SNG (animais: 9,1%, conjunto: 9,5%; Ppt (animais: 3,4%, conjunto: 4,0%); Lac (animais: 5,0%, conjunto: 4,9%); acidez Dornic (animais: 18oD, conjunto 19oD); pH (animais e conjunto 7,0); IC (animais e conjunto: -0,558oH).Todas as amostras foram negativas para a pesquisa de resíduos de antibióticos. Os resultados obtidos permitem concluir que o leite de cabra produzido na região estudada, apresenta qualidade satisfatória e, os dados gerados podem contribuir para o estímulo e o aumento da produção desse leite e seus derivados na região. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Brazilian dairy goat is a relatively new economic activity and with great growth potential due to their unique sensory characteristics and its characterization as a healthy and functional food, however the published data are not sufficient to create a standard product obtained in the country. The goals of this study were to evaluate the quality and microbiological safety of goat milk produced in the Midwest region of Brazil. Animal pool samples (n=40) and whole milk samples (n=10) were collected on the Distrito Federal and Entorno region to the research of mesophilic aerobic bacteria (MA), total coliforms (TC), Escherichia coli (EC), acid-lactic bacteria (ALB), Staphylococcus aureus(SA), psychrotrophic bacteria (PSI), yeast and mold (Y/M), Listeria monocytogenes and Salmonella spp. All samples were analyzed for fat content (G), solid not fat (SNF), density(D), protein (Ppt), lactose (Lac), pH, acidity, cryoscopic index (CI) and antibiotics residues.The mean scores of samples with microbiological growth were: MA 1,2x103 CFU/mL (animals) and 7,6x103 CFU/mL (whole milk); TC 1,0 CFU/mL (animals) and 1,2x104 CFU/mL (whole milk); EC 2,0 CFU/mL (animals); PSI 1,0x104 CFU/mL (whole milk); ALB 4,7x102 CFU/mL (animals) and 7,8x103 CFU/mL (whole milk); Y/M, 1,0 CFU/mL (animals) and 4,9x103 CFU/mL (whole milk); SA2,1x102 CFU/mL (animals) and 2,8x102 CFU/mL (whole milk). L.monocytogenes and Salmonella spp. were not detected in any sample. The physicalchemical means observed were: Fat (animals: 2,87%, whole milk: 4,8%); non fat solids (animals: 9,1%, whole milk: 9,5%); Protein (animals: 3,4%, whole milk: 4,0%); lactose (animals: 5,0%, whole milk: 4,9%); acidity (animals: 18oD, whole milk: 19oD); pH (animals and whole milk 7,0); animals and whole milk CI -0,558oH). There were no positive samples for antibiotic residues. The Anglo-Nubian and Saanen breeds showed significant differences only in relation to content of freezing point and acidity. The results indicate that the goat milk produced in the analyzed region offers quality and microbiological safety and may bean incentive for the further development of dairy goat.

A celulose é o polímero mais abundante na natureza, sendo sua biodegradação realizada por enzimas como exoglicanases, endoglicanases e b-glicosidases, denominadas celulases. Entre os microrganismos capazes de secretar estas enzimas, destacam-se os fungos filamentosos, como Trichoderma, Penicillium e Aspergillus. Neste trabalho, em sua primeira etapa foi selecionado o fungo Aspergillus phoenicis entre seis fungos filamentosos para a produção de celulases. Foram testados doze meios de cultivos diferentes, buscando a escolha de um meio de cultivo baseado em resíduos agroindustriais para a produção de enzimas celulásicas. O meio de cultivo composto por resíduo de uva e peptona foi escolhido para efetuar de otimização do meio de cultivo, por meio da metodologia de superfície de resposta, realizando o planejamento fatorial 2². O cultivo submerso do fungo foi realizado em frascos erlenmeyers de 250 mL, com 50 mL de meio de cultivo, na temperatura de 30ºC, durante 120 horas em agitador de plataforma, a 120 rpm. Foram mensuradas as atividades de celulases totais, endoglicanases, e b-glicosidases. A atividade enzimática presente no sobrenandante do meio de cultivo foi então caracterizada quanto a diferentes valores de pH, temperatura, termoestabilidade, presença de sais e reagentes. Os resultados demonstram que as enzimas presentes no sobrenadante bruto da cultura possuem melhores atividade entre os pHs 3,0 e 5,0, temperatura de 60 ºC, mantendo-se estável por duas horas de incubação. A atividade enzimática sofreu perdas quando incubada na presença de Hg2+ , Cu+2, detergentes e ßmercaptoetanol. / Cellulose is the most abundant polymer in the nature, being its degradation carried out by enzymes such as exoglicanases, endoglicanases and b-glicosidases, called cellulases. Among the microorganisms capable to secret this enzymes, the fungi distinguished the filamentous fungi, such as Trichoderma, Penicillium and Aspergillus are the most important microrganisms. In this work, the fungus Aspergillus phoenicis was selected among six others filamentous fungi for the production of cellulases. Twelve culture media based on agroindustrial waste for cellulase production were tested. Culture medium with the composition of waste grape and peptone was chosen for the optimization of process, with the help of the response surface methodology, through factorial planning 2². The fungus was cultivated at a temperature of 30 ºC and 120 rpm on shaker rotatory during 120 hours. The activity of total cellulases, endoglucanases and b-glucosidases were measured. The enzymatic activity was characterized for the different values of pH, temperature, thermostability and presence of ions and others composts. The results demonstrated that the crude enzymes have the optimum activity between pH 3,0 and 5,0, at 60 ºC, temperature that it was remained steady for two hours of incubation. The enzymatic activity suffered losses when incubate in the presence of Hg2+, Cu+2, detergents and ß-mercaptoetanol.

Orientadores: Lucimara Gaziola de La Torre, Reinaldo Gaspar Bastos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T04:50:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_AlineFurtado_M.pdf: 2165174 bytes, checksum: d3aa7acdee3edc7f222daf3f7a82f910 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A microfluídica é uma ciência que opera em pequenos volumes de fluídos dentro de canais em dimensões de micrômetros (10-6 m). Estes sistemas permitem controlar moléculas no espaço e no tempo, gerando resultados rápidos e confiáveis num sistema precisamente controlado e capaz de mimetizar ambientes celulares. Os dispositivos microfluídicos apresentam uma diversidade de geometrias aplicáveis para diversas áreas de pesquisas, sendo que a capacidade de formar gradientes permite avaliar as condições e o desempenho celular microbiano. Assim, este trabalho teve como objetivo desenvolver dispositivos microfluídicos capazes de formar gradiente de concentração difusivo e investigar sua aplicabilidade em bioprocessos. Diante disso, foram propostos três modelos de dispositivos usando materiais biocompatíveis: (i) dispositivo em base de vidro, denominado de Vidro-vidro; (ii) em base de vidro e poli dimetilsiloxano (PDMS), chamado de Vidro-PDMS e (iii) vidro e PDMS modificado quimicamente para tornar a superfície hidrofílica, Vidro-mPDMS. Os três dispositivos foram avaliados quanto à capacidade de formação de gradiente de concentração difusivo, os quais apresentaram um perfil linear. Além disso, validou-se o estudo do comportamento de Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 num gradiente de concentração de glicose de 0 a 40 g/L de glicose, sendo usado o dispositivo vidro-vidro. Foi observado que houve crescimento de células ao longo das câmaras microfluídicas, e isso possibilitou na determinação de parâmetros cinéticos, os quais não apresentaram diferença estatisticamente significativa com o cultivo em batelada convencional. As condições da microfluídica possibilitaram também a determinação da cinética de Monod, usando menores intervalos de gradiente. Portanto, este dispositivo microfluídico mostrou-se uma ferramenta com potencial para investigar comportamento celular frente à diferença de concentração e contribuirá para a otimização de bioprocessos através da determinação de parâmetros cinéticos / Abstract: Microfluidic is a science that operates in small amounts of fluids inside channels in dimensions of micrometers (10-6 m). These systems allow the precise control of molecules in space and time, generating fast and reliable results and it can also be used to mimics environment cellular . Microfluidic devices can be produced in diversity of geometries, it can be applied in several scientific areas and especially the formation of concentration gradients can be used to evaluate conditions and performance of microbial cell. Therefore, this work had the objective to develop microfluidic devices that are able to generate diffusive concentration gradients and investigate their applicability in bioprocesses. In this context, we propose three models of microfluidics devices using biocompatible materials: (i) Glass-based device, named glass-glass; (ii) glass and poli dimetilsiloxane (PDMS) based device, Glass-PDMS and (iii) glass and chemically modified PDMS (hydrophilic surface), Glass-mPDMS. The three devices were evaluated by their capacity of generating difusive concentration gradient, demonstrating linear concentration profile. Furthermore, the behavior of Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 inside of glucose concentration gradient ranging from 0 to 40 g/L were validated, using the glass-glass device . It was observed that cell growth along the microfluidic chambers, having determined the kinetic parameters, which was considered statistically similar to conventional batch cultivation. Conditions of microfluidics also allowed determination of the Monod kinetic, using smaller intervals gradient Therefore, the use of concentration gradient in microfluidic device is a potential tool for investigate of microbial cell behavior against the concentration difference and it can contribute to the optimization of bioprocesses through the determination of kinetic parameters / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_WilliamJamesNogueira_D.pdf: 7186235 bytes, checksum: ddd703d245f4f54c40b8d88fbf10674a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Neste trabalho foi possível estudar o cultivo em altas densidades celulares de E. coli recombinante em bioreatores identificando importantes parâmetros cinéticos para as fases de crescimento celular e indução da proteína recombinante. Foram estudadas diversas estratégias de cultivo para obtenção de elevadas densidades celulares, no intuito de desenvolver' uma tecnologia de fermentação robusta que permitisse: Elevados níveis de biomassa em peso seco de células por litro; determinar as condições nutricionais que permitem expressão da proteína de fusão da ordem de 20% ou mais em fermentações com alta concentração de biomassa e determinar a melhor estratégia de fermentação para atingir elevadas concentrações celulares, entre as quais, batelada-alimentada com cortes, batelada-alimentada cíclica em dois estágios e fermentações com reciclo e microfiltração. A cepa utilizada neste estudo foi a E. coli N-4830-1 transformada com o plasmídeo pHis. As fermentações foram realizadas em bioreatores de bancada de capacidade útil de 4,0 L e 12,0 L (NBS e Inceltech). Foram medidas as concentrações de biomassa, glicose, acetato e proteína recombinante. Os estudos cinéticos das diferentes estratégias mostraram incrementos em biomassa e em proteína de fusão, sendo que o melhor resultado foi obtido para fermentações com reciclo total de células, microfiltração do meio e alimentação exponencial de nutrientes, as quais obtiveram produtividade celular igual a PR = 6,437 g/L/h. A concentração final em peso seco de células foi 173,8 g/L, com porcentagem de expressão da proteína de fusão em 17,8%. Os incrementos obtidos em biomassa e em proteína de fusão, em relação à batelada-alimentada tradicional, foram respectivamente 341 % e 328 %. A técnica mostrou-se adequada para remoção de inibidores no meio de cultura permitindo maior produtividade e, conseqüentemente, maior crescimento celular, sendo até 3,5 vezes superiores aos cultivos em batelada-alimentada tradicional / Abstract: This thesis studied submerged high cell-density cultures (HCDC) of recombinant Escherichia coli identifying important kinetic parameters on growth and production phases. Several strategies to obtain HCDC were studied aiming to develop a robust fermentation process that allowed: High cell dry weight per liter; to determine the nutritional conditions to express the fusion protein in levels up to 20% of total protein, and to determine the best fermentation technique to reach dry biomass concentration higher that 100,0 g/L. The strain used in this work was E. colí N-4830-1 transformed with the plasmid pHis. The fermentations were ran out in 4.0 L and 12.0 L bench-top bioreactors (NBS e Inceltech). Total protein concentration, recombinant protein concentration, cell concentration, glucose concentration and acetate concentration were analyzed. The kinetics studies demonstrated that biomass and fusion protein were increased, however the best results were performed on a continuous fermentation with microfiltration, total cell recycle and exponencial feeding. The cell productivity was PR = 6,437 glUh, the final cell dry weight was 173,8 g/L and the percentage of fusion protein was 17,8 % of total protein. The biomass and fusion protein increase obtained were, respectively, 341 % and 328 %, comparing with traditional fed-batch fermentation. This technique showed appropriated to remove inhibitors of the broth allowing higher cell concentration and, consequently, higher productivity. In this type of culture strategy, the final cell concentration was 3.5 fold than one obtained in traditional fed-batch / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química